Summary
Detta protokoll beskriver beredningen av råtta hel ischias nervvävnad för ex vivo elektrofysiologisk stimulering och registrering i ett miljöreglerat, tvåfack, perfuserat saltlösningsbad.
Abstract
Ex vivo-preparat möjliggör studier av många neurofysiologiska processer isolerat från resten av kroppen samtidigt som den lokala vävnadsstrukturen bevaras. Detta arbete beskriver beredningen av råtta ischiasnerver för ex vivo neurofysiologi, inklusive buffertberedning, djurprocedurer, utrustningsinställning och neurofysiologisk registrering. Detta arbete ger en översikt över de olika typer av experiment som är möjliga med denna metod. Den skisserade metoden syftar till att ge 6 timmars stimulering och inspelning på extraherad perifer nervvävnad under tätt kontrollerade förhållanden för optimal konsistens i resultaten. Resultat som erhålls med denna metod är A-fiberföreningsaktionspotentialer (CAP) med topp-till-topp-amplituder i millivoltområdet under hela experimentets varaktighet. CAP-amplituder och former är konsekventa och tillförlitliga, vilket gör dem användbara för att testa och jämföra nya elektroder med befintliga modeller, eller effekterna av ingrepp på vävnaden, såsom användning av kemikalier, kirurgiska förändringar eller neuromodulerande stimuleringstekniker. Både konventionella kommersiellt tillgängliga manschettelektroder med platina-iridiumkontakter och skräddarsydda ledande elastomerelektroder testades och gav liknande resultat när det gäller nervstimulansstyrka-varaktighetssvar.
Introduction
Den nuvarande förståelsen av grundläggande nervfunktion som modellerad i silico saknas i flera aspekter, särskilt med avseende på effekterna av nervvävnadsfack utanför soma, axon och dendriter. Axon-myelininteraktioner är fortfarande dåligt förstådda, vilket framgår av det faktum att även detaljerade beräkningsnervmodeller som MRG1 (för däggdjursnerver) som på ett adekvat sätt fångar konventionellt elektriskt stimuleringssvar, inte fångar andra experimentellt observerade beteenden såsom högfrekvent blocköverföring2 eller sekundärt debutsvar3.
Detta protokoll tillhandahåller en metod för att effektivt undersöka neurofysiologiska processer på nervnivå i en akut liten laboratoriedjurmodell, med hjälp av ett standardiserat beredningsprotokoll för att isolera nerven, kontrollera dess miljö och ta bort den från ett in vivo-sammanhang till ett ex vivo-sammanhang. Detta kommer att förhindra andra kroppsprocesser eller anestetika som används av in vivo nervstimuleringsprotokoll för att ändra nervbeteende och förvirra uppmätta resultat eller deras tolkning 4,5. Detta möjliggör utveckling av mer realistiska modeller som enbart fokuserar på effekter som är specifika för nervvävnader som är dåligt förstådda. Detta protokoll är också användbart som en testbädd för ny nervstimulering och inspelning av elektrodmaterial och geometrier, liksom nya stimuleringsparadigmer som högfrekvent block 2,3. Variationer av denna teknik har tidigare använts för att studera nervfysiologi under tätt kontrollerade förhållanden6, till exempel för att mäta jonkanaldynamik och egenskaper eller effekterna av lokalbedövningsmedel7.
Denna teknik ger flera fördelar jämfört med alternativ som akuta in vivo små djurförsök8. Tekniken undanröjer behovet av att upprätthålla anestesidjupet eftersom vävnaden har extraherats från kroppen, vilket minskar mängden nödvändig utrustning som en bedövningsdiffusor, syrekoncentrator och värmedyna. Detta förenklar det experimentella protokollet, vilket minskar risken för misstag. Eftersom anestetika potentiellt kan förändra nervfunktionen4, säkerställer denna teknik att åtgärder inte kommer att förvirras av biverkningar från dessa bedövningsföreningar. Slutligen är denna teknik mer lämplig än akuta in vivo-experiment när man studerar effekterna av neurotoxiska föreningar såsom tetrodotoxin, vilket skulle döda ett sövt djur genom förlamning.
Perifera nervsektioner är ett unikt ex vivo-system eftersom det finns en stor chans att fibrerna som är ansvariga för inspelade neurala signaler inte innehåller någon soma. Eftersom dessa normalt skulle vara belägna, för motorneuroner, i ryggraden och för sensoriska neuroner i dorsala rotganglierna bredvid ryggraden, kan beredningen av en del av däggdjursnerven grovt modelleras som en samling rörformiga membran med jonkanaler, öppna i båda ändarna9. Metabolism upprätthålls av mitokondrierna som ligger i axonen vid tidpunkten för vävnadsdissektion10. Suturering av de öppna ändarna av axolemmen uppmuntras efter extraktion för att stänga dem och därigenom hjälpa till att upprätthålla befintliga joniska gradienter över membranet, vilket är viktigt för normal nervfunktion.
För att upprätthålla vävnadshomeostas utanför kroppen måste flera miljövariabler kontrolleras tätt. Dessa är temperatur11, syresättning12, osmolaritet, pH13,14 och tillgång till glukos för att upprätthålla ämnesomsättningen. För detta protokoll är tillvägagångssättet att använda en modifierad Krebs-Henseleit-buffert 15,16 (mKHB) kontinuerligt luftad med en blandning av syre och koldioxid. mKHB är i familjen kardioplegiska buffertar 6,17 som används för att bevara dissekerade vävnader utanför kroppen, till exempel i ex vivo-experiment. Dessa buffertar innehåller inget hemoglobin, antibiotika eller antifungaler och är därför endast lämpliga för preparat som involverar små mängder vävnad under en begränsad tid. pH-kontroll uppnåddes med karbonat- och koldioxid redoxparet, vilket krävde konstant luftning av bufferten med koldioxid för att upprätthålla pH-jämvikt. Detta för att undvika att använda andra vanliga buffringsmedel som HEPES, som kan modifiera nervcellsfunktion18. För att syresätta bufferten och ge pH-kontroll användes en blandning av 5% koldioxid i syre som kallas karbogen (95% O2, 5%CO2). En värmeomrörare användes för temperaturkontroll av en buffertbehållare, och bufferten perfuserades genom ett nervbad och återcirkulerades sedan till startbehållaren. Ett typiskt experiment skulle pågå i 6-8 timmar innan nerven förlorar sin livskraft och inte längre svarar tillräckligt på stimulering för att åtgärder ska vara representativa för frisk vävnad.
För att optimera signal-brusförhållandet användes silverkloridelektroder för inspelning, vilka framställdes enligt tidigare beskrivna metoder19. För stimulering kan en kombination av kommersiella platinamanschettelektroder och skräddarsydda ledande polymermanschettelektroder användas. Ledande polymermanschettelektroder har särskilt högre laddningskapacitet, vilket är användbart när man stimulerar nerven med hjälp av vågformer med hög amplitud20.
Stimulatorn som används i detta protokoll har tidigare beskrivits20. Dokumentation, designfiler och programvaruskript för att använda den är offentligt tillgängliga21. Andra stimulatorer kan användas för att utföra detta protokoll; emellertid är den anpassade stimulatorn också kapabel till högfrekvent alternativström (HFAC) block 2,20, vilket möjliggör ett bredare spektrum av neurofysiologiska experiment. För att använda HFAC-block rekommenderas ledande elastomermanschetter för att undvika skador på nerven. Ledande elastomernervmanschetter är mjuka och helt polymera elektrodmatriser framställda av ledande elastomerer som ledande komponent och polydimetylsiloxan som isolering22. Enheterna tillverkades i en bipolär konfiguration med hjälp av konventionella lasermikrofabrikationstekniker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All djurvård och alla djurprocedurer utfördes under lämpliga licenser utfärdade av det brittiska inrikesministeriet enligt Animals (Scientific Procedures) Act (1986) och godkändes av Animal Welfare and Ethical Review Board of Imperial College London.
1. Beredning av buffertar
OBS: Denna del av protokollet kan utföras i god tid före resten av protokollet, med undantag för de sista stegen som involverar beredning av modifierad Krebs-Henseleit-buffert (mKHB) vid 1x koncentration.
- Förbered 1 M CaCl2 stamlösning
- Tillsätt 14,701 g CaCl2-dihydrat till en ren 100 ml-bägare. Tillsätt ~ 75 ml avjoniserat vatten och rör om tills saltet har lösts helt.
- Överför lösningen till en 100 ml mätkolv och tillsätt avjoniserat vatten tills 100 ml har uppnåtts. Överför lösningen till en flaska och förvara den i kylskåp vid 4 °C.
- Förbered 10x koncentrerat mKHB-lager
- Tillsätt 66,03 g natriumklorid (NaCl), 3,57 g kaliumklorid (KCl), 1,63 g kaliumdivätefosfat (KH2PO4) och 1,44 g magnesiumsulfat till en 2 L-bägare.
- Tillsätt ~ 750 ml avjoniserat vatten till bägaren och rör om tills salterna har löst sig (det kan finnas små saltkristaller kvar i botten). Tillsätt 25 ml 1 M CaCl2 stamlösning (steg 1.1) och rör om; se till att detta är det sista saltet som tillsätts.
- Överför lösningen till en 1 L-mätkolv och tillsätt avjoniserat vatten för att nå en total volym på 1 liter. Överför lösningen till en 1 L-flaska. Förvara koncentrerad 10x mKHB vid 4 °C i kylskåp.
OBS: Koncentrerat mKHB-lager kan lagras i cirka 1 månad innan det byts ut.
- Förbered dissektion Petriskål (beläggning)
- Förbered en petriskål i rent glas (120 mm diameter) för beläggning genom att tvätta och torka skålen försiktigt.
- Följ tillverkarens instruktioner för användning och härdning av den konforma alkoxibeläggningen, täck botten av petriskålen med ~ 3-5 mm beläggning genom att försiktigt hälla den konforma beläggningsblandningen i skålen tills önskad tjocklek har uppnåtts.
- Härda beläggningen i en ugn vid 60 °C tills den är fast vid beröring. Dissektion Petriskålen är nu klar.
OBS: Skonsam rengöring av skålen efter varje användning säkerställer att beläggningen håller i flera år innan byte behövs. När du byter ut beläggningen, se till att ta bort allt beläggningsmaterial innan du applicerar en ny beläggning. Observera att den konforma alkoxibeläggningen (materialtabell) som används i detta protokoll har en hållbarhetstid som är kortare än ett år.
2. Preparat före dissektion
Det här steget startar experimentet. Nedanstående steg måste utföras samma dag, i denna ordning.
- Förbered 1x mKHB
- Förbered en ren 2 L bägare för bufferten. Överför 200 ml 10x mKHB-lager till 2 L-bägaren. Tillsätt 2,1 g natriumkarbonat (NaHCO3) och 0,99 g vattenfritt dextros (D-glukos) till 2 L-bägaren.
- Tillsätt cirka 1 liter avjoniserat vatten till bägaren. Rör om tills salterna är helt upplösta. Överför lösningen till en 2 L-mätkolv och tillsätt avjoniserat vatten för att nå en total volym på 2 L.
- Överför lösningen till en 2 L glasflaska placerad på en värmeomrörare med temperaturen inställd på 37 °C.
OBS: Mindre värmeomrörare kan ofta inte nå målet på 37 °C på grund av den termiska trögheten hos stora behållare fulla med vatten. Justera temperaturen uppåt så att innehållet i flaskan når 37 °C under omrörning. Övervaka temperaturen under experimentet och sänk den inställda temperaturen vid överskridande. - Placera en termometer i 2 L-flaskan för att övervaka temperaturen, med gripdon för att förhindra att termometern påverkas av omrörningsloppan. Lufta bufferten med karbogen i minst 30 minuter för att syresätta lösningen. Detta bör ställa in pH till 7,4. Mät pH-värdet med en pH-mätare för att säkerställa att det ligger inom 0,1 pH-enheter på 7,4 (vid 37 °C).
OBS: För att justera pH till 7,4, använd saltsyra eller natriumhydroxid vid behov. - Fyll två 15 ml centrifugrör och en 100 ml flaska med mKHB och lägg dem på is för att svalna.
OBS: Centrifugrören och flaskan kan rengöras och återanvändas efter varje experiment utan autoklavering. - För senare delar av experimentet, fortsätt att lufta bufferten i 2 L-flaskan med karbogen vid 37 °C under kontinuerlig omrörning.
OBS: Oövervakad användning av karbogen kan vara farligt om inga automatiska system finns på plats för att stänga av gasflödet i händelse av läckage. En automatiserad sensor och elektronisk avstängningsventil kan mildra detta; I annat fall måste en person lämnas att övervaka utrustningen om dissektion sker i ett annat rum. I alla fall bör en syresensor användas nära installationen för att varna operatörer när den omgivande syrekoncentrationen stiger över 25%. Använd om möjligt ett rum med aktiv ventilation.
- Slå på signalinhämtningsanordningen, förförstärkaren med låg brus, linjebrusfilter och oscilloskop för inspelning och stimulering för att ge tillräckligt med tid för temperaturstabilisering.
- Se till att all elektrisk färdskrivare är korrekt konfigurerad
- Ställ in förförstärkaren med låg ljudnivå på AC-kopplad ingång med ingångsbandpassfiltret inställt på 6 dB avrullning per decennium och avstängningsfrekvenser inställda på 30 Hz och 3 kHz för högpass- respektive lågpassfilter.
- Ställ in förstärkningen på förförstärkaren med låg ljudnivå till 100.
3. Djuranestesi och avlivning
OBS: Honråttor mellan 250 och 330 g (Materialtabell) användes för studierna.
- Förbered kirurgiska verktyg och förbrukningsvaror: 12 cm rak sax (trubbig); 2 mm skärkantvinklad fjädersax; 4 cm fin sax, skarp eller halvskarp; #7 Dumont tång; 45° vinklade fina pincett och 6-0 suturerande siden eller tråd.
- Placera råttan i en anestesibehållare eller kammare. Anslut syre och bedövningsdiffusorn till behållaren. Ställ in bedövningskoncentrationen (isofluran) till 3,5% och vänta cirka 10 minuter eller tills djuret visar tecken på anestesi, såsom förlust av rätningsreflex.
- Efter att råttan visar tecken på anestesi, bekräfta medvetslösheten med ett tånypa abstinensreflextest. Fortsätt endast när det inte finns något tåuttag; Annars kontrollerar du alla anslutningar och bedövningsnivåer i diffusorn och upprepar steg 3.2.
- Ta djuret ur behållaren och fortsätt med cervikal dislokation, följt av snitt av en lårbensartär för bekräftelse av döden.
4. Dissektionsprotokoll
OBS: Placera djuret med magen nere på dissektionsbordet. Upprepa följande steg för båda benen. Vanligtvis dissekeras det högra benet först.
- Håll fotleden stadigt mellan tummen, pekfingret och långfingret och skär av calcanealsenan med 12 cm rak trubbig sax.
- Med fin vass sax, gör ett hudsnitt från calcaneal senan längs baksidan av benet hela vägen upp till ryggraden, var noga med att inte dissekera muskelvävnaden nedan.
- Använd fina pincett och fina saxar och gör försiktiga snitt genom muskellagren nära mitten av benets baksida tills ischiasnerven exponeras. Så snart ischiasnerven är synlig, fuktar hålrummet med iskall mKHB för att förhindra att nerven torkar ut.
- Använd hemostater, dra isär hudflikarna på varje sida och håll snittet öppet för finare dissektionsarbete. Från platsen för det calcaneal sensnittet, med fin sax, avbryt muskeln på den mediala sidan av benet för att frigöra nerven. Fortsätt att upprätthålla fuktnivåerna i området med iskall mKHB.
- När nerven exponeras när du rör dig upp i benet, dissekera den överliggande muskelvävnaden. Frigör nerven närmare ryggraden från bindväv tills den når ryggradsklyftan vid vilken tidpunkt det finns en kink i nerven. Försök inte att rengöra nerven ännu eftersom hastighet är viktigt i detta skede.
- Skär av nerven så nära ryggraden som möjligt med fin sax. För att göra dissektionen enklare, dra mycket försiktigt nervens ände nära fotleden med pincett. Nyp aldrig nerven i mitten, utan bara ändarna. Dra aldrig en nerv spänd.
VALFRITT: Vid denna tidpunkt, om tiden tillåter, kan suturering av båda ändarna av nerven utföras för att upprätthålla livskraften. Håll hanteringen till ett minimum för att förhindra skador. Om tiden inte är tillräcklig (se steg 4.5) hoppar du över det här steget och följer steg 5.2 senare. - Placera den dissekerade nerven i 15 ml centrifugröret fyllt med mKHB (steg 2.1.5), stäng röret och lägg tillbaka röret på is tills rengöringsproceduren börjar.
- Upprepa steg 4.1-4.7 för det andra benet. Helst bör varje nerv ta 5-10 minuter att extrahera för att maximera vävnadens livskraft.
5. Nervrengöringsförfarande
- Fyll den belagda petriskålen ungefär halvvägs med kyld syresatt mKHB. Placera en av de dissekerade ischiasnerverna i skålen och fäst båda ändarna av nerven på skålen så att nerven är rak utan kinks, vridning eller vridningar. Fäst nerven så nära ändarna som möjligt.
- Använd 6-0 silkesuturer eller fin tråd, knyt en dubbel knut runt varje ände av nerven för att förhindra cytosolläckage i bufferten. Placera knutarna precis bredvid insektsstiften på sidan närmare nervens centrum, eftersom detta förhindrar läckage från nervvävnaden in i bufferten. Utför inte detta steg om nerven tidigare har ligerats.
- Använd mikroskopet för precision och den 2 mm vinklade fjädersaxen, ta bort fett, blodkärl och muskelvävnad från nerven. Beskär eventuella nervgrenar som inte kommer att användas i stimulerings- och inspelningsprotokollet.
- Var 5: e minuts rengöring, byt ut bufferten mot färsk kyld syresatt mKHB. Använd fina pincett för att dra i bindväv, fett och blodkärl för att underlätta dissektion.
- Placera nerverna tillbaka i transportrören fyllda med färsk syresatt kyld mKHB och placera rören på is.
6. Inställning av utrustning
OBS: Utrustningen som används för att utföra experiment illustreras i figur 1. Kortfattat består det av ett nervbad med dubbla fack, en 2 L-flaska placerad på en värmeomrörare, en källa till karbogen för buffertluftning och slangar för att låta bufferten strömma från flaskan till badet och tillbaka till flaskan med en peristaltisk pump. Badet kan bearbetas av plexiglas eller 3D-printas av vattentäta material. Den har ett djup på cirka 2 cm, och skiljeväggen som skiljer badets två kamrar har ett hål med en diameter på 1,5 mm för att möjliggöra gängning av en perifer nerv över båda kamrarna. En kammare är stor, måste vara minst 4 eller 5 cm lång och kommer att fyllas med buffert. Den andra kammaren ska vara minst 3 cm lång och fylls med silikon eller mineralolja. Badet får inte göras för stort eftersom det försämrar kontrollen av perfusion, temperatur och pH. Olika badstorlekar kan krävas beroende på storleken på nervvävnaden som studeras.
- Förbered ett rent nervbad med dubbla kammare (se tilläggsfil för designspecifikationer). Placera nervbadet under nivån på 2 L-flaskan som placeras på värmeomröraren med hjälp av vanliga laboratoriebosshuvuden och gripdon. Anslut badets avlopp till det peristaltiska pumpinloppet.
- Anslut den peristaltiska pumpens utlopp till ett rör som leder tillbaka till 2 L buffertflaskan. Anslut badinloppet till ett rör med en justerbar flödesventil och sätt röret inuti 2 L-flaskan. Använd en trevägsventil med en spruta ansluten till mittutloppet för att hjälpa till med att grunda röret som en sifon för tyngdkraftsassisterat buffertinflöde.
- Primera sifonen genom att dra sprutan tills bufferten rinner in i den. Konfigurera ventilen så att buffertens flöde in i badet är ~5-6 ml·min-1. Flödet kan ökas initialt för att fylla badet. När badbuffertnivån har nått avloppet, placera nerverna i badet.
- Använd en insektsstift och säkra nervens ände i hörnet av den buffertfyllda badkammaren. Använd 45° vinklade fina pincett och kläm fast nerven endast i ändarna, trä försiktigt nerven som ska stimuleras genom hålet i skiljeväggen mellan de två badkamrarna.
- Säkra den andra änden av nerven i badets oljekammare med en insektsstift, så att nerven är rak utan att sträckas och är fri från kinks och vridningar. Använd silikonfett och gör en tätning för att förhindra buffertläckage från buffertkammaren in i oljekammaren. Fyll oljekammaren med silikon eller mineralolja.
- Placera Ag/AgCl-elektrodkrokarna i oljebadkammaren och säkra dem med bosshuvuden och gripdon. Drapera delen av nerven i oljebadet över krokarna utan att dra nerven spänd. Nyp inte nerven; använd vinklade pincett för att lyfta nerven utan att klämma fast.
- Justera eller reparera silikonfetttätningen om något läckage observeras efter att nerven har flyttats.
- Anslut referens-Ag/AgCl-elektroden till förstärkarjorden och placera elektroden i den buffertfyllda badkammaren genom att säkra den med hjälp av en laboratoriegripare.
7. Elektrodimplantation på nerven i badet
- Förbered en ren nervmanschettelektrod för stimulering enligt referens21. Placera elektroden i den buffertfyllda badkammaren. Använd pincett eller fin pincett med trubbiga eller vinklade spetsar och öppna elektroden i badet för att blöta insidan av manschetten.
- Om bubblor kvarstår, använd en fin spruta för att dra buffert från badet och tvinga bubblorna ur manschetten. Med en pincett under nerven öppnar du försiktigt manschetten och skjuter den under nerven. Stäng manschetten runt nerven, var noga med att undvika kinking eller vridning av nerven.
- Anslut stimuleringselektroden till stimulatorn och säkra stimuleringselektrodledningen med tejp. Anslut strömreturelektroden till stimulatorn och säkra ledningen med tejp. Om du använder ett fyrkantigt platinaark som strömreturelektrod, placera arket bort från nerven i badet.
8. Stimulering och inspelning
- Anslut stimulatorns TTL-signalutgång till kanal 4 i oscilloskopet, som kommer att användas för att utlösa oscilloskopet. På skärmen oscilloskop trycker du på fliken Utlösande kanal och anger Kanal 4 som utlösande kanal. Ställ in utlösningsnivån på 1 V med nivåvredet .
- På oscilloskopet ställer du in tidsupplösningen till 1 ms / division och spänningsupplösningen till 10 mV / division. Centrera utlösarreferensen i tid och ställ in utlösarnivån på 1 V.
OBS: Följ steg 8.3 till 8.6 om du använder den anpassade stimulatorn (se materialtabell). Det antas att MATLAB-programvaran och drivrutinerna har installerats på laboratoriedatorn med hjälp av instruktioner som tillhandahålls fritt online för den anpassade neurala stimulatorn21. Annars följer du tillverkarens instruktioner för användning av en kommersiellt tillgänglig stimulator som ett alternativ. - Anslut stimulatorn till laboratoriedatorn. Slå på stimulatorn genom att ansluta batteriets strömförsörjning till strömingången. Starta MATLAB-programvaran på laboratoriedatorn.
- Kör det anpassade MATLAB-skriptet: HFAC_4ch_Stimulator_Initialization.m (materialtabell).
USB-kommunikationskabeln mellan datorn och stimulatorn ska blinka grönt. Om det inte gör det finns det ett konfigurationsfel och strömförsörjningen och anslutningarna måste verifieras. - Öppna MATLAB-skriptet: HFAC_4ch_Monophasic_Stimulation.m (Materialtabell). Genom att direkt redigera MATLAB-skriptet ställer du in parametrarna enligt följande: stimulatorpulsamplitud = -300 μA, stimulatorpulsbredd = 300 μs, stimulatorantal pulser = 10 och stimulatortid mellan pulser = 1 s.
- Starta stimuleringsprotokollet genom att klicka på Kör i MATLAB-programvaran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa resultat som kan erhållas med detta protokoll är de konsekventa sammansatta åtgärdspotentialerna från A-typ nervfibrer i ischiasnerven. Dessa åtgärdspotentialer har vanligtvis en topp-till-topp-amplitud på cirka 1 mV vid elektroden och därför 100 mV när de har förstärkts (figur 2). Liknande stimuleringsamplituder och pulsbredder bör ge liknande CAP-amplituder. Ledande elastomermanschettelektroder kräver i allmänhet något högre stimuleringsamplituder för att erhålla samma CAP-amplitud jämfört med kommersiellt tillgängliga platinamanschettelektroder. Denna skillnad är i allmänhet liten jämfört med variationen i stimuleringsamplitud som krävs för att stimulera nerver som kommer från olika djur. Detta beror på att små skillnader i nervstorlek och manschettpassning har stor effekt på den erforderliga stimuleringsamplituden för att erhålla en specifik CAP-amplitud, oavsett manschettmaterial. Detta kan användas för att testa effekterna av olika buffertkompositioner, såsom olika jonkoncentrationer eller tillsats av nervexcitatoriska eller hämmande ämnen såsom tetrodotoxin. Om buffertavfallsröret leds till en extra behållare kan tillsatsen av nervexcitabilitetsförändrande ämnen göras tillfällig för experimentet, med tvätthastigheter beroende på buffertinflödet.
Den minsta strömtätheten, beräknad som stimuleringsamplituden dividerad med ytan på stimuleringselektroderna, som krävs för att aktivera fibrerna av A-typ och erhålla en observerbar föreningsverkanspotential för oscilloskopet plottades kontra pulsbredden i figur 3. Resultaten som visas i figur 3 representerar typisk nerv excitabilitet för både kommersiellt tillgängliga standard platinanervmanschetter och skräddarsydda ledande elastomernervmanschetter.
De extraherade nerverna bör förbli livskraftiga i cirka 6 timmar efter extraktion och därför måste experiment passa inom detta tidsfönster. Förlust av nervviabilitet leder till en progressiv minskning av CAP-amplituden och ledningshastigheten. Efter att åtgärdspotentialamplituden minskar under 50% av den initiala amplituden (i början av inspelningen) bör nerven inte längre anses vara livskraftig eftersom resultaten kommer att vara signifikant skeva. Representativa resultat med avseende på nervlivslängd visas i figur 4. Höger och vänster ischiasnerver extraherades från ett djur mellan 10:00 och 11:00 på en viss dag. Initiala CAPs erhölls från höger ischiasnerv under initiala tester före experiment, och standard CAPs erhölls från både vänster och höger ischiasnerver, som hade hållits vid liv med hjälp av detta protokoll, i slutet av experimenten. Minimal CAP-amplitudreduktion observerades med höger ischiasnerv, medan den vänstra ischiasnerven CAP-amplituden vid cirka 3 mV liknade den hos höger ischiasnerv i början av experimentet mer än 6 timmar efter nervuttag.
Figur 1: Schematisk representation av den experimentella installationen som används i protokollet. Denna siffra har modifierats från Rapeaux, A. m.fl. (2020)20. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativa CAPs erhållna ex vivo efter stimulering med metalliska och ledande elastomernervmanschettmatriser. Reproducerad med modifieringar från Cuttaz, E. A. m.fl. (2021)22. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Aktiveringströskel för A-fiber för metalliska och ledande manschettmatriser av elastomer. Felstaplar representerar ±1 standardavvikelse från medelvärdet. Reproducerad med modifieringar från Cuttaz, E. A. m.fl. (2021)22. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Representativa CAPs erhållna ex vivo under en dag av experiment och med hjälp av båda ischiasnerverna från ett djur. (B) A-fiber CAP erhållen mitt på eftermiddagen från vänster ischiasnerv. (C) A-fiber CAP erhållen i slutet av experiment med samma vänstra ischiasnerv i (B). X-axeln motsvarar den tid på dagen då inspelningarna togs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande fil. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta arbete beskrev vi ett protokoll för att förbereda råtta ischiasnerver för ex vivo neurofysiologi. Vävnadsextraktion tar cirka 30 minuter, inklusive djurhantering, anestesi, avlivning och dissektion, medan nervrengöring, placering i badet och elektrodimplantation bör kräva ytterligare 30 minuter innan inspelningen kan startas. Buffertberedning kan utföras på 30 minuter, men detta kan göras före resten av experimentet. Denna typ av preparat och experiment har använts och beskrivits under de senaste 7,12, med liknande buffertar och för samma vävnadstyp. Såvitt författarna känner till är detta dock första gången en beskrivning av buffertberedningen, dissektion, utrustning som ställts in och efterföljande inspelning har getts i samma dokument.
Detta protokoll kan möjliggöra en mängd olika experiment inom neurofysiologi som inte skulle vara möjliga i varken in vitro- eller in vivo-sammanhang . Till exempel är en fördel med ex vivo-preparat att de bevarar makro- och mikrostrukturen hos den extraherade vävnaden samtidigt som de isolerar denna vävnad från resten av kroppen. Detta resulterar i ett enklare upplägg då anestesi inte behöver upprätthållas, vilket annars är ett krav i in vivo-experiment . När det gäller att möjliggöra experiment tillåter ex vivo-preparat användning av ämnen som tetrodotoxin, som är svåra att motivera i ett in vivo-sammanhang 23 eftersom de medför en hög risk för djuret. När användningen av sådana ämnen är till nytta är de lättare att använda i ex vivo-preparat . Användningen av den anpassade stimulatorn20 möjliggör experiment med HFAC-block för neuromodulering med hjälp av denna experimentella inställning.
Det mest kritiska steget i protokollet är dissektionssteget, för även ett litet misstag med dissektionssaxen kan skada nerven om tillräckligt med försiktighet inte vidtas. Hastigheten i detta skede är också viktig eftersom vävnaden snabbt måste extraheras från kroppen och placeras i en kyld buffert för att maximera livskraften i början av inspelningen. Efter vävnadsextraktion, medan försiktighet bör iakttas vid rengöring av nerven och implantering av elektroder, är protokollet mer flexibelt med avseende på tid, och risken för operatörsfel är därför lägre. Eftersom nervdiametrar och placering av fasciklar i nerverna kommer att variera från djur till djur, bör viss variation i resultat förväntas även om man använder samma elektroder och stimuleringsprotokoll. Effekten av denna variation kan ses i felstaplarna för stimuleringströsklar i figur 3. Det är viktigt att inte nypa nerven i något skede av preparatet eftersom detta kan orsaka irreversibel skada på vävnaden. Hantera nerven endast i ändarna med pincett och med stor omsorg för att inte dra nerven spänd.
Flera aspekter av protokollet i sin nuvarande form kan förbättras genom att öka mängden utrustning och installationstid. För att hjälpa till med diagnosen av potentiella problem med denna experimentella installation kan automatiserade mätningar av pH och upplöst syre i badet vara användbara men har inte implementerats här. Båda mätningarna kan uppnås med amperometriska eller potentiometriska metoder12,19. Utrustning som kräver regelbundet underhåll är slangar och glasvaror, som ackumulerar saltavlagringar över tiden. AgCl-inspelningskrokarna kräver också regelbunden ombeläggning eller byte, tillsammans med AgCl-referensen. Stimuleringselektroder bör rengöras efter varje användning men behöver i allmänhet inte bytas ut för många experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter.
UTTALANDE OM ÖPPEN TILLGÅNG:
För öppen åtkomst har författaren tillämpat en Creative Common Attribution (CC BY) -licens (där det är tillåtet enligt UKRI, 'Open Government License' eller 'Creative Commons Attribution No-derivatives (CC BY-ND) -licens kan anges istället) på alla författare accepterade manuskriptversioner som uppstår.
DELNING AV DATA:
De rådata som används i siffrorna i denna artikel kommer att göras tillgängliga av författarna, utan onödigt förbehåll.
Acknowledgments
Författarna erkänner Dr. Gerald Hunsberger från GlaxoSmithKline Pharmaceuticals, King of Prussia, PA, USA och Galvani Bioelectronics (Stevenage, Storbritannien) för att ha delat sin ursprungliga nervberedningsteknik med oss. Författarna erkänner Robert Toth för Dual-Chamber nervbaddesign. Författarna erkänner finansiering från Healthcare Technologies Challenge Awards (HTCA) -bidraget från Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC). Författarna erkänner High Performance Embedded and Distributed Systems Centre for Doctoral Training (HiPEDS CDT) vid Imperial College London för finansiering av Adrien Rapeaux (EP/L016796/1). Adrien Rapeaux finansieras för närvarande av UK Dementia Research Institute, Care Research and Technology Centre. Författarna erkänner tacksamt Zack Bailey från Imperial College, vid Institutionen för bioteknik, för hjälp med experiment och tillgång till djurvävnader under produktionen av JoVE-videoartikeln.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1595 | Borosilicate glass |
| 1 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | 612-3626 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1596 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | BRND937254 | Borosilicate glass |
| Adaptor, pneumatic, 8 mm to 1/4 NPT | RS UK | 536-2599 | push-to-fit straight adaptor between oxygen hose and gas dispersion tube |
| Alkoxy conformal coating | Farnell | 1971829 | ACC15 Alkoxy conformal coating for dissection petri dish preparation |
| Anesthetic | Chanelle | N/A | Isoflurane inhalation anesthetic, 250 mL bottle |
| Beaker, 2 L | VWR International Ltd | 213-0469 | Borosilicate glass |
| Bipolar nerve cuff | Cortec GMBH | N/A | 800 micron inner diameter, perpendicular lead out, no connector termination |
| Bossheads | N/A | N/A | Standard wet laboratory bossheads for attaching grippers to rods |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902-500g | 500 g in plastic bottle |
| Carbogen canister | BOC | N/A | F-size canister |
| Centrifuge Tubes, 15 mL volume | VWR International Ltd | 734-0451 | Falcon tubes |
| Conductive elastomer nerve cuff | N/A | N/A | high charge capacity nerve cuff for stimulation, see protocol for fabrication reference |
| Connector, Termimate | Mouser UK | 538-505073-1100-LP | These should be soldered to wire terminated with crocodile clips (see entry 11) |
| Crocodile clip connectors | RS UK | 212-1203 | These should be soldered to wire terminated with TermiMate connectors (see entry 10) |
| Deionized Water | N/A | N/A | Obtained from deionized water dispenser |
| Forceps angled 45 degrees | InterFocus Ltd | 91110-10 | Fine forceps, student range |
| Forceps standard Dumont #7 | InterFocus Ltd | 91197-00 | Student range forceps |
| Gas Disperson Tube, Porosity 3 | Merck | 12547866 | N/A |
| Glucose anhydrous, powder | VWR International Ltd | 101174Y | 500 g in plastic bottle |
| Grippers | N/A | N/A | Standard wet laboratory rod-mounted grippers |
| Heating Stirrer | RS UK | 768-9672 | Stuart US152 |
| Hemostats | N/A | N/A | Any hemostat >12 cm in length is suitable |
| Insect Pins, stainless steel, size 2 | InterFocus Ltd | 26001-45 | N/A |
| Laptop computer | N/A | N/A | Any laboratory-safe portable computer with at least 2 unused USB ports is suitable |
| Line Noise Filter | Digitimer | N/A | Humbug noise eliminator (50 Hz line noise filter) |
| Low-Noise Preamplifier, SR560 | Stanford Research Systems | SR560 | Low-noise voltage preamplifier |
| Magnesium Sulphate salt | VWR International Ltd | 291184P | 500g in plastic bottle |
| MATLAB scripts | Github | https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch | Initialization, calibration and stimulation scripts for the custom stimulator |
| MATLAB software | Mathworks | N/A | Standard package |
| Microscope Light, PL-2000 | Photonic | N/A | Light source with swan necks. Product may be obtained from third party supplier |
| Microscope, SMZ 745 | Nikon | SM745 | Stereoscopic Microscope |
| Mineral oil, non-toxic | VWR International Ltd | 31911.A1 | Oil for nerve bath |
| Nerve Bath | N/A | N/A | Plexiglas machined nerve bath, see protocol for details. |
| Oscilloscope | LeCroy | N/A | 434 Wavesurfer. Product may be obtained from 3rd party suppliers |
| Oxygen Hose, 1 meter | BOC | N/A | 1/4" NPT terminations |
| Oxygen Regulator | BOC | C106X/2B:3.5BAR-BS3-1/4"NPTF 230Bar | N/A |
| Peristaltic Pump P-1 | Pharmacia Biotech | N/A | Product may be obtained from third party supplier |
| Petri Dish, Glass | VWR International Ltd | 391-0580 | N/A |
| Potassium Chloride salt | Sigma Aldrich | P5405-250g | 250 g in plastic bottle |
| Potassium Dihydrogen Sulphate salt | Merck | 1.04873.0250 | 250 g in plastic bottle |
| Rat | Charles River Laboratories | N/A | Sprague Dawley, 250-330 grams, female |
| Reference electrode, ET072 | eDaQ (Australia) | ET072-1 | Silver silver-chloride reference electrode |
| Rod | N/A | N/A | Standard wet laboratory rods with fittings for stands |
| Scale | Sartorius | N/A | M-Power scale, for weighing powders. Product may be obtained from third-party suppliers |
| Scissors straight 12 cm edge | InterFocus Ltd | 91400-12 | blunt-blunt termination, student range |
| Signal Acquisition Device | Cambridge Electronic Design | Micro3-1401 | Micro3-1401 Multichannel ADC |
| Silicone grease, non-toxic | Farnell | 3821559 | for sealing of bath partition |
| Silicone tubing, 2 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silicone tubing, 5 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silver wire | Alfa Aesar | 41390 | 0.5 mm, annealed |
| Sodium Bicarbonate salt | Sigma Aldrich | S5761-500g | 500 g in plastic bottle |
| Sodium Chloride salt | VWR International Ltd | 27810.295 | 1 kg in plastic bottle |
| Spring scissors angled 2 mm edge | InterFocus Ltd | 15010-09 | N/A |
| Stand | N/A | N/A | Standard wet laboratory stands with sockets for rods |
| Stimulator | Digitimer | DS3 | DS3 or Custom Stimulator (see references) |
| Stirring flea | VWR International Ltd | 442-0270 | For use with the heating stirrer |
| Syringe tip, blunt, 1 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe tip, blunt, 2 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe, plastic, 10 mL volume | N/A | N/A | syringe should have luer lock fitting |
| Tape, water-resistant | N/A | N/A | For securing tubing and wiring to workbench |
| Thermometer | VWR International Ltd | 620-0806 | glass thermometer |
| USB Power Bank | RS UK | 135-1000 | Custom Stimulator power supply, fully charge before experiment. Not needed if using DS3 |
| Valve, Leuer Lock, 3-Way | VWR International Ltd | 229-7440 | For attaching syringe to bath feed tube and priming siphon |
References
- McIntyre, C. C., Richardson, A. G., Grill, W. M. Modeling the excitability of mammalian nerve fibers: Influence of afterpotentials on the recovery cycle. Journal of Neurophysiology. 87 (2), 995-1006 (2002).
- Pelot, N. A., Grill, W. M. In vivo quantification of excitation and kilohertz frequency block of the rat vagus nerve. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026005 (2020).
- Patel, Y. A., Kim, B. S., Rountree, W. S., Butera, R. J. Kilohertz electrical stimulation nerve conduction block: Effects of electrode surface area. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 25 (10), 1906-1916 (2017).
- Kortelainen, J., Al-Nashash, H., Vipin, A., Thow, X. Y., All, A. The effect of anaesthesia on somatosensory evoked potential measurement in a rat model. Laboratory Animals. 50 (1), 63-66 (2016).
- Oh, S. S., Hayes, J. M., Sims-Robinson, C., Sullivan, K. A., Feldman, E. L. The effects of anesthesia on measures of nerve conduction velocity in male C57Bl6/J mice. Neuroscience Letters. 483 (2), 127-131 (2010).
- Kuffler, S. W., Williams, E. M. V. Small-nerve junctional potentials. The distribution of small motor nerves to frog skeletal muscle, and the membrane characteristics of the fibres they innervate. The Journal of Physiology. 121 (2), 289-317 (1953).
- Brunton, E., Blau, C. W., Nazarpour, K. Separability of neural responses to standardised mechanical stimulation of limbs. Scientific Reports. 7 (1), 11138 (2017).
- Schmalbruch, H. Fiber composition of the rat sciatic nerve. The Anatomical Record. 215 (1), 71-81 (1986).
- Kagiava, A., Theophilidis, G. Assessing the permeability of the rat sciatic nerve epineural sheath against compounds with local anesthetic activity: an ex vivo electrophysiological study. Toxicology Mechanisms and Methods. 23 (8), 634-640 (2013).
- Motori, E., et al. Neuronal metabolic rewiring promotes resilience to neurodegeneration caused by mitochondrial dysfunction. Science Advances. 6 (35), 8271 (2020).
- Schwarz, J. R., Eikhof, G. Na currents and action potentials in rat myelinated nerve fibres at 20 and 37° C. Pflügers Archiv. 409 (6), 569-577 (1987).
- Cranefield, P. F., Brink, F., Bronk, D. W. The oxygen uptake of the peripheral nerve of the rat. Journal of Neurochemistry. 1 (3), 245-249 (1957).
- Lehmann, J. E. The effect of changes in pH on the action of mammalian A nerve fibers. American Journal of Physiology-Legacy Content. 118 (3), 600-612 (1937).
- Hamm, L. L., Nakhoul, N., Hering-Smith, K. S.
- Minasian, S. M., Galagudza, M. M., Dmitriev, Y. V., Kurapeev, D. I., Vlasov, T. D. Myocardial protection against global ischemia with Krebs-Henseleit buffer-based cardioplegic solution. Journal of Cardiothoracic Surgery. 8, 60 (2013).
- Bailey, L. E., Ong, S. D. Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations. Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).
- Miller, D. J. Sydney Ringer: physiological saline, calcium and the contraction of the heart. The Journal of Physiology. 555, Pt 3 585-587 (2004).
- Yamamoto, D., Suzuki, N., Miledi, R. Blockage of chloride channels by HEPES buffer). Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 230 (1258), 93-100 (1987).
- Janz, G. J., Taniguchi, H. The silver-silver halide electrodes. Preparation, stability, and standard potentials in aqueous and non-aqueous media. Chemical Reviews. 53 (3), 397-437 (1953).
- Rapeaux, A., Constandinou, T. G. An HFAC block-capable and module-extendable 4-channel stimulator for acute neurophysiology. Journal of Neural Engineering. 17 (4), 046013 (2020).
- Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch. Next Generation Neural Interfaces. , Available from: https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch> (2021).
- Cuttaz, E. A., Chapman, C. A. R., Syed, O., Goding, J. A., Stretchable Green, R. A. fully polymeric electrode arrays for peripheral nerve stimulation. Advanced Science. 8 (8), 2004033 (2021).
- Lossi, L., Merighi, A. The use of ex vivo rodent platforms in neuroscience translational research with attention to the 3Rs philosophy. Frontiers in Veterinary Science. 5, 164 (2018).
