Summary
이 프로토콜은 생체외 전기생리학적 자극을 위한 래트 전체 좌골 신경 조직의 제조를 기술하고, 환경적으로 조절된, 두 구획, 관류 식염수 욕조에서 기록한다.
Abstract
생체외 제제는 국소 조직 구조를 보존하면서 신체의 나머지 부분으로부터 격리된 많은 신경생리학적 과정의 연구를 가능하게 한다. 이 연구는 버퍼 준비, 동물 절차, 장비 설정 및 신경 생리 학적 기록을 포함하여 생체 외 신경 생리학을위한 쥐 좌골 신경의 준비를 설명합니다. 이 작업은이 방법으로 가능한 다양한 유형의 실험에 대한 개요를 제공합니다. 개요 된 방법은 결과의 최적 일관성을 위해 엄격하게 통제 된 조건에서 추출 된 말초 신경 조직에 6 시간의 자극 및 기록을 제공하는 것을 목표로합니다. 이 방법을 사용하여 얻은 결과는 실험의 전체 기간 동안 밀리볼트 범위의 피크 대 피크 진폭을 갖는 A-파이버 화합물 작용 전위(CAP)입니다. CAP 진폭과 모양은 일관되고 신뢰할 수 있으므로 새로운 전극을 기존 모델 또는 화학 물질의 사용, 외과 적 변경 또는 신경 조절 자극 기술의 사용과 같은 조직에 대한 개입의 영향을 테스트하고 비교하는 데 유용합니다. 백금-이리듐 접촉부를 갖는 기존의 상업적으로 이용가능한 커프 전극과 맞춤형 전도성 엘라스토머 전극 둘 다를 시험하였고, 신경 자극 강도-지속시간 반응의 관점에서 유사한 결과를 제공하였다.
Introduction
실리코에서 모델링된 바와 같은 근본적인 신경 기능에 대한 현재의 이해는 여러 측면에서, 특히 소마, 축삭돌기 및 덴드라이트의 외부 신경 조직 구획화의 효과와 관련하여 결여되어 있다. 축삭-미엘린 상호작용은 종래의 전기 자극 반응을 적절히 포착하는 MRG1(포유동물 신경에 대한)과 같은 상세한 계산 신경 모델조차도, 고주파 블록 이월오버2 또는 2차 발병 반응3과 같은 다른 실험적으로 관찰된 거동을 포착하지 못한다는 사실에 의해 입증된 바와 같이 여전히 잘 이해되지 않는다.
이 프로토콜은 표준화된 준비 프로토콜을 사용하여 신경을 분리하고, 그 환경을 제어하고, 생체내 맥락에서 생체외 맥락으로 이를 제거하기 위해 표준화된 준비 프로토콜을 사용하여 급성 소형 실험실 동물 모델에서 신경 수준에서 신경 생리학적 과정을 효율적으로 조사하는 방법을 제공한다. 이것은 신경 거동을 변경하고 측정 결과 또는 그들의 해석 4,5을 혼란스럽게하기 위해 생체 내 신경 자극 프로토콜에 의해 사용되는 다른 신체 과정 또는 마취제를 방지 할 것이다. 이를 통해 제대로 이해되지 않는 신경 조직에 특유한 효과에만 초점을 맞추는보다 현실적인 모델을 개발할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 새로운 신경 자극 및 기록 전극 재료 및 기하학뿐만 아니라 고주파 블록 2,3과 같은 새로운 자극 패러다임을 위한 테스트베드로도 유용하다. 이 기술의 변형은 이전에 엄격하게 조절된 조건6에서 신경 생리학을 연구하기 위해, 예를 들어, 이온 채널 역학 및 특성 또는 국소 마취제의 효과를 측정하기 위해 사용되었다7.
이 기술은 급성 생체내 작은 동물 실험(8)과 같은 대안에 비해 몇 가지 이점을 제공한다. 이 기술은 조직이 신체에서 추출됨에 따라 마취 깊이를 유지할 필요성을 없애고 마취 산광기, 산소 농축기 및 가열 패드와 같은 필요한 장비의 양을 줄입니다. 이를 통해 실험 프로토콜이 단순화되어 실수 위험이 줄어듭니다. 마취제가 잠재적으로 신경 기능4을 변화시킬 수 있기 때문에, 이 기술은 이러한 마취 화합물의 부작용에 의해 측정이 혼동되지 않도록 보장한다. 마지막으로,이 기술은 마비에 의해 마취 된 동물을 죽일 수있는 테트로도톡신과 같은 신경 독성 화합물의 효과를 연구 할 때 급성 생체 내 실험보다 더 적절합니다.
말초 신경 절편은 기록된 신경 신호를 담당하는 섬유가 어떠한 소마도 포함하지 않을 가능성이 높기 때문에 독특한 생체외 시스템이다. 이들은 일반적으로 운동 뉴런, 척추 및 척추 옆의 등쪽 뿌리 신경절의 감각 뉴런에 위치하기 때문에 포유류 신경의 한 부분의 준비는 양쪽 끝에서 열린 이온 채널이있는 관형 막의 집합체로 대략적으로 모델링 될 수 있습니다9. 신진대사는 조직 해부(10)시에 축삭돌기에 위치한 미토콘드리아에 의해 유지된다. axolemma의 열린 끝의 봉합은 추출 후 그들을 닫는 것이 권장되므로 정상적인 신경 기능에 필수적인 멤브레인 전체에 걸쳐 기존의 이온 구배를 유지하는 데 도움이됩니다.
신체 외부의 조직 항상성을 유지하려면 몇 가지 환경 변수를 엄격하게 통제해야합니다. 이들은 온도 11, 산소화12, 삼투압, pH13,14 및 신진 대사를 유지하기 위해 포도당에 대한 접근입니다. 이 프로토콜을 위해, 접근법은 산소와 이산화탄소의 혼합물로 연속적으로 폭기된 변형된 크렙스-헨셀릿 완충액15,16(mKHB)을 사용하는 것이다. mKHB는 예를 들어 생체외 실험에서 신체 외부의 해부된 조직을 보존하는데 사용되는 심흉막 완충액(6,17)의 패밀리에 있다. 이러한 완충제는 헤모글로빈, 항생제 또는 항진균제를 함유하지 않으며, 따라서 제한된 시간 동안 소량의 조직을 포함하는 제제에만 적합하다. pH 조절은 탄산염과 이산화탄소 산화 환원 쌍으로 달성되었으며, pH 평형을 유지하기 위해 이산화탄소로 완충액의 일정한 폭기가 필요했습니다. 이는 신경 세포 기능(18)을 변형시킬 수 있는 HEPES와 같은 다른 일반적인 완충제를 사용하는 것을 피하기 위함이다. 완충제를 산소화하고 pH 조절을 제공하기 위해, 카르보겐(95% O2, 5%CO2)이라고 불리는 산소 중의 5% 이산화탄소의 혼합물이 사용되었다. 완충 용기의 온도 조절을 위해 가열 교반기를 사용하고, 버퍼를 신경 배쓰를 통해 관류시킨 다음, 출발 용기로 재순환시켰다. 전형적인 실험은 신경이 생존력을 잃고 더 이상 건강한 조직을 대표하기위한 자극에 충분히 반응하지 않기 전에 6-8 시간 동안 지속됩니다.
신호-대-잡음비를 최적화하기 위해, 은-염화물 전극이 기록에 사용되었고, 이는 앞서 설명된 방법19에 따라 제조되었다. 자극을 위해, 상용 기성품 백금 커프 전극과 맞춤형 전도성 폴리머 커프 전극의 조합이 사용될 수 있다. 전도성 폴리머 커프 전극은 현저하게 더 높은 전하 용량을 가지며, 이는 높은 진폭 파형(20)을 사용하여 신경을 자극할 때 유용하다.
이 프로토콜에 사용된 자극기는 앞서 설명되었다(20). 이를 사용할 문서, 설계 파일 및 소프트웨어 스크립트는 공개적으로 입수가능하다(21). 이 프로토콜을 실행하기 위해 다른 자극기를 사용할 수 있습니다. 그러나 맞춤형 자극기는 고주파 대체 전류 (HFAC) 블록2,20을 사용할 수있어 더 넓은 범위의 신경 생리학 실험을 가능하게합니다. HFAC 블록을 사용하려면 신경 손상을 피하기 위해 전도성 엘라스토머 커프스를 사용하는 것이 좋습니다. 전도성 엘라스토머 신경 커프는 전도성 성분으로서 전도성 엘라스토머로부터 생산되고 절연체로서 폴리디메틸실록산(22)으로서 부드럽고 완전 폴리머 전극 어레이이다. 장치는 종래의 레이저 미세제조 기술을 사용하여 양극성 구성으로 제조되었다.
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Protocol
모든 동물 관리 및 절차는 동물 (과학 절차) 법 (1986)에 따라 영국 내무부에서 발행 한 적절한 라이센스에 따라 수행되었으며 임페리얼 칼리지 런던의 동물 복지 및 윤리 검토위원회의 승인을 받았습니다.
1. 완충액의 제조
참고: 프로토콜의 이 부분은 1x 농도에서 수정된 Krebs-Henseleit Buffer (mKHB)의 제조와 관련된 최종 단계를 제외하고는 나머지 프로토콜에 앞서 잘 수행될 수 있습니다.
- 1 MCaCl2 원액 준비
- 깨끗한 100 mL 비이커에CaCl2 이수화물 14.701 g을 첨가하십시오. ~ 75 mL의 탈이온수를 첨가하고 소금이 완전히 용해 될 때까지 저어줍니다.
- 용액을 100 mL 점진적 플라스크로 옮기고 100 mL 부피에 도달할 때까지 탈이온수를 첨가한다. 용액을 병에 옮기고 4 °C의 냉장고에 보관하십시오.
- 10x 농축 mKHB 재고 준비
- 66.03 g의 염화나트륨(NaCl), 3.57 g의 염화칼륨(KCl), 1.63 g의 인산이수소칼륨(KH2PO4) 및 1.44 g의 황산마그네슘을 2 L 비이커에 첨가한다.
- 비이커에 ~ 750 mL의 탈이온수를 넣고 염이 용해 될 때까지 저어줍니다 (바닥에 작은 소금 결정이 남아있을 수 있음). 25 mL의 1 MCaCl2 원액을 첨가하고(단계 1.1) 교반하는 단계; 이것이 마지막으로 첨가 된 소금인지 확인하십시오.
- 용액을 1 L 눈금 플라스크로 옮기고 탈이온수를 첨가하여 총 부피 1 L에 도달하고 용액을 1 L 병으로 옮긴다. 농축된 10x mKHB를 냉장고에 4°C에서 보관한다.
참고: 집중된 mKHB 재고는 교체하기 전에 약 1개월 동안 보관할 수 있습니다.
- 해부 페트리 접시 준비 (코팅)
- 깨끗한 유리 페트리 접시 (직경 120 mm)를 조심스럽게 세척하고 건조시켜 코팅을 준비하십시오.
- 컨포멀 알콕시 코팅의 사용 및 경화에 대한 제조업체의 지침에 따라 원하는 두께에 도달 할 때까지 등각 코팅 혼합물을 조심스럽게 접시에 부어 페트리 접시의 바닥을 ~ 3-5mm의 코팅으로 코팅하십시오.
- 코팅을 터치에 단단해질 때까지 60°C의 오븐에서 경화시킨다. 해부 페트리 요리가 준비되었습니다.
참고 : 각 사용 후 접시를 부드럽게 청소하면 교체가 필요하기 전에 코팅이 수년간 지속되도록합니다. 코팅을 교체 할 때 새 코팅을 적용하기 전에 모든 코팅 물질을 제거해야합니다. 이 프로토콜에 사용된 등각 알콕시 코팅(Table of Materials)은 일년보다 짧은 저장 수명을 갖는다는 점에 유의한다.
2. 해부 전 준비
참고: 이 단계는 실험을 시작합니다. 아래 단계는 같은 날에이 순서로 수행되어야합니다.
- 1x mKHB 준비
- 완충제를 위해 깨끗한 2 L 비이커를 준비하십시오. 200 mL의 10x mKHB 스톡을 2 L 비이커로 옮깁니다. 2.1 g의 탄산나트륨(NaHCO3) 및 0.99 g의 무수 덱스트로스(D-글루코스)를 2 L 비이커에 첨가한다.
- 비이커에 약 1L의 탈이온수를 첨가한다. 소금이 완전히 용해 될 때까지 저어줍니다. 용액을 2 L 눈금 플라스크로 옮기고 탈이온수를 첨가하여 총 부피가 2 L에 이른다.
- 용액을 37°C로 설정된 온도로 가열 교반기 상에 놓인 2 L 유리 병으로 옮긴다.
참고 : 더 작은 가열 교반기는 종종 물로 가득 찬 큰 용기의 열 관성으로 인해 목표 37 ° C 온도에 도달 할 수 없습니다. 교반하면서 병의 내용물이 37 °C에 도달하도록 온도를 위쪽으로 조정하십시오. 실험 중 온도를 모니터링하고 오버슛 시 설정 온도를 낮춥니다. - 온도계를 2L 병에 넣고 온도를 모니터링하고, 그리퍼를 사용하여 온도계가 교반 벼룩에 의해 영향을 받지 않도록 합니다. 완충액을 최소 30분 동안 카르보겐으로 통기시켜 용액을 산소화시킨다. 이것은 pH를 7.4로 설정한다. pH를 측정기로 측정하여 7.4의 0.1 pH 단위 (37°C에서) 내에 있는지 확인하십시오.
참고: pH를 7.4로 조정하려면 필요할 때 염산 또는 수산화나트륨을 사용하십시오. - 두 개의 15 mL 원심분리 튜브와 100 mL 병을 mKHB로 채우고 얼음 위에 올려 놓고 식히십시오.
참고 : 원심 분리 튜브와 병은 오토 클레이빙없이 각 실험 후에 청소하고 재사용 할 수 있습니다. - 실험의 후기 부분을 위해, 연속 교반으로 37°C에서 카르보겐으로 2 L 병 내의 완충액을 계속 통기시킨다.
주: 카보겐의 감독되지 않은 사용은 누출 시 가스 흐름을 차단하는 자동 시스템이 없는 경우 위험할 수 있습니다. 자동화 된 센서 및 전자 차단 밸브가이를 완화 할 수 있습니다. 그렇지 않으면 해부가 다른 방에서 발생하는 경우 장비를 감독하기 위해 사람을 남겨 두어야합니다. 모든 경우에 산소 센서를 설정 근처에 사용하여 주변 산소 농도가 25% 이상으로 상승할 때 작업자에게 경고해야 합니다. 가능하면 능동적 인 환기가있는 방을 사용하십시오.
- 신호 수집 장치, 저잡음 전치 증폭기, 라인 노이즈 필터 및 오실로스코프를 켜서 기록 및 자극을 받아 온도 안정화에 충분한 시간을 허용합니다.
- 모든 전기 기록 장비가 올바르게 구성되었는지 확인하십시오.
- 저잡음 프리앰프를 AC 커플링 입력으로 설정하고, 입력 대역 통과 필터를 10년당 6dB 롤오프로 설정하고, 하이 패스 및 저역 통과 필터의 경우 컷오프 주파수를 각각 30Hz 및 3kHz로 설정합니다.
- 저잡음 전치 증폭기의 이득을 100으로 설정합니다.
3. 동물 마취 및 안락사
주: 250 내지 330 g 사이의 암컷 래트(표 자료)를 연구에 사용하였다.
- 수술 도구와 소모품 준비 : 12cm 직선 가위 (무딘); 2mm 절삭 에지 각진 스프링 가위; 4cm 미세 가위, 날카 롭거나 반 날카로운; #7 듀몬트 포셉; 45 ° 각도의 미세 포셉과 6-0 봉합 실크 또는 실.
- 쥐를 마취 용기 또는 챔버에 넣으십시오. 산소와 마취 디퓨저를 용기에 연결하십시오. 마취제 (이소플루란) 농도를 3.5 %로 설정하고 약 10 분 동안 또는 동물이 우뢰 반사 상실과 같은 마취 징후를 보일 때까지 기다리십시오.
- 쥐가 마취의 징후를 보인 후, 발가락 꼬집음 금단 반사 검사로 의식 상실을 확인하십시오. 발가락 철수가없는 경우에만 진행하십시오. 그렇지 않으면 디퓨저의 모든 연결 및 마취 수준을 확인하고 3.2 단계를 반복하십시오.
- 동물을 용기에서 꺼내어 자궁 경부 탈구를 진행한 다음 사망 확인을 위해 대퇴골 동맥을 절개하십시오.
4. 해부 프로토콜
참고 : 배꼽이있는 동물을 해부 테이블 위에 놓습니다. 두 다리에 대해 다음 단계를 반복합니다. 일반적으로 오른쪽 다리가 먼저 해부됩니다.
- 엄지, 검지 손가락 및 가운데 손가락 사이에 발목을 단단히 잡고 12cm 직선 무딘 가위를 사용하여 종아리 힘줄을 절단하십시오.
- 미세한 날카로운 가위로 다리 뒤쪽의 종아리 힘줄에서 척추 바닥까지 피부를 절개하여 아래의 근육 조직을 해부하지 않도록주의하십시오.
- 미세한 포셉과 미세한 가위를 사용하여 좌골 신경이 노출 될 때까지 다리 뒤쪽 중간 근처의 근육층을 조심스럽게 절개하십시오. 좌골 신경이 보이 자마자 신경이 건조하지 않도록 얼음처럼 차가운 mKHB를 사용하여 공동에 수분을 공급하십시오.
- 지혈제를 사용하여 양쪽의 피부 플랩을 당기고 절개를 열어 두어 더 미세한 해부 작업을 수행하십시오. 종아리 힘줄 절개 위치에서 시작하여 미세한 가위로 다리의 내측 측의 근육을 방해하여 신경을 풀어줍니다. 얼음처럼 차가운 mKHB로 지역의 수분 수준을 계속 유지하십시오.
- 다리를 위로 움직이는 동안 신경이 노출되면 위에 놓인 근육 조직을 해부하십시오. 척추에 더 가까운 신경을 결합 조직에서 풀어 척추 구개열에 도달 할 때까지 신경에 꼬임이있는 지점에 도달하십시오. 이 단계에서 속도가 필수적이므로 아직 신경을 청소하려고 시도하지 마십시오.
- 미세한 가위로 가능한 한 척추에 가깝게 신경을 절단하십시오. 해부를 쉽게하려면 포셉을 사용하여 발목 근처의 신경 끝을 매우 부드럽게 당깁니다. 중간에 신경을 꼬집지 말고 끝 만 꼬집습니다. 신경 소동을 당기지 마십시오.
선택 사항 :이 시점에서 시간이 허락하면 신경의 양쪽 끝을 봉합하여 생존력을 유지할 수 있습니다. 손상을 방지하기 위해 취급을 최소한으로 유지하십시오. 시간이 충분하지 않은 경우(4.5단계 참조) 이 단계를 건너뛰고 나중에 5.2단계를 수행합니다. - 해부된 신경을 mKHB로 채워진 15 mL 원심분리 튜브에 넣고(단계 2.1.5), 튜브를 닫고, 세척 절차가 시작될 때까지 튜브를 다시 얼음 위에 놓는다.
- 다른 다리에 대해 4.1-4.7단계를 반복합니다. 이상적으로, 각 신경은 조직 생존력을 극대화하기 위해 추출하는 데 5-10 분이 걸립니다.
5. 신경 청소 절차
- 코팅 된 페트리 접시를 차가운 산소화 된 mKHB로 대략 반쯤 채 웁니다. 해부 된 좌골 신경 중 하나를 접시에 넣고 신경의 양쪽 끝을 접시에 고정하여 신경이 꼬임, 비틀림 또는 비틀림없이 똑바로 보이도록하십시오. 신경을 가능한 한 끝에 가깝게 고정시킵니다.
- 6-0 실크 봉합사 또는 미세 실을 사용하여 신경의 양쪽 끝 주위에 이중 매듭을 묶어 시토졸이 버퍼로 누출되는 것을 방지합니다. 매듭을 곤충 핀 바로 옆에 놓으면 신경 중심에 더 가깝게 배치하면 신경 조직에서 버퍼로 누출되는 것을 방지 할 수 있습니다. 신경이 이전에 결찰 된 경우이 단계를 수행하지 마십시오.
- 정밀 현미경과 2mm 각도의 스프링 가위를 사용하여 신경에서 지방, 혈관 및 근육 조직을 제거합니다. 자극 및 기록 프로토콜에 사용되지 않을 신경 가지를 가지치십시오.
- 청소 5 분마다 버퍼를 신선한 냉장 산소화 mKHB로 교체하십시오. 미세한 포셉을 사용하여 결합 조직, 지방 및 혈관을 당겨 해부를 용이하게하십시오.
- 신경을 신선한 산소화 냉장 mKHB로 채워진 수송 튜브에 다시 넣고 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
6. 장비 설정
참고: 실험을 수행하는 데 사용되는 장비 설정은 그림 1에 설명되어 있습니다. 간략하게, 그것은 이중 구획 신경 욕조, 가열 교반기에 놓인 2 L 병, 완충 폭기를위한 탄수화물의 공급원, 그리고 완충액이 병에서 욕조로 흐를 수 있도록하는 튜빙, 그리고 연동 펌프를 사용하여 병으로 다시 구성됩니다. 욕조는 플렉시 글라스로 가공하거나 방수 재료로 3D 인쇄 할 수 있습니다. 그것은 약 2cm의 깊이를 가지고 있으며, 욕조의 두 챔버를 분리하는 파티션은 두 챔버 모두에서 말초 신경의 나사 결합을 허용하는 직경 1.5mm 구멍을 특징으로합니다. 하나의 챔버는 크고 길이가 4 또는 5cm 이상이어야하며 버퍼로 채워집니다. 다른 챔버는 길이가 3cm 이상이어야하며 실리콘 또는 미네랄 오일로 채워집니다. 욕조는 관류, 온도 및 pH의 제어를 저하시킬 수 있으므로 너무 크게 만들어서는 안됩니다. 연구되는 신경 조직의 크기에 따라 다른 목욕 크기가 필요할 수 있습니다.
- 깨끗한 이중 챔버 신경 욕조를 준비하십시오 (설계 사양은 보충 파일 참조). 표준 실험실 보스 헤드와 그리퍼를 사용하여 가열 교반기에 놓인 2L 병 수준 아래에 신경 욕조를 놓습니다. 욕조의 배수구를 연동 펌프 입구에 연결하십시오.
- 연동 펌프의 출구를 2 L 버퍼 병으로 이어지는 튜브에 연결하십시오. 욕조 입구를 조절 가능한 유량 밸브가있는 튜브에 연결하고 튜브를 2L 병 안에 넣으십시오. 중간 출구에 연결된 주사기가있는 삼방 밸브를 사용하여 중력 보조 버퍼 유입을위한 사이펀으로 튜브를 프라이밍하는 데 도움을줍니다.
- 버퍼가 그 안으로 흐를 때까지 주사기를 그려서 사이펀을 프라임합니다. 욕조에 들어가는 버퍼의 유량이 ~ 5-6 mL·min-1이 되도록 밸브를 구성하십시오. 목욕을 채우기 위해 초기에 흐름을 늘릴 수 있습니다. 목욕 완충 수준이 배수구에 도달하면 신경을 욕조에 넣으십시오.
- 곤충 핀을 사용하여 버퍼가 채워진 욕조 챔버의 모서리에 신경의 끝을 고정하십시오. 45 ° 각도의 미세 포셉을 사용하고 끝에서만 신경을 꼬집고 두 목욕 챔버 사이의 파티션에있는 구멍을 통해 자극받을 신경을 조심스럽게 실을 꿰매십시오.
- 곤충 핀으로 욕조의 오일 챔버에 신경의 다른 쪽 끝을 고정시켜 신경이 늘어나지 않고 똑바로 펴지고 꼬임과 비틀림이 없도록하십시오. 실리콘 그리스를 사용하여 버퍼 챔버에서 오일 챔버로 버퍼 누출을 방지하기 위해 씰을 만듭니다. 오일 챔버를 실리콘 또는 미네랄 오일로 채 웁니다.
- Ag/AgCl 레코딩 전극 후크를 오일 배스 챔버에 놓고 보스 헤드와 그리퍼를 사용하여 고정합니다. 기름 욕조에서 신경의 일부를 후크 위로 떨어 뜨리지 않고 신경 taut을 당기지 마십시오. 신경을 꼬집지 마십시오; 각진 포셉을 사용하여 꼬집지 않고 신경을 들어 올립니다.
- 신경을 이동시킨 후 누출이 관찰되는 경우 실리콘 그리스 씰을 조정하거나 수리하십시오.
- 기준 Ag/AgCl 전극을 증폭기 접지에 연결하고 실험실 그리퍼를 사용하여 전극을 고정하여 버퍼가 채워진 욕조 챔버에 배치합니다.
7. 욕조에서 신경에 전극 이식
- 기준21에 따라 자극을 위한 클린 신경 커프 전극을 준비한다. 전극을 버퍼 충전된 배스 챔버 내에 놓는다. 무딘 팁이나 각진 팁이있는 포셉 또는 미세한 핀셋을 사용하여 욕조에서 전극을 열어 커프 내부를 적시십시오.
- 거품이 남아 있으면 미세한 주사기를 사용하여 욕조에서 버퍼를 뽑아 커프에서 거품을 강제로 꺼냅니다. 신경 아래에 핀셋을 넣고 부드럽게 커프를 열고 신경 아래로 밀어 넣으십시오. 신경 주위의 커프를 닫고 신경의 꼬임이나 비틀림을 피하십시오.
- 자극 전극을 자극기에 연결하고 테이프로 자극 전극 리드를 고정하십시오. 전류 복귀 전극을 자극기에 연결하고 리드를 테이프로 고정하십시오. 사각형 백금 시트를 전류 복귀 전극으로 사용하는 경우, 시트를 욕조의 신경에서 멀리 떨어 뜨립니다.
8. 자극 및 기록
- 자극기 TTL 신호 출력을 오실로스코프의 채널 4에 연결하면 오실로스코프를 트리거하는 데 사용됩니다. 오실로스코프 화면에서 트리거 채널 탭을 누르고 채널 4를 트리거 채널로 지정합니다. 레벨 노브를 사용하여 트리거 레벨 을 1V로 설정합니다.
- 오실로스코프에서 시간 분해능을 1ms/분할로, 전압 분해능을 10mV/분할로 설정합니다. 트리거 참조를 제 시간에 집중시키고 트리거 레벨을 1V로 설정합니다.
참고: 사용자 지정 자극기를 사용하는 경우 8.3~8.6단계를 수행합니다( 자료 표 참조). MATLAB 소프트웨어 및 장치 드라이버가 사용자 지정 신경 자극기(21)를 위해 온라인으로 자유롭게 제공되는 명령을 사용하여 실험실 컴퓨터에 설치되었다고 가정한다. 그렇지 않으면 상업적으로 이용 가능한 자극기를 대안으로 사용하기 위해 제조업체의 지침을 따르십시오. - 자극기를 실험실 컴퓨터에 연결합니다. 배터리 전원 공급 장치를 전원 입력에 연결하여 자극기를 켭니다. 실험실 컴퓨터에서 MATLAB 소프트웨어를 시작합니다.
- 사용자 지정 MATLAB 스크립트 인 HFAC_4ch_Stimulator_Initialization.m (재료 테이블)을 실행합니다.
주: 컴퓨터와 자극기 사이의 USB 통신 케이블이 녹색으로 깜박입니다. 그렇지 않으면 구성 오류가 발생하고 전원 공급 장치 및 연결을 확인해야 합니다. - MATLAB 스크립트를 엽니다: HFAC_4ch_Monophasic_Stimulation.m (재료 테이블). MATLAB 스크립트를 직접 편집하여 다음과 같은 파라미터를 설정합니다: 자극기 펄스 진폭 = -300 μA, 자극기 펄스 폭 = 300 μs, 자극기 펄스 수 = 10 및 펄스 사이의 자극기 시간 = 1 초.
- MATLAB 소프트웨어에서 실행 을 클릭하여 자극 프로토콜을 시작합니다.
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Representative Results
이 프로토콜로 얻을 수 있는 대표적인 결과는 좌골 신경 내의 A형 신경 섬유로부터의 일관된 복합 작용 전위이다. 이러한 작용 전위는 일반적으로 전극에서 약 1mV의 피크 대 피크 진폭을 가지며 따라서 증폭되면 100mV입니다(그림 2). 유사한 자극 진폭과 펄스 폭은 유사한 CAP 진폭을 산출해야 한다. 전도성 엘라스토머 커프 전극은 일반적으로 상업적으로 이용가능한 백금 커프 전극에 비해 동일한 CAP 진폭을 얻기 위해 약간 더 높은 자극 진폭을 필요로 할 것이다. 이러한 차이는 일반적으로 다른 동물로부터 오는 신경을 자극하는 데 필요한 자극 진폭의 변화와 비교하여 작다. 이는 신경 크기와 커프 핏의 작은 차이가 커프 재료에 관계없이 특정 CAP 진폭을 얻기 위해 필요한 자극 진폭에 큰 영향을 미치기 때문입니다. 이는 상이한 완충액 조성물, 예컨대 상이한 이온 농도 또는 테트로도톡신과 같은 신경 흥분성 또는 억제 물질의 첨가와 같은 효과를 시험하는데 사용될 수 있다. 완충 폐기물 파이프가 여분의 용기로 라우팅되는 경우, 신경 흥분성 변화 물질의 첨가는 완충액 유입 속도에 따라 세척 속도로 실험을 위해 일시적으로 이루어질 수 있습니다.
자극 진폭을 자극 전극의 표면적으로 나눈 값으로서 계산된 최소 전류 밀도를, A형 섬유를 활성화시키고 오실로스코프의 관찰 가능한 화합물 작용 전위를 얻기 위해 필요한 최소 전류 밀도를 도 3에 플롯팅하였다. 도 3 에 도시된 결과는 상업적으로 이용가능한 표준 백금 신경 커프와 맞춤형 전도성 엘라스토머 신경 커프 둘 다에 대한 전형적인 신경 흥분성을 나타낸다.
추출 된 신경은 추출 후 약 6 시간 동안 생존 할 수 있어야하며, 따라서 실험은이 시간 창 내에 적합해야합니다. 신경 생존력의 상실은 CAP 진폭과 전도 속도의 점진적인 감소로 이어진다. 행동 전위 진폭이 초기 진폭의 50 % 미만으로 감소 한 후 (기록 시작시), 결과가 크게 왜곡 될 것이므로 신경은 더 이상 실행 가능하지 않은 것으로 간주되어야합니다. 신경 수명에 대한 대표적인 결과는 도 4에 나타내었다. 오른쪽 및 왼쪽 좌골 신경은 주어진 날 오전 10:00에서 오전 11:00 사이에 한 동물로부터 추출되었습니다. 초기 CAP는 실험 전 초기 테스트 중에 오른쪽 좌골 신경에서 얻어졌으며 표준 CAP는 실험이 끝날 때이 프로토콜을 사용하여 살아 있던 왼쪽 및 오른쪽 좌골 신경에서 얻어졌습니다. 최소 CAP 진폭 감소는 우측 좌골 신경에서 관찰된 반면, 약 3 mV에서의 좌측 좌골 신경 CAP 진폭은 신경 추출 후 6 h 이상 실험 시작시 우측 좌골 신경의 진폭과 유사하였다.
그림 1: 프로토콜에 사용된 실험 설정의 개략적인 표현. 이 수치는 Rapeaux, A. et al. (2020) 20에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 금속 및 전도성 엘라스토머 신경 커프 어레이에 의한 자극 후 생체외 에서 얻어진 대표적인 CAPs. Cuttaz, E. A. et al. (2021) 22의 수정으로 재현되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 금속 및 전도성 엘라스토머 커프 어레이의 A-파이버 활성화 임계값. 오차 막대는 평균에서 ±1 표준 편차를 나타냅니다. Cuttaz, E. A. et al. (2021) 22의 수정으로 재현되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 한 동물로부터 양쪽 좌골 신경을 사용하여 하루 동안 생체외 에서 얻은 대표적인 CAPs . (A) 우측 좌골 신경으로부터 정오 부근에 수득된 A형 섬유 CAP. (b) 좌골신경으로부터 오후 중반에 수득된 A형 섬유 CAP. (c) (B)에서 동일한 좌좌좌신경을 이용한 실험 말기에 얻어진 A형 섬유CAP. x축은 녹음이 수행된 시간에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 연구에서, 우리는 생체외 신경 생리학을 위해 쥐 좌골 신경을 준비하기위한 프로토콜을 기술했다. 조직 추출은 동물 취급, 마취, 도태 및 해부를 포함하여 약 30 분이 소요되며, 신경 청소, 욕조 배치 및 전극 이식은 녹음을 시작하기 전에 추가 30 분이 필요합니다. 완충액 준비는 30 분 안에 수행 할 수 있지만 나머지 실험보다 앞서 수행 할 수 있습니다. 이러한 유형의 준비 및 실험은 과거 7,12에서 동일한 조직 유형에 대해 유사한 완충액을 사용하여 사용 및 기술되었습니다. 그러나 저자의 지식에 따르면, 버퍼 준비, 해부, 장비 설정 및 후속 기록에 대한 설명이 동일한 문서에 제공된 것은 이번이 처음입니다.
이 프로토콜은 시험관 내 또는 생체내 맥락에서 가능하지 않을 신경생리학에서 매우 다양한 실험을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 생체외 제제의 장점은 추출된 조직의 매크로 및 미세 구조를 보존하면서 이러한 조직을 신체의 나머지 부분으로부터 격리한다는 것이다. 이것은 마취가 유지될 필요가 없기 때문에 더 간단한 셋업을 초래하며, 이는 그렇지 않으면 생체내 실험에서 요구된다. 실험을 가능하게 하는 측면에서, 생체 외 제제는 테트로도톡신과 같은 물질의 사용을 허용하는데, 이는 동물에 대한 높은 위험을 지니고 있기 때문에 생체내 맥락(23 )에서 정당화하기 어렵다. 이러한 물질의 사용이 조사에 도움이 될 때, 그들은 생체 외 제제에서 사용하기가 더 쉽습니다. 커스텀 자극기(20 )의 사용은 이러한 실험 셋업을 사용하여 신경조절을 위해 HFAC 블록을 사용하는 실험을 가능하게 한다.
프로토콜에서 가장 중요한 단계는 해부 단계인데, 해부 가위를 사용하는 작은 실수조차도 충분한주의를 기울이지 않으면 신경을 손상시킬 수 있기 때문입니다. 이 단계의 속도는 조직이 신체에서 신속하게 추출되고 기록 시작시 생존력을 극대화하기 위해 차가운 버퍼에 넣어야하기 때문에 필수적입니다. 조직 추출 후, 신경을 청소하고 전극을 이식 할 때는주의를 기울여야하지만, 프로토콜은 시간에 대해보다 유연하며 따라서 작업자 오류의 위험이 낮아집니다. 신경 직경과 신경 내의 근막의 배치는 동물마다 다르기 때문에 동일한 전극 및 자극 프로토콜을 사용하더라도 결과의 일부 변동성이 예상되어야합니다. 이러한 가변성의 효과는 도 3의 자극 역치에 대한 오차 막대에서 볼 수 있다. 준비의 어떤 단계에서도 신경을 꼬집지 않는 것이 중요합니다.이 단계는 조직에 돌이킬 수없는 손상을 일으킬 수 있기 때문입니다. 포셉을 사용하여 끝까지만 신경을 다루고, 신경을 당기지 않도록 세심한주의를 기울이십시오.
현재 형태의 프로토콜의 여러 측면은 장비의 양과 설정 시간을 늘려 개선 할 수 있습니다. 이 실험 설정의 잠재적 인 문제를 진단하는 데 도움이되도록 욕조의 pH 및 용존 산소에 대한 자동 측정이 유용 할 수 있지만 여기서는 구현되지 않았습니다. 두 측정 모두 양수법 또는 전위차계 방법(12,19)을 사용하여 달성될 수 있다. 정기적 인 유지 보수가 필요한 장비는 시간이 지남에 따라 소금 침전물을 축적하는 튜브 및 유리 제품입니다. AgCl 기록 후크는 또한 AgCl 참조와 함께 정기적 인 재 코팅 또는 교체가 필요합니다. 자극 전극은 각 사용 후에 세척되어야 하지만 일반적으로 많은 실험을 위해 교체할 필요가 없을 것이다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없습니다.
오픈 액세스 문:
오픈 액세스를 위해 저자는 크리에이티브 공통 저작자 표시 (CC BY) 라이센스 (UKRI가 허용하는 경우, '공개 정부 라이센스'또는 '크리에이티브 커먼즈 저작자 표시 번호 파생 상품 (CC BY-ND) 라이센스가 대신 명시 될 수 있음)를 저자 수락 원고 버전에 적용했습니다.
데이터 공유:
이 기사의 그림에 사용 된 원시 데이터는 저자가 과도한 예약없이 사용할 수 있습니다.
Acknowledgments
저자들은 GlaxoSmithKline Pharmaceuticals의 Gerald Hunsberger 박사, King of Prussia, PA, USA, Galvani Bioelectronics (Stevenage, UK)가 원래의 신경 준비 기술을 우리와 공유했음을 인정합니다. 저자들은 Robert Toth가 Dual-Chamber 신경 목욕 디자인을 인정했습니다. 저자들은 EPSRC (Engineering and Physical Sciences Research Council)의 HTCA(Healthcare Technologies Challenge Awards) 보조금의 자금을 인정합니다. 저자들은 Adrien Rapeaux (EP / L016796 / 1)에 자금을 지원하기 위해 Imperial College London의 고성능 임베디드 및 분산 시스템 센터 (HiPEDS CDT)를 인정합니다. Adrien Rapeaux는 현재 영국 치매 연구소, 케어 연구 및 기술 센터에서 자금을 지원하고 있습니다. 저자들은 JoVE 비디오 기사를 제작하는 동안 실험과 동물 조직에 대한 접근에 대한 도움을 얻기 위해 생명 공학과에있는 임페리얼 칼리지의 잭 베일리 (Zack Bailey)를 감사하게 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1595 | Borosilicate glass |
| 1 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | 612-3626 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1596 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | BRND937254 | Borosilicate glass |
| Adaptor, pneumatic, 8 mm to 1/4 NPT | RS UK | 536-2599 | push-to-fit straight adaptor between oxygen hose and gas dispersion tube |
| Alkoxy conformal coating | Farnell | 1971829 | ACC15 Alkoxy conformal coating for dissection petri dish preparation |
| Anesthetic | Chanelle | N/A | Isoflurane inhalation anesthetic, 250 mL bottle |
| Beaker, 2 L | VWR International Ltd | 213-0469 | Borosilicate glass |
| Bipolar nerve cuff | Cortec GMBH | N/A | 800 micron inner diameter, perpendicular lead out, no connector termination |
| Bossheads | N/A | N/A | Standard wet laboratory bossheads for attaching grippers to rods |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902-500g | 500 g in plastic bottle |
| Carbogen canister | BOC | N/A | F-size canister |
| Centrifuge Tubes, 15 mL volume | VWR International Ltd | 734-0451 | Falcon tubes |
| Conductive elastomer nerve cuff | N/A | N/A | high charge capacity nerve cuff for stimulation, see protocol for fabrication reference |
| Connector, Termimate | Mouser UK | 538-505073-1100-LP | These should be soldered to wire terminated with crocodile clips (see entry 11) |
| Crocodile clip connectors | RS UK | 212-1203 | These should be soldered to wire terminated with TermiMate connectors (see entry 10) |
| Deionized Water | N/A | N/A | Obtained from deionized water dispenser |
| Forceps angled 45 degrees | InterFocus Ltd | 91110-10 | Fine forceps, student range |
| Forceps standard Dumont #7 | InterFocus Ltd | 91197-00 | Student range forceps |
| Gas Disperson Tube, Porosity 3 | Merck | 12547866 | N/A |
| Glucose anhydrous, powder | VWR International Ltd | 101174Y | 500 g in plastic bottle |
| Grippers | N/A | N/A | Standard wet laboratory rod-mounted grippers |
| Heating Stirrer | RS UK | 768-9672 | Stuart US152 |
| Hemostats | N/A | N/A | Any hemostat >12 cm in length is suitable |
| Insect Pins, stainless steel, size 2 | InterFocus Ltd | 26001-45 | N/A |
| Laptop computer | N/A | N/A | Any laboratory-safe portable computer with at least 2 unused USB ports is suitable |
| Line Noise Filter | Digitimer | N/A | Humbug noise eliminator (50 Hz line noise filter) |
| Low-Noise Preamplifier, SR560 | Stanford Research Systems | SR560 | Low-noise voltage preamplifier |
| Magnesium Sulphate salt | VWR International Ltd | 291184P | 500g in plastic bottle |
| MATLAB scripts | Github | https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch | Initialization, calibration and stimulation scripts for the custom stimulator |
| MATLAB software | Mathworks | N/A | Standard package |
| Microscope Light, PL-2000 | Photonic | N/A | Light source with swan necks. Product may be obtained from third party supplier |
| Microscope, SMZ 745 | Nikon | SM745 | Stereoscopic Microscope |
| Mineral oil, non-toxic | VWR International Ltd | 31911.A1 | Oil for nerve bath |
| Nerve Bath | N/A | N/A | Plexiglas machined nerve bath, see protocol for details. |
| Oscilloscope | LeCroy | N/A | 434 Wavesurfer. Product may be obtained from 3rd party suppliers |
| Oxygen Hose, 1 meter | BOC | N/A | 1/4" NPT terminations |
| Oxygen Regulator | BOC | C106X/2B:3.5BAR-BS3-1/4"NPTF 230Bar | N/A |
| Peristaltic Pump P-1 | Pharmacia Biotech | N/A | Product may be obtained from third party supplier |
| Petri Dish, Glass | VWR International Ltd | 391-0580 | N/A |
| Potassium Chloride salt | Sigma Aldrich | P5405-250g | 250 g in plastic bottle |
| Potassium Dihydrogen Sulphate salt | Merck | 1.04873.0250 | 250 g in plastic bottle |
| Rat | Charles River Laboratories | N/A | Sprague Dawley, 250-330 grams, female |
| Reference electrode, ET072 | eDaQ (Australia) | ET072-1 | Silver silver-chloride reference electrode |
| Rod | N/A | N/A | Standard wet laboratory rods with fittings for stands |
| Scale | Sartorius | N/A | M-Power scale, for weighing powders. Product may be obtained from third-party suppliers |
| Scissors straight 12 cm edge | InterFocus Ltd | 91400-12 | blunt-blunt termination, student range |
| Signal Acquisition Device | Cambridge Electronic Design | Micro3-1401 | Micro3-1401 Multichannel ADC |
| Silicone grease, non-toxic | Farnell | 3821559 | for sealing of bath partition |
| Silicone tubing, 2 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silicone tubing, 5 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silver wire | Alfa Aesar | 41390 | 0.5 mm, annealed |
| Sodium Bicarbonate salt | Sigma Aldrich | S5761-500g | 500 g in plastic bottle |
| Sodium Chloride salt | VWR International Ltd | 27810.295 | 1 kg in plastic bottle |
| Spring scissors angled 2 mm edge | InterFocus Ltd | 15010-09 | N/A |
| Stand | N/A | N/A | Standard wet laboratory stands with sockets for rods |
| Stimulator | Digitimer | DS3 | DS3 or Custom Stimulator (see references) |
| Stirring flea | VWR International Ltd | 442-0270 | For use with the heating stirrer |
| Syringe tip, blunt, 1 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe tip, blunt, 2 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe, plastic, 10 mL volume | N/A | N/A | syringe should have luer lock fitting |
| Tape, water-resistant | N/A | N/A | For securing tubing and wiring to workbench |
| Thermometer | VWR International Ltd | 620-0806 | glass thermometer |
| USB Power Bank | RS UK | 135-1000 | Custom Stimulator power supply, fully charge before experiment. Not needed if using DS3 |
| Valve, Leuer Lock, 3-Way | VWR International Ltd | 229-7440 | For attaching syringe to bath feed tube and priming siphon |
References
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