Summary
Denne protokol beskriver fremstillingen af hele iskiasnervevæv hos rotter til ex vivo elektrofysiologisk stimulering og registrering i et miljøreguleret, to-rums perfunderet saltvandsbad.
Abstract
Ex vivo-præparater gør det muligt at studere mange neurofysiologiske processer isoleret fra resten af kroppen, samtidig med at den lokale vævsstruktur bevares. Dette arbejde beskriver forberedelsen af rotte iskiasnerver til ex vivo neurofysiologi, herunder bufferforberedelse, dyreprocedurer, opsætning af udstyr og neurofysiologisk registrering. Dette arbejde giver et overblik over de forskellige typer eksperimenter, der er mulige med denne metode. Den skitserede metode sigter mod at tilvejebringe 6 timers stimulering og registrering på ekstraheret perifert nervevæv under tæt kontrollerede forhold for optimal konsistens i resultaterne. Resultater opnået ved hjælp af denne metode er A-fiber sammensatte aktionspotentialer (CAP) med peak-to-peak amplituder i millivoltområdet over hele eksperimentets varighed. CAP-amplituder og former er konsistente og pålidelige, hvilket gør dem nyttige til at teste og sammenligne nye elektroder med eksisterende modeller eller virkningerne af interventioner på vævet, såsom brugen af kemikalier, kirurgiske ændringer eller neuromodulerende stimuleringsteknikker. Både konventionelle kommercielt tilgængelige manchetelektroder med platin-iridiumkontakter og specialfremstillede ledende elastomerelektroder blev testet og gav lignende resultater med hensyn til nervestimuleringsstyrke-varighedsrespons.
Introduction
Den nuværende forståelse af grundlæggende nervefunktion som modelleret i silico mangler i flere aspekter, især med hensyn til virkningerne af nervevævsopdeling uden for soma, axon og dendritter. Axon-myelin-interaktioner forstås stadig dårligt som det fremgår af det faktum, at selv detaljerede beregningsnervemodeller såsom MRG1 (for pattedyrnerver), der tilstrækkeligt fanger konventionel elektrisk stimuleringsrespons, ikke fanger andre eksperimentelt observerede adfærd såsom højfrekvent blokoverførsel2 eller sekundær debutrespons3.
Denne protokol giver en metode til effektivt at undersøge neurofysiologiske processer på nerveniveau i en akut lille laboratoriedyrsmodel ved hjælp af en standardiseret forberedelsesprotokol til at isolere nerven, kontrollere dens miljø og fjerne den fra en in vivo-sammenhæng til en ex vivo-sammenhæng. Dette vil forhindre andre kropsprocesser eller anæstetika, der anvendes af in vivo nervestimuleringsprotokoller til at ændre nerveadfærd og forvirre målte resultater eller deres fortolkning 4,5. Dette muliggør udvikling af mere realistiske modeller, der udelukkende fokuserer på effekter, der er specifikke for nervevæv, der er dårligt forstået. Denne protokol er også nyttig som testbed til ny nervestimulering og registrering af elektrodematerialer og geometrier samt nye stimuleringsparadigmer såsom højfrekvent blok 2,3. Variationer af denne teknik er tidligere blevet brugt til at studere nervefysiologi under tæt kontrollerede forhold6, for eksempel til at måle ionkanaldynamik og egenskaber eller virkningerne af lokalbedøvelsesmidler7.
Denne teknik giver flere fordele sammenlignet med alternativer såsom akutte in vivo små dyreforsøg8. Teknikken undgår behovet for at opretholde anæstesidybden, da vævet er ekstraheret fra kroppen, hvilket reducerer mængden af nødvendigt udstyr såsom en bedøvelsesdiffusor, iltkoncentrator og varmepude. Dette forenkler den eksperimentelle protokol, hvilket reducerer risikoen for fejl. Da anæstetika potentielt kan ændre nervefunktion4, sikrer denne teknik, at målinger ikke vil blive forvirret af bivirkninger fra disse bedøvelsesforbindelser. Endelig er denne teknik mere hensigtsmæssig end akutte in vivo-eksperimenter , når man studerer virkningerne af neurotoksiske forbindelser, såsom tetrodotoxin, som ville dræbe et bedøvet dyr ved lammelse.
Perifere nerveafsnit er et unikt ex vivo-system , da der er stor chance for, at fibrene, der er ansvarlige for registrerede neurale signaler, ikke indeholder nogen soma. Da disse normalt ville være placeret, for motorneuroner, i rygsøjlen og for sensoriske neuroner i de dorsale rodganglier ved siden af rygsøjlen, kan forberedelsen af en sektion af pattedyrnerven groft modelleres som en samling rørformede membraner med ionkanaler, åbne i begge ender9. Metabolisme opretholdes af mitokondrierne placeret i axonen på tidspunktet for vævsdissektion10. Suturering af de åbne ender af axolemmaet tilskyndes efter ekstraktion til at lukke dem og derved hjælpe med at opretholde eksisterende ioniske gradienter over membranen, som er afgørende for normal nervefunktion.
For at opretholde vævshomeostase uden for kroppen skal flere miljøvariabler kontrolleres tæt. Disse er temperatur11, iltning12, osmolaritet, pH13,14 og adgang til glukose for at opretholde stofskiftet. Til denne protokol er fremgangsmåden at anvende en modificeret Krebs-Henseleit-buffer 15,16 (mKHB) kontinuerligt luftet med en blanding af ilt og kuldioxid. mKHB er i familien af kardioplegiske buffere 6,17, der bruges til at bevare dissekerede væv uden for kroppen, for eksempel i ex vivo-eksperimenter. Disse buffere indeholder ikke hæmoglobin, antibiotika eller svampemidler og er derfor kun egnede til præparater, der involverer små mængder væv i en begrænset periode. pH-kontrol blev opnået med carboncarbonat- og kuldioxidredoxparret, hvilket krævede konstant beluftning af bufferen med kuldioxid for at opretholde pH-ligevægt. Dette er for at undgå at bruge andre almindelige buffermidler såsom HEPES, som kan ændre nervecellefunktionen18. For at ilte bufferen og tilvejebringe pH-kontrol blev der anvendt en blanding af 5% kuldioxid i ilt kaldet carbogen (95%O2, 5% CO2). En varmeomrører blev brugt til temperaturregulering af en bufferbeholder, og bufferen blev perfunderet gennem et nervebad og derefter recirkuleret til startbeholderen. Et typisk eksperiment ville vare 6-8 timer, før nerven mister sin levedygtighed og ikke længere reagerer tilstrækkeligt på stimulering til, at foranstaltninger er repræsentative for sundt væv.
For at optimere signal-støj-forholdet blev sølvchloridelektroder anvendt til optagelse, som blev fremstillet i henhold til tidligere beskrevne metoder19. Til stimulering kan en kombination af kommercielle off-the-shelf platin manchetelektroder og specialfremstillede ledende polymer manchetelektroder anvendes. Ledende polymermanchetelektroder har markant højere ladningskapacitet, hvilket er nyttigt, når nerven stimuleres ved hjælp af bølgeformer med høj amplitude20.
Stimulatoren, der anvendes i denne protokol, er tidligere beskrevet20. Dokumentation, designfiler og softwarescripts til brug er offentligt tilgængelige21. Andre stimulatorer kan bruges til at udføre denne protokol; den brugerdefinerede stimulator er imidlertid også i stand til højfrekvent alternativ strøm (HFAC) blok 2,20, hvilket muliggør et bredere udvalg af neurofysiologiske eksperimenter. For at bruge HFAC-blok anbefales ledende elastomermanchetter for at undgå skade på nerven. Ledende elastomernervemanchetter er bløde og fuldt polymere elektrodearrays fremstillet af ledende elastomerer som den ledende komponent og polydimethylsiloxan som isoleringen22. Enheder blev fremstillet i en bipolar konfiguration ved hjælp af konventionelle lasermikrofabrikationsteknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Al dyrepleje og procedurer blev udført under passende licenser udstedt af det britiske hjemmekontor i henhold til Animals (Scientific Procedures) Act (1986) og blev godkendt af Animal Welfare and Ethical Review Board ved Imperial College London.
1. Forberedelse af buffere
BEMÆRK: Denne del af protokollen kan udføres i god tid før resten af protokollen, bortset fra de sidste trin, der involverer fremstilling af modificeret Krebs-Henseleit Buffer (mKHB) i 1x koncentration.
- Forbered 1 m CaCl2 stamopløsning
- Der tilsættes 14,701 g CaCl2 dihydrat til et rent bægerglas på 100 ml. Tilsæt ~ 75 ml deioniseret vand og rør indtil fuldstændig opløsning af saltet.
- Opløsningen overføres til en 100 ml gradueret kolbe, og der tilsættes deioniseret vand, indtil 100 ml volumen er nået. Opløsningen overføres til en flaske, og den opbevares i køleskab ved 4 °C.
- Forbered 10x koncentreret mKHB-lager
- Der tilsættes 66,03 g natriumchlorid (NaCl), 3,57 g kaliumchlorid (KCl), 1,63 g kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) og 1,44 g magnesiumsulfat til et 2 L bægerglas.
- Tilsæt ~ 750 ml deioniseret vand til bægerglasset og rør, indtil saltene er opløst (der kan være små saltkrystaller tilbage i bunden). Der tilsættes 25 ml 1 M CaCl2 stamopløsning (trin 1.1) og omrøres. Sørg for, at dette er det sidste salt, der tilsættes.
- Opløsningen overføres til en 1 L gradueret kolbe og tilsættes deioniseret vand for at nå et samlet volumen på 1 L. Overfør opløsningen til en 1 L flaske. Koncentreret 10x mKHB ved 4 °C opbevares i køleskab.
BEMÆRK: Koncentreret mKHB-lager kan opbevares i ca. 1 måned før udskiftning.
- Forbered dissektion Petriskål (belægning)
- Forbered en ren glas petriskål (120 mm diameter) til belægning ved at vaske og tørre fadet omhyggeligt.
- Efter producentens instruktioner til brug og hærdning af den konforme alkoxybelægning skal du belægge bunden af petriskålen med ~ 3-5 mm belægning ved forsigtigt at hælde den konforme belægningsblanding i skålen, indtil den ønskede tykkelse er nået.
- Hærd belægningen i en ovn ved 60 °C, indtil den er fast at røre ved. Dissektionsstellet er nu klar.
BEMÆRK: Skånsom rengøring af fadet efter hver brug sikrer, at belægningen holder i årevis, før der er behov for udskiftning. Når du udskifter belægningen, skal du sørge for at fjerne alt belægningsmaterialet, inden du påfører en ny belægning. Bemærk, at den konforme alkoxybelægning (Materialetabel), der anvendes i denne protokol, har en holdbarhed på under et år.
2. Prædissektion præparater
BEMÆRK: Dette trin starter eksperimentet. Nedenstående trin skal udføres samme dag i denne rækkefølge.
- Forbered 1x mKHB
- Forbered et rent 2 L bægerglas til bufferen. Overfør 200 ml 10x mKHB-lager til 2 L bægerglasset. Der tilsættes 2,1 g natriumcarbonat (NaHCO3) og 0,99 g vandfrit Dextrose (D-glucose) til 2 L bægerglasset.
- Der tilsættes ca. 1 liter deioniseret vand til bægerglasset. Rør, indtil saltene er helt opløst. Opløsningen overføres til en 2 L gradueret kolbe, og der tilsættes deioniseret vand for at nå et samlet volumen på 2 L.
- Opløsningen overføres til en 2 L glasflaske anbragt på en omrører med en temperatur indstillet til 37 °C.
BEMÆRK: Mindre varmeomrører vil ofte ikke være i stand til at nå måltemperaturen på 37 °C på grund af den termiske inerti af store beholdere fulde af vand. Temperaturen justeres opad, så flaskens indhold når 37 °C under omrøring. Overvåg temperaturen under eksperimentet, og sænk den indstillede temperatur i tilfælde af overskridelse. - Anbring et termometer i 2 L flasken for at overvåge temperaturen ved hjælp af gribere for at forhindre termometeret i at blive påvirket af den omrørende loppe. Luft bufferen med carbogen i mindst 30 minutter for at ilte opløsningen. Dette skal indstille pH til 7,4. PH-værdien måles med en pH-meter for at sikre, at den ligger inden for 0,1 pH-enheder på 7,4 (ved 37 °C).
BEMÆRK: For at justere pH til 7,4 skal du bruge saltsyre eller natriumhydroxid, når det er nødvendigt. - Fyld to 15 ml centrifugerør og en 100 ml flaske med mKHB og læg dem på is for at afkøle.
BEMÆRK: Centrifugerørene og flasken kan rengøres og genbruges efter hvert forsøg uden autoklavering. - I senere dele af forsøget fortsættes med at lufte bufferen i 2 L flasken med carbogen ved 37 °C under kontinuerlig omrøring.
BEMÆRK: Uovervåget brug af bilbogen kan være farlig, hvis der ikke er automatiske systemer til at lukke for gasstrømmen i tilfælde af lækage. En automatiseret sensor og elektronisk afspærringsventil kan afbøde dette; Ellers skal en person overlades til at overvåge udstyret, hvis dissektion finder sted i et andet rum. I alle tilfælde skal der anvendes en iltføler i nærheden af opsætningen for at advare operatører, når den omgivende iltkoncentration stiger til over 25 %. Brug et rum med aktiv ventilation, hvis det er muligt.
- Tænd for signaloptagelsesenheden, støjsvag forforstærker, linjestøjfilter og oscilloskop til optagelse og stimulering for at give tilstrækkelig tid til temperaturstabilisering.
- Sørg for, at alt elektrisk kontrolapparat er konfigureret korrekt
- Indstil støjsvag forforstærkeren til AC-koblet indgang med inputbåndpasfilteret indstillet til 6 dB roll-off pr. årti, og afskæringsfrekvenser indstillet til 30 Hz og 3 kHz for henholdsvis højpas- og lavpasfiltrene.
- Indstil forstærkningen af den støjsvage forforstærker til 100.
3. Dyrebedøvelse og aflivning
BEMÆRK: Hunrotter mellem 250 og 330 g (Materialetabel) blev anvendt til undersøgelserne.
- Forbered kirurgiske værktøjer og forbrugsstoffer: 12 cm lige saks (stump); 2 mm skærekant vinklet fjedersaks; 4 cm fin saks, skarp eller halvskarp; #7 Dumont tang; 45° vinklet fin tang og 6-0 suturerende silke eller tråd.
- Anbring rotten i en bedøvelsesbeholder eller et kammer. Tilslut ilt og bedøvelsesdiffusoren til beholderen. Indstil bedøvelseskoncentrationen (isofluran) til 3,5%, og vent ca. 10 minutter, eller indtil dyret viser tegn på anæstesi, såsom tab af opretningsrefleks.
- Når rotten viser tegn på anæstesi, skal du bekræfte bevidsthedstabet med en tåspids tilbagetrækningsreflekstest. Fortsæt kun, når der ikke er nogen tilbagetrækning; Ellers kontrolleres alle forbindelser og bedøvelsesniveauer i diffusoren, og trin 3.2 gentages.
- Tag dyret ud af beholderen og fortsæt med cervikal dislokation efterfulgt af snit af en lårbensarterie til bekræftelse af døden.
4. Dissektionsprotokol
BEMÆRK: Placer dyret med maven nede på dissektionsbordet. Gentag følgende trin for begge ben. Typisk dissekeres højre ben først.
- Hold anklen fast mellem tommelfingeren, pegefingeren og langfingeren, skær den calcaneale sene ved hjælp af 12 cm lige stump saks.
- Lav med en fin skarp saks et hudsnit fra den calcaneale sene langs bagsiden af benet helt op til bunden af rygsøjlen, og pas på ikke at dissekere muskelvævet nedenunder.
- Brug fine tang og fine sakse, lav forsigtige snit gennem muskellagene nær midten af bagsiden af benet, indtil iskiasnerven er udsat. Så snart iskiasnerven er synlig, fugtes hulrummet ved hjælp af iskold mKHB for at forhindre nerven i at tørre ud.
- Brug hæmostater til at trække hudflapperne på hver side fra hinanden og holde snittet åbent for finere dissektionsarbejde. Startende fra placeringen af det calcaneale sene snit, med fin saks, afbryde musklen på den mediale side af benet for at frigøre nerven. Fortsæt med at opretholde fugtniveauer i området med iskold mKHB.
- Da nerven udsættes, mens du bevæger dig op ad benet, dissekeres det overliggende muskelvæv. Frigør nerven tættere på rygsøjlen fra bindevæv, indtil du når rygsøjlen, på hvilket tidspunkt der er et knæk i nerven. Forsøg ikke at rense nerven endnu, da hastighed er afgørende på dette stadium.
- Skær nerven så tæt på rygsøjlen som muligt med en fin saks. For at gøre dissektionen lettere, træk meget forsigtigt enden af nerven nær anklen ved hjælp af tang. Klem aldrig nerven i midten, men kun enderne. Træk aldrig en nerve stramt.
VALGFRIT: På dette tidspunkt, hvis tiden tillader det, kan suturering af begge ender af nerven udføres for at hjælpe med at opretholde levedygtigheden. Hold håndteringen på et minimum for at forhindre skader. Hvis der ikke er tilstrækkelig tid (se trin 4.5), skal du springe dette trin over og følge trin 5.2 senere. - Den dissekerede nerve anbringes i 15 ml centrifugeglasset fyldt med mKHB (trin 2.1.5), røret lukkes, og røret ises på is, indtil rengøringsproceduren påbegyndes.
- Trin 4.1-4.7 gentages for det andet ben. Ideelt set bør hver nerve tage 5-10 minutter at udtrække for at maksimere vævets levedygtighed.
5. Nerve rengøring procedure
- Fyld den overtrukne petriskål ca. halvvejs med kølet iltet mKHB. Placer en af de dissekerede iskiasnerver i skålen og fastgør begge ender af nerven til skålen, så nerven er lige uden knæk, torsion eller vendinger. Fastgør nerven så tæt på enderne som muligt.
- Brug 6-0 silkesuturer eller fin tråd til at binde en dobbelt knude rundt om hver ende af nerven for at forhindre cytosollækage i bufferen. Placer knuderne lige ved siden af insektstifterne på siden tættere på midten af nerven, da dette forhindrer lækage fra nervevæv i bufferen. Udfør ikke dette trin, hvis nerven tidligere er blevet ligeret.
- Brug mikroskopet til præcision og den 2 mm vinklede fjedersaks til at fjerne fedt, blodkar og muskelvæv fra nerven. Beskær eventuelle nervegrene, der ikke vil blive brugt i stimulerings- og optagelsesprotokollen.
- Hvert 5. minuts rengøring udskiftes bufferen med frisk kølet iltet mKHB. Brug fine tang til at trække i bindevæv, fedt og blodkar for at lette dissektion.
- Anbring nerverne tilbage i transportrørene fyldt med frisk iltet kølet mKHB, og læg rørene på is.
6. Opsætning af udstyr
BEMÆRK: Den udstyrsopsætning, der blev brugt til at udføre eksperimenter, er illustreret i figur 1. Kort fortalt består den af et nervebad med dobbelt rum, en 2 L flaske placeret på en varmeomrører, en kilde til carbogen til bufferluftning og slanger, så bufferen kan strømme fra flasken til badet og tilbage til flasken ved hjælp af en peristaltisk pumpe. Badet kan bearbejdes af plexiglas eller 3D-printes af vandtætte materialer. Den har en dybde på ca. 2 cm, og skillevæggen, der adskiller badets to kamre, har et hul på 1,5 mm i diameter for at tillade gevindskæring af en perifer nerve på tværs af begge kamre. Et kammer er stort, skal være mindst 4 eller 5 cm langt og vil blive fyldt med buffer. Det andet kammer skal være mindst 3 cm langt og fyldes med silikone eller mineralolie. Badet må ikke gøres for stort, da dette vil forringe kontrollen med perfusion, temperatur og pH. Forskellige badestørrelser kan være påkrævet afhængigt af størrelsen på det nervevæv, der undersøges.
- Forbered et rent nervebad med dobbelt kammer (se supplerende fil for designspecifikationer). Anbring nervebadet under niveauet for den 2 L flaske, der er placeret på varmeomrøreren, ved hjælp af standard laboratoriehoveder og gribere. Tilslut badets afløb til det peristaltiske pumpeindløb.
- Tilslut udløbet af den peristaltiske pumpe til et rør, der fører tilbage til 2 L bufferflasken. Tilslut badeindløbet til et rør med en justerbar strømningsventil, og sæt røret inde i 2 L flasken. Brug en trevejsventil med en sprøjte forbundet til det midterste udløb for at hjælpe med at grunde røret som en sifon til tyngdekraftassisteret bufferindstrømning.
- Prime sifonen ved at trække sprøjten, indtil buffer strømmer ind i den. Konfigurer ventilen således, at bufferens strømningshastighed i badet er ~5-6 ml·min-1. Strømmen kan øges i første omgang for at fylde badet. Når badbufferniveauet har nået afløbet, skal du placere nerverne i badet.
- Brug en insektstift til at fastgøre enden af nerven i hjørnet af det bufferfyldte badekammer. Brug 45° vinklede fine pincet og klem nerven kun i enderne, og træk forsigtigt nerven, der skal stimuleres, gennem hullet i skillevæggen mellem de to badekamre.
- Fastgør den anden ende af nerven i badets oliekammer med en insektstift, der sikrer, at nerven er lige uden at blive strakt og er fri for knæk og vrid. Brug silikonefedt til at forsegle for at forhindre bufferlækage fra bufferkammeret ind i oliekammeret. Fyld oliekammeret med silikone eller mineralolie.
- Placer Ag/AgCl-optageelektrodekrogene i oliebadekammeret, og fastgør dem ved hjælp af bosshoveder og gribere. Draper den del af nerven i oliebadet over krogene uden at trække nerven stramt. Klem ikke nerven; brug vinklede tang til at løfte nerven uden at klemme.
- Juster eller reparer silikonefedtforseglingen, hvis der observeres lækage efter bevægelse af nerven.
- Reference-Ag/AgCl-referenceelektroden tilsluttes forstærkerjorden, og placer elektroden i det bufferfyldte badekammer ved at fastgøre den ved hjælp af en laboratoriegriber.
7. Elektrodeimplantation på nerven i badet
- Forbered en ren nervemanchetelektrode til stimulering i henhold til reference21. Placer elektroden i det bufferfyldte badekammer. Brug pincet eller fin pincet med stumpe eller vinklede spidser til at åbne elektroden i badet for at våde indersiden af manchetten.
- Hvis der er bobler tilbage, skal du bruge en fin sprøjte til at trække buffer fra badet og tvinge boblerne ud af manchetten. Med en pincet under nerven skal du forsigtigt åbne manchetten og skubbe den under nerven. Luk manchetten omkring nerven, og pas på at undgå knæk eller vridning af nerven.
- Tilslut stimuleringselektroden til stimulatoren, og fastgør stimuleringselektrodeledningen med tape. Tilslut den aktuelle returelektrode til stimulatoren, og fastgør ledningen med tape. Hvis du bruger et firkantet platinark som den aktuelle returelektrode, skal du placere arket væk fra nerven i badet.
8. Stimulering og optagelse
- Tilslut stimulatorens TTL-signaludgang til kanal 4 i oscilloskopet, som vil blive brugt til at udløse oscilloskopet. På oscilloskopskærmen skal du trykke på fanen Triggerkanal og angive Kanal 4 som den udløsende kanal. Indstil udløserniveauet til 1 V ved hjælp af niveauknappen .
- På oscilloskopet indstilles tidsopløsningen til 1 ms/division og spændingsopløsningen til 10 mV/division. Centrer udløserreferencen i tide, og indstil udløserniveauet til 1 V.
BEMÆRK: Følg trin 8.3 til 8.6, hvis du bruger den brugerdefinerede stimulator (se Materialetabel). Det antages, at MATLAB-softwaren og enhedsdrivere er installeret på laboratoriecomputeren ved hjælp af instruktioner, der frit leveres online til den brugerdefinerede neurale stimulator21. Ellers skal du følge producentens anvisninger for brug af en kommercielt tilgængelig stimulator som et alternativ. - Tilslut stimulatoren til laboratoriecomputeren. Tænd for stimulatoren ved at slutte batteriets strømforsyning til strømindgangen. Start MATLAB-softwaren på laboratoriecomputeren.
- Udfør det brugerdefinerede MATLAB-script: HFAC_4ch_Stimulator_Initialization.m (Materialetabel).
BEMÆRK: USB-kommunikationskablet mellem computeren og stimulatoren skal blinke grønt. Hvis det ikke gør det, er der en konfigurationsfejl, og strømforsyningen og forbindelserne skal verificeres. - Åbn MATLAB-scriptet: HFAC_4ch_Monophasic_Stimulation.m (Materialetabel). Ved direkte redigering af MATLAB-scriptet indstilles parametrene som følger: stimulatorpulsamplitude = -300 μA, stimulatorpulsbredde = 300 μs, stimulatorantal impulser = 10 og stimulatortid mellem impulser = 1 s.
- Start stimuleringsprotokollen ved at klikke på Kør i MATLAB-softwaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repræsentative resultater, der kan opnås med denne protokol, er de konsistente sammensatte handlingspotentialer fra A-type nervefibre i iskiasnerven. Disse aktionspotentialer har typisk en peak-to-peak amplitude på ca. 1 mV ved elektroden og derfor 100 mV, når den er amplificeret (figur 2). Lignende stimuleringsamplituder og pulsbredder bør give lignende CAP-amplituder. Ledende elastomermanchetelektroder vil generelt kræve lidt højere stimuleringsamplituder for at opnå den samme CAP-amplitude sammenlignet med kommercielt tilgængelige platinmanchetelektroder. Denne forskel er generelt lille sammenlignet med variationen i stimuleringsamplitude, der kræves for at stimulere nerver, der kommer fra forskellige dyr. Dette skyldes, at små forskelle i nervestørrelse og manchetpasning har en stor effekt på den krævede stimuleringsamplitude for at opnå en specifik CAP-amplitude, uanset manchetmaterialet. Dette kan bruges til at teste virkningerne af forskellige buffersammensætninger, såsom forskellige ionkoncentrationer eller tilsætning af nerveexcitatoriske eller hæmmende stoffer såsom tetrodotoxin. Hvis bufferaffaldsrøret ledes til en ekstra beholder, kan tilsætningen af nerve excitabilitetsændrende stoffer gøres midlertidig for eksperimentet med udvaskningshastigheder afhængig af bufferindstrømningshastigheden.
Den mindste strømtæthed, beregnet som stimuleringsamplituden divideret med overfladearealet af stimuleringselektroderne, der kræves for at aktivere fibrene af A-typen og opnå et observerbart sammensat handlingspotentiale for oscilloskopet, blev plottet versus pulsbredden i figur 3. Resultaterne vist i figur 3 repræsenterer typisk nerve excitabilitet for både kommercielt tilgængelige standard platin nerve manchetter og specialfremstillede ledende elastomer nerve manchetter.
De ekstraherede nerver skal forblive levedygtige i ca. 6 timer efter ekstraktion, og derfor skal eksperimenter passe inden for dette tidsvindue. Tab af nerve levedygtighed fører til et progressivt fald i CAP amplitude og ledningshastighed. Efter at aktionspotentialeamplituden falder til under 50% af den indledende amplitude (i starten af optagelsen), bør nerven betragtes som ikke længere levedygtig, da resultaterne vil blive signifikant skæve. Repræsentative resultater med hensyn til nervelængde er vist i figur 4. Højre og venstre iskiasnerve blev ekstraheret fra et dyr mellem kl. 10.00 og 11.00 på en given dag. Indledende CAPs blev opnået fra højre iskiasnerve under indledende tests før forsøg, og standard CAPs blev opnået fra både venstre og højre iskiasnerver, som var blevet holdt i live ved hjælp af denne protokol, i slutningen af forsøgene. Minimal CAP-amplitudereduktion blev observeret med højre iskiasnerve, mens den venstre iskiasnerve CAP-amplitude ved ca. 3 mV svarede til den højre iskiasnerve ved starten af eksperimentet mere end 6 timer efter nerveekstraktion.
Figur 1: Skematisk repræsentation af den eksperimentelle opsætning, der bruges i protokollen. Dette tal er ændret fra Rapeaux, A. et al. (2020)20. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative CAPs opnået ex vivo efter stimulering af metalliske og ledende elastomernervestmanchetarrays. Gengivet med modifikationer fra Cuttaz, E. A. et al. (2021)22. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: A-fiberaktiveringstærskel for metalliske og ledende elastomermanchetarrays. Fejllinjer repræsenterer ±1 standardafvigelse fra gennemsnittet. Gengivet med modifikationer fra Cuttaz, E. A. et al. (2021)22. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentative CAPs opnået ex vivo i løbet af en dag med forsøg og ved anvendelse af begge iskiasnerver fra et dyr. (A) A-type fiber CAP opnået nær middag fra højre iskiasnerve. (B) A-type fiber CAP opnået midt på eftermiddagen fra venstre iskiasnerve. (C) A-type fiber CAP opnået ved afslutningen af forsøg med den samme venstre iskiasnerve i (B). X-aksen svarer til det tidspunkt på dagen, hvor optagelserne blev taget. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette arbejde beskrev vi en protokol til forberedelse af rotte iskiasnerver til ex vivo neurofysiologi. Vævsekstraktion tager cirka 30 minutter, inklusive dyrehåndtering, anæstesi, aflivning og dissektion, mens nerverensning, placering i badet og elektrodeimplantation bør kræve yderligere 30 minutter, før optagelsen kan startes. Bufferforberedelse kan udføres på 30 minutter, selvom dette kan gøres forud for resten af eksperimentet. Denne type præparat og forsøg er blevet anvendt og beskrevet i de seneste 7,12 ved hjælp af lignende buffere og for samme vævstype. Så vidt forfatterne ved, er det imidlertid første gang, at der i samme dokument er givet en beskrivelse af bufferforberedelse, dissektion, opsætning af udstyr og efterfølgende registrering.
Denne protokol kan muliggøre en lang række eksperimenter inden for neurofysiologi, som ikke ville være mulige i hverken in vitro- eller in vivo-sammenhænge . For eksempel er en fordel ved ex vivo-præparater , at de bevarer makro- og mikrostrukturen i det ekstraherede væv, mens de isolerer dette væv fra resten af kroppen. Dette resulterer i en enklere opsætning, da anæstesi ikke behøver at blive opretholdt, hvilket ellers er et krav i in vivo-forsøg . Med hensyn til at muliggøre forsøg tillader ex vivo-præparater anvendelse af stoffer som tetrodotoxin, som er vanskelige at retfærdiggøre i en in vivo-sammenhæng 23 , da de indebærer en høj risiko for dyret. Når anvendelsen af sådanne stoffer er til gavn for undersøgelsen, er de lettere at anvende i ex vivo-præparater . Brugen af den brugerdefinerede stimulator20 muliggør eksperimenter ved hjælp af HFAC-blok til neuromodulation ved hjælp af denne eksperimentelle opsætning.
Det mest kritiske trin i protokollen er dissektionstrinnet, fordi selv en lille fejl ved hjælp af dissektionssaksen kan beskadige nerven, hvis der ikke udvises tilstrækkelig omhu. Hastigheden på dette stadium er også afgørende, da vævet hurtigt skal ekstraheres fra kroppen og placeres i en kølet buffer for at maksimere levedygtigheden i starten af optagelsen. Efter vævsekstraktion, mens der skal udvises forsigtighed ved rengøring af nerven og implantering af elektroder, er protokollen mere fleksibel med hensyn til tid, og risikoen for operatørfejl er derfor lavere. Da nervediametre og placering af fascikler i nerverne vil variere fra dyr til dyr, bør der forventes en vis variation i resultaterne, selvom der anvendes de samme elektroder og stimuleringsprotokol. Effekten af denne variabilitet kan ses i fejlbjælkerne for stimuleringstærskler i figur 3. Det er vigtigt ikke at klemme nerven på noget tidspunkt af præparatet, da dette kan forårsage irreversibel skade på vævet. Håndter kun nerven ved dens ender ved hjælp af tang og med stor omhu for ikke at trække nerven stramt.
Flere aspekter af protokollen i sin nuværende form kan forbedres ved at øge mængden af udstyr og opsætningstid. For at hjælpe med diagnosticeringen af potentielle problemer med denne eksperimentelle opsætning kan automatiserede målinger af pH og opløst ilt i badet være nyttige, men er ikke implementeret her. Begge målinger kan opnås ved hjælp af amperometriske eller potentiometriske metoder12,19. Udstyr, der kræver regelmæssig vedligeholdelse, er slangen og glasvarer, som akkumulerer saltaflejringer over tid. AgCl-optagekrogene kræver også regelmæssig genbelægning eller udskiftning sammen med AgCl-referencen. Stimuleringselektroder skal rengøres efter hver brug, men vil generelt ikke kræve udskiftning for mange eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
OPEN ACCESS-ERKLÆRING:
Med henblik på open access har forfatteren anvendt en Creative Common Attribution (CC BY) licens (hvor det er tilladt af UKRI, 'Open Government License' eller 'Creative Commons Attribution No-derivatives (CC BY-ND) licens kan angives i stedet) til enhver forfatter accepteret manuskriptversion, der opstår.
DELING AF DATA:
De rådata, der anvendes i tallene i denne artikel, vil blive stillet til rådighed af forfatterne uden unødig reservation.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender Dr. Gerald Hunsberger fra GlaxoSmithKline Pharmaceuticals, King of Prussia, PA, USA og Galvani Bioelectronics (Stevenage, UK) for at dele deres originale nerveforberedelsesteknik med os. Forfatterne anerkender Robert Toth for dual-chamber nervebaddesignet. Forfatterne anerkender finansiering fra Healthcare Technologies Challenge Awards (HTCA) bevilling fra Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC). Forfatterne anerkender High Performance Embedded and Distributed Systems Centre for Doctoral Training (HiPEDS CDT) fra Imperial College London for finansiering af Adrien Rapeaux (EP / L016796/1 ). Adrien Rapeaux er i øjeblikket finansieret af UK Dementia Research Institute, Care Research and Technology Centre. Forfatterne anerkender taknemmeligt Zack Bailey fra Imperial College, i Institut for Bioengineering, for hjælp med eksperimenter og adgang til animalsk væv under produktionen af JoVE-videoartiklen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1595 | Borosilicate glass |
| 1 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | 612-3626 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1596 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | BRND937254 | Borosilicate glass |
| Adaptor, pneumatic, 8 mm to 1/4 NPT | RS UK | 536-2599 | push-to-fit straight adaptor between oxygen hose and gas dispersion tube |
| Alkoxy conformal coating | Farnell | 1971829 | ACC15 Alkoxy conformal coating for dissection petri dish preparation |
| Anesthetic | Chanelle | N/A | Isoflurane inhalation anesthetic, 250 mL bottle |
| Beaker, 2 L | VWR International Ltd | 213-0469 | Borosilicate glass |
| Bipolar nerve cuff | Cortec GMBH | N/A | 800 micron inner diameter, perpendicular lead out, no connector termination |
| Bossheads | N/A | N/A | Standard wet laboratory bossheads for attaching grippers to rods |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902-500g | 500 g in plastic bottle |
| Carbogen canister | BOC | N/A | F-size canister |
| Centrifuge Tubes, 15 mL volume | VWR International Ltd | 734-0451 | Falcon tubes |
| Conductive elastomer nerve cuff | N/A | N/A | high charge capacity nerve cuff for stimulation, see protocol for fabrication reference |
| Connector, Termimate | Mouser UK | 538-505073-1100-LP | These should be soldered to wire terminated with crocodile clips (see entry 11) |
| Crocodile clip connectors | RS UK | 212-1203 | These should be soldered to wire terminated with TermiMate connectors (see entry 10) |
| Deionized Water | N/A | N/A | Obtained from deionized water dispenser |
| Forceps angled 45 degrees | InterFocus Ltd | 91110-10 | Fine forceps, student range |
| Forceps standard Dumont #7 | InterFocus Ltd | 91197-00 | Student range forceps |
| Gas Disperson Tube, Porosity 3 | Merck | 12547866 | N/A |
| Glucose anhydrous, powder | VWR International Ltd | 101174Y | 500 g in plastic bottle |
| Grippers | N/A | N/A | Standard wet laboratory rod-mounted grippers |
| Heating Stirrer | RS UK | 768-9672 | Stuart US152 |
| Hemostats | N/A | N/A | Any hemostat >12 cm in length is suitable |
| Insect Pins, stainless steel, size 2 | InterFocus Ltd | 26001-45 | N/A |
| Laptop computer | N/A | N/A | Any laboratory-safe portable computer with at least 2 unused USB ports is suitable |
| Line Noise Filter | Digitimer | N/A | Humbug noise eliminator (50 Hz line noise filter) |
| Low-Noise Preamplifier, SR560 | Stanford Research Systems | SR560 | Low-noise voltage preamplifier |
| Magnesium Sulphate salt | VWR International Ltd | 291184P | 500g in plastic bottle |
| MATLAB scripts | Github | https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch | Initialization, calibration and stimulation scripts for the custom stimulator |
| MATLAB software | Mathworks | N/A | Standard package |
| Microscope Light, PL-2000 | Photonic | N/A | Light source with swan necks. Product may be obtained from third party supplier |
| Microscope, SMZ 745 | Nikon | SM745 | Stereoscopic Microscope |
| Mineral oil, non-toxic | VWR International Ltd | 31911.A1 | Oil for nerve bath |
| Nerve Bath | N/A | N/A | Plexiglas machined nerve bath, see protocol for details. |
| Oscilloscope | LeCroy | N/A | 434 Wavesurfer. Product may be obtained from 3rd party suppliers |
| Oxygen Hose, 1 meter | BOC | N/A | 1/4" NPT terminations |
| Oxygen Regulator | BOC | C106X/2B:3.5BAR-BS3-1/4"NPTF 230Bar | N/A |
| Peristaltic Pump P-1 | Pharmacia Biotech | N/A | Product may be obtained from third party supplier |
| Petri Dish, Glass | VWR International Ltd | 391-0580 | N/A |
| Potassium Chloride salt | Sigma Aldrich | P5405-250g | 250 g in plastic bottle |
| Potassium Dihydrogen Sulphate salt | Merck | 1.04873.0250 | 250 g in plastic bottle |
| Rat | Charles River Laboratories | N/A | Sprague Dawley, 250-330 grams, female |
| Reference electrode, ET072 | eDaQ (Australia) | ET072-1 | Silver silver-chloride reference electrode |
| Rod | N/A | N/A | Standard wet laboratory rods with fittings for stands |
| Scale | Sartorius | N/A | M-Power scale, for weighing powders. Product may be obtained from third-party suppliers |
| Scissors straight 12 cm edge | InterFocus Ltd | 91400-12 | blunt-blunt termination, student range |
| Signal Acquisition Device | Cambridge Electronic Design | Micro3-1401 | Micro3-1401 Multichannel ADC |
| Silicone grease, non-toxic | Farnell | 3821559 | for sealing of bath partition |
| Silicone tubing, 2 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silicone tubing, 5 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silver wire | Alfa Aesar | 41390 | 0.5 mm, annealed |
| Sodium Bicarbonate salt | Sigma Aldrich | S5761-500g | 500 g in plastic bottle |
| Sodium Chloride salt | VWR International Ltd | 27810.295 | 1 kg in plastic bottle |
| Spring scissors angled 2 mm edge | InterFocus Ltd | 15010-09 | N/A |
| Stand | N/A | N/A | Standard wet laboratory stands with sockets for rods |
| Stimulator | Digitimer | DS3 | DS3 or Custom Stimulator (see references) |
| Stirring flea | VWR International Ltd | 442-0270 | For use with the heating stirrer |
| Syringe tip, blunt, 1 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe tip, blunt, 2 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe, plastic, 10 mL volume | N/A | N/A | syringe should have luer lock fitting |
| Tape, water-resistant | N/A | N/A | For securing tubing and wiring to workbench |
| Thermometer | VWR International Ltd | 620-0806 | glass thermometer |
| USB Power Bank | RS UK | 135-1000 | Custom Stimulator power supply, fully charge before experiment. Not needed if using DS3 |
| Valve, Leuer Lock, 3-Way | VWR International Ltd | 229-7440 | For attaching syringe to bath feed tube and priming siphon |
References
- McIntyre, C. C., Richardson, A. G., Grill, W. M. Modeling the excitability of mammalian nerve fibers: Influence of afterpotentials on the recovery cycle. Journal of Neurophysiology. 87 (2), 995-1006 (2002).
- Pelot, N. A., Grill, W. M. In vivo quantification of excitation and kilohertz frequency block of the rat vagus nerve. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026005 (2020).
- Patel, Y. A., Kim, B. S., Rountree, W. S., Butera, R. J. Kilohertz electrical stimulation nerve conduction block: Effects of electrode surface area. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 25 (10), 1906-1916 (2017).
- Kortelainen, J., Al-Nashash, H., Vipin, A., Thow, X. Y., All, A. The effect of anaesthesia on somatosensory evoked potential measurement in a rat model. Laboratory Animals. 50 (1), 63-66 (2016).
- Oh, S. S., Hayes, J. M., Sims-Robinson, C., Sullivan, K. A., Feldman, E. L. The effects of anesthesia on measures of nerve conduction velocity in male C57Bl6/J mice. Neuroscience Letters. 483 (2), 127-131 (2010).
- Kuffler, S. W., Williams, E. M. V. Small-nerve junctional potentials. The distribution of small motor nerves to frog skeletal muscle, and the membrane characteristics of the fibres they innervate. The Journal of Physiology. 121 (2), 289-317 (1953).
- Brunton, E., Blau, C. W., Nazarpour, K. Separability of neural responses to standardised mechanical stimulation of limbs. Scientific Reports. 7 (1), 11138 (2017).
- Schmalbruch, H. Fiber composition of the rat sciatic nerve. The Anatomical Record. 215 (1), 71-81 (1986).
- Kagiava, A., Theophilidis, G. Assessing the permeability of the rat sciatic nerve epineural sheath against compounds with local anesthetic activity: an ex vivo electrophysiological study. Toxicology Mechanisms and Methods. 23 (8), 634-640 (2013).
- Motori, E., et al. Neuronal metabolic rewiring promotes resilience to neurodegeneration caused by mitochondrial dysfunction. Science Advances. 6 (35), 8271 (2020).
- Schwarz, J. R., Eikhof, G. Na currents and action potentials in rat myelinated nerve fibres at 20 and 37° C. Pflügers Archiv. 409 (6), 569-577 (1987).
- Cranefield, P. F., Brink, F., Bronk, D. W. The oxygen uptake of the peripheral nerve of the rat. Journal of Neurochemistry. 1 (3), 245-249 (1957).
- Lehmann, J. E. The effect of changes in pH on the action of mammalian A nerve fibers. American Journal of Physiology-Legacy Content. 118 (3), 600-612 (1937).
- Hamm, L. L., Nakhoul, N., Hering-Smith, K. S.
- Minasian, S. M., Galagudza, M. M., Dmitriev, Y. V., Kurapeev, D. I., Vlasov, T. D. Myocardial protection against global ischemia with Krebs-Henseleit buffer-based cardioplegic solution. Journal of Cardiothoracic Surgery. 8, 60 (2013).
- Bailey, L. E., Ong, S. D. Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations. Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).
- Miller, D. J. Sydney Ringer: physiological saline, calcium and the contraction of the heart. The Journal of Physiology. 555, Pt 3 585-587 (2004).
- Yamamoto, D., Suzuki, N., Miledi, R. Blockage of chloride channels by HEPES buffer). Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 230 (1258), 93-100 (1987).
- Janz, G. J., Taniguchi, H. The silver-silver halide electrodes. Preparation, stability, and standard potentials in aqueous and non-aqueous media. Chemical Reviews. 53 (3), 397-437 (1953).
- Rapeaux, A., Constandinou, T. G. An HFAC block-capable and module-extendable 4-channel stimulator for acute neurophysiology. Journal of Neural Engineering. 17 (4), 046013 (2020).
- Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch. Next Generation Neural Interfaces. , Available from: https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch> (2021).
- Cuttaz, E. A., Chapman, C. A. R., Syed, O., Goding, J. A., Stretchable Green, R. A. fully polymeric electrode arrays for peripheral nerve stimulation. Advanced Science. 8 (8), 2004033 (2021).
- Lossi, L., Merighi, A. The use of ex vivo rodent platforms in neuroscience translational research with attention to the 3Rs philosophy. Frontiers in Veterinary Science. 5, 164 (2018).
