Summary
Bu protokol, sıçan tüm siyatik sinir dokusunun ex vivo elektrofizyolojik stimülasyon için hazırlanmasını ve çevresel olarak düzenlenmiş, iki bölmeli, perfüze edilmiş bir salin banyosunda kaydedilmesini açıklar.
Abstract
Ex vivo preparatlar, lokal doku yapısını korurken vücudun geri kalanından izole olarak birçok nörofizyolojik sürecin incelenmesini sağlar. Bu çalışma, tampon preparatı, hayvan prosedürleri, ekipman kurulumu ve nörofizyolojik kayıt dahil olmak üzere ex vivo nörofizyoloji için sıçan siyatik sinirlerinin hazırlanmasını açıklamaktadır. Bu çalışma, bu yöntemle mümkün olan farklı deney türlerine genel bir bakış sunmaktadır. Özetlenen yöntem, sonuçlarda optimal tutarlılık için sıkı bir şekilde kontrol edilen koşullarda ekstrakte edilen periferik sinir dokusu üzerinde 6 saatlik stimülasyon ve kayıt sağlamayı amaçlamaktadır. Bu yöntem kullanılarak elde edilen sonuçlar, deneyin tüm süresi boyunca milivolt aralığında tepeden tepeye genliklere sahip A-fiber bileşik aksiyon potansiyelleridir (CAP). CAP genlikleri ve şekilleri tutarlı ve güvenilirdir, bu da onları yeni elektrotları mevcut modellerle veya kimyasalların kullanımı, cerrahi değişiklikler veya nöromodülatör stimülasyon teknikleri gibi müdahalelerin doku üzerindeki etkilerini test etmek ve karşılaştırmak için yararlı kılar. Hem platin-iridyum kontaktlı geleneksel manşet elektrotları hem de ısmarlama iletken elastomer elektrotlar test edilmiş ve sinir uyaranı kuvvet-süre yanıtı açısından benzer sonuçlar vermiştir.
Introduction
Siliko modellenmiş olarak temel sinir fonksiyonunun mevcut anlayışı, özellikle soma, akson ve dendritlerin dışındaki sinir dokusu bölümlenmesinin etkileri ile ilgili olarak, birçok açıdan eksiktir. Akson-miyelin etkileşimleri, geleneksel elektriksel stimülasyon yanıtını yeterince yakalayan MRG1 (memeli sinirleri için) gibi ayrıntılı hesaplamalı sinir modellerinin bile, yüksek frekanslı blok taşıma2 veya ikincil başlangıçlı yanıt3 gibi deneysel olarak gözlemlenen diğer davranışları yakalamadığı gerçeğiyle kanıtlandığı gibi hala tam olarak anlaşılamamıştır.
Bu protokol, siniri izole etmek, çevresini kontrol etmek ve in vivo bağlamdan ex vivo bir bağlama çıkarmak için standartlaştırılmış bir hazırlık protokolü kullanarak, akut küçük bir laboratuvar hayvanı modelinde sinir düzeyinde nörofizyolojik süreçleri verimli bir şekilde araştırmak için bir yöntem sağlar. Bu, in vivo sinir stimülasyon protokolleri tarafından kullanılan diğer vücut süreçlerini veya anesteziklerin sinir davranışını değiştirmesini ve ölçülen sonuçları veya bunların yorumlanmasını karıştırmasını önleyecektir 4,5. Bu, yalnızca az anlaşılmış sinir dokularına özgü etkilere odaklanan daha gerçekçi modellerin geliştirilmesini sağlar. Bu protokol aynı zamanda yeni sinir stimülasyonu ve elektrot materyallerinin ve geometrilerinin yanı sıra yüksek frekanslı blok 2,3 gibi yeni stimülasyon paradigmaları için bir test yatağı olarak da yararlıdır. Bu tekniğin varyasyonları daha önce sıkı kontrol edilen koşullarda sinir fizyolojisini incelemek için kullanılmıştır6, örneğin, iyon kanalı dinamiklerini ve özelliklerini veya lokal anesteziklerin etkilerini ölçmekiçin 7.
Bu teknik, akut in vivo küçük hayvan deneyleri8 gibi alternatiflere kıyasla çeşitli avantajlar sağlar. Teknik, doku vücuttan çıkarıldığı için anestezi derinliğini koruma ihtiyacını ortadan kaldırır ve anestezik difüzör, oksijen konsantratör ve ısıtma yastığı gibi gerekli ekipman miktarını azaltır. Bu, deneysel protokolü basitleştirerek hata riskini azaltır. Anestezikler potansiyel olarak sinir fonksiyonunudeğiştirebildiğinden 4, bu teknik, önlemlerin bu anestezik bileşiklerin yan etkileriyle karıştırılmamasını sağlar. Son olarak, bu teknik, anestezi uygulanmış bir hayvanı felç yoluyla öldürecek olan tetrodotoksin gibi nörotoksik bileşiklerin etkilerini incelerken akut in vivo deneylerden daha uygundur.
Periferik sinir kesitleri benzersiz bir ex vivo sistemdir, çünkü kaydedilen nöral sinyallerden sorumlu liflerin herhangi bir soma içermeme olasılığı yüksektir. Bunlar normalde motor nöronlar için, omurgada ve omurganın yanındaki dorsal kök gangliyonlarındaki duyusal nöronlar için yerleştirileceği için, memeli sinirinin bir bölümünün hazırlanması, kabaca, her iki ucunda da açık olan iyon kanallarına sahip boru şeklindeki zarların bir koleksiyonu olarak modellenebilir9. Metabolizma, doku diseksiyonu10 sırasında aksonda bulunan mitokondri tarafından korunur. Aksolemmanın açık uçlarının dikilmesi, ekstraksiyondan sonra onları kapatmak için teşvik edilir ve böylece normal sinir fonksiyonu için gerekli olan membran boyunca mevcut iyonik gradyanların korunmasına yardımcı olur.
Doku homeostazını vücudun dışında tutmak için, çeşitli çevresel değişkenler sıkı bir şekilde kontrol edilmelidir. Bunlar sıcaklık11, oksijenasyon 12, ozmolarite, pH13,14 ve metabolizmayı korumak için glikoza erişimdir. Bu protokol için yaklaşım, oksijen ve karbondioksit karışımı ile sürekli olarak havalandırılan modifiye edilmiş bir Krebs-Henseleit tamponu 15,16 (mKHB) kullanmaktır. mKHB, örneğin ex vivo deneylerde, vücut dışındaki disseke dokuları korumak için kullanılan kardiyoplejik tamponlar 6,17 ailesindedir. Bu tamponlar herhangi bir hemoglobin, antibiyotik veya antifungal içermez ve bu nedenle yalnızca sınırlı bir süre için az miktarda doku içeren preparatlar için uygundur. pH kontrolü, pH dengesini korumak için tamponun karbondioksit ile sürekli havalandırılmasını gerektiren karbonat ve karbondioksit redoks çifti ile sağlanmıştır. Bu, sinir hücresi fonksiyonunu değiştirebilen HEPES gibi diğer yaygın tamponlama ajanlarını kullanmaktan kaçınmaktır18. Tamponu oksijenlendirmek ve pH kontrolünü sağlamak için, karbojen adı verilen oksijende% 5 karbondioksit karışımı (% 95 O 2,% 5 CO2) kullanılmıştır. Bir tampon kabının sıcaklık kontrolü için bir ısıtma karıştırıcısı kullanıldı ve tampon bir sinir banyosundan geçirildi ve daha sonra başlangıç kabına yeniden dolaştırıldı. Tipik bir deney, sinir canlılığını kaybetmeden ve artık sağlıklı dokuyu temsil edecek önlemler için stimülasyona yeterince yanıt vermeden önce 6-8 saat sürecektir.
Sinyal-gürültü oranını optimize etmek için, daha önce açıklanan yöntemlere göre hazırlanan kayıt için gümüş-klorür elektrotları kullanılmıştır19. Stimülasyon için, ticari kullanıma hazır platin manşet elektrotları ve özel yapım iletken polimer manşet elektrotlarının bir kombinasyonu kullanılabilir. İletken polimer manşet elektrotları, yüksek genlikli dalga formları20 kullanarak siniri uyarırken yararlı olan özellikle daha yüksek şarj kapasitelerine sahiptir.
Bu protokolde kullanılan uyarıcı daha önce20 olarak tanımlanmıştır. Kullanılacak belgeler, tasarım dosyaları ve yazılım komut dosyaları herkese açıktır21. Bu protokolü yürütmek için diğer uyarıcılar kullanılabilir; Bununla birlikte, özel stimülatör aynı zamanda daha geniş bir nörofizyoloji deneyi yelpazesine olanak tanıyan yüksek frekanslı alternatif akım (HFAC) blok 2,20 yeteneğine de sahiptir. HFAC bloğunu kullanmak için, sinirin zarar görmesini önlemek için iletken elastomer manşetler önerilir. İletken elastomer sinir manşetleri, iletken bileşen olarak iletken elastomerlerden ve yalıtım olarak polidimetilsiloksandan üretilen yumuşak ve tamamen polimerik elektrot dizileridir22. Cihazlar, geleneksel lazer mikrofabrikasyon teknikleri kullanılarak bipolar konfigürasyonda üretildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan bakımı ve prosedürleri, İngiltere İçişleri Bakanlığı tarafından Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler) Yasası (1986) uyarınca verilen uygun lisanslar altında gerçekleştirildi ve Imperial College London'ın Hayvan Refahı ve Etik İnceleme Kurulu tarafından onaylandı.
1. Tamponların hazırlanması
NOT: Protokolün bu kısmı, 1x konsantrasyonda modifiye Krebs-Henseleit Tamponunun (mKHB) hazırlanmasını içeren son adımlar hariç, protokolün geri kalanından çok önce gerçekleştirilebilir.
- 1 M CaCl2 stok çözümü hazırlayın
- Temiz bir 100 mL beherine 14.701 g CaCl2 dihidrat ekleyin. ~ 75 mL deiyonize su ekleyin ve tuzun tamamen çözünmesine kadar karıştırın.
- Çözeltiyi 100 mL dereceli bir şişeye aktarın ve 100 mL hacme ulaşana kadar deiyonize su ekleyin. Çözeltiyi bir şişeye aktarın ve 4 ° C'de bir buzdolabında saklayın.
- 10x konsantre mKHB stoğu hazırlayın
- 2 L'lik bir beherin içine 66.03 g sodyum klorür (NaCl), 3.57 g potasyum klorür (KCl), 1.63 g potasyum dihidrojen fosfat (KH2PO4) ve 1.44 g magnezyum sülfat ekleyin.
- Behere ~ 750 mL deiyonize su ekleyin ve tuzlar çözünene kadar karıştırın (altta küçük tuz kristalleri kalabilir). 25 mL'lik 1 M CaCl2 stok çözeltisi ekleyin (adım 1.1) ve karıştırın; bunun eklenen son tuz olduğundan emin olun.
- Çözeltiyi 1 L'lik dereceli bir şişeye aktarın ve toplam 1 L'lik bir hacme ulaşmak için deiyonize su ekleyin. Konsantre 10x mKHB'yi 4 ° C'de buzdolabında saklayın.
NOT: Konsantre mKHB stoğu, değiştirilmeden önce yaklaşık 1 ay saklanabilir.
- Diseksiyon hazırlama Petri kabı (kaplama)
- Bulaşığı dikkatlice yıkayarak ve kurutarak kaplama için temiz bir cam Petri kabı (120 mm çapında) hazırlayın.
- Konformal alkoksi kaplamanın kullanımı ve kürlenmesi için üreticinin talimatlarını takiben, konformal kaplama karışımını istenen kalınlığa ulaşana kadar dikkatlice kabın içine dökerek Petri Tabağının tabanını ~ 3-5 mm kaplama ile kaplayın.
- Kaplamayı 60 °C'de bir fırında, dokunuşa sıkı sıkıya dayanana kadar kürleyin. Diseksiyon Petri kabı şimdi hazır.
NOT: Her kullanımdan sonra kabın nazikçe temizlenmesi, kaplamanın değiştirilmesi gerekmeden önce yıllarca dayanmasını sağlayacaktır. Kaplamayı değiştirirken, yeni bir kaplama uygulamadan önce tüm kaplama malzemesini çıkardığınızdan emin olun. Bu protokolde kullanılan konformal alkoksi kaplamanın (Malzeme Tablosu) bir yıldan daha kısa bir raf ömrüne sahip olduğunu unutmayın.
2. Diseksiyon öncesi hazırlıklar
NOT: Bu adım denemeyi başlatır. Aşağıdaki adımlar aynı gün, bu sırayla gerçekleştirilmelidir.
- 1x mKHB hazırlayın
- Tampon için temiz bir 2 L beher hazırlayın. 200 mL 10x mKHB stoğunu 2 L beherine aktarın. 2 L beherine 2.1 g sodyum karbonat (NaHCO3) ve 0.99 g susuz Dekstroz (D-glikoz) ekleyin.
- Behere yaklaşık 1 L deiyonize su ekleyin. Tuzlar tamamen çözülene kadar karıştırın. Çözeltiyi 2 L dereceli bir şişeye aktarın ve toplam 2 L'lik bir hacme ulaşmak için deiyonize su ekleyin.
- Çözeltiyi, sıcaklığı 37 ° C'ye ayarlanmış bir ısıtma karıştırıcısına yerleştirilmiş 2 L'lik bir cam şişeye aktarın.
NOT: Daha küçük ısıtma karıştırıcısı, su dolu büyük kapların termal ataleti nedeniyle genellikle hedef 37 °C sıcaklığa ulaşamaz. Sıcaklığı yukarı doğru ayarlayın, böylece şişenin içeriği karıştırma ile 37 ° C'ye ulaşır. Deney sırasında sıcaklığı izleyin ve aşım durumunda ayarlanan sıcaklığı düşürün. - Sıcaklığı izlemek için 2 L'lik şişeye bir termometre yerleştirin, termometrenin karıştıran pireden etkilenmesini önlemek için tutucular kullanın. Çözeltiyi oksijenlendirmek için tamponu karbojenle en az 30 dakika havalandırın. Bu, pH'ı 7.4'e ayarlamalıdır. pH değerini bir pH metre ile ölçün, pH değeri 7,4'ün 0,1 pH birimi (37 °C'de) içinde olduğundan emin olun.
NOT: PH'ı 7,4'e ayarlamak için, gerektiğinde hidroklorik asit veya sodyum hidroksit kullanın. - İki adet 15 mL santrifüj tüpü ve bir adet 100 mL şişeyi mKHB ile doldurun ve soğuması için buzun üzerine yerleştirin.
NOT: Santrifüj tüpleri ve şişe, otoklavlama yapılmadan her deneyden sonra temizlenebilir ve tekrar kullanılabilir. - Deneyin sonraki bölümleri için, 2 L şişedeki tamponu 37 ° C'de karbojenle sürekli karıştırma ile havalandırmaya devam edin.
NOT: Denetimsiz karbojen kullanımı, sızıntı durumunda gaz akışını kapatmak için otomatik sistemler mevcut değilse tehlikeli olabilir. Otomatik bir sensör ve elektronik kapatma valfi bunu hafifletebilir; Aksi takdirde, diseksiyon farklı bir odada gerçekleşirse, ekipmanı denetlemek için bir kişi bırakılmalıdır. Her durumda, ortam oksijen konsantrasyonu %25'in üzerine çıktığında operatörleri uyarmak için kurulumun yakınında bir oksijen sensörü kullanılmalıdır. Mümkünse aktif havalandırmalı bir oda kullanın.
- Sıcaklık stabilizasyonu için yeterli zaman tanımak üzere sinyal alma cihazını, düşük gürültülü ön amplifikatörü, hat gürültü filtresini ve kayıt ve stimülasyon için osiloskobu açın.
- Tüm elektrikli kayıt ekipmanlarının doğru yapılandırıldığından emin olun
- Giriş bandı geçiş filtresi on yılda 6 dB yuvarlanmaya ayarlanmış ve kesme frekansları yüksek geçişli ve alçak geçirgen filtreler için sırasıyla 30 Hz ve 3 kHz'e ayarlanmış olarak düşük gürültülü ön amplifikatörü AC bağlantılı girişe ayarlayın.
- Düşük gürültülü ön amplifikatörün kazancını 100 olarak ayarlayın.
3. Hayvan anestezisi ve ötenazi
NOT: Çalışmalarda 250 ila 330 g (Malzeme Tablosu) arasındaki dişi sıçanlar kullanılmıştır.
- Cerrahi aletler ve sarf malzemeleri hazırlayın: 12 cm düz makas (künt); 2 mm kesme kenarı açılı yaylı makas; 4 cm ince makas, keskin veya yarı keskin; #7 Dumont forseps; 45° açılı ince forseps ve 6-0 dikiş ipeği veya iplik.
- Sıçanı bir anestezi kabına veya odasına yerleştirin. Oksijen ve anestezik difüzörü kaba bağlayın. Anestezik (izofluran) konsantrasyonunu% 3.5'e ayarlayın ve yaklaşık 10 dakika veya hayvan sağ refleks kaybı gibi anestezi belirtileri gösterene kadar bekleyin.
- Sıçan anestezi belirtileri gösterdikten sonra, bir ayak parmağı sıkışma yoksunluk refleks testi ile bilinç kaybını onaylayın. Sadece ayak parmağı çekilmesi olmadığında devam edin; aksi takdirde, difüzördeki tüm bağlantıları ve anestezik seviyeleri kontrol edin ve adım 3.2'yi tekrarlayın.
- Hayvanı kaptan çıkarın ve servikal çıkık ile devam edin, ardından ölümün doğrulanması için femoral arterin kesilmesi ile devam edin.
4. Diseksiyon protokolü
NOT: Hayvanı göbeği aşağı bakacak şekilde diseksiyon masasına yerleştirin. Her iki bacak için de aşağıdaki adımları tekrarlayın. Tipik olarak, önce sağ bacak diseke edilir.
- Ayak bileğini başparmak, işaret parmağı ve orta parmak arasında sıkıca tutarak, kalkaneal tendonu 12 cm düz künt makas kullanarak kesin.
- İnce keskin makaslarla, bacağın arkasındaki kalkaneal tendondan omurganın tabanına kadar bir cilt kesisi yapın, aşağıdaki kas dokusunu diseke etmemeye dikkat edin.
- İnce forseps ve ince makas kullanarak, siyatik sinir açığa çıkana kadar bacağın arkasının ortasına yakın kas katmanlarından dikkatli kesikler yapın. Siyatik sinir görünür olur olmaz, sinirin kurumasını önlemek için buz gibi soğuk mKHB kullanarak boşluğu nemlendirin.
- Hemostatları kullanarak, her iki taraftaki cilt kapaklarını birbirinden ayırın ve daha ince diseksiyon çalışmaları için insizyonu açık tutun. Kalkaneal tendon insizyonunun bulunduğu yerden başlayarak, ince makasla, siniri serbest bırakmak için bacağın medial tarafındaki kası kesin. Buz gibi soğuk mKHB ile bölgedeki nem seviyelerini korumaya devam edin.
- Bacak yukarı doğru hareket ederken sinir açığa çıktığından, üstteki kas dokusunu disseke edin. Omurgaya yakın olan siniri, omurga yarığına ulaşana kadar bağ dokularından serbest bırakın, bu noktada sinirde bir bükülme vardır. Bu aşamada hız çok önemli olduğu için siniri henüz temizlemeye çalışmayın.
- Siniri omurgaya mümkün olduğunca yakın bir yerde ince makasla kesin. Diseksiyonu kolaylaştırmak için, forseps kullanarak sinirin ucunu ayak bileğinin yanına çok nazikçe çekin. Siniri asla ortada tutmayın, sadece uçları sıkıştırın. Asla siniri gergin çekmeyin.
İSTEĞE BAĞLI: Bu noktada, zaman izin verirse, canlılığın korunmasına yardımcı olmak için sinirin her iki ucunun dikilmesi gerçekleştirilebilir. Hasarı önlemek için elleçlemeyi minimumda tutun. Yeterli zaman yoksa (bkz. adım 4.5), bu adımı atlayın ve sonraki adım 5.2'yi izleyin. - Disseke edilmiş siniri mKHB ile doldurulmuş 15 mL santrifüj tüpüne yerleştirin (adım 2.1.5), tüpü kapatın ve temizleme prosedürünün başlamasına kadar tüpü tekrar buzun üzerine yerleştirin.
- Diğer bacak için 4.1-4.7 arasındaki adımları yineleyin. İdeal olarak, doku canlılığını en üst düzeye çıkarmak için her sinirin çıkarılması 5-10 dakika sürmelidir.
5. Sinir temizleme prosedürü
- Kaplanmış Petri kabını yaklaşık olarak yarı yarıya soğutulmuş oksijenli mKHB ile doldurun. Disseke edilmiş siyatik sinirlerden birini tabağa yerleştirin ve sinirin her iki ucunu da çanağa sabitleyin, böylece sinir bükülme, burulma veya bükülme olmadan düz olur. Siniri uçlarına mümkün olduğunca yakın tutun.
- 6-0 ipek dikiş veya ince iplik kullanarak, tampona sitosol sızıntısını önlemek için sinirin her iki ucuna çift düğüm bağlayın. Düğümleri, sinir merkezine daha yakın olan taraftaki böcek pimlerinin hemen yanına yerleştirin, çünkü bu, sinir dokusundan tampona sızmayı önleyecektir. Sinir daha önce bağlanmışsa bu adımı uygulamayın.
- Hassasiyet için mikroskop ve 2 mm açılı yay makası kullanarak, sinirden yağ, kan damarları ve kas dokusunu çıkarın. Stimülasyon ve kayıt protokolünde kullanılmayacak sinir dallarını budayın.
- Her 5 dakikalık temizlikte, tamponu taze soğutulmuş oksijenli mKHB ile değiştirin. Diseksiyonu kolaylaştırmak için bağ dokularını, yağ ve kan damarlarını çekmek için ince forseps kullanın.
- Sinirleri taze oksijenli soğutulmuş mKHB ile doldurulmuş taşıma tüplerine geri yerleştirin ve tüpleri buzun üzerine yerleştirin.
6. Ekipman kurulumu
NOT: Deneyleri gerçekleştirmek için kullanılan ekipman kurulumu Şekil 1'de gösterilmiştir. Kısaca, çift bölmeli bir sinir banyosu, bir ısıtma karıştırıcısına yerleştirilmiş 2 L'lik bir şişe, tampon havalandırması için bir karbojen kaynağı ve tamponun şişeden banyoya ve peristaltik bir pompa kullanarak şişeye geri akmasına izin veren borulardan oluşur. Banyo, pleksiglastan veya su geçirmez malzemelerden 3D baskıdan işlenebilir. Yaklaşık 2 cm derinliğe sahiptir ve banyonun iki odacığını ayıran bölme, periferik bir sinirin her iki odacıkta da dişlenmesine izin vermek için 1,5 mm çapında bir deliğe sahiptir. Bir oda büyüktür, en az 4 veya 5 cm uzunluğunda olmalı ve tamponla doldurulacaktır. Diğer hazne en az 3 cm uzunluğunda olmalı ve silikon veya mineral yağ ile doldurulmalıdır. Banyo çok büyük yapılmamalıdır, çünkü bu perfüzyon, sıcaklık ve pH kontrolünü bozacaktır. İncelenen sinir dokusunun boyutuna bağlı olarak farklı banyo boyutları gerekebilir.
- Temiz bir çift odacıklı sinir banyosu hazırlayın (tasarım özellikleri için Ek Dosya'ya bakınız). Sinir banyosunu, standart laboratuvar patron kafalarını ve tutucuları kullanarak ısıtma karıştırıcısına yerleştirilen 2 L'lik şişenin seviyesinin altına yerleştirin. Banyonun tahliyesini peristaltik pompa girişine bağlayın.
- Peristaltik pompanın çıkışını 2 L tampon şişesine geri giden bir tüpe bağlayın. Banyo girişini ayarlanabilir bir akış valfi ile bir tüpe bağlayın ve tüpü 2 L şişenin içine yerleştirin. Yerçekimi destekli tampon girişi için tüpün sifon olarak astarlanmasına yardımcı olması için orta çıkışa bağlı bir şırıngaya sahip üç bir valf kullanın.
- Şırıngayı tampon içine akana kadar çekerek sifonu astarlayın. Vanayı, tamponun banyoya akış hızı ~ 5-6 mL · min-1 olacak şekilde yapılandırın. Banyoyu doldurmak için akış başlangıçta arttırılabilir. Banyo tamponu seviyesi drenaja ulaştığında, sinirleri banyoya yerleştirin.
- Bir böcek pimi kullanarak, sinirin ucunu tampon dolu banyo odasının köşesine sabitleyin. 45° açılı ince forseps kullanarak ve siniri sadece uçlarından sıkıştırarak, iki banyo odası arasındaki bölmedeki delikten uyarılmak üzere siniri dikkatlice geçirin.
- Sinirin diğer ucunu banyonun yağ odasına bir böcek pimi ile sabitleyin, sinirin gerilmeden düz olmasını ve bükülme ve bükülmelerden arındırılmış olmasını sağlayın. Silikon gres kullanarak, tampon odasından yağ odasına tampon sızıntısını önlemek için bir sızdırmazlık yapın. Yağ haznesini silikon veya mineral yağ ile doldurun.
- Ag/AgCl kayıt elektrot kancalarını yağ banyosu odasına yerleştirin ve patron kafaları ve tutucular kullanarak sabitleyin. Yağ banyosundaki sinirin bir kısmını, siniri gerginleştirmeden kancaların üzerine örtün. Siniri sıkıştırmayın; siniri sıkıştırmadan kaldırmak için açılı forseps kullanın.
- Siniri hareket ettirdikten sonra herhangi bir sızıntı gözlenirse silikon gres contasını ayarlayın veya onarın.
- Referans Ag/AgCl elektrodunu amplifikatör toprağına bağlayın ve elektrodu bir laboratuvar tutucusu kullanarak sabitleyerek tampon dolu banyo odasına yerleştirin.
7. Banyoda sinire elektrot implantasyonu
- Referans21'e göre stimülasyon için temiz bir sinir manşet elektrodu hazırlayın. Elektrodu tampon dolu banyo odasına yerleştirin. Forseps veya künt veya açılı uçlu ince cımbız kullanarak, manşetin içini ıslatmak için banyodaki elektrodu açın.
- Kabarcıklar kalırsa, banyodan tampon çekmek için ince bir şırınga kullanın ve kabarcıkları manşetten dışarı çıkmaya zorlayın. Sinirin altında bir cımbızla, manşeti yavaşça açın ve sinirin altına kaydırın. Sinirin etrafındaki manşeti kapatın, sinirin bükülmesini veya bükülmesini önlemeye özen gösterin.
- Stimülasyon elektrodunu stimülatöre bağlayın ve stimülasyon elektrodu kablosunu bantla sabitleyin. Mevcut dönüş elektrodunu stimülatöre bağlayın ve kabloyu bantla sabitleyin. Akım dönüş elektrodu olarak kare platin bir tabaka kullanıyorsanız, tabakayı banyodaki sinirden uzağa yerleştirin.
8. Stimülasyon ve kayıt
- Stimülatör TTL sinyal çıkışını, osiloskobu tetiklemek için kullanılacak olan osiloskobun kanal 4'üne bağlayın. Osiloskop ekranında, Tetikleyici kanal sekmesine basın ve tetikleyici kanal olarak Kanal 4'ü belirtin. Seviye düğmesini kullanarak tetikleme düzeyini 1 V olarak ayarlayın.
- Osiloskopta, zaman çözünürlüğünü 1 ms / bölmeye ve voltaj çözünürlüğünü 10 mV / bölmeye ayarlayın. Tetikleyici referansını zamanında ortalayın ve tetikleyici düzeyini 1 V olarak ayarlayın.
NOT: Özel uyarıcı kullanıyorsanız 8.3 ile 8.6 arasındaki adımları izleyin (bkz. MATLAB yazılımının ve aygıt sürücülerinin, özel nöral uyarıcı21 için çevrimiçi olarak serbestçe sağlanan talimatlar kullanılarak laboratuvar bilgisayarına yüklendiği varsayılmaktadır. Aksi takdirde, alternatif olarak ticari olarak temin edilebilen bir uyarıcının kullanımı için üreticinin talimatlarını izleyin. - Stimülatörün laboratuvar bilgisayarına bağlanmasını sağlayın. Pil güç kaynağını güç girişine bağlayarak uyarıcıyı açın. Laboratuvar bilgisayarında MATLAB yazılımını başlatın.
- Özel MATLAB komut dosyasını yürütün: HFAC_4ch_Stimulator_Initialization.m (Malzeme Tablosu).
NOT: Bilgisayar ve uyarıcı arasındaki USB iletişim kablosu yeşil renkte yanıp sönmelidir. Olmazsa, bir yapılandırma hatası vardır ve güç kaynağı ve bağlantılar doğrulanmalıdır. - MATLAB komut dosyasını açın: HFAC_4ch_Monophasic_Stimulation.m (Malzeme Tablosu). MATLAB betiğini doğrudan düzenleyerek, parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın: uyarıcı darbe genliği = -300 μA, uyarıcı darbe genişliği = 300 μs, uyarıcı darbe sayısı = 10 ve darbeler arasındaki uyarıcı süresi = 1 s.
- MATLAB yazılımında Çalıştır'a tıklayarak stimülasyon protokolünü başlatın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol ile elde edilebilecek temsili sonuçlar, siyatik sinir içindeki A-tipi sinir liflerinden tutarlı bileşik aksiyon potansiyelleridir. Bu aksiyon potansiyelleri tipik olarak elektrotta yaklaşık 1 mV'luk bir tepeden tepeye genliğe sahiptir ve bu nedenle bir kez yükseltildiğinde 100 mV'dur (Şekil 2). Benzer stimülasyon genlikleri ve darbe genişlikleri benzer CAP genlikleri vermelidir. İletken elastomer manşet elektrotları, ticari olarak temin edilebilen platin manşet elektrotlarına kıyasla aynı CAP genliğini elde etmek için genellikle biraz daha yüksek stimülasyon genliklerine ihtiyaç duyacaktır. Bu fark, farklı hayvanlardan gelen sinirleri uyarmak için gereken stimülasyon genliğindeki varyasyona kıyasla genellikle küçüktür. Bunun nedeni, sinir boyutundaki ve manşet uyumundaki küçük farklılıkların, manşet malzemesinden bağımsız olarak, belirli bir CAP genliği elde etmek için gerekli stimülasyon genliği üzerinde büyük bir etkiye sahip olmasıdır. Bu, farklı iyon konsantrasyonları veya tetrodotoksin gibi sinir uyarıcı veya inhibitör maddelerin eklenmesi gibi farklı tampon bileşimlerinin etkilerini test etmek için kullanılabilir. Tampon atık borusu ekstra bir kaba yönlendirilirse, sinir uyarılabilirliğini değiştiren maddelerin eklenmesi, tampon giriş hızına bağlı olarak yıkama oranları ile deney için geçici hale getirilebilir.
A tipi lifleri aktive etmek ve osiloskopun gözlemlenebilir bir bileşik aksiyon potansiyelini elde etmek için gerekli olan stimülasyon genliğinin stimülasyon elektrotlarının yüzey alanına bölünmesiyle hesaplanan minimum akım yoğunluğu, Şekil 3'teki darbe genişliğine karşı çizilmiştir. Şekil 3'te gösterilen sonuçlar, hem ticari olarak temin edilebilen standart platin sinir manşetleri hem de ısmarlama iletken elastomer sinir manşetleri için tipik sinir uyarılabilirliğini temsil etmektedir.
Ekstrakte edilen sinirler, ekstraksiyondan sonra yaklaşık 6 saat boyunca canlı kalmalıdır ve bu nedenle, deneyler bu zaman penceresine sığmalıdır. Sinir canlılığının kaybı, CAP genliğinde ve iletim hızında ilerleyici bir düşüşe yol açar. Aksiyon potansiyeli genliği, başlangıç genliğinin% 50'sinin altına düştükten sonra (kayıt başlangıcında), sonuçlar önemli ölçüde çarpık olacağından, sinirin artık uygun olmadığı düşünülmelidir. Sinir ömrü ile ilgili temsili sonuçlar Şekil 4'te gösterilmiştir. Sağ ve sol siyatik sinirler, belirli bir günde 10: 00-11: 00 saatleri arasında bir hayvandan çıkarıldı. Deneylerden önceki ilk testler sırasında ilk CAP'ler sağ siyatik sinirden, deneylerin sonunda ise bu protokol kullanılarak canlı tutulan sol ve sağ siyatik sinirlerden standart CAP'ler elde edildi. Sağ siyatik sinir ile minimal CAP genlik azalması gözlenirken, yaklaşık 3 mV'deki sol siyatik sinir CAP genliği, sinir ekstraksiyonundan 6 saatten fazla bir süre sonra deneyin başlangıcındaki sağ siyatik sinirinkine benzerdi.
Şekil 1: Protokolde kullanılan deney düzeneğinin şematik gösterimi. Bu rakam Rapeaux, A. et al. (2020)20'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Metalik ve iletken elastomer sinir manşet dizileri tarafından stimülasyonu takiben ex vivo elde edilen temsili CAP'ler elde edildi. Cuttaz, E. A. et al. (2021)22'den yapılan değişikliklerle çoğaltılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Metalik ve iletken elastomer manşet dizilerinin A-fiber aktivasyon eşiği. Hata çubukları, ortalamadan ±1 standart sapmayı temsil eder. Cuttaz, E. A. et al. (2021)22'den yapılan değişikliklerle çoğaltılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Temsili CAP'ler bir günlük deneyler boyunca ve bir hayvandan her iki siyatik siniri kullanarak ex vivo elde ettiler. (A) Sağ siyatik sinirden öğlene yakın elde edilen A tipi fiber CAP. (B) Öğleden sonra sol siyatik sinirden elde edilen A-tipi fiber CAP. (C) (B)'de aynı sol siyatik sinir ile yapılan deneyler sonunda elde edilen A-tipi fiber CAP. X ekseni, kayıtların alındığı günün saatine karşılık gelir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, sıçan siyatik sinirlerini ex vivo nörofizyolojiye hazırlamak için bir protokol tanımladık. Doku ekstraksiyonu, hayvan taşıma, anestezi, itlaf ve diseksiyon dahil olmak üzere yaklaşık 30 dakika sürerken, sinir temizliği, banyoya yerleştirme ve elektrot implantasyonu, kayda başlamadan önce 30 dakika daha gerektirmelidir. Tampon hazırlığı 30 dakika içinde gerçekleştirilebilir, ancak bu deneyin geri kalanından önce yapılabilir. Bu tür bir hazırlık ve deney, benzer tamponlar kullanılarak ve aynı doku tipi için son 7,12'de kullanılmış ve tanımlanmıştır. Bununla birlikte, yazarların bilgisine göre, tampon hazırlama, diseksiyon, ekipman kurulumu ve müteakip kaydın bir açıklaması aynı belgede ilk kez verilmiştir.
Bu protokol, nörofizyolojide in vitro veya in vivo bağlamlarda mümkün olmayacak çok çeşitli deneylere olanak sağlayabilir. Örneğin, ex vivo preparatların bir avantajı, bu dokuyu vücudun geri kalanından izole ederken, çıkarılan dokunun makro ve mikro yapısını korumalarıdır. Bu, anestezinin sürdürülmesi gerekmediği için daha basit bir kurulumla sonuçlanır, aksi takdirde in vivo deneylerde bir gerekliliktir. Deneylerin etkinleştirilmesi açısından, ex vivo preparatlar, hayvan için yüksek risk taşıdıkları için in vivo bağlamda23 haklı çıkarılması zor olan tetrodotoksin gibi maddelerin kullanılmasına izin verir. Bu tür maddelerin kullanımı araştırmaya fayda sağladığında, ex vivo preparatlarda kullanımı daha kolaydır. Özel uyarıcı20'nin kullanımı, bu deney düzeneğini kullanarak nöromodülasyon için HFAC bloğu kullanan deneylere olanak tanır.
Protokoldeki en kritik adım diseksiyon adımıdır, çünkü diseksiyon makası kullanan küçük bir hata bile yeterli özen gösterilmezse sinire zarar verebilir. Bu aşamadaki hız da önemlidir, çünkü doku vücuttan hızla çıkarılmalı ve kaydın başlangıcında canlılığı en üst düzeye çıkarmak için soğutulmuş bir tampona yerleştirilmelidir. Doku ekstraksiyonundan sonra, siniri temizlerken ve herhangi bir elektrot implante ederken dikkatli olunması gerekirken, protokol zamana göre daha esnektir ve bu nedenle operatör hatası riski daha düşüktür. Sinir çapları ve fasiküllerin sinirler içindeki yerleşimi hayvandan hayvana değişeceğinden, aynı elektrotlar ve stimülasyon protokolü kullanılsa bile sonuçlarda bazı değişkenlikler beklenmelidir. Bu değişkenliğin etkisi, Şekil 3'teki stimülasyon eşikleri için hata çubuklarında görülebilir. Preparatın herhangi bir aşamasında siniri sıkıştırmamak önemlidir, çünkü bu dokuda geri dönüşü olmayan hasara neden olabilir. Forseps kullanarak siniri sadece uçlarından tutun ve siniri gerginleştirmemeye özen gösterin.
Protokolün mevcut haliyle çeşitli yönleri, ekipman miktarını ve kurulum süresini artırarak geliştirilebilir. Bu deney düzeneği ile ilgili potansiyel sorunların teşhisine yardımcı olmak için, banyodaki pH ve çözünmüş oksijenin otomatik ölçümleri yararlı olabilir, ancak burada uygulanmamıştır. Her iki ölçüm de amperometrik veya potansiyometrik yöntemler kullanılarak elde edilebilir12,19. Düzenli bakım gerektirecek ekipman, zamanla tuz birikintileri biriktiren boru ve cam eşyalardır. AgCl kayıt kancaları, AgCl referansı ile birlikte düzenli olarak yeniden kaplama veya değiştirme gerektirecektir. Stimülasyon elektrotları her kullanımdan sonra temizlenmelidir, ancak genellikle birçok deney için değiştirilmesi gerekmeyecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların çıkar çatışması yoktur.
AÇIK ERİŞİM BİLDİRİMİ:
Açık erişim amacıyla, yazar ortaya çıkan herhangi bir Yazar Kabul Edilen Makale sürümüne bir Creative Common Atıf (CC BY) lisansı (UKRI tarafından izin verildiği durumlarda, 'Open Government License' veya 'Creative Commons Attribution No-derivatives (CC BY-ND) lisansı belirtilebilir) uygulamıştır.
VERİ PAYLAŞIMI:
Bu makalenin rakamlarında kullanılan ham veriler, yazarlar tarafından gereksiz bir çekince olmaksızın kullanıma sunulacaktır.
Acknowledgments
Yazarlar, GlaxoSmithKline Pharmaceuticals, Prusya Kralı, PA, ABD ve Galvani Bioelectronics'ten (Stevenage, İngiltere) Dr. Gerald Hunsberger'e orijinal sinir hazırlama tekniklerini bizimle paylaştıkları için teşekkür eder. Yazarlar, Çift Odacıklı sinir banyosu tasarımı için Robert Toth'u kabul ediyor. Yazarlar, Mühendislik ve Fiziksel Bilimler Araştırma Konseyi'nin (EPSRC) Sağlık Teknolojileri Mücadelesi Ödülleri (HTCA) hibesinden gelen finansmanı kabul etmektedir. Yazarlar, Adrien Rapeaux'yu (EP / L016796 / 1) finanse etmek için Imperial College London'ın Yüksek Performanslı Gömülü ve Dağıtılmış Sistemler Doktora Eğitimi Merkezi'ni (HiPEDS CDT) kabul etmektedir. Adrien Rapeaux şu anda İngiltere Demans Araştırma Enstitüsü, Bakım Araştırma ve Teknoloji Merkezi tarafından finanse edilmektedir. Yazarlar, JoVE video makalesinin üretimi sırasında deneyler ve hayvan dokularına erişim konusunda yardım için Imperial College'dan Zack Bailey'e Biyomühendislik Bölümü'nden minnetle teşekkür ediyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1595 | Borosilicate glass |
| 1 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | 612-3626 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1596 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | BRND937254 | Borosilicate glass |
| Adaptor, pneumatic, 8 mm to 1/4 NPT | RS UK | 536-2599 | push-to-fit straight adaptor between oxygen hose and gas dispersion tube |
| Alkoxy conformal coating | Farnell | 1971829 | ACC15 Alkoxy conformal coating for dissection petri dish preparation |
| Anesthetic | Chanelle | N/A | Isoflurane inhalation anesthetic, 250 mL bottle |
| Beaker, 2 L | VWR International Ltd | 213-0469 | Borosilicate glass |
| Bipolar nerve cuff | Cortec GMBH | N/A | 800 micron inner diameter, perpendicular lead out, no connector termination |
| Bossheads | N/A | N/A | Standard wet laboratory bossheads for attaching grippers to rods |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902-500g | 500 g in plastic bottle |
| Carbogen canister | BOC | N/A | F-size canister |
| Centrifuge Tubes, 15 mL volume | VWR International Ltd | 734-0451 | Falcon tubes |
| Conductive elastomer nerve cuff | N/A | N/A | high charge capacity nerve cuff for stimulation, see protocol for fabrication reference |
| Connector, Termimate | Mouser UK | 538-505073-1100-LP | These should be soldered to wire terminated with crocodile clips (see entry 11) |
| Crocodile clip connectors | RS UK | 212-1203 | These should be soldered to wire terminated with TermiMate connectors (see entry 10) |
| Deionized Water | N/A | N/A | Obtained from deionized water dispenser |
| Forceps angled 45 degrees | InterFocus Ltd | 91110-10 | Fine forceps, student range |
| Forceps standard Dumont #7 | InterFocus Ltd | 91197-00 | Student range forceps |
| Gas Disperson Tube, Porosity 3 | Merck | 12547866 | N/A |
| Glucose anhydrous, powder | VWR International Ltd | 101174Y | 500 g in plastic bottle |
| Grippers | N/A | N/A | Standard wet laboratory rod-mounted grippers |
| Heating Stirrer | RS UK | 768-9672 | Stuart US152 |
| Hemostats | N/A | N/A | Any hemostat >12 cm in length is suitable |
| Insect Pins, stainless steel, size 2 | InterFocus Ltd | 26001-45 | N/A |
| Laptop computer | N/A | N/A | Any laboratory-safe portable computer with at least 2 unused USB ports is suitable |
| Line Noise Filter | Digitimer | N/A | Humbug noise eliminator (50 Hz line noise filter) |
| Low-Noise Preamplifier, SR560 | Stanford Research Systems | SR560 | Low-noise voltage preamplifier |
| Magnesium Sulphate salt | VWR International Ltd | 291184P | 500g in plastic bottle |
| MATLAB scripts | Github | https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch | Initialization, calibration and stimulation scripts for the custom stimulator |
| MATLAB software | Mathworks | N/A | Standard package |
| Microscope Light, PL-2000 | Photonic | N/A | Light source with swan necks. Product may be obtained from third party supplier |
| Microscope, SMZ 745 | Nikon | SM745 | Stereoscopic Microscope |
| Mineral oil, non-toxic | VWR International Ltd | 31911.A1 | Oil for nerve bath |
| Nerve Bath | N/A | N/A | Plexiglas machined nerve bath, see protocol for details. |
| Oscilloscope | LeCroy | N/A | 434 Wavesurfer. Product may be obtained from 3rd party suppliers |
| Oxygen Hose, 1 meter | BOC | N/A | 1/4" NPT terminations |
| Oxygen Regulator | BOC | C106X/2B:3.5BAR-BS3-1/4"NPTF 230Bar | N/A |
| Peristaltic Pump P-1 | Pharmacia Biotech | N/A | Product may be obtained from third party supplier |
| Petri Dish, Glass | VWR International Ltd | 391-0580 | N/A |
| Potassium Chloride salt | Sigma Aldrich | P5405-250g | 250 g in plastic bottle |
| Potassium Dihydrogen Sulphate salt | Merck | 1.04873.0250 | 250 g in plastic bottle |
| Rat | Charles River Laboratories | N/A | Sprague Dawley, 250-330 grams, female |
| Reference electrode, ET072 | eDaQ (Australia) | ET072-1 | Silver silver-chloride reference electrode |
| Rod | N/A | N/A | Standard wet laboratory rods with fittings for stands |
| Scale | Sartorius | N/A | M-Power scale, for weighing powders. Product may be obtained from third-party suppliers |
| Scissors straight 12 cm edge | InterFocus Ltd | 91400-12 | blunt-blunt termination, student range |
| Signal Acquisition Device | Cambridge Electronic Design | Micro3-1401 | Micro3-1401 Multichannel ADC |
| Silicone grease, non-toxic | Farnell | 3821559 | for sealing of bath partition |
| Silicone tubing, 2 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silicone tubing, 5 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silver wire | Alfa Aesar | 41390 | 0.5 mm, annealed |
| Sodium Bicarbonate salt | Sigma Aldrich | S5761-500g | 500 g in plastic bottle |
| Sodium Chloride salt | VWR International Ltd | 27810.295 | 1 kg in plastic bottle |
| Spring scissors angled 2 mm edge | InterFocus Ltd | 15010-09 | N/A |
| Stand | N/A | N/A | Standard wet laboratory stands with sockets for rods |
| Stimulator | Digitimer | DS3 | DS3 or Custom Stimulator (see references) |
| Stirring flea | VWR International Ltd | 442-0270 | For use with the heating stirrer |
| Syringe tip, blunt, 1 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe tip, blunt, 2 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe, plastic, 10 mL volume | N/A | N/A | syringe should have luer lock fitting |
| Tape, water-resistant | N/A | N/A | For securing tubing and wiring to workbench |
| Thermometer | VWR International Ltd | 620-0806 | glass thermometer |
| USB Power Bank | RS UK | 135-1000 | Custom Stimulator power supply, fully charge before experiment. Not needed if using DS3 |
| Valve, Leuer Lock, 3-Way | VWR International Ltd | 229-7440 | For attaching syringe to bath feed tube and priming siphon |
References
- McIntyre, C. C., Richardson, A. G., Grill, W. M. Modeling the excitability of mammalian nerve fibers: Influence of afterpotentials on the recovery cycle. Journal of Neurophysiology. 87 (2), 995-1006 (2002).
- Pelot, N. A., Grill, W. M. In vivo quantification of excitation and kilohertz frequency block of the rat vagus nerve. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026005 (2020).
- Patel, Y. A., Kim, B. S., Rountree, W. S., Butera, R. J. Kilohertz electrical stimulation nerve conduction block: Effects of electrode surface area. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 25 (10), 1906-1916 (2017).
- Kortelainen, J., Al-Nashash, H., Vipin, A., Thow, X. Y., All, A. The effect of anaesthesia on somatosensory evoked potential measurement in a rat model. Laboratory Animals. 50 (1), 63-66 (2016).
- Oh, S. S., Hayes, J. M., Sims-Robinson, C., Sullivan, K. A., Feldman, E. L. The effects of anesthesia on measures of nerve conduction velocity in male C57Bl6/J mice. Neuroscience Letters. 483 (2), 127-131 (2010).
- Kuffler, S. W., Williams, E. M. V. Small-nerve junctional potentials. The distribution of small motor nerves to frog skeletal muscle, and the membrane characteristics of the fibres they innervate. The Journal of Physiology. 121 (2), 289-317 (1953).
- Brunton, E., Blau, C. W., Nazarpour, K. Separability of neural responses to standardised mechanical stimulation of limbs. Scientific Reports. 7 (1), 11138 (2017).
- Schmalbruch, H. Fiber composition of the rat sciatic nerve. The Anatomical Record. 215 (1), 71-81 (1986).
- Kagiava, A., Theophilidis, G. Assessing the permeability of the rat sciatic nerve epineural sheath against compounds with local anesthetic activity: an ex vivo electrophysiological study. Toxicology Mechanisms and Methods. 23 (8), 634-640 (2013).
- Motori, E., et al. Neuronal metabolic rewiring promotes resilience to neurodegeneration caused by mitochondrial dysfunction. Science Advances. 6 (35), 8271 (2020).
- Schwarz, J. R., Eikhof, G. Na currents and action potentials in rat myelinated nerve fibres at 20 and 37° C. Pflügers Archiv. 409 (6), 569-577 (1987).
- Cranefield, P. F., Brink, F., Bronk, D. W. The oxygen uptake of the peripheral nerve of the rat. Journal of Neurochemistry. 1 (3), 245-249 (1957).
- Lehmann, J. E. The effect of changes in pH on the action of mammalian A nerve fibers. American Journal of Physiology-Legacy Content. 118 (3), 600-612 (1937).
- Hamm, L. L., Nakhoul, N., Hering-Smith, K. S.
- Minasian, S. M., Galagudza, M. M., Dmitriev, Y. V., Kurapeev, D. I., Vlasov, T. D. Myocardial protection against global ischemia with Krebs-Henseleit buffer-based cardioplegic solution. Journal of Cardiothoracic Surgery. 8, 60 (2013).
- Bailey, L. E., Ong, S. D. Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations. Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).
- Miller, D. J. Sydney Ringer: physiological saline, calcium and the contraction of the heart. The Journal of Physiology. 555, Pt 3 585-587 (2004).
- Yamamoto, D., Suzuki, N., Miledi, R. Blockage of chloride channels by HEPES buffer). Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 230 (1258), 93-100 (1987).
- Janz, G. J., Taniguchi, H. The silver-silver halide electrodes. Preparation, stability, and standard potentials in aqueous and non-aqueous media. Chemical Reviews. 53 (3), 397-437 (1953).
- Rapeaux, A., Constandinou, T. G. An HFAC block-capable and module-extendable 4-channel stimulator for acute neurophysiology. Journal of Neural Engineering. 17 (4), 046013 (2020).
- Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch. Next Generation Neural Interfaces. , Available from: https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch> (2021).
- Cuttaz, E. A., Chapman, C. A. R., Syed, O., Goding, J. A., Stretchable Green, R. A. fully polymeric electrode arrays for peripheral nerve stimulation. Advanced Science. 8 (8), 2004033 (2021).
- Lossi, L., Merighi, A. The use of ex vivo rodent platforms in neuroscience translational research with attention to the 3Rs philosophy. Frontiers in Veterinary Science. 5, 164 (2018).
