Summary
Этот протокол описывает подготовку всей седалищной нервной ткани крысы к электрофизиологической стимуляции ex vivo и запись в экологически регулируемую двухкамерную перфузированную солевую ванну.
Abstract
Препараты ex vivo позволяют изучать многие нейрофизиологические процессы в отрыве от остального организма при сохранении местной тканевой структуры. Эта работа описывает подготовку седалищных нервов крыс для нейрофизиологии ex vivo, включая буферную подготовку, процедуры для животных, настройку оборудования и нейрофизиологическую запись. В этой работе представлен обзор различных типов экспериментов, возможных с помощью этого метода. Описанный метод направлен на обеспечение 6 ч стимуляции и записи на извлеченной периферической нервной ткани в жестко контролируемых условиях для оптимальной согласованности результатов. Результаты, полученные с помощью этого метода, представляют собой потенциалы действия соединения А-волокна (CAP) с амплитудами от пика до пика в диапазоне милливольт в течение всей продолжительности эксперимента. Амплитуды и формы CAP являются последовательными и надежными, что делает их полезными для тестирования и сравнения новых электродов с существующими моделями или эффектами вмешательств на ткани, такими как использование химических веществ, хирургических изменений или методов нейромодулирующей стимуляции. Как обычные коммерчески доступные манжеты с платино-иридиевыми контактами, так и изготовленные на заказ проводящие эластомерные электроды были протестированы и дали аналогичные результаты с точки зрения реакции силы и продолжительности нервного стимула.
Introduction
Современное понимание фундаментальной функции нерва, смоделированной in silico , отсутствует в нескольких аспектах, особенно в отношении эффектов компартментализации нервной ткани за пределами сомы, аксона и дендритов. Взаимодействия аксон-миелин все еще плохо изучены, о чем свидетельствует тот факт, что даже подробные вычислительные модели нервов, такие как MRG1 (для нервов млекопитающих), которые адекватно захватывают обычный ответ электрической стимуляции, не фиксируют другие экспериментально наблюдаемые модели поведения, такие как перенос высокочастотного блока2 или вторичный ответ начала3.
Этот протокол обеспечивает метод эффективного исследования нейрофизиологических процессов на нервном уровне в острой модели малых лабораторных животных, используя стандартизированный протокол подготовки для изоляции нерва, контроля его окружающей среды и удаления его из контекста in vivo в контекст ex vivo. Это предотвратит другие процессы в организме или анестетики, используемые протоколами стимуляции нервов in vivo для изменения поведения нервов и искажения измеренных результатов или их интерпретации 4,5. Это позволяет разрабатывать более реалистичные модели, ориентированные исключительно на эффекты, специфичные для нервных тканей, которые плохо изучены. Этот протокол также полезен в качестве испытательного стенда для новой стимуляции нервов и регистрации электродных материалов и геометрии, а также новых парадигм стимуляции, таких как высокочастотный блок 2,3. Вариации этого метода ранее использовались для изучения физиологии нервов в жестко контролируемых условиях6, например, для измерения динамики и свойств ионных каналов или эффектов местных анестетиков7.
Этот метод обеспечивает несколько преимуществ по сравнению с альтернативами, такими как острые эксперименты in vivo на мелких животных8. Этот метод устраняет необходимость поддержания глубины анестезии, поскольку ткань была извлечена из организма, уменьшая количество необходимого оборудования, такого как диффузор анестезии, концентратор кислорода и грелка. Это упрощает экспериментальный протокол, снижая риск ошибок. Поскольку анестетики могут потенциально изменять функцию нерва4, этот метод гарантирует, что меры не будут смешаны побочными эффектами от этих анестезирующих соединений. Наконец, этот метод более уместен, чем острые эксперименты in vivo при изучении эффектов нейротоксичных соединений, таких как тетродотоксин, которые убивают обезболенное животное параличом.
Периферические нервные участки являются уникальной системой ex vivo , поскольку существует высокая вероятность того, что волокна, ответственные за записанные нейронные сигналы, не содержат никакой сомы. Поскольку они обычно расположены, для двигательных нейронов в позвоночнике и для сенсорных нейронов в дорсальных корневых ганглиях рядом с позвоночником, подготовка участка нерва млекопитающих может быть грубо смоделирована как набор трубчатых мембран с ионными каналами, открытыми на обоих концах9. Метаболизм поддерживается митохондриями, расположенными в аксоне в момент рассечения ткани10. Швы открытых концов аксолеммы поощряются после экстракции, чтобы закрыть их и тем самым помочь поддерживать существующие ионные градиенты по всей мембране, которые необходимы для нормальной функции нерва.
Чтобы поддерживать тканевый гомеостаз вне организма, необходимо жестко контролировать несколько переменных окружающей среды. Это температура11, оксигенация12, осмолярность, рН13,14 и доступ к глюкозе для поддержания метаболизма. Для этого протокола подход заключается в использовании модифицированного буфера Кребса-Хенселейта15,16 (mKHB), непрерывно аэрированного смесью кислорода и углекислого газа. MKHB относится к семейству кардиоплегических буферов 6,17, используемых для сохранения рассеченных тканей вне организма, например, в экспериментах ex vivo. Эти буферы не содержат гемоглобина, антибиотиков или противогрибковых препаратов и, следовательно, подходят только для препаратов с участием небольших количеств ткани в течение ограниченного времени. Контроль pH был достигнут с помощью карбонатной и углекислотной окислительно-восстановительной пары, требующей постоянной аэрации буфера углекислым газом для поддержания равновесия рН. Это делается для того, чтобы избежать использования других распространенных буферных агентов, таких как HEPES, которые могут модифицировать функцию нервных клеток18. Для насыщения буфера кислородом и обеспечения контроля рН использовалась смесь 5% углекислого газа в кислороде, называемая карбогеном (95% O2, 5% CO2). Нагревательную мешалку использовали для контроля температуры буферного контейнера, и буфер перфузировали через нервную ванну, а затем рециркулировали в исходный контейнер. Типичный эксперимент будет длиться 6-8 часов, прежде чем нерв потеряет свою жизнеспособность и больше не будет достаточно реагировать на стимуляцию, чтобы меры были репрезентативными для здоровой ткани.
Для оптимизации отношения сигнал/шум для записи использовали серебристо-хлоридные электроды, которые готовили согласно ранее описанным способам19. Для стимуляции может использоваться комбинация коммерческих готовых платиновых манжетных электродов и изготовленных на заказ проводящих полимерных манжетных электродов. Проводящие полимерные манжеты электроды имеют заметно более высокую емкость заряда, которые полезны при стимуляции нерва с использованием высокоамплитудных сигналов20.
Стимулятор, используемый в этом протоколе, был ранее описан20. Документация, файлы проектирования и программные сценарии для его использования являются общедоступными21. Другие стимуляторы могут быть использованы для выполнения этого протокола; однако пользовательский стимулятор также способен использовать блок2,20 высокочастотного альтернативного тока (HFAC), что позволяет проводить более широкий спектр нейрофизиологических экспериментов. Для использования блока HFAC рекомендуются проводящие эластомерные манжеты, чтобы избежать повреждения нерва. Манжеты проводящих эластомерных нервов представляют собой мягкие и полностью полимерные электродные массивы, изготовленные из проводящих эластомеров в качестве проводящего компонента и полидиметилсилоксана в качестве изоляции22. Устройства были изготовлены в биполярной конфигурации с использованием обычных методов лазерного микропроизводства.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры по уходу за животными были выполнены в соответствии с соответствующими лицензиями, выданными Министерством внутренних дел Великобритании в соответствии с Законом о животных (научные процедуры) (1986 год) и были одобрены Советом по благополучию и этическому надзору за животными Имперского колледжа Лондона.
1. Подготовка буферов
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта часть протокола может быть выполнена задолго до остальной части протокола, за исключением заключительных этапов, включающих получение модифицированного буфера Кребса-Хенселейта (mKHB) при концентрации 1x.
- Подготовьте 1 M CaCl2 стокового раствора
- Добавьте 14,701 г дигидратаCaCl2 в чистый стакан объемом 100 мл. Добавьте ~75 мл деионизированной воды и перемешайте до полного растворения соли.
- Переложите раствор в градуированную колбу объемом 100 мл и добавьте деионизированную воду до тех пор, пока не будет достигнут объем 100 мл. Переложите раствор во флакон и храните в холодильнике при 4 °C.
- Подготовьте 10-кратный концентрированный запас мКХБ
- Добавьте 66,03 г хлорида натрия (NaCl), 3,57 г хлорида калия (KCl), 1,63 г дигидрофосфата калия (KH2PO4) и 1,44 г сульфата магния в стакан 2 л.
- Добавьте ~750 мл деионизированной воды в стакан и перемешивайте до тех пор, пока соли не растворятся (на дне могут остаться небольшие кристаллы соли). Добавить 25 мл 1 МCaCl2 раствора (стадия 1.1) и перемешать; убедитесь, что это последняя добавленная соль.
- Переложите раствор в градуированную колбу объемом 1 л и добавьте деионизированную воду до общего объема 1 л. Переложите раствор в бутылку объемом 1 л. Хранить в холодильнике концентрированный 10x мКХБ при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрированный запас mKHB может храниться в течение примерно 1 месяца до замены.
- Приготовить рассечение чашки Петри (покрытие)
- Подготовьте чистую стеклянную чашку Петри (диаметром 120 мм) для покрытия, тщательно вымыв и высушив посуду.
- Следуя инструкциям производителя по использованию и отверждению конформного алкокси-покрытия, покройте дно чашки Петри ~ 3-5 мм покрытия, тщательно вливая конформную смесь покрытия в посуду до тех пор, пока не будет достигнута желаемая толщина.
- Отверните покрытие в духовке при 60 °C до тех пор, пока оно не станет твердым на ощупь. Рассечение чашки Петри готово.
ПРИМЕЧАНИЕ: Бережная очистка посуды после каждого использования гарантирует, что покрытие прослужит в течение многих лет, прежде чем потребуется замена. При замене покрытия убедитесь, что перед нанесением нового покрытия необходимо удалить весь материал покрытия. Обратите внимание, что конформное алкокси-покрытие (Таблица материалов), используемое в этом протоколе, имеет срок годности менее года.
2. Препараты перед рассечением
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом шаге запускается эксперимент. Следующие шаги должны быть выполнены в тот же день, в таком порядке.
- Приготовьте 1x mKHB
- Подготовьте чистый 2-литровый стакан для буфера. Переложите 200 мл запаса 10x mKHB на стакан 2 л. Добавьте 2,1 г карбоната натрия (NaHCO3) и 0,99 г безводной декстрозы (D-глюкозы) к стакану 2 л.
- Добавьте примерно 1 л деионизированной воды в стакан. Перемешивайте до полного растворения солей. Переложите раствор в градуированную колбу объемом 2 л и добавьте деионизированную воду до общего объема 2 л.
- Переложите раствор в стеклянную бутылку объемом 2 л, помещенную на нагревательную мешалку с температурой 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Меньшая нагревательная мешалка часто не может достичь целевой температуры 37 ° C из-за тепловой инерции больших контейнеров, полных воды. Отрегулируйте температуру вверх, чтобы содержимое бутылки достигало 37 °C при перемешивании. Следите за температурой во время эксперимента и понижайте заданную температуру в случае превышения. - Поместите термометр в бутылку объемом 2 л, чтобы контролировать температуру, используя захваты, чтобы предотвратить воздействие перемешивающейся блохи на термометр. Аэрировать буфер карбогеном в течение минимум 30 мин, чтобы насытить раствор кислородом. Это должно установить pH равным 7,4. Измерьте pH с помощью pH-метра, чтобы убедиться, что он находится в пределах 0,1 единицы pH 7,4 (при 37 °C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы отрегулировать рН до 7,4, используйте соляную кислоту или гидроксид натрия, когда это необходимо. - Наполните мХБ две трубки центрифуги объемом 15 мл и одну бутылку объемом 100 мл и поместите их на лед для охлаждения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифужные трубки и бутылка могут быть очищены и повторно использованы после каждого эксперимента без автоклавирования. - Для более поздних частей эксперимента продолжают аэрировать буфер в 2-литровом флаконе карбогеном при 37 °C при непрерывном перемешивании.
ПРИМЕЧАНИЕ: Неконтролируемое использование карбогена может быть опасным, если отсутствуют автоматические системы отключения потока газа в случае утечки. Автоматизированный датчик и электронный запорный клапан могут смягчить это; в противном случае человек должен быть оставлен для наблюдения за оборудованием, если вскрытие происходит в другом помещении. Во всех случаях датчик кислорода следует использовать рядом с установкой, чтобы предупредить операторов, когда концентрация кислорода в окружающей среде поднимается выше 25%. По возможности используйте помещение с активной вентиляцией.
- Включите устройство сбора сигнала, малошумящий предусилитель, фильтр линейного шума и осциллограф для записи и стимуляции, чтобы обеспечить достаточно времени для стабилизации температуры.
- Убедитесь, что все электрорегистраторное оборудование правильно настроено
- Установите малошумящий предусилитель на вход, связанный с переменным током, с входным полосовым фильтром, установленным на 6 дБ в десятилетие, и частотами среза 30 Гц и 3 кГц для фильтров высоких и нижних частот соответственно.
- Установите коэффициент усиления малошумящего предусилителя равным 100.
3. Обезболивание и эвтаназия животных
ПРИМЕЧАНИЕ: Для исследований использовались самки крыс весом от 250 до 330 г (Таблица материалов).
- Подготовьте хирургические инструменты и расходные материалы: 12 см прямыми ножницами (тупыми); 2 мм режущие кромки угловые пружинные ножницы; 4 см тонкие ножницы, острые или полуострые; #7 Щипцы Дюмона; 45° под углом тонкие щипцы и 6-0 шов шелка или нити.
- Поместите крысу в контейнер для анестезии или камеру. Подключите кислород и обезболивающий диффузор к контейнеру. Установите концентрацию анестетика (изофлурана) на 3,5% и подождите примерно 10 минут или до тех пор, пока у животного не появятся признаки анестезии, такие как потеря корректирующего рефлекса.
- После того, как у крысы появятся признаки анестезии, подтвердите потерю сознания с помощью рефлекса отмены пальца ноги. Продолжайте только тогда, когда нет снятия пальца ноги; в противном случае проверьте все соединения и уровни анестезии в диффузоре и повторите шаг 3.2.
- Выньте животное из контейнера и приступайте к вывиху шейки матки с последующим разрезанием бедренной артерии для подтверждения смерти.
4. Протокол вскрытия
ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите животное животом вниз на стол для вскрытия. Повторите следующие шаги для обеих ног. Как правило, сначала рассекают правую ногу.
- Крепко удерживая лодыжку между большим, указательным и средним пальцами, отрежьте пяточное сухожилие с помощью 12 см прямых тупых ножниц.
- Тонкими острыми ножницами сделайте разрез кожи от пяточного сухожилия вдоль задней части ноги до основания позвоночника, следя за тем, чтобы не рассекать мышечную ткань внизу.
- Используя тонкие щипцы и тонкие ножницы, делайте осторожные разрезы через мышечные слои около середины задней части ноги, пока седалищный нерв не будет обнажен. Как только седалищный нерв будет виден, увлажните полость с помощью ледяного mKHB, чтобы предотвратить высыхание нерва.
- Используя гемостаты, раздвиньте лоскуты кожи с каждой стороны и держите разрез открытым для более тонкой работы по рассечению. Начиная с расположения разреза сухожилия пяточной кишки, тонкими ножницами прерывают мышцу на медиальной стороне ноги, чтобы освободить нерв. Продолжайте поддерживать уровень влажности в этом районе с помощью ледяного mKHB.
- Поскольку нерв обнажается при движении вверх по ноге, рассекайте вышележащую мышечную ткань. Освободите нерв ближе к позвоночнику от соединительных тканей до достижения расщелины позвоночника, после чего в этой точке возникает перегиб в нерве. Пока не пытайтесь очистить нерв, так как скорость необходима на этом этапе.
- Отрежьте нерв как можно ближе к позвоночнику тонкими ножницами. Чтобы сделать рассечение легче, очень осторожно потяните конец нерва возле лодыжки с помощью щипцов. Никогда не защемляйте нерв посередине, а только концы. Никогда не дергайте нерв подтянутым.
НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: На этом этапе, если позволяет время, можно провести ушивание обоих концов нерва, чтобы помочь сохранить жизнеспособность. Сведите управляемость к минимуму, чтобы предотвратить повреждение. Если времени недостаточно (см. шаг 4.5), пропустите этот шаг и следуйте шагу 5.2 позже. - Поместите рассеченный нерв в центрифужную трубку объемом 15 мл, заполненную mKHB (шаг 2.1.5), закройте трубку и поместите трубку обратно на лед до начала процедуры очистки.
- Повторите шаги 4.1-4.7 для другой ноги. В идеале, каждый нерв должен занять 5-10 минут для извлечения, чтобы максимизировать жизнеспособность ткани.
5. Процедура очистки нервов
- Наполните покрытую оболочкой чашку Петри примерно наполовину охлажденным кислородом mKHB. Поместите один из рассеченных седалищных нервов в чашку и прикрепите оба конца нерва к чашке так, чтобы нерв был прямым без перегибов, перекрутов или скручиваний. Зажмите нерв как можно ближе к концам.
- Используя 6-0 шелковых швов или тонкую нить, завяжите двойной узел вокруг каждого конца нерва, чтобы предотвратить утечку цитозола в буфер. Поместите узлы прямо рядом со штифтами насекомых сбоку ближе к центру нерва, так как это предотвратит утечку из нервной ткани в буфер. Не проводите этот этап, если нерв был предварительно перевязан.
- Используя микроскоп для точности и 2 мм угловых пружинных ножниц, удалите жир, кровеносные сосуды и мышечную ткань из нерва. Обрежьте любые нервные ветви, которые не будут использоваться в протоколе стимуляции и записи.
- Каждые 5 мин очистки заменяйте буфер свежеохлажденным оксигенированным мКХБ. Используйте тонкие щипцы, чтобы потянуть за соединительные ткани, жир и кровеносные сосуды, чтобы облегчить рассечение.
- Поместите нервы обратно в транспортные трубки, заполненные свежим охлажденным кислородом mKHB, и поместите трубки на лед.
6. Настройка оборудования
ПРИМЕЧАНИЕ: Установка оборудования, используемого для проведения экспериментов, проиллюстрирована на рисунке 1. Короче говоря, он состоит из двухкамерной нервной ванны, бутылки объемом 2 л, помещенной на нагревательную мешалку, источника карбогена для буферной аэрации и трубки, позволяющей буферу течь из бутылки в ванну и обратно в бутылку с помощью перистальтического насоса. Ванна может быть выточена из плексигласа или напечатана на 3D-принтере из водонепроницаемых материалов. Он имеет глубину около 2 см, а перегородка, разделяющая две камеры ванны, имеет отверстие диаметром 1,5 мм, чтобы позволить резьбу периферического нерва через обе камеры. Одна камера большая, должна быть не менее 4 или 5 см в длину и будет заполнена буфером. Другая камера должна быть длиной не менее 3 см и будет заполнена силиконом или минеральным маслом. Ванна не должна быть слишком большой, так как это ухудшит контроль перфузии, температуры и pH. Могут потребоваться различные размеры ванны в зависимости от размера исследуемой нервной ткани.
- Подготовьте чистую двухкамерную нервную ванну (см. Дополнительный файл для спецификаций конструкции). Поместите нервную ванну ниже уровня бутылки объемом 2 л, помещенной на нагревательную мешалку, используя стандартные лабораторные головки и захваты. Подключите слив ванны к входу перистальтического насоса.
- Подключите выходное отверстие перистальтического насоса к трубке, ведущей обратно к буферной бутылке объемом 2 л. Подключите входное отверстие для ванны к трубке с помощью регулируемого клапана потока и поместите трубку внутрь бутылки объемом 2 л. Используйте трехсторонний клапан со шприцем, соединенным со средним выпускным отверстием, чтобы помочь с заправкой трубки в качестве сифона для гравитационного буферного притока.
- Загрунтуйте сифон, нарисовав шприц до тех пор, пока в него не потечет буфер. Сконфигурируйте клапан таким образом, чтобы скорость потока буфера в ванну составляла ~5-6 мл·мин-1. Поток может быть увеличен изначально, чтобы заполнить ванну. Как только уровень буфера ванны достигнет дренажа, поместите нервы в ванну.
- Используя штифт насекомого, закрепите конец нерва в углу заполненной буфером ванны камеры. Используя 45° под углом тонкие щипцы и защемляя нерв только на концах, осторожно проденьте нерв, подлежащий стимуляции, через отверстие в перегородке между двумя ванными камерами.
- Закрепите другой конец нерва в масляной камере ванны с помощью штифта насекомого, гарантируя, что нерв будет прямым, не растягиваясь и свободным от перегибов и скручиваний. Используя силиконовую смазку, сделайте уплотнение для предотвращения утечки буфера из буферной камеры в масляную камеру. Заполните масляную камеру силиконовым или минеральным маслом.
- Поместите крючки регистрирующих электродов Ag/AgCl в камеру масляной ванны и закрепите их с помощью головок босса и захватов. Задрапируйте часть нерва в масляной ванне над крючками, не вытягивая нерв подтянутым. Не защемляйте нерв; используйте угловые щипцы, чтобы поднять нерв без защемления.
- Отрегулируйте или отремонтируйте силиконовое жирное уплотнение, если наблюдается какая-либо утечка после перемещения нерва.
- Подключите опорный электрод Ag/AgCl к заземлению усилителя и поместите электрод в заполненную буфером камеру ванны, закрепив ее с помощью лабораторного захвата.
7. Имплантация электрода на нерв в ванне
- Подготовьте чистый электрод нервной манжеты для стимуляции в соответствии со ссылкой21. Поместите электрод в заполненную буфером камеру ванны. Используя щипцы или тонкий пинцет с тупыми или угловыми кончиками, откройте электрод в ванне, чтобы намочить внутреннюю часть манжеты.
- Если пузырьки остаются, используйте тонкий шприц, чтобы вытащить буфер из ванны и вытолкнуть пузырьки из манжеты. Пинцетом под нерв осторожно откройте манжету и засуньте ее под нерв. Закройте манжету вокруг нерва, заботясь о том, чтобы избежать перегиба или скручивания нерва.
- Подключите стимулирующий электрод к стимулятору и закрепите провод стимулирующего электрода лентой. Подключите возвратный электрод тока к стимулятору и закрепите провод скотчем. Если в качестве электрода возврата тока используется квадратный платиновый лист, расположите лист подальше от нерва в ванне.
8. Стимуляция и запись
- Подключите выходной сигнал стимулятора TTL к каналу 4 осциллографа, который будет использоваться для запуска осциллографа. На экране осциллографа нажмите вкладку Триггерный канал и укажите Канал 4 в качестве триггерного канала. Установите уровень триггера на 1 В с помощью ручки уровня .
- На осциллографе установите временное разрешение 1 мс/деление и разрешение напряжения 10 мВ/деление. Центрируйте ссылку на триггер во времени и установите уровень триггера равным 1 В.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги с 8.3 по 8.6 при использовании пользовательского стимулятора (см. Таблицу материалов). Предполагается, что программное обеспечение MATLAB и драйверы устройств были установлены на лабораторном компьютере с использованием инструкций, свободно предоставляемых онлайн для пользовательского нейронного стимулятора21. В противном случае следуйте инструкциям производителя по использованию коммерчески доступного стимулятора в качестве альтернативы. - Подключите стимулятор к лабораторному компьютеру. Включите стимулятор, подключив блок питания аккумулятора к входу питания. Запустите программное обеспечение MATLAB на лабораторном компьютере.
- Выполните пользовательский скрипт MATLAB: HFAC_4ch_Stimulator_Initialization.m (Таблица материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Кабель связи USB между компьютером и стимулятором должен мигать зеленым цветом. Если этого не происходит, то возникает ошибка конфигурации, и блок питания и соединения должны быть проверены. - Откройте скрипт MATLAB: HFAC_4ch_Monophasic_Stimulation.00 (Таблица материалов). Непосредственно редактируя скрипт MATLAB, задайте параметры следующим образом: амплитуда импульса стимулятора = -300 мкА, ширина импульса стимулятора = 300 мкс, число импульсов стимулятора = 10 и время стимулятора между импульсами = 1 с.
- Запустите протокол стимуляции, щелкнув Выполнить в программном обеспечении MATLAB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Репрезентативными результатами, которые могут быть получены с помощью этого протокола, являются последовательные потенциалы действия соединения из нервных волокон А-типа в седалищном нерве. Эти потенциалы действия обычно имеют амплитуду от пика до пика приблизительно 1 мВ на электроде и, следовательно, 100 мВ после усиления (рисунок 2). Аналогичные амплитуды стимуляции и длительности импульсов должны давать аналогичные амплитуды CAP. Электроды с проводящей эластомерной манжетой, как правило, требуют несколько более высоких амплитуд стимуляции, чтобы получить ту же амплитуду CAP по сравнению с коммерчески доступными платиновыми электродами с манжетой. Эта разница, как правило, мала по сравнению с изменением амплитуды стимуляции, необходимой для стимуляции нервов, поступающих от разных животных. Это связано с тем, что небольшие различия в размере нерва и посадке манжеты оказывают большое влияние на требуемую амплитуду стимуляции для получения определенной амплитуды CAP, независимо от материала манжеты. Это может быть использовано для проверки эффектов различных буферных композиций, таких как различные концентрации ионов или добавление нервных возбуждающих или ингибирующих веществ, таких как тетродотоксин. Если буферная отработанная труба направляется в дополнительный контейнер, добавление веществ, изменяющих нервную возбудимость, может быть сделано временным для эксперимента, причем скорость вымывания зависит от скорости притока буфера.
Минимальная плотность тока, рассчитанная как амплитуда стимуляции, деленная на площадь поверхности стимулирующих электродов, необходимая для активации волокон типа А и получения наблюдаемого потенциала действия соединения осциллографа, была построена по отношению к ширине импульса на фиг.3. Результаты, показанные на рисунке 3, представляют собой типичную нервную возбудимость как для коммерчески доступных стандартных платиновых нервных манжет, так и для изготовленных на заказ проводящих эластомерных нервных манжет.
Извлеченные нервы должны оставаться жизнеспособными в течение примерно 6 часов после извлечения, и, следовательно, эксперименты должны укладываться в это временное окно. Потеря жизнеспособности нерва приводит к прогрессирующему снижению амплитуды CAP и скорости проводимости. После того, как амплитуда потенциала действия снизится ниже 50% от начальной амплитуды (в начале записи), нерв следует считать более нежизнеспособным, так как результаты будут значительно искажены. Репрезентативные результаты в отношении долголетия нервов показаны на рисунке 4. Правый и левый седалищные нервы были извлечены у одного животного между 10:00 и 11:00 в определенный день. Начальные CAP были получены из правого седалищного нерва во время первоначальных испытаний перед экспериментами, а стандартные CAP были получены как из левого, так и из правого седалищного нерва, которые поддерживались с использованием этого протокола в конце экспериментов. Минимальное снижение амплитуды CAP наблюдалось с правым седалищным нервом, в то время как амплитуда CAP левого седалищного нерва примерно на 3 мВ была аналогична амплитуде правого седалищного нерва в начале эксперимента более чем через 6 ч после извлечения нерва.
Рисунок 1: Схематическое представление экспериментальной установки, используемой в протоколе. Эта цифра была изменена с Rapeaux, A. et al. (2020)20. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Репрезентативные CAP, полученные ex vivo после стимуляции металлическими и проводящими эластомерными нервными манжетами. Воспроизведено с изменениями из Cuttaz, E. A. et al. (2021)22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Порог активации А-волокна металлических и проводящих эластомерных манжет. Полосы погрешностей представляют стандартное отклонение ±1 от среднего значения. Воспроизведено с изменениями из Cuttaz, E. A. et al. (2021)22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативные CAP, полученные ex vivo в течение дня экспериментов и с использованием обоих седалищных нервов у одного животного. (A) ВОЛОКНО типа А, полученное около полудня из правого седалищного нерва. (B) ВОЛОКНО типа А, полученное в середине дня из левого седалищного нерва. (C) ВОЛОКНО типа А, полученное в конце экспериментов с тем же левым седалищным нервом в (B). Ось X соответствует времени суток, в которое были сделаны записи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой работе мы описали протокол подготовки седалищных нервов крыс для нейрофизиологии ex vivo. Экстракция тканей занимает около 30 минут, включая обработку животных, анестезию, выбраковку и рассечение, в то время как очистка нервов, помещение в ванну и имплантация электрода должны потребовать дополнительных 30 минут, прежде чем запись может быть начата. Буферная подготовка может быть проведена за 30 мин, хотя это можно сделать до конца эксперимента. Этот тип препарата и эксперимента был использован и описан в последних 7,12, с использованием аналогичных буферов и для одного и того же типа ткани. Однако, насколько известно авторам, в одном и том же документе впервые дается описание подготовки буфера, вскрытия, настройки оборудования и последующей записи.
Этот протокол может обеспечить широкий спектр экспериментов в нейрофизиологии, которые были бы невозможны ни в контексте in vitro , ни in vivo . Например, преимущество препаратов ex vivo заключается в том, что они сохраняют макро- и микроструктуру извлеченной ткани, изолируя эту ткань от остальной части тела. Это приводит к более простой настройке, поскольку анестезия не должна поддерживаться, что в противном случае является требованием в экспериментах in vivo . С точки зрения проведения экспериментов, препараты ex vivo допускают использование таких веществ, как тетродотоксин, которые трудно обосновать в контексте in vivo 23 , поскольку они несут высокий риск для животного. Когда применение таких веществ приносит пользу исследованию, их легче использовать в препаратах ex vivo . Использование пользовательского стимулятора20 позволяет проводить эксперименты с использованием блока HFAC для нейромодуляции с использованием этой экспериментальной установки.
Наиболее важным шагом в протоколе является шаг рассечения, потому что даже небольшая ошибка с использованием ножниц для рассечения может повредить нерв, если не принять достаточно мер. Скорость на этом этапе также важна, так как ткань должна быть быстро извлечена из тела и помещена в охлажденный буфер, чтобы максимизировать жизнеспособность в начале записи. После извлечения ткани, хотя следует соблюдать осторожность при очистке нерва и имплантации любых электродов, протокол является более гибким в отношении времени, и риск ошибки оператора, следовательно, ниже. Поскольку диаметры нервов и размещение фасцикул внутри нервов будут варьироваться от животного к животному, следует ожидать некоторой изменчивости результатов, даже если использовать одни и те же электроды и протокол стимуляции. Эффект этой изменчивости можно увидеть в полосах ошибок для пороговых значений стимуляции на рисунке 3. Важно не защемлять нерв на любом этапе подготовки, так как это может вызвать необратимое повреждение тканей. Обрабатывайте нерв только его концами с помощью щипцов и с большой осторожностью не натягивайте нерв.
Некоторые аспекты протокола в его нынешнем виде могут быть улучшены за счет увеличения количества оборудования и времени настройки. Чтобы помочь с диагностикой потенциальных проблем с этой экспериментальной установкой, автоматизированные измерения pH и растворенного кислорода в ванне могут быть полезны, но не были реализованы здесь. Оба измерения могут быть достигнуты с использованием амперометрических или потенциометрических методов12,19. Оборудованием, которое потребует регулярного технического обслуживания, являются трубы и стеклянная посуда, которая накапливает солевые отложения с течением времени. Регистрирующие крючки AgCl также потребуют регулярного повторного нанесения покрытия или замены, наряду со ссылкой на AgCl. Стимулирующие электроды должны очищаться после каждого использования, но, как правило, не требуют замены для многих экспериментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов.
ЗАЯВЛЕНИЕ ОБ ОТКРЫТОМ ДОСТУПЕ:
В целях открытого доступа автор применил лицензию Creative Common Attribution (CC BY) (если это разрешено UKRI, «Лицензия открытого правительства» или «Лицензия Creative Commons Attribution No-derivatives (CC BY-ND)) к любой версии принятой автором рукописи.
ОБМЕН ДАННЫМИ:
Исходные данные, использованные в рисунках этой статьи, будут предоставлены авторами без излишней оговорки.
Acknowledgments
Авторы выражают признательность доктору Джеральду Хансбергеру из GlaxoSmithKline Pharmaceuticals, king of Prussia, PA, США и Galvani Bioelectronics (Stevenage, UK) за то, что они поделились с нами своей оригинальной техникой подготовки нервов. Авторы признают Роберта Тота за дизайн двухкамерной нервной ванны. Авторы признают финансирование из гранта Healthcare Technologies Challenge Awards (HTCA) Исследовательского совета по инженерным и физическим наукам (EPSRC). Авторы выражают признательность Центру высокопроизводительных встраиваемых и распределенных систем для докторантуры (HiPEDS CDT) Имперского колледжа Лондона за финансирование Adrien Rapeaux (EP/L016796/1). Adrien Rapeaux в настоящее время финансируется Британским научно-исследовательским институтом деменции, Научно-исследовательским и технологическим центром ухода. Авторы с благодарностью отмечают Зака Бейли из Имперского колледжа на кафедре биоинженерии за помощь в экспериментах и доступ к тканям животных во время производства видеостатьи JoVE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1595 | Borosilicate glass |
| 1 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | 612-3626 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1596 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | BRND937254 | Borosilicate glass |
| Adaptor, pneumatic, 8 mm to 1/4 NPT | RS UK | 536-2599 | push-to-fit straight adaptor between oxygen hose and gas dispersion tube |
| Alkoxy conformal coating | Farnell | 1971829 | ACC15 Alkoxy conformal coating for dissection petri dish preparation |
| Anesthetic | Chanelle | N/A | Isoflurane inhalation anesthetic, 250 mL bottle |
| Beaker, 2 L | VWR International Ltd | 213-0469 | Borosilicate glass |
| Bipolar nerve cuff | Cortec GMBH | N/A | 800 micron inner diameter, perpendicular lead out, no connector termination |
| Bossheads | N/A | N/A | Standard wet laboratory bossheads for attaching grippers to rods |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902-500g | 500 g in plastic bottle |
| Carbogen canister | BOC | N/A | F-size canister |
| Centrifuge Tubes, 15 mL volume | VWR International Ltd | 734-0451 | Falcon tubes |
| Conductive elastomer nerve cuff | N/A | N/A | high charge capacity nerve cuff for stimulation, see protocol for fabrication reference |
| Connector, Termimate | Mouser UK | 538-505073-1100-LP | These should be soldered to wire terminated with crocodile clips (see entry 11) |
| Crocodile clip connectors | RS UK | 212-1203 | These should be soldered to wire terminated with TermiMate connectors (see entry 10) |
| Deionized Water | N/A | N/A | Obtained from deionized water dispenser |
| Forceps angled 45 degrees | InterFocus Ltd | 91110-10 | Fine forceps, student range |
| Forceps standard Dumont #7 | InterFocus Ltd | 91197-00 | Student range forceps |
| Gas Disperson Tube, Porosity 3 | Merck | 12547866 | N/A |
| Glucose anhydrous, powder | VWR International Ltd | 101174Y | 500 g in plastic bottle |
| Grippers | N/A | N/A | Standard wet laboratory rod-mounted grippers |
| Heating Stirrer | RS UK | 768-9672 | Stuart US152 |
| Hemostats | N/A | N/A | Any hemostat >12 cm in length is suitable |
| Insect Pins, stainless steel, size 2 | InterFocus Ltd | 26001-45 | N/A |
| Laptop computer | N/A | N/A | Any laboratory-safe portable computer with at least 2 unused USB ports is suitable |
| Line Noise Filter | Digitimer | N/A | Humbug noise eliminator (50 Hz line noise filter) |
| Low-Noise Preamplifier, SR560 | Stanford Research Systems | SR560 | Low-noise voltage preamplifier |
| Magnesium Sulphate salt | VWR International Ltd | 291184P | 500g in plastic bottle |
| MATLAB scripts | Github | https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch | Initialization, calibration and stimulation scripts for the custom stimulator |
| MATLAB software | Mathworks | N/A | Standard package |
| Microscope Light, PL-2000 | Photonic | N/A | Light source with swan necks. Product may be obtained from third party supplier |
| Microscope, SMZ 745 | Nikon | SM745 | Stereoscopic Microscope |
| Mineral oil, non-toxic | VWR International Ltd | 31911.A1 | Oil for nerve bath |
| Nerve Bath | N/A | N/A | Plexiglas machined nerve bath, see protocol for details. |
| Oscilloscope | LeCroy | N/A | 434 Wavesurfer. Product may be obtained from 3rd party suppliers |
| Oxygen Hose, 1 meter | BOC | N/A | 1/4" NPT terminations |
| Oxygen Regulator | BOC | C106X/2B:3.5BAR-BS3-1/4"NPTF 230Bar | N/A |
| Peristaltic Pump P-1 | Pharmacia Biotech | N/A | Product may be obtained from third party supplier |
| Petri Dish, Glass | VWR International Ltd | 391-0580 | N/A |
| Potassium Chloride salt | Sigma Aldrich | P5405-250g | 250 g in plastic bottle |
| Potassium Dihydrogen Sulphate salt | Merck | 1.04873.0250 | 250 g in plastic bottle |
| Rat | Charles River Laboratories | N/A | Sprague Dawley, 250-330 grams, female |
| Reference electrode, ET072 | eDaQ (Australia) | ET072-1 | Silver silver-chloride reference electrode |
| Rod | N/A | N/A | Standard wet laboratory rods with fittings for stands |
| Scale | Sartorius | N/A | M-Power scale, for weighing powders. Product may be obtained from third-party suppliers |
| Scissors straight 12 cm edge | InterFocus Ltd | 91400-12 | blunt-blunt termination, student range |
| Signal Acquisition Device | Cambridge Electronic Design | Micro3-1401 | Micro3-1401 Multichannel ADC |
| Silicone grease, non-toxic | Farnell | 3821559 | for sealing of bath partition |
| Silicone tubing, 2 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silicone tubing, 5 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silver wire | Alfa Aesar | 41390 | 0.5 mm, annealed |
| Sodium Bicarbonate salt | Sigma Aldrich | S5761-500g | 500 g in plastic bottle |
| Sodium Chloride salt | VWR International Ltd | 27810.295 | 1 kg in plastic bottle |
| Spring scissors angled 2 mm edge | InterFocus Ltd | 15010-09 | N/A |
| Stand | N/A | N/A | Standard wet laboratory stands with sockets for rods |
| Stimulator | Digitimer | DS3 | DS3 or Custom Stimulator (see references) |
| Stirring flea | VWR International Ltd | 442-0270 | For use with the heating stirrer |
| Syringe tip, blunt, 1 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe tip, blunt, 2 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe, plastic, 10 mL volume | N/A | N/A | syringe should have luer lock fitting |
| Tape, water-resistant | N/A | N/A | For securing tubing and wiring to workbench |
| Thermometer | VWR International Ltd | 620-0806 | glass thermometer |
| USB Power Bank | RS UK | 135-1000 | Custom Stimulator power supply, fully charge before experiment. Not needed if using DS3 |
| Valve, Leuer Lock, 3-Way | VWR International Ltd | 229-7440 | For attaching syringe to bath feed tube and priming siphon |
References
- McIntyre, C. C., Richardson, A. G., Grill, W. M. Modeling the excitability of mammalian nerve fibers: Influence of afterpotentials on the recovery cycle. Journal of Neurophysiology. 87 (2), 995-1006 (2002).
- Pelot, N. A., Grill, W. M. In vivo quantification of excitation and kilohertz frequency block of the rat vagus nerve. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026005 (2020).
- Patel, Y. A., Kim, B. S., Rountree, W. S., Butera, R. J. Kilohertz electrical stimulation nerve conduction block: Effects of electrode surface area. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 25 (10), 1906-1916 (2017).
- Kortelainen, J., Al-Nashash, H., Vipin, A., Thow, X. Y., All, A. The effect of anaesthesia on somatosensory evoked potential measurement in a rat model. Laboratory Animals. 50 (1), 63-66 (2016).
- Oh, S. S., Hayes, J. M., Sims-Robinson, C., Sullivan, K. A., Feldman, E. L. The effects of anesthesia on measures of nerve conduction velocity in male C57Bl6/J mice. Neuroscience Letters. 483 (2), 127-131 (2010).
- Kuffler, S. W., Williams, E. M. V. Small-nerve junctional potentials. The distribution of small motor nerves to frog skeletal muscle, and the membrane characteristics of the fibres they innervate. The Journal of Physiology. 121 (2), 289-317 (1953).
- Brunton, E., Blau, C. W., Nazarpour, K. Separability of neural responses to standardised mechanical stimulation of limbs. Scientific Reports. 7 (1), 11138 (2017).
- Schmalbruch, H. Fiber composition of the rat sciatic nerve. The Anatomical Record. 215 (1), 71-81 (1986).
- Kagiava, A., Theophilidis, G. Assessing the permeability of the rat sciatic nerve epineural sheath against compounds with local anesthetic activity: an ex vivo electrophysiological study. Toxicology Mechanisms and Methods. 23 (8), 634-640 (2013).
- Motori, E., et al. Neuronal metabolic rewiring promotes resilience to neurodegeneration caused by mitochondrial dysfunction. Science Advances. 6 (35), 8271 (2020).
- Schwarz, J. R., Eikhof, G. Na currents and action potentials in rat myelinated nerve fibres at 20 and 37° C. Pflügers Archiv. 409 (6), 569-577 (1987).
- Cranefield, P. F., Brink, F., Bronk, D. W. The oxygen uptake of the peripheral nerve of the rat. Journal of Neurochemistry. 1 (3), 245-249 (1957).
- Lehmann, J. E. The effect of changes in pH on the action of mammalian A nerve fibers. American Journal of Physiology-Legacy Content. 118 (3), 600-612 (1937).
- Hamm, L. L., Nakhoul, N., Hering-Smith, K. S.
- Minasian, S. M., Galagudza, M. M., Dmitriev, Y. V., Kurapeev, D. I., Vlasov, T. D. Myocardial protection against global ischemia with Krebs-Henseleit buffer-based cardioplegic solution. Journal of Cardiothoracic Surgery. 8, 60 (2013).
- Bailey, L. E., Ong, S. D. Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations. Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).
- Miller, D. J. Sydney Ringer: physiological saline, calcium and the contraction of the heart. The Journal of Physiology. 555, Pt 3 585-587 (2004).
- Yamamoto, D., Suzuki, N., Miledi, R. Blockage of chloride channels by HEPES buffer). Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 230 (1258), 93-100 (1987).
- Janz, G. J., Taniguchi, H. The silver-silver halide electrodes. Preparation, stability, and standard potentials in aqueous and non-aqueous media. Chemical Reviews. 53 (3), 397-437 (1953).
- Rapeaux, A., Constandinou, T. G. An HFAC block-capable and module-extendable 4-channel stimulator for acute neurophysiology. Journal of Neural Engineering. 17 (4), 046013 (2020).
- Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch. Next Generation Neural Interfaces. , Available from: https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch> (2021).
- Cuttaz, E. A., Chapman, C. A. R., Syed, O., Goding, J. A., Stretchable Green, R. A. fully polymeric electrode arrays for peripheral nerve stimulation. Advanced Science. 8 (8), 2004033 (2021).
- Lossi, L., Merighi, A. The use of ex vivo rodent platforms in neuroscience translational research with attention to the 3Rs philosophy. Frontiers in Veterinary Science. 5, 164 (2018).
