Summary
Questo protocollo descrive la preparazione del tessuto nervoso sciatico intero di ratto per la stimolazione elettrofisiologica ex vivo e la registrazione in un bagno salino perfuso a due compartimenti regolato dall'ambiente.
Abstract
I preparati ex vivo consentono lo studio di molti processi neurofisiologici in isolamento dal resto del corpo, preservando la struttura tissutale locale. Questo lavoro descrive la preparazione dei nervi sciatici di ratto per la neurofisiologia ex vivo , compresa la preparazione del tampone, le procedure animali, la configurazione delle apparecchiature e la registrazione neurofisiologica. Questo lavoro fornisce una panoramica dei diversi tipi di esperimenti possibili con questo metodo. Il metodo delineato mira a fornire 6 ore di stimolazione e registrazione sul tessuto nervoso periferico estratto in condizioni strettamente controllate per una coerenza ottimale nei risultati. I risultati ottenuti con questo metodo sono potenziali d'azione composti in fibra A (CAP) con ampiezze da picco a picco nell'intervallo millivolt per l'intera durata dell'esperimento. Le ampiezze e le forme del CAP sono coerenti e affidabili, rendendole utili per testare e confrontare nuovi elettrodi con modelli esistenti o gli effetti di interventi sul tessuto, come l'uso di sostanze chimiche, alterazioni chirurgiche o tecniche di stimolazione neuromodulatoria. Sono stati testati sia gli elettrodi per polsini convenzionali disponibili in commercio con contatti platino-iridio che gli elettrodi di elastomero conduttivo su misura e hanno dato risultati simili in termini di risposta forza-durata dello stimolo nervoso.
Introduction
L'attuale comprensione della funzione nervosa fondamentale come modellata in silico è carente in diversi aspetti, in particolare per quanto riguarda gli effetti della compartimentazione del tessuto nervoso al di fuori del soma, dell'assone e dei dendriti. Le interazioni assone-mielina sono ancora poco comprese, come evidenziato dal fatto che anche modelli nervosi computazionali dettagliati come MRG1 (per i nervi dei mammiferi) che catturano adeguatamente la risposta di stimolazione elettrica convenzionale, non catturano altri comportamenti osservati sperimentalmente come il carryover di blocco ad alta frequenza2 o la risposta di insorgenza secondaria3.
Questo protocollo fornisce un metodo per studiare in modo efficiente i processi neurofisiologici a livello nervoso in un modello acuto di piccoli animali da laboratorio, utilizzando un protocollo di preparazione standardizzato per isolare il nervo, controllarne l'ambiente e rimuoverlo da un contesto in vivo a un contesto ex vivo. Ciò impedirà altri processi corporei o anestetici utilizzati dai protocolli di stimolazione nervosa in vivo per alterare il comportamento nervoso e confondere i risultati misurati o la loro interpretazione 4,5. Ciò consente lo sviluppo di modelli più realistici incentrati esclusivamente su effetti specifici dei tessuti nervosi che sono poco compresi. Questo protocollo è anche utile come banco di prova per la stimolazione nervosa e la registrazione di materiali e geometrie degli elettrodi, nonché nuovi paradigmi di stimolazione come il blocco ad alta frequenza 2,3. Variazioni di questa tecnica sono state utilizzate in precedenza per studiare la fisiologia nervosa in condizioni strettamente controllate6, ad esempio, per misurare la dinamica e le proprietà dei canali ionici o gli effetti degli anestetici locali7.
Questa tecnica offre diversi vantaggi rispetto ad alternative come la sperimentazione acuta in vivo su piccoli animali8. La tecnica evita la necessità di mantenere la profondità dell'anestesia poiché il tessuto è stato estratto dal corpo, riducendo la quantità di attrezzature necessarie come un diffusore anestetico, un concentratore di ossigeno e una piastra riscaldante. Questo semplifica il protocollo sperimentale, riducendo il rischio di errori. Poiché gli anestetici possono potenzialmente alterare la funzione nervosa4, questa tecnica garantisce che le misure non siano confuse dagli effetti collaterali di questi composti anestetici. Infine, questa tecnica è più appropriata degli esperimenti acuti in vivo quando si studiano gli effetti di composti neurotossici come la tetrodotossina, che ucciderebbe un animale anestetizzato per paralisi.
Le sezioni nervose periferiche sono un sistema ex vivo unico poiché vi è un'alta probabilità che le fibre responsabili dei segnali neurali registrati non contengano alcun soma. Poiché questi sarebbero normalmente localizzati, per i motoneuroni, nella colonna vertebrale e per i neuroni sensoriali nei gangli della radice dorsale vicino alla colonna vertebrale, la preparazione di una sezione del nervo dei mammiferi può essere approssimativamente modellata come una raccolta di membrane tubolari con canali ionici, aperti ad entrambe le estremità9. Il metabolismo è mantenuto dai mitocondri situati nell'assone al momento della dissezione tissutale10. La sutura delle estremità aperte dell'axolemma è incoraggiata dopo l'estrazione per chiuderle e quindi aiutare a mantenere i gradienti ionici esistenti attraverso la membrana, che sono essenziali per la normale funzione nervosa.
Per mantenere l'omeostasi tissutale al di fuori del corpo, diverse variabili ambientali devono essere strettamente controllate. Questi sono temperatura11, ossigenazione12, osmolarità, pH13,14 e accesso al glucosio per mantenere il metabolismo. Per questo protocollo, l'approccio consiste nell'utilizzare un tampone Krebs-Henseleitmodificato 15,16 (mKHB) continuamente aerato con una miscela di ossigeno e anidride carbonica. L'mKHB fa parte della famiglia dei tamponi cardioplegici 6,17 utilizzati per preservare i tessuti sezionati al di fuori del corpo, ad esempio in esperimenti ex vivo. Questi tamponi non contengono emoglobina, antibiotici o antifungini e sono, quindi, adatti solo per preparazioni che coinvolgono piccole quantità di tessuto per un tempo limitato. Il controllo del pH è stato ottenuto con la coppia redox carbonato e anidride carbonica, che richiede un'aerazione costante del tampone con anidride carbonica per mantenere l'equilibrio del pH. Questo per evitare l'uso di altri agenti tampone comuni come HEPES, che possono modificare la funzione delle cellule nervose18. Per ossigenare il tampone e fornire il controllo del pH, è stata utilizzata una miscela di anidride carbonica al 5% in ossigeno chiamata carbogeno (95% O 2, 5% CO2). Un agitatore di riscaldamento è stato utilizzato per il controllo della temperatura di un contenitore tampone e il tampone è stato perfuso attraverso un bagno nervoso e quindi rimesso in circolo nel contenitore di partenza. Un esperimento tipico durerebbe 6-8 ore prima che il nervo perda la sua vitalità e non risponda più sufficientemente alla stimolazione affinché le misure siano rappresentative del tessuto sano.
Per ottimizzare il rapporto segnale-rumore, per la registrazione sono stati utilizzati elettrodi di cloruro d'argento, che sono stati preparati secondo i metodi precedentemente descritti19. Per la stimolazione, è possibile utilizzare una combinazione di elettrodi commerciali per polsini in platino pronti all'uso e elettrodi per polsini in polimero conduttivo su misura. Gli elettrodi per polsini polimerici conduttivi hanno capacità di carica notevolmente più elevate, che sono utili quando si stimola il nervo utilizzando forme d'onda ad alta ampiezza20.
Lo stimolatore utilizzato in questo protocollo è stato precedentemente descritto20. Documentazione, file di progettazione e script software per utilizzarlo sono disponibili pubblicamente21. Altri stimolatori possono essere utilizzati per eseguire questo protocollo; tuttavia, lo stimolatore personalizzato è anche in grado di bloccare2,20 il blocco 2,20 di corrente alternativa ad alta frequenza (HFAC), che consente una gamma più ampia di esperimenti di neurofisiologia. Per utilizzare il blocco HFAC, si raccomandano polsini in elastomero conduttivo per evitare danni al nervo. I polsini nervosi in elastomero conduttivo sono array di elettrodi morbidi e completamente polimerici prodotti da elastomeri conduttivi come componente conduttivo e polidimetilsilossano come isolamento22. I dispositivi sono stati fabbricati in una configurazione bipolare utilizzando tecniche convenzionali di microfabbricazione laser.
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Protocol
Tutte le procedure e la cura degli animali sono state eseguite con licenze appropriate rilasciate dal Ministero degli Interni del Regno Unito ai sensi dell'Animals (Scientific Procedures) Act (1986) e sono state approvate dall'Animal Welfare and Ethical Review Board dell'Imperial College di Londra.
1. Preparazione dei buffer
NOTA: Questa parte del protocollo può essere eseguita con largo anticipo rispetto al resto del protocollo, ad eccezione delle fasi finali che prevedono la preparazione del tampone Krebs-Henseleit modificato (mKHB) a concentrazione 1x.
- Preparare la soluzione madre 1 M CaCl2
- Aggiungere 14.701 g di CaCl2 diidrato a un becher pulito da 100 ml. Aggiungere ~75 ml di acqua deionizzata e mescolare fino alla completa dissoluzione del sale.
- Trasferire la soluzione in un matraccio tarato da 100 mL e aggiungere acqua deionizzata fino al raggiungimento di 100 mL di volume. Trasferire la soluzione in un flacone e conservarla in frigorifero a 4 °C.
- Preparare 10x stock mKHB concentrato
- Aggiungere 66,03 g di cloruro di sodio (NaCl), 3,57 g di cloruro di potassio (KCl), 1,63 g di potassio diidrogeno fosfato (KH2PO4) e 1,44 g di solfato di magnesio a un becher da 2 L.
- Aggiungere ~ 750 ml di acqua deionizzata al becher e mescolare fino a quando i sali si sono sciolti (potrebbero esserci piccoli cristalli di sale lasciati sul fondo). Aggiungere 25 mL di soluzione madre 1 M CaCl2 (fase 1.1) e mescolare; assicurarsi che questo sia l'ultimo sale aggiunto.
- Trasferire la soluzione in un matraccio tarato da 1 L e aggiungere acqua deionizzata per raggiungere un volume totale di 1 L. Trasferire la soluzione in un flacone da 1 L. Conservare concentrato 10x mKHB a 4 °C in frigorifero.
NOTA: le scorte mKHB concentrate possono essere conservate per circa 1 mese prima della sostituzione.
- Preparare la dissezione della capsula di Petri (rivestimento)
- Preparare una capsula di Petri di vetro pulita (diametro 120 mm) per il rivestimento lavando e asciugando accuratamente il piatto.
- Seguendo le istruzioni del produttore per l'uso e la polimerizzazione del rivestimento alcossico conforme, rivestire il fondo della capsula di Petri con ~ 3-5 mm di rivestimento versando con cura la miscela di rivestimento conforme nel piatto fino a raggiungere lo spessore desiderato.
- Polimerizzare il rivestimento in forno a 60 °C fino a quando non è fermo al tatto. La dissezione della capsula di Petri è ora pronta.
NOTA: una pulizia delicata del piatto dopo ogni utilizzo assicurerà che il rivestimento duri per anni prima che sia necessaria la sostituzione. Quando si sostituisce il rivestimento, assicurarsi di rimuovere tutto il materiale di rivestimento prima di applicare un nuovo rivestimento. Si noti che il rivestimento alcosossico conforme (Table of Materials) utilizzato in questo protocollo ha una durata di conservazione inferiore a un anno.
2. Preparazioni pre-dissezione
NOTA: questo passaggio avvia l'esperimento. I passaggi seguenti devono essere eseguiti lo stesso giorno, in questo ordine.
- Preparare 1x mKHB
- Preparare un becher pulito da 2 L per il buffer. Trasferire 200 mL di stock 10x mKHB al becher da 2 L. Aggiungere 2,1 g di carbonato di sodio (NaHCO3) e 0,99 g di destrosio anidro (D-glucosio) al becher da 2 L.
- Aggiungere circa 1 L di acqua deionizzata al becher. Mescolare fino a quando i sali non sono stati completamente sciolti. Trasferire la soluzione in un matraccio tarato da 2 L e aggiungere acqua deionizzata per raggiungere un volume totale di 2 L.
- Trasferire la soluzione in un flacone di vetro da 2 L posto su un agitatore riscaldante con la temperatura impostata a 37 °C.
NOTA: l'agitatore riscaldante più piccolo spesso non sarà in grado di raggiungere la temperatura target di 37 °C a causa dell'inerzia termica di grandi contenitori pieni d'acqua. Regolare la temperatura verso l'alto in modo che il contenuto della bottiglia raggiunga i 37 °C mescolando. Monitorare la temperatura durante l'esperimento e abbassare la temperatura impostata in caso di overshoot. - Posizionare un termometro nella bottiglia da 2 L per monitorare la temperatura, utilizzando pinze per evitare che il termometro venga influenzato dalla pulce in movimento. Aerare il tampone con carbogeno per un minimo di 30 minuti per ossigenare la soluzione. Questo dovrebbe impostare il pH a 7,4. Misurare il pH con un pHmetro per assicurarsi che sia entro 0,1 unità di pH di 7,4 (a 37 °C).
NOTA: per regolare il pH a 7,4, utilizzare acido cloridrico o idrossido di sodio quando necessario. - Riempire due tubi di centrifuga da 15 mL e una bottiglia da 100 ml con mKHB e metterli sul ghiaccio per raffreddare.
NOTA: I tubi della centrifuga e la bottiglia possono essere puliti e riutilizzati dopo ogni esperimento senza autoclave. - Per le parti successive dell'esperimento, continuare ad aerare il tampone nel flacone da 2 L con carbogeno a 37 °C con agitazione continua.
NOTA: l'uso non supervisionato del carbogeno può essere pericoloso se non sono presenti sistemi automatici per interrompere il flusso di gas in caso di perdita. Un sensore automatizzato e una valvola di intercettazione elettronica possono mitigare questo fenomeno; in caso contrario, una persona deve essere lasciata a supervisionare l'apparecchiatura se la dissezione avviene in una stanza diversa. In tutti i casi, è necessario utilizzare un sensore di ossigeno vicino alla configurazione per avvisare gli operatori quando la concentrazione di ossigeno ambientale supera il 25%. Utilizzare una stanza con ventilazione attiva, se possibile.
- Accendere il dispositivo di acquisizione del segnale, il preamplificatore a basso rumore, il filtro del rumore di linea e l'oscilloscopio per la registrazione e la stimolazione, per consentire un tempo sufficiente per la stabilizzazione della temperatura.
- Assicurarsi che tutte le apparecchiature di registrazione elettrica siano configurate correttamente
- Impostare il preamplificatore a basso rumore su ingresso accoppiato CA con il filtro passa-banda di ingresso impostato su 6 dB roll-off per decennio e frequenze di taglio impostate rispettivamente su 30 Hz e 3 kHz per i filtri passa-alto e passa-basso.
- Impostare il guadagno del preamplificatore a basso rumore su 100.
3. Anestesia animale ed eutanasia
NOTA: per gli studi sono state utilizzate femmine di ratto tra 250 e 330 g (Tabella dei materiali).
- Preparare strumenti chirurgici e materiali di consumo: forbici dritte da 12 cm (smussate); Forbici a molla angolate da 2 mm; Forbici fini di 4 cm, affilate o semi-affilate; # 7 Pinza Dumont; Pinza fine angolata di 45° e seta o filo sutura 6-0.
- Posizionare il ratto in un contenitore o in una camera di anestesia. Collegare l'ossigeno e il diffusore anestetico al contenitore. Impostare la concentrazione di anestetico (isoflurano) al 3,5% e attendere circa 10 minuti o fino a quando l'animale mostra segni di anestesia come perdita del riflesso di raddrizzamento.
- Dopo che il ratto mostra segni di anestesia, confermare la perdita di coscienza con un test del riflesso di astinenza del pizzico della punta. Procedere solo quando non c'è prelievo della punta; in caso contrario, controllare tutte le connessioni e i livelli di anestetico nel diffusore e ripetere il passaggio 3.2.
- Estrarre l'animale dal contenitore e procedere con la lussazione cervicale, seguita dall'incisione di un'arteria femorale per la conferma della morte.
4. Protocollo di dissezione
NOTA: Posizionare l'animale con la pancia in giù sul tavolo di dissezione. Ripeti i seguenti passaggi per entrambe le gambe. In genere, la gamba destra viene sezionata per prima.
- Tenendo saldamente la caviglia tra il pollice, l'indice e il dito medio, recidere il tendine calcaneare usando forbici smussate dritte di 12 cm.
- Con le forbici affilate, fai un'incisione cutanea dal tendine calcaneare lungo la parte posteriore della gamba fino alla base della colonna vertebrale, facendo attenzione a non sezionare il tessuto muscolare sottostante.
- Usando pinze fini e forbici fini, fare incisioni accurate attraverso gli strati muscolari vicino al centro della parte posteriore della gamba fino a quando il nervo sciatico è esposto. Non appena il nervo sciatico è visibile, idratare la cavità usando mKHB ghiacciato per evitare che il nervo si secchi.
- Usando gli emostati, tirare i lembi della pelle su ciascun lato e mantenere l'incisione aperta per un lavoro di dissezione più fine. Partendo dalla posizione dell'incisione del tendine calcaneare, con forbici fini, interrompere il muscolo sul lato mediale della gamba per liberare il nervo. Continuare a mantenere i livelli di umidità nell'area con mKHB ghiacciato.
- Mentre il nervo è esposto mentre si muove verso l'alto della gamba, sezionare il tessuto muscolare sovrastante. Liberare il nervo più vicino alla colonna vertebrale dai tessuti connettivi fino a raggiungere la fessura spinale a quel punto c'è un nodo nel nervo. Non tentare di pulire il nervo ancora come la velocità è essenziale in questa fase.
- Tagliare il nervo il più vicino possibile alla colonna vertebrale con forbici fini. Per facilitare la dissezione, tirare molto delicatamente l'estremità del nervo vicino alla caviglia usando una pinza. Non pizzicare mai il nervo nel mezzo, ma solo le estremità. Non tirare mai un nervo teso.
OPZIONALE: A questo punto, se il tempo lo consente, è possibile eseguire la sutura di entrambe le estremità del nervo per aiutare a mantenere la vitalità. Mantenere la maneggevolezza al minimo per evitare danni. Se il tempo non è sufficiente (vedere il passaggio 4.5), ignorare questo passaggio e seguire il passaggio 5.2 in seguito. - Posizionare il nervo sezionato nel tubo della centrifuga da 15 ml riempito con mKHB (punto 2.1.5), chiudere il tubo e riposizionarlo sul ghiaccio fino all'inizio della procedura di pulizia.
- Ripetere i passaggi 4.1-4.7 per l'altra gamba. Idealmente, ogni nervo dovrebbe richiedere 5-10 minuti per estrarre, al fine di massimizzare la vitalità dei tessuti.
5. Procedura di pulizia dei nervi
- Riempire la capsula di Petri rivestita circa a metà strada con mKHB ossigenato refrigerato. Posizionare uno dei nervi sciatici sezionati nel piatto e appuntare entrambe le estremità del nervo al piatto in modo tale che il nervo sia dritto senza attorcigliamenti, torsioni o torsioni. Fissare il nervo il più vicino possibile alle estremità.
- Usando suture di seta 6-0 o filo sottile, legare un doppio nodo attorno a ciascuna estremità del nervo per evitare la fuoriuscita di citosol nel tampone. Posiziona i nodi proprio accanto agli insetti sul lato più vicino al centro del nervo, in quanto ciò impedirà la fuoriuscita dal tessuto nervoso nel tampone. Non eseguire questo passaggio se il nervo è stato precedentemente legato.
- Utilizzando il microscopio per la precisione e le forbici a molla angolate da 2 mm, rimuovere grasso, vasi sanguigni e tessuto muscolare dal nervo. Potare eventuali rami nervosi che non verranno utilizzati nel protocollo di stimolazione e registrazione.
- Ogni 5 minuti di pulizia, sostituire il tampone con mKHB ossigenato fresco refrigerato. Utilizzare pinze sottili per tirare su tessuti connettivi, grasso e vasi sanguigni per facilitare la dissezione.
- Riposizionare i nervi nei tubi di trasporto riempiti con mKHB refrigerato fresco ossigenato e posizionare i tubi sul ghiaccio.
6. Configurazione dell'apparecchiatura
NOTA: la configurazione dell'apparecchiatura utilizzata per eseguire esperimenti è illustrata nella Figura 1. In breve, consiste in un bagno nervoso a doppio compartimento, una bottiglia da 2 L posta su un agitatore riscaldante, una fonte di carbogeno per l'aerazione tampone e un tubo per consentire al tampone di fluire dalla bottiglia al bagno e tornare alla bottiglia usando una pompa peristaltica. Il bagno può essere lavorato in plexiglass o stampato in 3D con materiali a tenuta stagna. Ha una profondità di circa 2 cm e la partizione che separa le due camere del bagno presenta un foro di 1,5 mm di diametro per consentire la filettatura di un nervo periferico attraverso entrambe le camere. Una camera è grande, deve essere lunga almeno 4 o 5 cm e sarà riempita con tampone. L'altra camera deve essere lunga almeno 3 cm e sarà riempita con silicone o olio minerale. Il bagno non deve essere reso troppo grande in quanto ciò degraderà il controllo della perfusione, della temperatura e del pH. Possono essere necessarie diverse dimensioni del bagno a seconda delle dimensioni del tessuto nervoso studiato.
- Preparare un bagno nervoso pulito a doppia camera (vedere File supplementare per le specifiche di progettazione). Posizionare il bagno nervoso sotto il livello della bottiglia da 2 L posta sull'agitatore riscaldante, utilizzando teste e pinze standard da laboratorio. Collegare lo scarico del bagno all'ingresso della pompa peristaltica.
- Collegare l'uscita della pompa peristaltica a un tubo che riporta al flacone tampone da 2 L. Collegare l'ingresso del bagno a un tubo con una valvola di flusso regolabile e inserire il tubo all'interno della bottiglia da 2 L. Utilizzare una valvola a tre vie con una siringa collegata all'uscita centrale per aiutare con l'adescamento del tubo come sifone per l'afflusso tampone assistito dalla gravità.
- Innescare il sifone disegnando la siringa fino a quando il buffer non scorre in esso. Configurare la valvola in modo che la portata del tampone nel bagno sia ~5-6 mL·min-1. Il flusso può essere aumentato inizialmente per riempire il bagno. Una volta che il livello del tampone del bagno ha raggiunto lo scarico, posizionare i nervi nella vasca da bagno.
- Usando una spilla per insetti, fissare l'estremità del nervo all'angolo della camera da bagno piena di buffer. Usando una pinza fine angolata di 45° e pizzicando il nervo solo alle estremità, infilare con cura il nervo da stimolare attraverso il foro nella partizione tra le due camere da bagno.
- Fissare l'altra estremità del nervo nella camera dell'olio del bagno con una spilla per insetti, assicurandosi che il nervo sia dritto senza essere allungato e privo di attorcigliamenti e torsioni. Utilizzando grasso siliconico, creare una guarnizione per evitare perdite tampone dalla camera tampone nella camera dell'olio. Riempire la camera dell'olio con silicone o olio minerale.
- Posizionare i ganci degli elettrodi di registrazione Ag/AgCl nella camera del bagno d'olio e fissarli utilizzando teste e pinze. Drappeggiare la parte del nervo nel bagno d'olio sopra i ganci senza tirare il nervo teso. Non pizzicare il nervo; utilizzare pinze angolate per sollevare il nervo senza pizzicare.
- Regolare o riparare il sigillo di grasso siliconico se si osservano perdite dopo aver spostato il nervo.
- Collegare l'elettrodo Ag/AgCl di riferimento alla messa a terra dell'amplificatore e posizionare l'elettrodo nella camera da bagno riempita di tampone fissandolo utilizzando una pinza da laboratorio.
7. Impianto di elettrodi sul nervo nel bagno
- Preparare un elettrodo per polsino nervoso pulito per la stimolazione secondo il riferimento21. Posizionare l'elettrodo nella camera da bagno riempita di tampone. Usando pinze o pinzette sottili con punte smussate o angolate, aprire l'elettrodo nella vasca da bagno per bagnare l'interno del bracciale.
- Se le bolle rimangono, utilizzare una siringa fine per estrarre il tampone dal bagno e forzare le bolle fuori dal bracciale. Con una pinzetta sotto il nervo, aprire delicatamente il bracciale e farlo scorrere sotto il nervo. Chiudere il bracciale intorno al nervo, avendo cura di evitare qualsiasi attorcigliamento o torsione del nervo.
- Collegare l'elettrodo di stimolazione allo stimolatore e fissare il cavo dell'elettrodo di stimolazione con del nastro adesivo. Collegare l'elettrodo di ritorno della corrente allo stimolatore e fissare il cavo con del nastro. Se si utilizza un foglio di platino quadrato come elettrodo di ritorno della corrente, posizionare il foglio lontano dal nervo nella vasca da bagno.
8. Stimolazione e registrazione
- Collegare l'uscita del segnale TTL dello stimolatore al canale 4 dell'oscilloscopio, che verrà utilizzato per attivare l'oscilloscopio. Nella schermata dell'oscilloscopio, premere la scheda Canale trigger e specificare canale 4 come canale di attivazione. Impostare il livello di trigger su 1 V utilizzando la manopola Level .
- Sull'oscilloscopio, impostare la risoluzione temporale su 1 ms/divisione e la risoluzione di tensione su 10 mV/divisione. Centrare il riferimento del trigger nel tempo e impostare il livello di trigger su 1 V.
NOTA: seguire i passaggi da 8.3 a 8.6 se si utilizza lo stimolatore personalizzato (vedere Tabella dei materiali). Si presume che il software MATLAB e i driver di dispositivo siano stati installati sul computer di laboratorio utilizzando le istruzioni fornite gratuitamente online per lo stimolatore neurale personalizzato21. In caso contrario, seguire le istruzioni del produttore per l'uso di uno stimolatore disponibile in commercio come alternativa. - Collegare lo stimolatore al computer di laboratorio. Accendere lo stimolatore collegando l'alimentatore a batteria all'ingresso di alimentazione. Avviare il software MATLAB sul computer di laboratorio.
- Esegui lo script MATLAB personalizzato: HFAC_4ch_Stimulator_Initialization.m (Table of Materials).
NOTA: il cavo di comunicazione USB tra il computer e lo stimolatore dovrebbe lampeggiare in verde. In caso contrario, si verifica un errore di configurazione e l'alimentatore e le connessioni devono essere verificati. - Apri lo script MATLAB: HFAC_4ch_Monophasic_Stimulation.m (Tabella dei materiali). Modificando direttamente lo script MATLAB, imposta i parametri come segue: ampiezza dell'impulso dello stimolatore = -300 μA, larghezza dell'impulso dello stimolatore = 300 μs, numero dello stimolatore di impulsi = 10 e tempo dello stimolatore tra gli impulsi = 1 s.
- Avviare il protocollo di stimolazione facendo clic su Esegui nel software MATLAB.
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Representative Results
I risultati rappresentativi che possono essere ottenuti con questo protocollo sono i potenziali d'azione composti coerenti dalle fibre nervose di tipo A all'interno del nervo sciatico. Questi potenziali d'azione hanno tipicamente un'ampiezza da picco a picco di circa 1 mV all'elettrodo e quindi di 100 mV una volta amplificati (Figura 2). Ampiezze di stimolazione e larghezze di impulso simili dovrebbero produrre ampiezze CAP simili. Gli elettrodi per polsini in elastomero conduttivo richiedono generalmente ampiezze di stimolazione leggermente più elevate per ottenere la stessa ampiezza CAP rispetto agli elettrodi a bracciale in platino disponibili in commercio. Questa differenza è generalmente piccola rispetto alla variazione dell'ampiezza di stimolazione necessaria per stimolare i nervi provenienti da animali diversi. Questo perché piccole differenze nelle dimensioni del nervo e nella vestibilità del bracciale hanno un grande effetto sull'ampiezza di stimolazione richiesta per ottenere un'ampiezza CAP specifica, indipendentemente dal materiale del bracciale. Questo può essere utilizzato per testare gli effetti di diverse composizioni tampone, come diverse concentrazioni di ioni o l'aggiunta di sostanze nervose eccitatorie o inibitorie come la tetrodotossina. Se il tubo di scarico tampone viene instradato verso un contenitore aggiuntivo, l'aggiunta di sostanze che alterano l'eccitabilità nervosa può essere resa temporanea per l'esperimento, con tassi di lavaggio dipendenti dalla velocità di afflusso del tampone.
La densità minima di corrente, calcolata come ampiezza di stimolazione divisa per la superficie degli elettrodi di stimolazione, necessaria per attivare le fibre di tipo A e ottenere un potenziale d'azione composto osservabile dell'oscilloscopio, è stata tracciata rispetto alla larghezza dell'impulso nella Figura 3. I risultati mostrati nella Figura 3 rappresentano l'eccitabilità nervosa tipica sia per i polsini nervosi in platino standard disponibili in commercio che per i polsini nervosi in elastomero conduttivo su misura.
I nervi estratti dovrebbero rimanere vitali per circa 6 ore dopo l'estrazione e, pertanto, gli esperimenti devono rientrare in questa finestra temporale. La perdita di vitalità nervosa porta ad un progressivo declino dell'ampiezza del CAP e della velocità di conduzione. Dopo che l'ampiezza del potenziale d'azione diminuisce al di sotto del 50% dell'ampiezza iniziale (all'inizio della registrazione), il nervo deve essere considerato non più vitale in quanto i risultati saranno significativamente distorti. I risultati rappresentativi rispetto alla longevità dei nervi sono mostrati nella Figura 4. I nervi sciatico destro e sinistro sono stati estratti da un animale tra le 10:00 e le 11:00 di un dato giorno. I CAP iniziali sono stati ottenuti dal nervo sciatico destro durante i test iniziali prima degli esperimenti, e i CAP standard sono stati ottenuti da entrambi i nervi sciatici sinistro e destro, che erano stati mantenuti in vita usando questo protocollo, alla fine degli esperimenti. La riduzione minima dell'ampiezza della CAP è stata osservata con il nervo sciatico destro, mentre l'ampiezza del CAP del nervo sciatico sinistro a circa 3 mV era simile a quella del nervo sciatico destro all'inizio dell'esperimento più di 6 ore dopo l'estrazione del nervo.
Figura 1: Rappresentazione schematica del setup sperimentale utilizzato nel protocollo. Questa cifra è stata modificata da Rapeaux, A. et al. (2020)20. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: CAP rappresentativi ottenuti ex vivo a seguito di stimolazione da parte di polsini nervosi in elastomero metallico e conduttivo. Riprodotto con modifiche da Cuttaz, E. A. et al. (2021)22. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Soglia di attivazione della fibra A dei polsini in elastomero metallico e conduttivo. Le barre di errore rappresentano ±1 deviazione standard dalla media. Riprodotto con modifiche da Cuttaz, E. A. et al. (2021)22. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: CAP rappresentativi ottenuti ex vivo in una giornata di esperimenti e utilizzando entrambi i nervi sciatici da un animale. (A) CAP in fibra di tipo A ottenuto vicino a mezzogiorno dal nervo sciatico destro. (B) CAP in fibra di tipo A ottenuto a metà pomeriggio dal nervo sciatico sinistro. (C) CAP in fibra di tipo A ottenuto al termine di esperimenti con lo stesso nervo sciatico sinistro in (B). L'asse x corrisponde all'ora del giorno in cui sono state effettuate le registrazioni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File integrativo. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
In questo lavoro, abbiamo descritto un protocollo per preparare i nervi sciatici di ratto per la neurofisiologia ex vivo. L'estrazione dei tessuti richiede circa 30 minuti, compresa la manipolazione degli animali, l'anestesia, l'abbattimento e la dissezione, mentre la pulizia dei nervi, il posizionamento nel bagno e l'impianto dell'elettrodo dovrebbero richiedere altri 30 minuti prima che la registrazione possa essere avviata. La preparazione del buffer può essere eseguita in 30 minuti, anche se questo può essere fatto prima del resto dell'esperimento. Questo tipo di preparazione ed esperimento è stato utilizzato e descritto negli ultimi 7,12, utilizzando tamponi simili e per lo stesso tipo di tessuto. Per quanto a conoscenza degli autori, tuttavia, questa è la prima volta che una descrizione della preparazione del buffer, della dissezione, dell'attrezzatura installata e della successiva registrazione è stata fornita nello stesso documento.
Questo protocollo può consentire un'ampia varietà di esperimenti in neurofisiologia che non sarebbero possibili né in vitro né in vivo . Ad esempio, un vantaggio dei preparati ex vivo è che preservano la macro e la microstruttura del tessuto estratto isolando questo tessuto dal resto del corpo. Ciò si traduce in una configurazione più semplice in quanto l'anestesia non deve essere mantenuta, che è altrimenti un requisito negli esperimenti in vivo . In termini di sperimentazione, i preparati ex vivo consentono l'uso di sostanze come la tetrodotossina, che sono difficili da giustificare in un contesto in vivo 23 in quanto comportano un rischio elevato per l'animale. Quando l'uso di tali sostanze giova all'indagine, esse sono più facili da usare nei preparati ex vivo . L'uso dello stimolatore personalizzato20 consente esperimenti che utilizzano il blocco HFAC per la neuromodulazione utilizzando questa configurazione sperimentale.
Il passaggio più critico nel protocollo è il passaggio di dissezione, perché anche un piccolo errore usando le forbici di dissezione può danneggiare il nervo se non si presta sufficiente attenzione. Anche la velocità in questa fase è essenziale in quanto il tessuto deve essere rapidamente estratto dal corpo e posto in un buffer refrigerato per massimizzare la vitalità all'inizio della registrazione. Dopo l'estrazione del tessuto, mentre si deve prestare attenzione durante la pulizia del nervo e l'impianto di eventuali elettrodi, il protocollo è più flessibile rispetto al tempo e il rischio di errore dell'operatore è, quindi, inferiore. Poiché i diametri dei nervi e il posizionamento dei fascicoli all'interno dei nervi variano da animale ad animale, ci si dovrebbe aspettare una certa variabilità nei risultati anche se si utilizzano gli stessi elettrodi e lo stesso protocollo di stimolazione. L'effetto di questa variabilità può essere visto nelle barre di errore per le soglie di stimolazione nella Figura 3. È importante non pizzicare il nervo in nessuna fase della preparazione in quanto ciò può causare danni irreversibili al tessuto. Maneggiare il nervo solo dalle sue estremità usando una pinza e con grande attenzione a non tirare il nervo teso.
Diversi aspetti del protocollo nella sua forma attuale possono essere migliorati aumentando la quantità di apparecchiature e il tempo di configurazione. Per aiutare con la diagnosi di potenziali problemi con questa configurazione sperimentale, le misurazioni automatizzate del pH e dell'ossigeno disciolto nel bagno potrebbero essere utili, ma non sono state implementate qui. Entrambe le misure possono essere realizzate utilizzando metodi amperometrici o potenziometrici12,19. L'attrezzatura che richiederà una manutenzione regolare è il tubo e la vetreria, che accumula depositi di sale nel tempo. I ganci di registrazione AgCl richiedono anche un regolare ri-rivestimento o sostituzione, insieme al riferimento AgCl. Gli elettrodi di stimolazione devono essere puliti dopo ogni utilizzo, ma generalmente non richiedono la sostituzione per molti esperimenti.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse.
DICHIARAZIONE OPEN ACCESS:
Ai fini dell'accesso aperto, l'autore ha applicato una licenza Creative Common Attribution (CC BY) (ove consentito da UKRI, "Open Government Licence" o "Creative Commons Attribution No-derivatives (CC BY-ND) licenza può essere indicata invece) a qualsiasi versione del manoscritto accettato dall'autore.
CONDIVISIONE DEI DATI:
I dati grezzi utilizzati nelle figure di questo articolo saranno resi disponibili dagli autori, senza indebite riserve.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono il Dr. Gerald Hunsberger di GlaxoSmithKline Pharmaceuticals, King of Prussia, PA, USA e Galvani Bioelectronics (Stevenage, Regno Unito) per aver condiviso con noi la loro tecnica originale di preparazione nervosa. Gli autori riconoscono Robert Toth per il design del bagno nervino a doppia camera. Gli autori riconoscono il finanziamento della sovvenzione Healthcare Technologies Challenge Awards (HTCA) del Consiglio di ricerca in ingegneria e scienze fisiche (EPSRC). Gli autori riconoscono l'High Performance Embedded and Distributed Systems Centre for Doctoral Training (HiPEDS CDT) dell'Imperial College di Londra per il finanziamento di Adrien Rapeaux (EP/L016796/1). Adrien Rapeaux è attualmente finanziato dal Dementia Research Institute, Care Research and Technology Centre del Regno Unito. Gli autori riconoscono con gratitudine Zack Bailey dell'Imperial College, nel Dipartimento di Bioingegneria, per l'aiuto con gli esperimenti e l'accesso ai tessuti animali durante la produzione dell'articolo video JoVE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1595 | Borosilicate glass |
| 1 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | 612-3626 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1596 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | BRND937254 | Borosilicate glass |
| Adaptor, pneumatic, 8 mm to 1/4 NPT | RS UK | 536-2599 | push-to-fit straight adaptor between oxygen hose and gas dispersion tube |
| Alkoxy conformal coating | Farnell | 1971829 | ACC15 Alkoxy conformal coating for dissection petri dish preparation |
| Anesthetic | Chanelle | N/A | Isoflurane inhalation anesthetic, 250 mL bottle |
| Beaker, 2 L | VWR International Ltd | 213-0469 | Borosilicate glass |
| Bipolar nerve cuff | Cortec GMBH | N/A | 800 micron inner diameter, perpendicular lead out, no connector termination |
| Bossheads | N/A | N/A | Standard wet laboratory bossheads for attaching grippers to rods |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902-500g | 500 g in plastic bottle |
| Carbogen canister | BOC | N/A | F-size canister |
| Centrifuge Tubes, 15 mL volume | VWR International Ltd | 734-0451 | Falcon tubes |
| Conductive elastomer nerve cuff | N/A | N/A | high charge capacity nerve cuff for stimulation, see protocol for fabrication reference |
| Connector, Termimate | Mouser UK | 538-505073-1100-LP | These should be soldered to wire terminated with crocodile clips (see entry 11) |
| Crocodile clip connectors | RS UK | 212-1203 | These should be soldered to wire terminated with TermiMate connectors (see entry 10) |
| Deionized Water | N/A | N/A | Obtained from deionized water dispenser |
| Forceps angled 45 degrees | InterFocus Ltd | 91110-10 | Fine forceps, student range |
| Forceps standard Dumont #7 | InterFocus Ltd | 91197-00 | Student range forceps |
| Gas Disperson Tube, Porosity 3 | Merck | 12547866 | N/A |
| Glucose anhydrous, powder | VWR International Ltd | 101174Y | 500 g in plastic bottle |
| Grippers | N/A | N/A | Standard wet laboratory rod-mounted grippers |
| Heating Stirrer | RS UK | 768-9672 | Stuart US152 |
| Hemostats | N/A | N/A | Any hemostat >12 cm in length is suitable |
| Insect Pins, stainless steel, size 2 | InterFocus Ltd | 26001-45 | N/A |
| Laptop computer | N/A | N/A | Any laboratory-safe portable computer with at least 2 unused USB ports is suitable |
| Line Noise Filter | Digitimer | N/A | Humbug noise eliminator (50 Hz line noise filter) |
| Low-Noise Preamplifier, SR560 | Stanford Research Systems | SR560 | Low-noise voltage preamplifier |
| Magnesium Sulphate salt | VWR International Ltd | 291184P | 500g in plastic bottle |
| MATLAB scripts | Github | https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch | Initialization, calibration and stimulation scripts for the custom stimulator |
| MATLAB software | Mathworks | N/A | Standard package |
| Microscope Light, PL-2000 | Photonic | N/A | Light source with swan necks. Product may be obtained from third party supplier |
| Microscope, SMZ 745 | Nikon | SM745 | Stereoscopic Microscope |
| Mineral oil, non-toxic | VWR International Ltd | 31911.A1 | Oil for nerve bath |
| Nerve Bath | N/A | N/A | Plexiglas machined nerve bath, see protocol for details. |
| Oscilloscope | LeCroy | N/A | 434 Wavesurfer. Product may be obtained from 3rd party suppliers |
| Oxygen Hose, 1 meter | BOC | N/A | 1/4" NPT terminations |
| Oxygen Regulator | BOC | C106X/2B:3.5BAR-BS3-1/4"NPTF 230Bar | N/A |
| Peristaltic Pump P-1 | Pharmacia Biotech | N/A | Product may be obtained from third party supplier |
| Petri Dish, Glass | VWR International Ltd | 391-0580 | N/A |
| Potassium Chloride salt | Sigma Aldrich | P5405-250g | 250 g in plastic bottle |
| Potassium Dihydrogen Sulphate salt | Merck | 1.04873.0250 | 250 g in plastic bottle |
| Rat | Charles River Laboratories | N/A | Sprague Dawley, 250-330 grams, female |
| Reference electrode, ET072 | eDaQ (Australia) | ET072-1 | Silver silver-chloride reference electrode |
| Rod | N/A | N/A | Standard wet laboratory rods with fittings for stands |
| Scale | Sartorius | N/A | M-Power scale, for weighing powders. Product may be obtained from third-party suppliers |
| Scissors straight 12 cm edge | InterFocus Ltd | 91400-12 | blunt-blunt termination, student range |
| Signal Acquisition Device | Cambridge Electronic Design | Micro3-1401 | Micro3-1401 Multichannel ADC |
| Silicone grease, non-toxic | Farnell | 3821559 | for sealing of bath partition |
| Silicone tubing, 2 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silicone tubing, 5 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silver wire | Alfa Aesar | 41390 | 0.5 mm, annealed |
| Sodium Bicarbonate salt | Sigma Aldrich | S5761-500g | 500 g in plastic bottle |
| Sodium Chloride salt | VWR International Ltd | 27810.295 | 1 kg in plastic bottle |
| Spring scissors angled 2 mm edge | InterFocus Ltd | 15010-09 | N/A |
| Stand | N/A | N/A | Standard wet laboratory stands with sockets for rods |
| Stimulator | Digitimer | DS3 | DS3 or Custom Stimulator (see references) |
| Stirring flea | VWR International Ltd | 442-0270 | For use with the heating stirrer |
| Syringe tip, blunt, 1 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe tip, blunt, 2 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe, plastic, 10 mL volume | N/A | N/A | syringe should have luer lock fitting |
| Tape, water-resistant | N/A | N/A | For securing tubing and wiring to workbench |
| Thermometer | VWR International Ltd | 620-0806 | glass thermometer |
| USB Power Bank | RS UK | 135-1000 | Custom Stimulator power supply, fully charge before experiment. Not needed if using DS3 |
| Valve, Leuer Lock, 3-Way | VWR International Ltd | 229-7440 | For attaching syringe to bath feed tube and priming siphon |
References
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