Summary
פרוטוקול זה מתאר את ההכנה של רקמת עצב סיאטית שלמה של חולדה לגירוי אלקטרופיזיולוגי ex vivo ורישום באמבט מלוחים בעל שני תאים מווסתים סביבתית.
Abstract
תכשירי Ex vivo מאפשרים לחקור תהליכים נוירופיזיולוגיים רבים בבידוד משאר הגוף תוך שמירה על מבנה הרקמות המקומי. עבודה זו מתארת את ההכנה של עצבים סיאטיים של חולדות לנוירופיזיולוגיה ex vivo, כולל הכנת חיץ, הליכים בבעלי חיים, הגדרת ציוד ורישום נוירופיזיולוגי. עבודה זו מספקת סקירה כללית של סוגי הניסויים השונים האפשריים בשיטה זו. השיטה המתוארת נועדה לספק 6 שעות של גירוי ורישום על רקמת עצב היקפית שחולצה בתנאים מבוקרים היטב לעקביות אופטימלית בתוצאות. התוצאות המתקבלות בשיטה זו הן פוטנציאל פעולה מורכב מסיבי A (CAP) עם משרעת שיא לשיא בטווח המיליוולט לאורך כל משך הניסוי. משרעת וצורות CAP הן עקביות ואמינות, מה שהופך אותן לשימושיות לבדיקה והשוואה של אלקטרודות חדשות למודלים קיימים, או להשפעות של התערבויות על הרקמה, כגון שימוש בכימיקלים, שינויים כירורגיים או טכניקות גירוי נוירומודולטוריות. הן אלקטרודות שרשרת מסחריות קונבנציונליות עם מגעי פלטינה-אירידיום והן אלקטרודות אלסטומר מוליכות בהתאמה אישית נבדקו ונתנו תוצאות דומות מבחינת תגובת משך חוזק הגירוי העצבי.
Introduction
ההבנה הנוכחית של תפקוד עצבי בסיסי כפי שהיא מעוצבת בסיליקו חסרה במספר היבטים, בעיקר ביחס להשפעות של מידור רקמת העצב מחוץ לסומה, אקסון ודנדריטים. אינטראקציות אקסון-מיאלין עדיין אינן מובנות היטב, כפי שמעידה העובדה שאפילו מודלים מפורטים של עצבים חישוביים כגון MRG1 (עבור עצבי יונקים) הלוכדים כראוי את תגובת הגירוי החשמלי הקונבנציונלית, אינם לוכדים התנהגויות אחרות שנצפו בניסוי כגון הובלת בלוק בתדר גבוה2 או תגובת התפרצות משנית3.
פרוטוקול זה מספק שיטה לחקור ביעילות תהליכים נוירופיזיולוגיים ברמת העצב במודל של חיית מעבדה קטנה חריפה, תוך שימוש בפרוטוקול הכנה סטנדרטי כדי לבודד את העצב, לשלוט בסביבתו ולהסיר אותו מהקשר in vivo להקשר ex vivo. זה ימנע תהליכים אחרים בגוף או חומרי הרדמה המשמשים פרוטוקולי גירוי עצבי in vivo כדי לשנות את התנהגות העצבים ולבלבל את התוצאות הנמדדות או אתהפרשנות שלהם 4,5. זה מאפשר פיתוח של מודלים מציאותיים יותר המתמקדים אך ורק בהשפעות ספציפיות לרקמות עצב שאינן מובנות היטב. פרוטוקול זה שימושי גם כנקודת בדיקה לגירוי עצבי חדש ולרישום חומרים וגיאומטריות של אלקטרודות, כמו גם כפרדיגמות גירוי חדשות כגון בלוק 2,3 בתדר גבוה. וריאציות של טכניקה זו שימשו בעבר כדי לחקור פיזיולוגיה של העצבים בתנאים מבוקרים היטב6, למשל, כדי למדוד דינמיקה ותכונות של תעלת יונים או את ההשפעות של הרדמה מקומית7.
טכניקה זו מספקת מספר יתרונות בהשוואה לחלופות כגון ניסויים חריפים בבעלי חיים קטנים in vivo 8. הטכניקה מייתרת את הצורך לשמור על עומק ההרדמה כאשר הרקמה הוצאה מהגוף, ומפחיתה את כמות הציוד הנדרש כגון מפזר הרדמה, רכז חמצן וכרית חימום. זה מפשט את פרוטוקול הניסוי, מקטין את הסיכון לטעויות. מכיוון שחומרי הרדמה יכולים לשנות את תפקוד העצב4, טכניקה זו מבטיחה כי האמצעים לא יתבלבלו על ידי תופעות לוואי מתרכובות הרדמה אלה. לבסוף, טכניקה זו מתאימה יותר מניסויי in vivo חריפים כאשר חוקרים את ההשפעות של תרכובות נוירוטוקסיות כגון טטרודוטוקסין, אשר יהרגו חיה מורדמת על ידי שיתוק.
חתכי עצבים היקפיים הם מערכת ex vivo ייחודית שכן קיים סיכוי גבוה שהסיבים האחראים לאותות עצביים מוקלטים אינם מכילים כל סומה. כפי שבדרך כלל אלה היו ממוקמים, עבור נוירונים מוטוריים, בעמוד השדרה, ועבור נוירונים חושיים בגרעיני השורש הגבי שליד עמוד השדרה, ניתן לדגום באופן גס את הכנת קטע של עצב היונקים כאוסף של ממברנות צינוריות עם תעלות יונים, הפתוחות בשניהקצוות 9. חילוף החומרים נשמר על ידי המיטוכונדריה הממוקמת באקסון בזמן כריתת רקמות10. תפירה של הקצוות הפתוחים של האקסולמה מעודדת לאחר המיצוי לסגור אותם ובכך לסייע בשמירה על שיפועים יוניים קיימים על פני הממברנה, החיוניים לתפקוד עצבי תקין.
כדי לשמור על הומאוסטזיס של רקמות מחוץ לגוף, מספר משתנים סביבתיים חייבים להיות מבוקרים היטב. אלה הם טמפרטורה11, חמצון12, אוסמולריות, pH13,14, וגישה לגלוקוז כדי לשמור על חילוף החומרים. עבור פרוטוקול זה, הגישה היא להשתמש במאגר Krebs-Henseleit15,16 (mKHB) שונה ברציפות עם תערובת של חמצן ופחמן דו חמצני. ה-mKHB נמצא במשפחת המאגרים הקרדיופלגיים 6,17 המשמשים לשימור רקמות שנותחו מחוץ לגוף, למשל, בניסויי ex vivo. מאגרים אלה אינם מכילים המוגלובין, אנטיביוטיקה או אנטי פטרייתיים, ולכן הם מתאימים רק לתכשירים הכוללים כמויות קטנות של רקמות לזמן מוגבל. בקרת ה-pH הושגה עם זוג החמצונים הפחמיים והפחמן הדו-חמצני, מה שדרש אוורור מתמיד של החיץ עם פחמן דו-חמצני כדי לשמור על שיווי משקל ה-pH. זאת כדי להימנע משימוש בחומרי אגירה נפוצים אחרים כגון HEPES, אשר יכול לשנות את תפקוד תאי העצב18. כדי לחמצן את החיץ ולספק בקרת pH, נעשה שימוש בתערובת של 5% פחמן דו חמצני בחמצן הנקרא קרבוגן (95% O2, 5% CO2). מערבל חימום שימש לבקרת טמפרטורה של מיכל חיץ, והחוצץ הוחדר דרך אמבט עצבים, ולאחר מכן הוחזר למיכל ההתחלה. ניסוי טיפוסי יימשך 6-8 שעות לפני שהעצב מאבד את הכדאיות שלו וכבר לא מגיב מספיק לגירוי כדי שהאמצעים ייצגו רקמה בריאה.
כדי לייעל את יחס האות לרעש, אלקטרודות כסף-כלוריד שימשו להקלטה, אשר הוכנו על פי שיטותשתוארו קודם לכן 19. לצורך גירוי, ניתן להשתמש בשילוב של אלקטרודות מסחריות של שרוול פלטינה מהמדף ואלקטרודות של חפתים פולימריים מוליכים בהתאמה אישית. אלקטרודות של חפתים פולימריים מוליכים הן בעלות יכולות מטען גבוהות במיוחד, אשר שימושיות בעת גירוי העצב באמצעות צורות גל משרעת גבוהות20.
הממריץ המשמש בפרוטוקול זה תואר בעבר20. תיעוד, קבצי עיצוב וסקריפטים של תוכנה לשימוש בהם זמינים לציבור21. ניתן להשתמש בממריצים אחרים כדי לבצע פרוטוקול זה; עם זאת, הממריץ המותאם אישית מסוגל גם לבלוק זרם חלופי בתדר גבוה (HFAC) 2,20, המאפשר מגוון רחב יותר של ניסויים נוירופיזיולוגיים. כדי להשתמש בחסימת HFAC, מומלץ לאזיקים מוליכים של אלסטומר כדי למנוע נזק לעצב. אזיקי עצב אלסטומר מוליכים הם מערכי אלקטרודות רכים ופולימריים לחלוטין המופקים מאלסטומרים מוליכים כמרכיב המוליך ופולידימתילסילוקסן כבידוד22. המכשירים יוצרו בתצורה דו קוטבית תוך שימוש בטכניקות מיקרו-פבריקציה קונבנציונליות של לייזר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הטיפול והנהלים בבעלי חיים בוצעו תחת רישיונות מתאימים שהונפקו על ידי משרד הבית הבריטי תחת חוק בעלי החיים (נהלים מדעיים) (1986) ואושרו על ידי המועצה לרווחת בעלי חיים ובדיקה אתית של אימפריאל קולג 'בלונדון.
1. הכנת מאגרים
הערה: חלק זה של הפרוטוקול יכול להתבצע הרבה לפני שאר הפרוטוקול, למעט השלבים הסופיים הכרוכים בהכנת חיץ קרבס-הנסלייט (mKHB) שונה בריכוז 1x.
- הכן 1 M CaCl2 פתרון מלאי
- הוסיפו 14.701 גרם של CaCl2 דיהידרט לכוס נקייה של 100 מ"ל. מוסיפים כ-75 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה ומערבבים עד לפירוק מלא של המלח.
- מעבירים את התמיסה לבקבוקון מדורג של 100 מ"ל ומוסיפים מים שעברו דה-יוניזציה עד להגעה לנפח של 100 מ"ל. מעבירים את הפתרון לבקבוק ומאחסנים אותו במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- הכן 10x מלאי mKHB מרוכז
- הוסיפו 66.03 גרם של נתרן כלורי (NaCl), 3.57 גרם אשלגן כלורי (KCl), 1.63 גרם אשלגן דיהידרוגן פוספט (KH2PO4) ו-1.44 גרם מגנזיום גופרתי לכוס 2 ליטר.
- מוסיפים כ-750 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה לכוס ומערבבים עד שהמלחים נמסים (ייתכן שנותרו גבישי מלח קטנים בתחתית). הוסף 25 מ"ל של תמיסת מלאי CaCl2 של 1 M (שלב 1.1) וערבב; ודא שזהו המלח האחרון שנוסף.
- מעבירים את התמיסה לבקבוקון מדורג 1 ליטר ומוסיפים מים שעברו דה-יוניזציה כדי להגיע לנפח כולל של 1 L. העבירו את התמיסה לבקבוק 1 ליטר. יש לאחסן מרוכז 10x mKHB בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במקרר.
הערה: ניתן לאחסן מלאי mKHB מרוכז למשך כחודש לפני ההחלפה.
- להכין דיסקציה צלחת פטרי (ציפוי)
- מכינים צלחת פטרי מזכוכית נקייה (בקוטר 120 מ"מ) לציפוי על ידי שטיפה וייבוש של המנה בזהירות.
- בעקבות הוראות היצרן לשימוש וריפוי של ציפוי האלקוקסי הקונפורמי, ציפו את החלק התחתון של צלחת פטרי בכ-3-5 מ"מ של ציפוי על ידי מזיגה קפדנית של תערובת הציפוי הקונפורמי לתוך המנה עד להגעת העובי הרצוי.
- יש לרפא את הציפוי בתנור בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס עד שהוא מוצק למגע. צלחת פטרי הנתיחה מוכנה כעת.
הערה: ניקוי עדין של המנה לאחר כל שימוש יבטיח שהציפוי יחזיק מעמד שנים לפני הצורך בהחלפה. בעת החלפת הציפוי, הקפד להסיר את כל חומר הציפוי לפני החלת ציפוי חדש. שים לב שלציפוי האלקוקסי הקונפורמי (טבלת החומרים) המשמש בפרוטוקול זה יש חיי מדף קצרים יותר משנה.
2. תכשירים לפני הנתיחה
הערה: שלב זה מתחיל את הניסוי. הצעדים שלהלן חייבים להתבצע באותו יום, בסדר זה.
- הכן 1x mKHB
- הכינו 2 ליטר נקייה למאגר. העברת 200 מ"ל של מלאי 10x mKHB לכוס 2 ליטר. הוסיפו 2.1 גרם של נתרן פחמתי (NaHCO3) ו-0.99 גרם של דקסטרוז נטול מים (D-גלוקוז) לכוס 2 ליטר.
- הוסיפו כ-1 ליטר של מים שעברו דה-יוניזציה לכוס. מערבבים עד שהמלחים נמסים לחלוטין. מעבירים את התמיסה לבקבוקון מדורג 2 ליטר ומוסיפים מים שעברו דה-יוניזציה כדי להגיע לנפח כולל של 2 ליטר.
- העבירו את התמיסה לבקבוק זכוכית בנפח 2 ליטר המונח על מערבל חימום כאשר הטמפרטורה נקבעה ל-37 מעלות צלזיוס.
הערה: מערבל חימום קטן יותר לרוב לא יוכל להגיע ליעד טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בשל האינרציה התרמית של מיכלים גדולים מלאים במים. כוונו את הטמפרטורה כלפי מעלה כך שתכולת הבקבוק תגיע ל-37 מעלות צלזיוס עם ערבוב. עקוב אחר הטמפרטורה במהלך הניסוי והורד את הטמפרטורה שנקבעה במקרה של צילום יתר. - מניחים מדחום בבקבוק 2 ליטר כדי לנטר את הטמפרטורה, תוך שימוש באחיזות כדי למנוע מהמדחום להיפגע מהפרעוש הבוחש. יש לאוורר את החיץ עם קרבוגן למשך 30 דקות לפחות כדי לחמצן את התמיסה. פעולה זו אמורה להגדיר את ה-pH ל-7.4. מדוד את ה- pH עם מד pH כדי לוודא שהוא נמצא בתוך 0.1 יחידות pH של 7.4 (ב- 37 °C ).
הערה: כדי להתאים את ה-pH ל-7.4, השתמש בחומצה הידרוכלורית או נתרן הידרוקסיד בעת הצורך. - מלאו שני צינורות צנטריפוגה של 15 מ"ל ובקבוק אחד של 100 מ"ל עם mKHB והניחו אותם על קרח כדי להתקרר.
הערה: ניתן לנקות את צינורות הצנטריפוגה ואת הבקבוק ולעשות בהם שימוש חוזר לאחר כל ניסוי ללא אוטוקלאבים. - בחלקים מאוחרים יותר של הניסוי, המשיכו לאוורר את המאגר בבקבוק 2 ליטר עם קרבוגן בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ערבוב מתמשך.
הערה: שימוש לא מפוקח בקרבוגן עלול להיות מסוכן אם לא קיימות מערכות אוטומטיות לכיבוי זרימת הגז במקרה של דליפה. חיישן אוטומטי ושסתום כיבוי אלקטרוני יכולים למתן זאת; אחרת, יש להשאיר אדם לפקח על הציוד אם הנתיחה מתבצעת בחדר אחר. בכל המקרים, יש להשתמש בחיישן חמצן בסמוך למערך כדי להזהיר את המפעילים כאשר ריכוז החמצן הסביבתי עולה מעל 25%. השתמשו בחדר עם אוורור פעיל במידת האפשר.
- הפעל את התקן רכישת האותות, את הקדם-מהדק בעל הרעש הנמוך, את מסנן רעשי הקו ואת האוסצילוסקופ להקלטה וגירוי, כדי לאפשר מספיק זמן לייצוב טמפרטורה.
- ודא שכל ציוד ההקלטה החשמלי מוגדר כהלכה
- הגדר את הקדם-מהאמפליפייר בעל הרעש הנמוך לקלט המצומד ל-AC עם מסנן מעבר-פס הכניסה המוגדר ל-6 dB roll-off לעשור, ותדרי ניתוק המוגדרים ל-30 הרץ ו-3 קילוהרץ עבור מסנני מעבר גבוה ומעבר נמוך, בהתאמה.
- הגדר את הרווח של הקדם-מהאמפיפייר בעל הרעש הנמוך ל-100.
3. הרדמה של בעלי חיים והמתת חסד
הערה: נקבות חולדות בין 250 ל-330 גרם (טבלת חומרים) שימשו למחקרים.
- להכין כלי ניתוח וחומרים מתכלים: 12 ס"מ מספריים ישרים (קהים); 2 מ"מ מספריים קפיציים זוויתיים זוויתיים; מספריים עדינים 4 ס"מ, חדים או חדים למחצה; #7 מלקחיים של דומונט; מלקחיים עדינים בזווית של 45° ומשי או חוט תפירה של 6-0.
- מניחים את החולדה במיכל או בתא הרדמה. חברו את החמצן ואת מפזר ההרדמה למיכל. קבעו את ריכוז ההרדמה (איזופלורן) ל-3.5% והמתינו כ-10 דקות או עד שהחיה מראה סימני הרדמה כגון אובדן רפלקס הזכות.
- לאחר שהחולדה מראה סימני הרדמה, אשרו את אובדן ההכרה באמצעות בדיקת רפלקס נסיגה מכווץ בבוהן. המשך רק כאשר אין נסיגת בוהן; אחרת, בדוק את כל החיבורים ורמות ההרדמה במפזר וחזור על שלב 3.2.
- מוציאים את החיה מהמיכל וממשיכים עם נקע צוואר הרחם, ולאחר מכן חותכים עורק עצם הירך לאישור המוות.
4. פרוטוקול דיסקציה
הערה: הניחו את החיה עם בטנה על שולחן הנתיחה. חזור על השלבים הבאים עבור שתי הרגליים. בדרך כלל, רגל ימין מנותחת ראשונה.
- כשהם אוחזים את הקרסול בחוזקה בין האגודל, האצבע המורה והאצבע האמצעית, מנתקים את גיד הקלקניאל באמצעות מספריים קהים ישרים בקוטר 12 ס"מ.
- עם מספריים חדים עדינים, לעשות חתך בעור מן הגיד calcaneal לאורך החלק האחורי של הרגל כל הדרך עד לבסיס של עמוד השדרה, תוך הקפדה לא לנתח את רקמת השריר למטה.
- באמצעות מלקחיים עדינים ומספריים עדינים, בצע חתכים זהירים דרך שכבות השרירים הסמוכות לאמצע החלק האחורי של הרגל עד שהעצב הסיאטי נחשף. ברגע שהעצב הסיאטי נראה לעין, מעניקים לחות לחלל באמצעות mKHB קר כקרח כדי למנוע מהעצב להתייבש.
- באמצעות hemostats, למשוך את דשי העור מכל צד זה מזה, ולשמור על החתך פתוח לעבודת דיסקציה עדינה יותר. החל ממיקום החתך של גיד הקלקניאל, עם מספריים עדינים, להפריע את השריר בצד המדיאלי של הרגל כדי לשחרר את העצב. המשך לשמור על רמות הלחות באזור עם mKHB קר כקרח.
- כאשר העצב נחשף תוך כדי תנועה במעלה הרגל, נתחו את רקמת השריר העליונה. משחררים את העצב קרוב יותר לעמוד השדרה מרקמות החיבור עד שמגיעים לשסע בעמוד השדרה ואז יש קינק בעצב. אל תנסה לנקות את העצב עדיין מכיוון שהמהירות חיונית בשלב זה.
- נתקו את העצב קרוב ככל האפשר לעמוד השדרה עם מספריים עדינים. כדי להפוך את הנתיחה לקלה יותר, בעדינות רבה למשוך את קצה העצב ליד הקרסול באמצעות מלקחיים. לעולם אל תצבטו את העצב באמצע, אלא רק את הקצוות. לעולם אל תמשוך בעצבים.
אופציונלי: בשלב זה, אם הזמן מאפשר, ניתן לבצע תפירה של שני קצוות העצב כדי לסייע בשמירה על כדאיות. יש לצמצם את הטיפול למינימום כדי למנוע נזק. אם אין מספיק זמן (ראה שלב 4.5), דלג על שלב זה ועקוב אחר שלב 5.2 בהמשך. - מניחים את העצב המנותח בצינור הצנטריפוגה 15 מ"ל המלא ב-mKHB (שלב 2.1.5), סוגרים את הצינור ומניחים את הצינור בחזרה על הקרח עד לתחילת הליך הניקוי.
- חזור על שלבים 4.1-4.7 עבור הרגל השנייה. באופן אידיאלי, כל עצב צריך לקחת 5-10 דקות כדי לחלץ, על מנת למקסם את כדאיות הרקמה.
5. הליך ניקוי עצבים
- מלאו את צלחת הפטרי המצופה בערך באמצע הדרך ב-mKHB מחומצן מצונן. מניחים את אחד העצבים הסיאטיים המנותחים בצלחת ומצמידים את שני קצות העצב למנה כך שהעצב ישר ללא סטיות, פיתולים או פיתולים. הצמד את העצב קרוב ככל האפשר לקצוות.
- באמצעות 6-0 תפרי משי או חוט דק, קושרים קשר כפול סביב כל קצה של העצב כדי למנוע דליפת ציטוזול לתוך החיץ. הניחו את הקשרים ממש ליד סיכות החרקים בצד קרוב יותר למרכז העצב, שכן הדבר ימנע דליפה מרקמת העצב לתוך החיץ. אל תבצע צעד זה אם העצב כבר נקשר בעבר.
- שימוש במיקרוסקופ לדיוק ומספריים קפיציים זוויתיים בקוטר 2 מ"מ, מסירים מהעצב שומן, כלי דם ורקמת שריר. לגזום את כל ענפי העצב שלא ישמשו בפרוטוקול הגירוי וההקלטה.
- כל 5 דקות של ניקוי, להחליף את המאגר עם mKHB מחומצן מצונן טרי. השתמש במלקחיים עדינים כדי למשוך רקמות חיבור, שומן וכלי דם כדי להקל על הנתיחה.
- הניחו את העצבים בחזרה בצינורות ההובלה המלאים ב-mKHB מצונן ומחומצן טרי והניחו את הצינורות על הקרח.
6. הגדרת ציוד
הערה: מערך הציוד המשמש לביצוע ניסויים מודגם באיור 1. בקצרה, הוא מורכב מאמבטיה עצבית דו-תאית, בקבוק 2 ליטר המונח על מערבל חימום, מקור של קרבוגן לאוורור חיץ, וצינורות כדי לאפשר למאגר לזרום מהבקבוק לאמבטיה, ובחזרה לבקבוק באמצעות משאבה פריסטלטית. ניתן להכין את האמבטיה מתוך פרספקס או להדפיס בתלת-ממד מחומרים אטומים למים. עומקו כ-2 ס"מ, והמחיצה המפרידה בין שני תאי האמבטיה כוללת חור בקוטר 1.5 מ"מ המאפשר השחלה של עצב היקפי על פני שני התאים. תא אחד גדול, חייב להיות באורך של לפחות 4 או 5 ס"מ, והוא יתמלא במאגר. התא השני צריך להיות באורך של לפחות 3 ס"מ ויהיה מלא בסיליקון או בשמן מינרלי. אסור להפוך את האמבטיה לגדולה מדי מכיוון שהדבר יפגע בשליטה על זלוף, טמפרטורה ו- pH. ייתכן שיהיה צורך בגדלים שונים של אמבטיה בהתאם לגודל רקמת העצב הנחקרת.
- הכינו אמבט עצבים נקי עם שני תאים (ראו קובץ משלים למפרטי העיצוב). מניחים את אמבט העצבים מתחת לרמה של בקבוק 2 ליטר המונח על מערבל החימום, באמצעות ראשי בוס מעבדה סטנדרטיים ותופסים. חברו את ניקוז האמבטיה לכניסת המשאבה הפריסטלטית.
- חברו את השקע של המשאבה הפריסטלטית לצינור המוביל בחזרה לבקבוק המאגר 2 ליטר. חברו את פתח האמבטיה לצינור עם שסתום זרימה מתכוונן והניחו את הצינור בתוך בקבוק 2 ליטר. השתמש בשסתום תלת-כיווני עם מזרק המחובר לשקע האמצעי כדי לסייע בהחדרת הצינור כסיפון לזרימת חיץ בסיוע כוח הכבידה.
- הכינו את הסיפון על ידי ציור המזרק עד שהמאגר זורם לתוכו. הגדר את השסתום כך שקצב הזרימה של החיץ לאמבטיה הוא ~ 5-6 mL·min-1. ניתן להגדיל את הזרימה בתחילה כדי למלא את האמבטיה. לאחר שמפלס חיץ האמבטיה הגיע לניקוז, הניחו את העצבים באמבטיה.
- באמצעות סיכת חרקים, אבטחו את קצה העצב בפינת תא האמבטיה המלא בחיץ. באמצעות מלקחיים עדינים בזווית של 45° וצביטת העצב רק בקצוות, משחילים בזהירות את העצב כדי להיות מגורה דרך החור במחיצה בין שני תאי האמבטיה.
- יש לאבטח את הקצה השני של העצב בתא השמן של האמבטיה באמצעות סיכת חרקים, ולהבטיח שהעצב ישר מבלי להימתח והוא נקי מסטיות ופיתולים. באמצעות גריז סיליקון, יש ליצור אטימה כדי למנוע דליפת חיץ מתא החיץ לתוך תא השמן. מלאו את תא השמן בסיליקון או בשמן מינרלי.
- הניחו את ווי האלקטרודה לרישום Ag/AgCl בתא אמבט השמן ואבטחו אותם באמצעות ראשי בוסים ותאבי אחיזה. עטפו את החלק של העצב באמבט השמן מעל הקרסים מבלי למשוך את העצב מתוח. אל תצבטו את העצב; השתמש במלקחיים זוויתיים כדי להרים את העצב מבלי לצבוט.
- התאם או תקן את חותם השומן מסיליקון אם נצפתה דליפה כלשהי לאחר הזזת העצב.
- חברו את אלקטרודת הייחוס Ag/AgCl לקרקע המגבר והניחו את האלקטרודה בתא הרחצה המלא בחיץ על ידי אבטחתה באמצעות מאחיזת מעבדה.
7. השתלת אלקטרודה על העצב באמבטיה
- הכן אלקטרודה של שרוול עצב נקי לגירוי על פי הפניה21. מניחים את האלקטרודה בתא הרחצה מלא החיץ. באמצעות מלקחיים או פינצטה עדינה עם קצוות קהים או זוויתיים, פותחים את האלקטרודה באמבטיה כדי להרטיב את החלק הפנימי של השרוול.
- אם נשארות בועות, השתמשו במזרק דק כדי לשאוב חיץ מהאמבטיה ולהוציא את הבועות מהשרוול בכוח. עם פינצטה מתחת לעצב, פתחו בעדינות את השרוול והחליקו אותו מתחת לעצב. סגור את השרוול סביב העצב, תוך הקפדה על הימנעות מכל סטייה או פיתול של העצב.
- חברו את אלקטרודת הגירוי לממריץ והבטיחו את אלקטרודת הגירוי באמצעות סרט הדבקה. חברו את אלקטרודת החזרת הזרם לגורם הממריץ ואבטחו את העופרת באמצעות סרט הדבקה. אם אתה משתמש ביריעת פלטינה מרובעת כאלקטרודת ההחזרה הנוכחית, מקם את היריעה הרחק מהעצב באמבטיה.
8. גירוי והקלטה
- חברו את פלט האות TTL הממריץ לערוץ 4 של האוסצילוסקופ, שישמש להפעלת האוסצילוסקופ. במסך האוסצילוסקופ, לחץ על הכרטיסיה ערוץ טריגר וציין את ערוץ 4 כערוץ המפעיל. הגדר את רמת ההדק ל- 1 V באמצעות כפתור הרמה .
- באוסצילוסקופ, קבעו את רזולוציית הזמן ל-1 אלפיות השנייה/חלוקה ואת רזולוציית המתח ל-10 mV/division. מרכז את הפניית ההדק בזמן והגדר את רמת ההדק ל- 1 V.
הערה: בצע את שלבים 8.3 עד 8.6 אם אתה משתמש בממריץ המותאם אישית (ראה טבלת חומרים). ההנחה היא כי תוכנת MATLAB ומנהלי ההתקנים הותקנו במחשב המעבדה באמצעות הוראות שסופקו באופן חופשי באינטרנט עבור הממריץ העצבי המותאם אישית21. אחרת, בצע את הוראות היצרן לשימוש בממריץ זמין מסחרית כחלופה. - חבר את הממריץ למחשב המעבדה. הפעל את הממריץ על-ידי חיבור ספק הכוח של הסוללה לכניסת החשמל. הפעל את תוכנת MATLAB במחשב המעבדה.
- הפעל את סקריפט MATLAB המותאם אישית: HFAC_4ch_Stimulator_Initialization.m (טבלת חומרים).
הערה: כבל התקשורת מסוג USB בין המחשב לגורם הממריץ צריך להבהב בירוק. אם לא, יש שגיאת תצורה, ויש לאמת את ספק הכוח והחיבורים. - פתח את סקריפט MATLAB: HFAC_4ch_Monophasic_Stimulation.m (טבלת חומרים). על ידי עריכה ישירה של סקריפט MATLAB, הגדר את הפרמטרים כדלקמן: משרעת דופק מגרה = -300 μA, רוחב דופק מגרה = 300 μs, מספר מגרה של פולסים = 10 וזמן מגרה בין פולסים = 1 s.
- התחל את פרוטוקול הגירוי על-ידי לחיצה על הפעל בתוכנת MATLAB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תוצאות מייצגות שניתן להשיג באמצעות פרוטוקול זה הן פוטנציאל הפעולה המורכב העקבי מסיבי עצב מסוג A בתוך העצב הסיאטי. לפוטנציאלי הפעולה האלה יש בדרך כלל משרעת שיא לשיא של כ-1 mV באלקטרודה ולכן 100 mV מוגברת לאחר ההגברה (איור 2). משרעת גירוי דומה ורוחב דופק אמורים להניב משרעת CAP דומה. אלקטרודות של חפת אלסטומר מוליך ידרשו בדרך כלל משרעת גירוי מעט גבוהה יותר על מנת לקבל את אותה משרעת CAP בהשוואה לאלקטרודות של שרוול פלטינה הזמינות מסחרית. הבדל זה הוא בדרך כלל קטן בהשוואה לשונות במשרעת הגירוי הנדרשת כדי לעורר עצבים המגיעים מבעלי חיים שונים. הסיבה לכך היא שלהבדלים קטנים בגודל העצב ובהתאמת השרוול יש השפעה גדולה על משרעת הגירוי הנדרשת כדי להשיג משרעת CAP ספציפית, ללא קשר לחומר השרוול. זה יכול לשמש כדי לבדוק את ההשפעות של הרכבי חיץ שונים, כגון ריכוזי יונים שונים או תוספת של חומרים מעוררים עצביים או מעכבים כגון טטרודוטוקסין. אם צינור פסולת החיץ מנותב למיכל נוסף, ניתן להפוך את התוספת של חומרים המשנים את רגישות העצבים לניסוי באופן זמני, כאשר קצבי השטיפה תלויים בקצב זרימת החיץ.
צפיפות הזרם המינימלית, המחושבת כמשרעת הגירוי המחולקת בשטח הפנים של אלקטרודות הגירוי, הנדרשת להפעלת הסיבים מסוג A, ולקבל פוטנציאל פעולה מורכב הניתן לצפייה של האוסצילוסקופ, הותווה לעומת רוחב הדופק באיור 3. התוצאות המוצגות באיור 3 מייצגות התרגשות עצבית טיפוסית הן עבור אזיקי עצב פלטינה סטנדרטיים הזמינים מסחרית והן עבור אזיקי עצב אלסטומר מוליכים בהתאמה אישית.
העצבים שחולצו צריכים להישאר ברי קיימא במשך כ -6 שעות לאחר החילוץ, ולכן, ניסויים חייבים להתאים בתוך חלון זמן זה. אובדן הכדאיות העצבית מוביל לירידה הדרגתית באמפליטודה ובמהירות ההולכה של CAP. לאחר ירידה באמפליטודה פוטנציאלית של 50% מתחת ל-50% מהמשרעת הראשונית (בתחילת ההקלטה), יש לראות בעצב כבר לא בר קיימא מכיוון שהתוצאות יהיו מוטות באופן משמעותי. תוצאות מייצגות ביחס לאריכות ימים עצבית מוצגות באיור 4. העצבים הסיאטיים הימניים והשמאליים הוצאו מבעל חיים אחד בין השעות 10:00 בבוקר ל-11:00 בבוקר ביום נתון. CAPs ראשוניים התקבלו מהעצב הסיאטי הימני במהלך בדיקות ראשוניות לפני הניסויים, ו- CAPs סטנדרטיים התקבלו מעצבים סיאטיים שמאליים וימניים כאחד, שנשמרו בחיים באמצעות פרוטוקול זה, בסוף הניסויים. הפחתה מינימלית באמפליטודה של CAP נצפתה עם העצב הסיאטי הימני, בעוד משרעת ה-CAP של העצב הסיאטי השמאלי בערך 3 mV הייתה דומה לזו של העצב הסיאטי הימני בתחילת הניסוי יותר מ-6 שעות לאחר מיצוי העצב.
איור 1: ייצוג סכמטי של מערך הניסויים שבו נעשה שימוש בפרוטוקול. נתון זה שונה מ- Rapeaux, A. et al. (2020)20. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: CAPs מייצגים התקבלו ב-ex vivo בעקבות גירוי על-ידי מערכי שרוולים מתכתיים ומוליכים של עצבים אלסטומרים. הועתק עם שינויים מ- Cuttaz, E. A. et al. (2021)22. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: סף ההפעלה של סיבי A של מערכי חפתים אלסטומרים מתכתיים ומוליכים. פסי שגיאה מייצגים ±1 סטיית תקן מהממוצע. הועתק עם שינויים מ- Cuttaz, E. A. et al. (2021)22. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: CAPs מייצגים השיגו ex vivo במשך יום של ניסויים ושימוש בשני העצבים הסיאטיים מבעל חיים אחד. (B) סיב מסוג A CAP המתקבל באמצע אחר הצהריים מהעצב הסיאטי השמאלי. (C) סיב מסוג A CAP המתקבל בסוף ניסויים עם אותו עצב סיאטי שמאלי ב-(B). ציר ה-x מתאים לשעה ביום שבה נלקחו ההקלטות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
קובץ משלים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעבודה זו תיארנו פרוטוקול להכנת עצבים סיאטיים של חולדות לנוירופיזיולוגיה של ex vivo. מיצוי רקמות אורך כ-30 דקות, כולל טיפול בבעלי חיים, הרדמה, קילוף וכריתה, בעוד שניקוי עצבים, מיקום באמבטיה והשתלת אלקטרודות אמורים לדרוש 30 דקות נוספות לפני שניתן יהיה להתחיל בהקלטה. ניתן לבצע הכנת חיץ תוך 30 דקות, אם כי ניתן לעשות זאת לפני שאר הניסוי. סוג זה של הכנה וניסוי שימש ותוארב-7,12 השנים האחרונות, תוך שימוש במאגרים דומים ובאותו סוג רקמה. עם זאת, למיטב ידיעתם של המחברים, זו הפעם הראשונה שתיאור של הכנת המאגר, הניתוח, הציוד שהוקם וההקלטה שלאחר מכן ניתן באותו מסמך.
פרוטוקול זה יכול לאפשר מגוון רחב של ניסויים בנוירופיזיולוגיה שלא יתאפשרו בהקשרים של in vitro או in vivo . לדוגמה, יתרון של תכשירי ex vivo הוא שהם משמרים את המאקרו ואת מבנה המיקרו של הרקמה המופקת תוך בידוד רקמה זו משאר הגוף. התוצאה היא התקנה פשוטה יותר מכיוון שאין צורך לשמור על הרדמה, מה שאחרת הוא דרישה בניסויי in vivo . במונחים של הפעלת ניסויים, תכשירי ex vivo מאפשרים שימוש בחומרים כגון טטרודוטוקסין, שקשה להצדיקם בהקשר in vivo 23 מכיוון שהם נושאים סיכון גבוה לבעל החיים. כאשר השימוש בחומרים כאלה מועיל לחקירה, הם קלים יותר לשימוש בתכשירי ex vivo . השימוש בממריץ המותאם אישית20 מאפשר ניסויים באמצעות בלוק HFAC לנוירומודולציה באמצעות מערך ניסיוני זה.
השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול הוא שלב הנתיחה, מכיוון שאפילו טעות קטנה באמצעות מספריים של דיסקציה עלולה לפגוע בעצב אם לא ננקט טיפול מספיק. המהירות בשלב זה חיונית גם מכיוון שיש לחלץ את הרקמה במהירות מהגוף ולהניח אותה בתוך חיץ מצונן כדי למקסם את הכדאיות בתחילת ההקלטה. לאחר מיצוי רקמות, בעוד שיש לנקוט בזהירות בעת ניקוי העצב והשתלת כל אלקטרודות, הפרוטוקול גמיש יותר ביחס לזמן, והסיכון לטעות המפעיל הוא, אם כן, נמוך יותר. מכיוון שקוטרי העצבים והמיקום של החיתוליות בתוך העצבים ישתנו מחיה לחיה, יש לצפות לשונות מסוימת בתוצאות גם אם משתמשים באותן אלקטרודות ופרוטוקול גירוי. את ההשפעה של השתנות זו ניתן לראות בפסי השגיאה של ספי הגירוי באיור 3. חשוב לא לצבוט את העצב בכל שלב של ההכנה כמו זה יכול לגרום נזק בלתי הפיך לרקמה. טפלו בעצב רק על ידי קצות אצבעותיו באמצעות מלקחיים ובזהירות רבה לא למשוך את העצב מתוח.
ניתן לשפר מספר היבטים של הפרוטוקול בצורתו הנוכחית על ידי הגדלת כמות הציוד וזמן ההתקנה. כדי לסייע באבחון בעיות פוטנציאליות במערך ניסיוני זה, מדידות אוטומטיות של pH וחמצן מומס באמבטיה יכולות להיות שימושיות אך לא יושמו כאן. ניתן להשיג את שתי המדידות בשיטות אמפרומטריות או פוטנציומטריות12,19. ציוד שידרוש תחזוקה שוטפת הוא כלי הצינורות והזכוכית, שצוברים משקעי מלח לאורך זמן. ווי ההקלטה של AgCl ידרשו גם ציפוי מחדש או החלפה רגילים, יחד עם הפניית AgCl. יש לנקות אלקטרודות גירוי לאחר כל שימוש, אך בדרך כלל לא ידרשו החלפה לניסויים רבים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים.
הצהרת גישה פתוחה:
לצורך גישה פתוחה, המחבר החיל במקום זאת רישיון ייחוס Creative Common (CC BY) (כאשר הוא מותר על ידי UKRI, 'רישיון ממשל פתוח' או 'רישיון ייחוס של Creative Commons ללא נגזרות (CC BY-ND) על כל גרסת כתב יד מקובלת של המחבר הנובעת.
שיתוף נתונים:
הנתונים הגולמיים המשמשים באיורים של מאמר זה יהיו זמינים על ידי המחברים, ללא הסתייגות מיותרת.
Acknowledgments
המחברים מודים לד"ר ג'רלד הונסברגר מ-GlaxoSmithKline Pharmaceuticals, מלך פרוסיה, פנסילבניה, ארה"ב, ול-Galvani Bioelectronics (סטיבנייג', בריטניה) על ששיתפו אותנו בטכניקת ההכנה העצבית המקורית שלהם. המחברים מודים לרוברט טות' על עיצוב אמבטיית העצבים הדו-קאמרית. המחברים מכירים במימון מענק פרסי אתגר טכנולוגיות הבריאות (HTCA) של המועצה למחקר בהנדסה ובמדעים פיזיקליים (EPSRC). המחברים מכירים במרכז המערכות המשובצות והמבוזרות בעלות הביצועים הגבוהים להכשרת דוקטורט (HiPEDS CDT) של אימפריאל קולג 'בלונדון למימון אדריאן ראפו (EP/L016796/1 ). אדריאן Rapeaux ממומן כיום על ידי המכון הבריטי לחקר דמנציה, המרכז לחקר הטיפול והטכנולוגיה. המחברים מודים בזאק ביילי מאימפריאל קולג', במחלקה לביו-הנדסה, על העזרה בניסויים וגישה לרקמות בעלי חיים במהלך הפקת מאמר הווידאו של JoVE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1595 | Borosilicate glass |
| 1 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | 612-3626 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1596 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | BRND937254 | Borosilicate glass |
| Adaptor, pneumatic, 8 mm to 1/4 NPT | RS UK | 536-2599 | push-to-fit straight adaptor between oxygen hose and gas dispersion tube |
| Alkoxy conformal coating | Farnell | 1971829 | ACC15 Alkoxy conformal coating for dissection petri dish preparation |
| Anesthetic | Chanelle | N/A | Isoflurane inhalation anesthetic, 250 mL bottle |
| Beaker, 2 L | VWR International Ltd | 213-0469 | Borosilicate glass |
| Bipolar nerve cuff | Cortec GMBH | N/A | 800 micron inner diameter, perpendicular lead out, no connector termination |
| Bossheads | N/A | N/A | Standard wet laboratory bossheads for attaching grippers to rods |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902-500g | 500 g in plastic bottle |
| Carbogen canister | BOC | N/A | F-size canister |
| Centrifuge Tubes, 15 mL volume | VWR International Ltd | 734-0451 | Falcon tubes |
| Conductive elastomer nerve cuff | N/A | N/A | high charge capacity nerve cuff for stimulation, see protocol for fabrication reference |
| Connector, Termimate | Mouser UK | 538-505073-1100-LP | These should be soldered to wire terminated with crocodile clips (see entry 11) |
| Crocodile clip connectors | RS UK | 212-1203 | These should be soldered to wire terminated with TermiMate connectors (see entry 10) |
| Deionized Water | N/A | N/A | Obtained from deionized water dispenser |
| Forceps angled 45 degrees | InterFocus Ltd | 91110-10 | Fine forceps, student range |
| Forceps standard Dumont #7 | InterFocus Ltd | 91197-00 | Student range forceps |
| Gas Disperson Tube, Porosity 3 | Merck | 12547866 | N/A |
| Glucose anhydrous, powder | VWR International Ltd | 101174Y | 500 g in plastic bottle |
| Grippers | N/A | N/A | Standard wet laboratory rod-mounted grippers |
| Heating Stirrer | RS UK | 768-9672 | Stuart US152 |
| Hemostats | N/A | N/A | Any hemostat >12 cm in length is suitable |
| Insect Pins, stainless steel, size 2 | InterFocus Ltd | 26001-45 | N/A |
| Laptop computer | N/A | N/A | Any laboratory-safe portable computer with at least 2 unused USB ports is suitable |
| Line Noise Filter | Digitimer | N/A | Humbug noise eliminator (50 Hz line noise filter) |
| Low-Noise Preamplifier, SR560 | Stanford Research Systems | SR560 | Low-noise voltage preamplifier |
| Magnesium Sulphate salt | VWR International Ltd | 291184P | 500g in plastic bottle |
| MATLAB scripts | Github | https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch | Initialization, calibration and stimulation scripts for the custom stimulator |
| MATLAB software | Mathworks | N/A | Standard package |
| Microscope Light, PL-2000 | Photonic | N/A | Light source with swan necks. Product may be obtained from third party supplier |
| Microscope, SMZ 745 | Nikon | SM745 | Stereoscopic Microscope |
| Mineral oil, non-toxic | VWR International Ltd | 31911.A1 | Oil for nerve bath |
| Nerve Bath | N/A | N/A | Plexiglas machined nerve bath, see protocol for details. |
| Oscilloscope | LeCroy | N/A | 434 Wavesurfer. Product may be obtained from 3rd party suppliers |
| Oxygen Hose, 1 meter | BOC | N/A | 1/4" NPT terminations |
| Oxygen Regulator | BOC | C106X/2B:3.5BAR-BS3-1/4"NPTF 230Bar | N/A |
| Peristaltic Pump P-1 | Pharmacia Biotech | N/A | Product may be obtained from third party supplier |
| Petri Dish, Glass | VWR International Ltd | 391-0580 | N/A |
| Potassium Chloride salt | Sigma Aldrich | P5405-250g | 250 g in plastic bottle |
| Potassium Dihydrogen Sulphate salt | Merck | 1.04873.0250 | 250 g in plastic bottle |
| Rat | Charles River Laboratories | N/A | Sprague Dawley, 250-330 grams, female |
| Reference electrode, ET072 | eDaQ (Australia) | ET072-1 | Silver silver-chloride reference electrode |
| Rod | N/A | N/A | Standard wet laboratory rods with fittings for stands |
| Scale | Sartorius | N/A | M-Power scale, for weighing powders. Product may be obtained from third-party suppliers |
| Scissors straight 12 cm edge | InterFocus Ltd | 91400-12 | blunt-blunt termination, student range |
| Signal Acquisition Device | Cambridge Electronic Design | Micro3-1401 | Micro3-1401 Multichannel ADC |
| Silicone grease, non-toxic | Farnell | 3821559 | for sealing of bath partition |
| Silicone tubing, 2 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silicone tubing, 5 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silver wire | Alfa Aesar | 41390 | 0.5 mm, annealed |
| Sodium Bicarbonate salt | Sigma Aldrich | S5761-500g | 500 g in plastic bottle |
| Sodium Chloride salt | VWR International Ltd | 27810.295 | 1 kg in plastic bottle |
| Spring scissors angled 2 mm edge | InterFocus Ltd | 15010-09 | N/A |
| Stand | N/A | N/A | Standard wet laboratory stands with sockets for rods |
| Stimulator | Digitimer | DS3 | DS3 or Custom Stimulator (see references) |
| Stirring flea | VWR International Ltd | 442-0270 | For use with the heating stirrer |
| Syringe tip, blunt, 1 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe tip, blunt, 2 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe, plastic, 10 mL volume | N/A | N/A | syringe should have luer lock fitting |
| Tape, water-resistant | N/A | N/A | For securing tubing and wiring to workbench |
| Thermometer | VWR International Ltd | 620-0806 | glass thermometer |
| USB Power Bank | RS UK | 135-1000 | Custom Stimulator power supply, fully charge before experiment. Not needed if using DS3 |
| Valve, Leuer Lock, 3-Way | VWR International Ltd | 229-7440 | For attaching syringe to bath feed tube and priming siphon |
References
- McIntyre, C. C., Richardson, A. G., Grill, W. M. Modeling the excitability of mammalian nerve fibers: Influence of afterpotentials on the recovery cycle. Journal of Neurophysiology. 87 (2), 995-1006 (2002).
- Pelot, N. A., Grill, W. M. In vivo quantification of excitation and kilohertz frequency block of the rat vagus nerve. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026005 (2020).
- Patel, Y. A., Kim, B. S., Rountree, W. S., Butera, R. J. Kilohertz electrical stimulation nerve conduction block: Effects of electrode surface area. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 25 (10), 1906-1916 (2017).
- Kortelainen, J., Al-Nashash, H., Vipin, A., Thow, X. Y., All, A. The effect of anaesthesia on somatosensory evoked potential measurement in a rat model. Laboratory Animals. 50 (1), 63-66 (2016).
- Oh, S. S., Hayes, J. M., Sims-Robinson, C., Sullivan, K. A., Feldman, E. L. The effects of anesthesia on measures of nerve conduction velocity in male C57Bl6/J mice. Neuroscience Letters. 483 (2), 127-131 (2010).
- Kuffler, S. W., Williams, E. M. V. Small-nerve junctional potentials. The distribution of small motor nerves to frog skeletal muscle, and the membrane characteristics of the fibres they innervate. The Journal of Physiology. 121 (2), 289-317 (1953).
- Brunton, E., Blau, C. W., Nazarpour, K. Separability of neural responses to standardised mechanical stimulation of limbs. Scientific Reports. 7 (1), 11138 (2017).
- Schmalbruch, H. Fiber composition of the rat sciatic nerve. The Anatomical Record. 215 (1), 71-81 (1986).
- Kagiava, A., Theophilidis, G. Assessing the permeability of the rat sciatic nerve epineural sheath against compounds with local anesthetic activity: an ex vivo electrophysiological study. Toxicology Mechanisms and Methods. 23 (8), 634-640 (2013).
- Motori, E., et al. Neuronal metabolic rewiring promotes resilience to neurodegeneration caused by mitochondrial dysfunction. Science Advances. 6 (35), 8271 (2020).
- Schwarz, J. R., Eikhof, G. Na currents and action potentials in rat myelinated nerve fibres at 20 and 37° C. Pflügers Archiv. 409 (6), 569-577 (1987).
- Cranefield, P. F., Brink, F., Bronk, D. W. The oxygen uptake of the peripheral nerve of the rat. Journal of Neurochemistry. 1 (3), 245-249 (1957).
- Lehmann, J. E. The effect of changes in pH on the action of mammalian A nerve fibers. American Journal of Physiology-Legacy Content. 118 (3), 600-612 (1937).
- Hamm, L. L., Nakhoul, N., Hering-Smith, K. S.
- Minasian, S. M., Galagudza, M. M., Dmitriev, Y. V., Kurapeev, D. I., Vlasov, T. D. Myocardial protection against global ischemia with Krebs-Henseleit buffer-based cardioplegic solution. Journal of Cardiothoracic Surgery. 8, 60 (2013).
- Bailey, L. E., Ong, S. D. Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations. Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).
- Miller, D. J. Sydney Ringer: physiological saline, calcium and the contraction of the heart. The Journal of Physiology. 555, Pt 3 585-587 (2004).
- Yamamoto, D., Suzuki, N., Miledi, R. Blockage of chloride channels by HEPES buffer). Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 230 (1258), 93-100 (1987).
- Janz, G. J., Taniguchi, H. The silver-silver halide electrodes. Preparation, stability, and standard potentials in aqueous and non-aqueous media. Chemical Reviews. 53 (3), 397-437 (1953).
- Rapeaux, A., Constandinou, T. G. An HFAC block-capable and module-extendable 4-channel stimulator for acute neurophysiology. Journal of Neural Engineering. 17 (4), 046013 (2020).
- Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch. Next Generation Neural Interfaces. , Available from: https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch> (2021).
- Cuttaz, E. A., Chapman, C. A. R., Syed, O., Goding, J. A., Stretchable Green, R. A. fully polymeric electrode arrays for peripheral nerve stimulation. Advanced Science. 8 (8), 2004033 (2021).
- Lossi, L., Merighi, A. The use of ex vivo rodent platforms in neuroscience translational research with attention to the 3Rs philosophy. Frontiers in Veterinary Science. 5, 164 (2018).
