Summary
このプロトコールは、 エキソビボ 電気生理学的刺激および環境的に調節された2区画の灌流生理食塩水浴中での記録のためのラット全坐骨神経組織の調製を記載している。
Abstract
Ex vivo 製剤は、局所組織構造を維持しながら、身体の他の部分から隔離された多くの神経生理学的プロセスの研究を可能にする。この研究は、緩衝液調製、動物処置、機器のセットアップおよび神経生理学的記録を含む、 エクスビボ 神経生理学のためのラット坐骨神経の調製を記述する。この研究は、この方法で可能なさまざまな種類の実験の概要を提供します。概説された方法は、結果の最適な一貫性のために、厳密に制御された条件下で抽出された末梢神経組織に6時間の刺激および記録を提供することを目的としている。この方法を用いて得られた結果は、実験の全期間にわたってミリボルト範囲のピークツーピーク振幅を有するA繊維化合物活動電位(CAP)である。CAPの振幅と形状は一貫しており信頼性が高いため、新しい電極を既存のモデルと比較したり、化学物質の使用、外科的変化、神経調節刺激技術などの組織に対する介入の影響をテストして比較するのに役立ちます。白金-イリジウム接点を備えた従来の市販のカフ電極とカスタムメイドの導電性エラストマー電極の両方を試験し、神経刺激強度 - 持続時間応答の点で同様の結果を与えた。
Introduction
インシリコでモデル化した基本的な神経機能の現在の理解は、いくつかの側面、特にソーマ、軸索、および樹状突起の外側の神経組織区画化の影響に関して欠けている。軸索-ミエリン相互作用は、従来の電気刺激応答を適切に捕捉するMRG1(哺乳動物神経用)などの詳細な計算神経モデルでさえ、高周波ブロックキャリーオーバー2または二次発症応答3などの実験的に観察された他の行動を捕捉しないという事実によって証明されるように、依然として十分に理解されていない。
このプロトコルは、標準化された調製プロトコルを使用して神経を単離し、その環境を制御し、in vivoの文脈からex vivoの文脈にそれを除去するために、急性小型実験動物モデルにおける神経レベルで神経生理学的プロセスを効率的に調査する方法を提供する。これは、in vivo神経刺激プロトコルによって使用される他の身体プロセスまたは麻酔薬が神経行動を変化させ、測定結果またはそれらの解釈を混乱させるのを防ぐであろう4,5。これにより、あまり理解されていない神経組織に特異的な効果のみに焦点を当てたより現実的なモデルの開発が可能になります。このプロトコルは、新しい神経刺激および記録電極材料および形状、ならびに高周波ブロック2,3などの新しい刺激パラダイムのテストベッドとしても有用である。この技術の変形は、例えば、イオンチャネルのダイナミクスおよび特性または局所麻酔薬7の効果を測定するために、厳密に制御された条件6における神経生理学を研究するために以前に使用されてきた。
この技術は、急性 インビボ 小動物実験8などの代替物と比較していくつかの利点を提供する。この技術は、組織が身体から抽出されたときに麻酔の深さを維持する必要性を排除し、麻酔薬ディフューザー、酸素濃縮器、加熱パッドなどの必要な機器の量を減らす。これにより、実験プロトコルが簡素化され、ミスのリスクが軽減されます。麻酔薬は潜在的に神経機能4を変化させる可能性があるため、この技術は、これらの麻酔薬化合物からの副作用によって測定値が混乱しないことを確実にする。最後に、この技術は、麻酔をかけられた動物を麻痺によって殺すテトロドトキシンなどの神経毒性化合物の効果を研究する際に、急性 のin vivo 実験よりも適切である。
末梢神経切片は、記録された神経信号の原因となる線維が体腫を含まない可能性が高いため、ユニークな エクスビボ システムです。これらは通常位置するように、運動ニューロン、脊椎、および脊椎の隣の背根神経節の感覚ニューロンの場合、哺乳類神経のセクションの調製は、両端に開いたイオンチャネルを有する管状膜の集合体として大まかにモデル化することができる9。代謝は、組織郭清10時に軸索に位置するミトコンドリアによって維持される。軸索腫の開放端の縫合は、抽出後にそれらを閉じるために奨励され、それによって正常な神経機能に不可欠な膜を横切る既存のイオン勾配を維持するのに役立つ。
組織恒常性を体外で維持するためには、いくつかの環境変数を厳密に制御する必要があります。これらは、温度11、酸素化12、浸透圧、pH13、14、および代謝を維持するためのグルコースへのアクセスである。このプロトコールの場合、アプローチは、酸素と二酸化炭素の混合物で連続的に通気された修飾クレブス・ヘンゼライト緩衝液15、16(mKHB)を使用することである。このmKHBは、例えばエクスビボ実験において、解剖された組織を体外に保存するために使用される心麻痺緩衝液6,17のファミリーにある。これらの緩衝液は、ヘモグロビン、抗生物質、または抗真菌剤を一切含まず、したがって、限られた時間の間、少量の組織を含む調製物にのみ適している。pH制御は、炭酸塩と二酸化炭素の酸化還元対で達成され、pH平衡を維持するために二酸化炭素による緩衝液の一定の曝気を必要とした。これは、神経細胞機能18を改変することができるHEPSなどの他の一般的な緩衝剤の使用を避けるためである。緩衝液を酸素化し、pH制御を提供するために、カルボゲンと呼ばれる酸素中の5%二酸化炭素の混合物(95%O2、5%CO2)を使用した。緩衝液容器の温度制御に加熱攪拌機を用い、緩衝液を神経浴中で灌流した後、出発容器に再循環させた。典型的な実験は、神経がその生存能力を失い、健康な組織を代表する尺度のための刺激にもはや十分に反応しなくなる前に、6〜8時間持続するであろう。
信号対雑音比を最適化するために、塩化銀電極を記録に使用し、これは先に記載した方法19に従って調製した。刺激のために、市販の白金カフ電極とカスタムメイドの導電性ポリマーカフ電極の組み合わせを使用することができる。導電性ポリマーカフ電極は、著しく高い電荷容量を有し、これは、高振幅波形20を用いて神経を刺激するときに有用である。
このプロトコルで使用される刺激器は、以前に20に記載された。ドキュメント、デザインファイル、およびそれを使用するためのソフトウェアスクリプトは、一般に公開されています21.他の刺激器は、このプロトコルを実行するために使用することができる。しかし、カスタム刺激器は、高周波代替電流(HFAC)ブロック2,20も可能であり、より広い範囲の神経生理学実験を可能にする。HFACブロックを使用するには、神経への損傷を避けるために導電性エラストマーカフをお勧めします。導電性エラストマー神経カフは、導電性成分としての導電性エラストマーおよび絶縁体としてのポリジメチルシロキサン22から製造された柔らかく完全にポリマーの電極アレイである。デバイスは、従来のレーザー微細加工技術を用いてバイポーラ構成で製造された。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
すべての動物の世話と手順は、動物(科学的手続き)法(1986年)に基づいて英国内務省が発行した適切なライセンスに基づいて実施され、インペリアルカレッジロンドンの動物福祉倫理審査委員会によって承認されました。
1. バッファーの調製
注:プロトコルのこの部分は、1x濃度での修飾クレブス・ヘンゼライト緩衝液(mKHB)の調製を含む最終ステップを除いて、プロトコルの残りの部分に先立って十分に実施することができる。
- 1 M CaCl 2 原液の 調製
- 14.701gのCaCl2 二水和物を清潔な100mLビーカーに加える。約75mLの脱イオン水を加え、塩が完全に溶解するまでかき混ぜる。
- 溶液を100 mLの目盛り付きフラスコに移し、100 mL容量に達するまで脱イオン水を加えます。溶液をボトルに移し、4°Cの冷蔵庫に保管する。
- 10倍濃縮mKHBストックを調製する
- 2Lビーカーに66.03gの塩化ナトリウム(NaCl)、3.57gの塩化カリウム(KCl)、1.63gのリン酸二水素カリウム(KH2PO4)、および1.44gの硫酸マグネシウムを加える。
- ビーカーに約750mLの脱イオン水を加え、塩が溶解するまでかき混ぜる(底に小さな塩結晶が残っているかもしれない)。25 mLの1 MCaCl2 ストック溶液を加え(工程1.1)、撹拌する;これが最後に追加された塩であることを確認してください。
- 溶液を1 L目盛り付きフラスコに移し、脱イオン水を加えて全量1 Lに達する。冷蔵庫にて4°Cで10x mKHBを濃縮保存する。
注:濃縮mKHBストックは、交換前に約1ヶ月間保管することができます。
- 解剖ペトリ皿(コーティング)を準備する
- 皿を丁寧に洗って乾燥させて塗布用のきれいなガラスシャーレ(直径120mm)を用意します。
- コンフォーマルアルコキシコーティングの使用および硬化に関する製造業者の指示に従って、所望の厚さに達するまでコンフォーマルコーティング混合物をディッシュに慎重に注ぐことによって、ペトリディッシュの底部を〜3〜5mmのコーティングでコーティングする。
- 60°Cのオーブンで、触ってしっかりするまでコーティングを硬化させます。解剖ペトリ皿の準備ができました。
注:使用後に皿を優しく清掃すると、交換が必要になる前にコーティングが何年も続くことが保証されます。コーティングを交換するときは、新しいコーティングを塗布する前に、必ずすべてのコーティング材料を除去してください。このプロトコルで使用されるコンフォーマルアルコキシコーティング(材料表)は、1年よりも短い貯蔵寿命を有することに留意されたい。
2. 解剖前準備
メモ: この手順では、実験を開始します。以下の手順は、同じ日にこの順序で実行する必要があります。
- 1x mKHB を準備する
- バッファー用に清潔な2 Lビーカーを用意します。200 mL の 10x mKHB ストックを 2 L ビーカーに移します。2Lビーカーに2.1gの炭酸ナトリウム(NaHCO3)と0.99gの無水デキストロース(D-グルコース)を加える。
- 約1Lの脱イオン水をビーカーに加える。塩が完全に溶解するまでかき混ぜる。溶液を2Lの目盛り付きフラスコに移し、脱イオン水を加えて全量2Lに達する。
- この溶液を、温度を37°Cに設定した加熱攪拌機に置いた2Lガラス瓶に移す。
注:小さな加熱攪拌機は、水でいっぱいの大きな容器の熱慣性のために、目標の37°C温度に達することができないことがよくあります。攪拌しながらボトルの内容物が37°Cに達するように温度を上方に調整します。実験中の温度を監視し、オーバーシュートが発生した場合は設定温度を下げます。 - 温度計を2Lボトルに入れて温度を監視し、グリッパーを使用して温度計が攪拌ノミの影響を受けないようにします。バッファーをカルボゲンで最低30分間通気し、溶液を酸素化します。これにより、pHが7.4に設定されます。pHメーターでpHを測定し、0.1 pH単位で7.4(37°C)以内であることを確認します。
メモ: pH を 7.4 に調整するには、必要に応じて塩酸または水酸化ナトリウムを使用してください。 - 2本の15 mL遠沈管と1本の100 mLボトルにmKHBを入れ、氷の上に置き、冷却します。
注:遠沈管とボトルは、オートクレーブなしで各実験後に洗浄して再利用できます。 - 実験の後半部分については、連続攪拌しながら37°Cでカルボゲンで2Lボトル内の緩衝液を通気し続けます。
注:漏れが発生した場合にガスの流れを遮断する自動システムが設置されていない場合、カルボゲンの教師なし使用は危険です。自動センサーと電子シャットオフバルブはこれを緩和できます。さもなければ、解剖が別の部屋で行われた場合、人は装置を監督するために残されなければなりません。いずれの場合も、セットアップの近くで酸素センサーを使用して、周囲酸素濃度が25%を超えたときにオペレータに警告する必要があります。可能であれば、換気が活発な部屋を使用してください。
- 信号集録デバイス、低ノイズプリアンプ、ラインノイズフィルタ、および記録と刺激用のオシロスコープをオンにして、温度安定化に十分な時間を確保します。
- すべての電気記録機器が正しく構成されていることを確認する
- 低ノイズプリアンプをAC結合入力に設定し、入力バンドパスフィルタを10年あたり6dBのロールオフに設定し、ハイパスフィルタとローパスフィルタのカットオフ周波数をそれぞれ30Hzと3kHzに設定します。
- 低ノイズプリアンプのゲインを100に設定します。
3.動物麻酔と安楽死
注:250〜330g(材料表)の雌ラットを研究に使用した。
- 手術器具と消耗品を準備する:12cmのストレートハサミ(鈍い)。2 mm刃先角度付きスプリングはさみ;4cmの細かいはさみ、鋭いまたは半鋭い。#7デュモン鉗子;45°の角度の細かい鉗子と6-0の縫合シルクまたは糸。
- ラットを麻酔容器またはチャンバーに入れる。酸素と麻酔薬ディフューザーを容器に接続します。麻酔薬(イソフルラン)濃度を3.5%に設定し、約10分間待つか、動物が右反射の喪失などの麻酔の徴候を示すまで待ちます。
- ラットが麻酔の徴候を示した後、つま先ピンチ離脱反射試験で意識喪失を確認する。つま先の離脱がない場合にのみ続行します。それ以外の場合は、ディフューザー内のすべての接続と麻酔レベルを確認し、手順3.2を繰り返します。
- 動物を容器から取り出し、子宮頸部脱臼を進行させ、続いて死亡の確認のために大腿動脈を切開する。
4. 解剖プロトコル
注:腹を下ろした動物を解剖台に置きます。両方の脚について、次の手順を繰り返します。典型的には、右脚が最初に解剖される。
- 親指、人差し指、中指の間に足首をしっかりと挟み、12cmのまっすぐな鈍いはさみで踵骨腱を断ち切ります。
- 細かい鋭いはさみで、脚の後ろに沿って踵骨腱から背骨の付け根まで皮膚を切開し、下の筋肉組織を解剖しないように注意してください。
- 細かい鉗子と細かいはさみを使って、坐骨神経が露出するまで、脚の裏の中央付近の筋肉層を通して慎重に切開します。坐骨神経が見えたらすぐに、氷冷mKHBを使用して空洞に潤いを与え、神経が乾燥するのを防ぎます。
- 止血剤を使用して、両側の皮膚のフラップを引っ張り、より細かい解剖作業のために切開部を開いたままにします。踵骨腱切開の位置から始めて、細かいはさみで、脚の内側の筋肉を中断して神経を解放します。氷のように冷たいmKHBで地域の水分レベルを維持し続けます。
- 脚を上に動かしながら神経が露出したので、その上にある筋肉組織を解剖します。脊椎に近い神経を結合組織から解放し、脊椎間隙に到達するまで、その時点で神経にねじれがある。この段階ではスピードが不可欠であるため、まだ神経をきれいにしようとしないでください。
- 細かいはさみでできるだけ背骨に近い神経を切断します。解剖を容易にするために、鉗子を使用して足首の近くの神経の端を非常に穏やかに引っ張ります。真ん中の神経をつまむのではなく、端だけをつまむ。神経を緊張させないでください。
オプション:この時点で、時間が許せば、生存率を維持するために神経の両端の縫合を行うことができる。破損を防ぐため、取り扱いは最小限にとどめてください。時間が足りない場合は (ステップ 4.5 を参照)、このステップをスキップして、後でステップ 5.2 に従ってください。 - mKHBを充填した15mL遠沈管に切開した神経を入れ(ステップ2.1.5)、チューブを閉じ、洗浄手順の開始までチューブを氷上に戻す。
- もう一方の脚について、手順4.1~4.7を繰り返します。理想的には、組織の生存率を最大化するために、各神経は抽出に5〜10分かかるべきである。
5. 神経洗浄手順
- コーティングされたペトリ皿を約半分にチルド酸素化mKHBで満たします。解剖した坐骨神経の1つを皿に入れ、神経の両端を皿に固定して、神経がねじれ、ねじれ、ねじれのないまっすぐになるようにします。できるだけ両端の近くに神経を固定します。
- 6-0シルク縫合糸または細い糸を使用して、神経の両端の周りに二重の結び目を結び、緩衝液への細胞質ゾルの漏れを防ぎます。これは神経組織から緩衝液への漏れを防ぐので、神経の中心に近い側の昆虫ピンのすぐ隣に結び目を置きます。神経が以前に結紮されている場合は、このステップを実行しないでください。
- 顕微鏡と2mm角のスプリングはさみを使用して、神経から脂肪、血管、筋肉組織を除去します。刺激および記録プロトコルで使用されない神経枝を剪定します。
- 洗浄の5分ごとに、バッファーを新鮮な冷蔵酸素化mKHBと交換します。細かい鉗子を使って結合組織、脂肪、血管を引っ張り、解剖を容易にします。
- 新鮮な酸素化された冷蔵mKHBで満たされた輸送チューブに神経を戻し、チューブを氷の上に置きます。
6. 設備のセットアップ
メモ: 実験の実行に使用した機器のセットアップを 図 1 に示します。簡単に言えば、二重コンパートメント神経浴、加熱攪拌機に置かれた2Lボトル、緩衝液曝気のためのカルボゲン源、および緩衝液がボトルから浴に流れ、蠕動ポンプを使用してボトルに戻ることを可能にするチューブからなる。バスは、プレキシガラスから機械加工することも、防水材料から3Dプリントすることもできます。それは約2cmの深さを有し、浴の2つのチャンバを隔てる仕切りは、両方のチャンバを横切る末梢神経のねじ切りを可能にする直径1.5mmの穴を有する。1つのチャンバーは大きく、少なくとも4または5cmの長さでなければならず、バッファで満たされます。他のチャンバーは少なくとも3cmの長さでなければならず、シリコーンまたは鉱物油で満たされます。浴は、灌流、温度、およびpHの制御を劣化させるため、大きすぎてはなりません。異なる浴サイズは、研究されている神経組織のサイズに応じて必要とされ得る。
- 清潔なデュアルチャンバー神経浴を準備します(設計仕様については 、補足ファイル を参照してください)。標準的な実験室のボスヘッドとグリッパーを使用して、加熱攪拌機に置かれた2Lボトルのレベルの下に神経浴を置きます。バスのドレンをペリスタルティックポンプの入口に接続します。
- ペリスタルティックポンプの出口を、2Lバッファーボトルに戻るチューブに接続します。バス入口を調節可能な流量バルブ付きのチューブに接続し、チューブを2Lボトルの中に入れます。中央の出口に接続されたシリンジを備えた三方弁を使用して、重力支援バッファー流入用のサイフォンとしてチューブをプライミングするのに役立ちます。
- バッファがシリンジに流れるまでシリンジを引き抜いてサイフォンをプライムします。浴中へのバッファーの流量が~5-6 mL・min-1となるようにバルブを構成します。流れは、最初に浴を満たすために増加させることができる。浴槽の緩衝レベルが排水管に達したら、神経を風呂に入れます。
- 昆虫ピンを使用して、神経の端をバッファーで満たされた浴室の角に固定します。45°の角度の細かい鉗子を使用し、両端のみで神経をつまみ、2つの浴室の間の仕切りの穴を通して刺激される神経を慎重にねじ込みます。
- 昆虫ピンでお風呂の油室に神経のもう一方の端を固定し、神経が引き伸ばされずにまっすぐで、ねじれやねじれがないことを確認します。シリコーングリースを使用して、バッファーチャンバーからオイルチャンバーへのバッファー漏れを防ぐためにシールを作成します。オイルチャンバーをシリコーンまたは鉱物油で満たします。
- Ag/AgCl記録電極フックをオイルバスチャンバー内に置き、ボスヘッドとグリッパーで固定します。神経の緊張を引っ張ることなく、オイルバスの神経の部分をフックの上にドレープします。神経をつまないでください;角度のついた鉗子を使用して、挟むことなく神経を持ち上げます。
- 神経を動かした後に漏れが観察された場合は、シリコーングリースシールを調整または修復してください。
- リファレンスAg/AgCl電極をアンプグランドに接続し、電極を実験室用グリッパを使用して固定してバッファ充填バスチャンバに配置します。
7.お風呂内の神経への電極移植
- 参考文献21に記載の刺激用の清浄な神経カフ電極を作製する。バッファーで満たされた浴室に電極を置きます。先端が鈍い、または角度のある鉗子または細かいピンセットを使用して、バス内の電極を開き、袖口の内側を濡らします。
- 泡が残っている場合は、細かい注射器を使用して浴からバッファーを引き出し、泡を袖口から強制的に取り出します。ピンセットを神経の下に入れ、袖口をそっと開けて神経の下にスライドさせます。神経の周りの袖口を閉じ、神経のねじれやねじれを避けるように注意してください。
- 刺激電極を刺激装置に接続し、刺激電極のリード線をテープで固定します。電流リターン電極を刺激器に接続し、リード線をテープで固定します。電流リターン電着として正方形の白金シートを使用する場合は、お風呂の中で神経から離れてシートを置きます。
8. 刺激と記録
- 刺激器TTL信号出力をオシロスコープのチャンネル4に接続し、オシロスコープのトリガに使用します。オシロスコープ画面で、トリガチャンネルタブを押し、 トリガ チャンネルとしてチャンネル4を指定します。レベルノブを使用してトリガ レベル を1 Vに設定します。
- オシロスコープで、時間分解能を1 ms/分周、電圧分解能を10 mV/分周に設定します。トリガリファレンスを時間内にセンタリングし、トリガレベルを1Vに設定します。
メモ: カスタム刺激装置を使用する場合は、手順 8.3 ~ 8.6 に従います( 材料表を参照)。MATLABソフトウェアおよびデバイスドライバは、カスタム神経刺激装置21に対してオンラインで自由に提供される命令を使用して実験室コンピュータにインストールされているものとする。さもなければ、代替として市販の刺激剤の使用について製造業者の指示に従ってください。 - 刺激装置を実験室のコンピュータに接続します。バッテリ電源を電源入力に接続して、刺激器の電源を入れます。ラボのコンピューターで MATLAB ソフトウェアを起動します。
- カスタム MATLAB スクリプト HFAC_4ch_Stimulator_Initialization.m (材料表) を実行します。
メモ: コンピュータと刺激装置間の USB 通信ケーブルが緑色に点滅します。そうでない場合は、構成エラーが発生しており、電源装置と接続を確認する必要があります。 - MATLAB スクリプトを開きます: HFAC_4ch_Monophasic_Stimulation.m (材料表)。MATLABスクリプトを直接編集して、パラメータを次のように設定します:刺激器パルス振幅= -300μA、刺激器パルス幅= 300μs、刺激器パルス数= 10、刺激器パルス間時間= 1秒。
- MATLABソフトウェアで [実行 ]をクリックして、刺激プロトコルを開始します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
このプロトコールで得ることができる代表的な結果は、坐骨神経内のA型神経線維からの一貫した化合物活動電位である。これらの活動電位は、通常、電極で約1mVのピークtoピーク振幅を持ち、したがって一度増幅すると100mVになります(図2)。同様の刺激振幅とパルス幅は、同様のCAP振幅をもたらすはずです。導電性エラストマーカフ電極は、一般に、市販の白金カフ電極と比較して同じCAP振幅を得るために、わずかに高い刺激振幅を必要とする。この差は、一般に、異なる動物から来る神経を刺激するのに必要な刺激振幅の変動と比較して小さい。これは、神経の大きさとカフフィットのわずかな違いが、カフの材料に関係なく、特定のCAP振幅を得るために必要な刺激振幅に大きな影響を与えるためである。これは、異なるイオン濃度またはテトロドトキシンなどの神経興奮性または阻害性物質の添加など、異なる緩衝液組成の効果を試験するために使用することができる。バッファー廃液パイプを余分な容器にルーティングする場合、神経興奮性を変化させる物質の添加を実験のために一時的にすることができ、ウォッシュアウト率はバッファー流入速度に依存する。
最小電流密度を、刺激電極の表面積で割った刺激振幅として計算し、A型繊維を活性化し、オシロスコープの活動電位を観察可能な化合物を得るために必要な、 図3のパルス幅に対してプロットした。 図3 に示す結果は、市販の標準的な白金神経カフおよびカスタムメイドの導電性エラストマー神経カフの両方に対する典型的な神経興奮性を表す。
抽出された神経は、抽出後約6時間生存可能であるべきであり、したがって、実験はこの時間枠内に収まらなければならない。神経生存率の喪失は、CAP振幅および伝導速度の漸進的な低下をもたらす。活動電位振幅が初期振幅の50%未満に低下した後(記録開始時)、結果が著しく歪むため、神経はもはや生存不能であると考えるべきである。神経長寿に関する代表的な結果を 図4に示す。右および左の坐骨神経は、ある日の午前10時から午前11時の間に1匹の動物から抽出された。初期CAPは実験前の初期試験中に右坐骨神経から得られ、標準CAPは実験終了時にこのプロトコルを使用して生かされていた左右の坐骨神経の両方から得られた。右坐骨神経では最小のCAP振幅低下が観察されたが、左坐骨神経のCAP振幅は約3mVで、神経抜出後6時間以上で実験開始時の右坐骨神経のCAP振幅と同様であった。
図1:プロトコルで使用される実験セットアップの概略図。 この数字は、Rapeaux, A. et al. (2020)20から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:金属および導電性エラストマー神経カフアレイによる刺激に続いて エクスビボ で得られた代表的なCAPs。Cuttaz, E. A. et al. (2021)22からの改変を加えて再現。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:金属および導電性エラストマーカフアレイのA繊維活性化閾値 エラーバーは、平均からの±1標準偏差を表す。Cuttaz, E. A. et al. (2021)22からの改変を加えて再現。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:1匹の動物から両方の坐骨神経を用いて1日の実験にわたってエキソビボで得られた代表的なCAPs。(b)左坐骨神経から午後半ばに得られたA型線維CAP。(C)(B)で同じ左坐骨神経を用いた実験終了時に得られたA型線維CAP。x 軸は、録音が撮影された時刻に対応します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
この研究では、エクスビボ神経生理学のためにラット坐骨神経を調製するためのプロトコルを記載した。組織の抽出には、動物の取り扱い、麻酔、カリング、解剖など約30分かかりますが、神経洗浄、浴槽への配置、電極移植には、記録を開始するまでにさらに30分かかります。バッファーの調製は30分で行うことができますが、これは残りの実験よりも先に行うことができます。このタイプの調製および実験は、過去7、12に使用され、記載されており、同様の緩衝液を使用して、同じ組織型に対して使用および記載されている。しかし、著者の知る限り、バッファーの準備、解剖、機器のセットアップ、およびその後の録音に関する説明が同じ文書に記載されているのはこれが初めてです。
このプロトコルは、イン ビトロ または インビボ の文脈のいずれにおいても不可能であろう神経生理学における多種多様な実験を可能にすることができる。例えば、 エキソビボ 製剤の利点は、抽出された組織のマクロおよびミクロ構造を保持しながら、この組織を身体の他の部分から単離することである。これは、麻酔を維持する必要がないため、より簡単なセットアップをもたらし、そうでなければ in vivo実験における 要件である。実験を可能にするという点では、エキ ソ ビボ製剤は、テトロドトキシンなどの物質の使用を可能にするが、これらは動物にとって高いリスクを伴うため、 インビボ の文脈23 において正当化することは困難である。そのような物質の使用が調査に利益をもたらすとき、それらは ex vivo 製剤において使用するのがより容易である。カスタム刺激装置20 の使用により、この実験セットアップを用いた神経調節のためのHFACブロックを用いた実験が可能になる。
プロトコルの最も重要なステップは解剖ステップであり、十分な注意が払われないと、解剖はさみを使用する小さな間違いでも神経を損傷する可能性があるためです。記録開始時の生存率を最大化するために、組織を体内から迅速に抽出し、冷蔵バッファーに入れる必要があるため、この段階での速度も不可欠です。組織抽出後、神経を洗浄し、電極を移植する場合は注意が必要ですが、プロトコルは時間に対してより柔軟であり、したがって、オペレータエラーのリスクは低くなります。神経内の神経の直径と筋膜の配置は動物ごとに異なるため、同じ電極と刺激プロトコルを使用しても結果に多少のばらつきが予想されます。この変動の影響は、 図3の刺激閾値のエラーバーで見ることができます。これは組織に不可逆的な損傷を引き起こす可能性があるため、調製のどの段階でも神経をつままないことが重要です。鉗子を使用して、神経を引っ張っないように細心の注意を払って、その端だけで神経を扱います。
現在の形式のプロトコルのいくつかの側面は、機器の量とセットアップ時間を増やすことによって改善できます。この実験セットアップの潜在的な問題の診断を支援するために、浴中のpHと溶存酸素の自動測定は有用かもしれませんが、ここでは実装されていません。両方の測定は、アンペロメトリック法またはポテンショメトリック法12、19を用いて達成することができる。定期的なメンテナンスを必要とする機器はチューブとガラス製品であり、時間の経過とともに塩の堆積物を蓄積します。AgCl 記録フックは、AgCl リファレンスとともに、定期的な再コーティングまたは交換も必要になります。刺激電極は、使用するたびに洗浄する必要がありますが、一般的に多くの実験で交換する必要はありません。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者には利益相反はありません。
オープンアクセスステートメント:
オープンアクセスの目的のために、著者はクリエイティブ・コモン・アトリビューション(CC BY)ライセンス(UKRIで許可されている場合、「オープン・ガバメント・ライセンス」または「クリエイティブ・コモンズ表示デリバティブなし(CC BY-ND)ライセンスが代わりに記載されている場合があります)を、著者が受け入れた原稿バージョンに適用しています。
データ共有:
この記事の図で使用されている生データは、過度の予約なしに著者によって利用可能になります。
Acknowledgments
著者らは、米国ペンシルベニア州プロイセンのキング・オブ・プロイセンであるグラクソ・スミスクライン・ファーマシューティカルズのジェラルド・ハンスバーガー博士とガルヴァーニ・バイオエレクトロニクス(英国スティーブネージ)が、独自の神経調製技術を当社と共有していることを認めています。著者らは、ロバート・トスがデュアルチャンバー神経浴の設計に成功したことを認めている。著者らは、Engineering and Physical Sciences Research Council(EPSRC)のHealthcare Technologies Challenge Awards(HTCA)助成金からの資金提供を認めている。著者らは、Adrien Rapeaux(EP/L016796/1)に資金を提供するため、Imperial College LondonのHigh Performance Embedded and Distributed Systems Centre for Doctoral Training(HiPEDS CDT)を認めている。エイドリアン・ラポーは現在、英国認知症研究所、ケア研究技術センターから資金提供を受けています。著者らは、JoVEビデオ記事の制作中に実験と動物組織へのアクセスを支援してくれたインペリアルカレッジの生物工学科のザックベイリーに感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1595 | Borosilicate glass |
| 1 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | 612-3626 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1596 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | BRND937254 | Borosilicate glass |
| Adaptor, pneumatic, 8 mm to 1/4 NPT | RS UK | 536-2599 | push-to-fit straight adaptor between oxygen hose and gas dispersion tube |
| Alkoxy conformal coating | Farnell | 1971829 | ACC15 Alkoxy conformal coating for dissection petri dish preparation |
| Anesthetic | Chanelle | N/A | Isoflurane inhalation anesthetic, 250 mL bottle |
| Beaker, 2 L | VWR International Ltd | 213-0469 | Borosilicate glass |
| Bipolar nerve cuff | Cortec GMBH | N/A | 800 micron inner diameter, perpendicular lead out, no connector termination |
| Bossheads | N/A | N/A | Standard wet laboratory bossheads for attaching grippers to rods |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902-500g | 500 g in plastic bottle |
| Carbogen canister | BOC | N/A | F-size canister |
| Centrifuge Tubes, 15 mL volume | VWR International Ltd | 734-0451 | Falcon tubes |
| Conductive elastomer nerve cuff | N/A | N/A | high charge capacity nerve cuff for stimulation, see protocol for fabrication reference |
| Connector, Termimate | Mouser UK | 538-505073-1100-LP | These should be soldered to wire terminated with crocodile clips (see entry 11) |
| Crocodile clip connectors | RS UK | 212-1203 | These should be soldered to wire terminated with TermiMate connectors (see entry 10) |
| Deionized Water | N/A | N/A | Obtained from deionized water dispenser |
| Forceps angled 45 degrees | InterFocus Ltd | 91110-10 | Fine forceps, student range |
| Forceps standard Dumont #7 | InterFocus Ltd | 91197-00 | Student range forceps |
| Gas Disperson Tube, Porosity 3 | Merck | 12547866 | N/A |
| Glucose anhydrous, powder | VWR International Ltd | 101174Y | 500 g in plastic bottle |
| Grippers | N/A | N/A | Standard wet laboratory rod-mounted grippers |
| Heating Stirrer | RS UK | 768-9672 | Stuart US152 |
| Hemostats | N/A | N/A | Any hemostat >12 cm in length is suitable |
| Insect Pins, stainless steel, size 2 | InterFocus Ltd | 26001-45 | N/A |
| Laptop computer | N/A | N/A | Any laboratory-safe portable computer with at least 2 unused USB ports is suitable |
| Line Noise Filter | Digitimer | N/A | Humbug noise eliminator (50 Hz line noise filter) |
| Low-Noise Preamplifier, SR560 | Stanford Research Systems | SR560 | Low-noise voltage preamplifier |
| Magnesium Sulphate salt | VWR International Ltd | 291184P | 500g in plastic bottle |
| MATLAB scripts | Github | https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch | Initialization, calibration and stimulation scripts for the custom stimulator |
| MATLAB software | Mathworks | N/A | Standard package |
| Microscope Light, PL-2000 | Photonic | N/A | Light source with swan necks. Product may be obtained from third party supplier |
| Microscope, SMZ 745 | Nikon | SM745 | Stereoscopic Microscope |
| Mineral oil, non-toxic | VWR International Ltd | 31911.A1 | Oil for nerve bath |
| Nerve Bath | N/A | N/A | Plexiglas machined nerve bath, see protocol for details. |
| Oscilloscope | LeCroy | N/A | 434 Wavesurfer. Product may be obtained from 3rd party suppliers |
| Oxygen Hose, 1 meter | BOC | N/A | 1/4" NPT terminations |
| Oxygen Regulator | BOC | C106X/2B:3.5BAR-BS3-1/4"NPTF 230Bar | N/A |
| Peristaltic Pump P-1 | Pharmacia Biotech | N/A | Product may be obtained from third party supplier |
| Petri Dish, Glass | VWR International Ltd | 391-0580 | N/A |
| Potassium Chloride salt | Sigma Aldrich | P5405-250g | 250 g in plastic bottle |
| Potassium Dihydrogen Sulphate salt | Merck | 1.04873.0250 | 250 g in plastic bottle |
| Rat | Charles River Laboratories | N/A | Sprague Dawley, 250-330 grams, female |
| Reference electrode, ET072 | eDaQ (Australia) | ET072-1 | Silver silver-chloride reference electrode |
| Rod | N/A | N/A | Standard wet laboratory rods with fittings for stands |
| Scale | Sartorius | N/A | M-Power scale, for weighing powders. Product may be obtained from third-party suppliers |
| Scissors straight 12 cm edge | InterFocus Ltd | 91400-12 | blunt-blunt termination, student range |
| Signal Acquisition Device | Cambridge Electronic Design | Micro3-1401 | Micro3-1401 Multichannel ADC |
| Silicone grease, non-toxic | Farnell | 3821559 | for sealing of bath partition |
| Silicone tubing, 2 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silicone tubing, 5 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silver wire | Alfa Aesar | 41390 | 0.5 mm, annealed |
| Sodium Bicarbonate salt | Sigma Aldrich | S5761-500g | 500 g in plastic bottle |
| Sodium Chloride salt | VWR International Ltd | 27810.295 | 1 kg in plastic bottle |
| Spring scissors angled 2 mm edge | InterFocus Ltd | 15010-09 | N/A |
| Stand | N/A | N/A | Standard wet laboratory stands with sockets for rods |
| Stimulator | Digitimer | DS3 | DS3 or Custom Stimulator (see references) |
| Stirring flea | VWR International Ltd | 442-0270 | For use with the heating stirrer |
| Syringe tip, blunt, 1 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe tip, blunt, 2 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe, plastic, 10 mL volume | N/A | N/A | syringe should have luer lock fitting |
| Tape, water-resistant | N/A | N/A | For securing tubing and wiring to workbench |
| Thermometer | VWR International Ltd | 620-0806 | glass thermometer |
| USB Power Bank | RS UK | 135-1000 | Custom Stimulator power supply, fully charge before experiment. Not needed if using DS3 |
| Valve, Leuer Lock, 3-Way | VWR International Ltd | 229-7440 | For attaching syringe to bath feed tube and priming siphon |
References
- McIntyre, C. C., Richardson, A. G., Grill, W. M. Modeling the excitability of mammalian nerve fibers: Influence of afterpotentials on the recovery cycle. Journal of Neurophysiology. 87 (2), 995-1006 (2002).
- Pelot, N. A., Grill, W. M. In vivo quantification of excitation and kilohertz frequency block of the rat vagus nerve. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026005 (2020).
- Patel, Y. A., Kim, B. S., Rountree, W. S., Butera, R. J. Kilohertz electrical stimulation nerve conduction block: Effects of electrode surface area. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 25 (10), 1906-1916 (2017).
- Kortelainen, J., Al-Nashash, H., Vipin, A., Thow, X. Y., All, A. The effect of anaesthesia on somatosensory evoked potential measurement in a rat model. Laboratory Animals. 50 (1), 63-66 (2016).
- Oh, S. S., Hayes, J. M., Sims-Robinson, C., Sullivan, K. A., Feldman, E. L. The effects of anesthesia on measures of nerve conduction velocity in male C57Bl6/J mice. Neuroscience Letters. 483 (2), 127-131 (2010).
- Kuffler, S. W., Williams, E. M. V. Small-nerve junctional potentials. The distribution of small motor nerves to frog skeletal muscle, and the membrane characteristics of the fibres they innervate. The Journal of Physiology. 121 (2), 289-317 (1953).
- Brunton, E., Blau, C. W., Nazarpour, K. Separability of neural responses to standardised mechanical stimulation of limbs. Scientific Reports. 7 (1), 11138 (2017).
- Schmalbruch, H. Fiber composition of the rat sciatic nerve. The Anatomical Record. 215 (1), 71-81 (1986).
- Kagiava, A., Theophilidis, G. Assessing the permeability of the rat sciatic nerve epineural sheath against compounds with local anesthetic activity: an ex vivo electrophysiological study. Toxicology Mechanisms and Methods. 23 (8), 634-640 (2013).
- Motori, E., et al. Neuronal metabolic rewiring promotes resilience to neurodegeneration caused by mitochondrial dysfunction. Science Advances. 6 (35), 8271 (2020).
- Schwarz, J. R., Eikhof, G. Na currents and action potentials in rat myelinated nerve fibres at 20 and 37° C. Pflügers Archiv. 409 (6), 569-577 (1987).
- Cranefield, P. F., Brink, F., Bronk, D. W. The oxygen uptake of the peripheral nerve of the rat. Journal of Neurochemistry. 1 (3), 245-249 (1957).
- Lehmann, J. E. The effect of changes in pH on the action of mammalian A nerve fibers. American Journal of Physiology-Legacy Content. 118 (3), 600-612 (1937).
- Hamm, L. L., Nakhoul, N., Hering-Smith, K. S.
- Minasian, S. M., Galagudza, M. M., Dmitriev, Y. V., Kurapeev, D. I., Vlasov, T. D. Myocardial protection against global ischemia with Krebs-Henseleit buffer-based cardioplegic solution. Journal of Cardiothoracic Surgery. 8, 60 (2013).
- Bailey, L. E., Ong, S. D. Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations. Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).
- Miller, D. J. Sydney Ringer: physiological saline, calcium and the contraction of the heart. The Journal of Physiology. 555, Pt 3 585-587 (2004).
- Yamamoto, D., Suzuki, N., Miledi, R. Blockage of chloride channels by HEPES buffer). Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 230 (1258), 93-100 (1987).
- Janz, G. J., Taniguchi, H. The silver-silver halide electrodes. Preparation, stability, and standard potentials in aqueous and non-aqueous media. Chemical Reviews. 53 (3), 397-437 (1953).
- Rapeaux, A., Constandinou, T. G. An HFAC block-capable and module-extendable 4-channel stimulator for acute neurophysiology. Journal of Neural Engineering. 17 (4), 046013 (2020).
- Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch. Next Generation Neural Interfaces. , Available from: https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch> (2021).
- Cuttaz, E. A., Chapman, C. A. R., Syed, O., Goding, J. A., Stretchable Green, R. A. fully polymeric electrode arrays for peripheral nerve stimulation. Advanced Science. 8 (8), 2004033 (2021).
- Lossi, L., Merighi, A. The use of ex vivo rodent platforms in neuroscience translational research with attention to the 3Rs philosophy. Frontiers in Veterinary Science. 5, 164 (2018).
