Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung von ganzem Ischiasnervengewebe der Ratte für die elektrophysiologische Stimulation ex vivo und die Aufzeichnung in einem umweltregulierten, durchbluteten Salzbad mit zwei Kompartimenten.
Abstract
Ex-vivo-Präparate ermöglichen es, viele neurophysiologische Prozesse isoliert vom Rest des Körpers zu untersuchen und gleichzeitig die lokale Gewebestruktur zu erhalten. Diese Arbeit beschreibt die Vorbereitung von Rattenischiasnerven für die Ex-vivo-Neurophysiologie , einschließlich Puffervorbereitung, Tierverfahren, Geräteaufbau und neurophysiologische Aufzeichnung. Diese Arbeit gibt einen Überblick über die verschiedenen Arten von Experimenten, die mit dieser Methode möglich sind. Die skizzierte Methode zielt darauf ab, 6 h Stimulation und Aufzeichnung auf extrahiertem peripherem Nervengewebe unter streng kontrollierten Bedingungen für eine optimale Konsistenz der Ergebnisse bereitzustellen. Die mit dieser Methode erzielten Ergebnisse sind A-Faserverbindungswirkungspotentiale (CAP) mit Peak-to-Peak-Amplituden im Millivoltbereich über die gesamte Dauer des Experiments. CAP-Amplituden und -Formen sind konsistent und zuverlässig, was sie nützlich macht, um neue Elektroden mit bestehenden Modellen zu testen und zu vergleichen, oder die Auswirkungen von Eingriffen auf das Gewebe, wie die Verwendung von Chemikalien, chirurgische Veränderungen oder neuromodulatorische Stimulationstechniken. Sowohl herkömmliche handelsübliche Manschettenelektroden mit Platin-Iridium-Kontakten als auch maßgeschneiderte leitfähige Elastomerelektroden wurden getestet und lieferten ähnliche Ergebnisse in Bezug auf die Nervenreizstärke-Dauer-Reaktion.
Introduction
Das derzeitige Verständnis der grundlegenden Nervenfunktion, wie sie in silico modelliert wird, fehlt in mehreren Aspekten, insbesondere in Bezug auf die Auswirkungen der Kompartimentierung von Nervengewebe außerhalb des Somas, Axons und der Dendriten. Axon-Myelin-Wechselwirkungen sind immer noch wenig verstanden, wie die Tatsache zeigt, dass selbst detaillierte Computernervenmodelle wie MRG1 (für Säugetiernerven), die die konventionelle elektrische Stimulationsreaktion angemessen erfassen, andere experimentell beobachtete Verhaltensweisen wie Hochfrequenz-Blockübertragung2 oder sekundäre Beginnantwort3 nicht erfassen.
Dieses Protokoll bietet eine Methode, um neurophysiologische Prozesse auf Nervenebene in einem akuten Kleinlabortiermodell effizient zu untersuchen, wobei ein standardisiertes Vorbereitungsprotokoll verwendet wird, um den Nerv zu isolieren, seine Umgebung zu kontrollieren und ihn aus einem In-vivo-Kontext in einen Ex-vivo-Kontext zu entfernen. Dies verhindert andere Körperprozesse oder Anästhetika, die von In-vivo-Nervenstimulationsprotokollen verwendet werden, um das Nervenverhalten zu verändern und die Messergebnisse oder deren Interpretation zu verfälschen 4,5. Dies ermöglicht die Entwicklung realistischerer Modelle, die sich ausschließlich auf Effekte konzentrieren, die für Nervengewebe spezifisch sind und kaum verstanden werden. Dieses Protokoll ist auch als Testumgebung für neue Nervenstimulation und Aufzeichnung von Elektrodenmaterialien und -geometrien sowie für neue Stimulationsparadigmen wie Hochfrequenzblock 2,3 nützlich. Variationen dieser Technik wurden zuvor verwendet, um die Nervenphysiologie unter streng kontrollierten Bedingungen zu untersuchen6, zum Beispiel um die Dynamik und Eigenschaften von Ionenkanälen oder die Auswirkungen von Lokalanästhetika zu messen7.
Diese Technik bietet mehrere Vorteile im Vergleich zu Alternativen wie akuten In-vivo-Kleintierversuchen 8. Die Technik macht es überflüssig, die Anästhesietiefe aufrechtzuerhalten, da das Gewebe aus dem Körper extrahiert wurde, wodurch die erforderliche Ausrüstung wie ein Anästhesiediffusor, ein Sauerstoffkonzentrator und ein Heizkissen reduziert werden. Dies vereinfacht das experimentelle Protokoll und reduziert das Risiko von Fehlern. Da Anästhetika möglicherweise die Nervenfunktion4 verändern können, stellt diese Technik sicher, dass die Maßnahmen nicht durch Nebenwirkungen dieser Anästhesieverbindungen beeinträchtigt werden. Schließlich ist diese Technik besser geeignet als akute In-vivo-Experimente , wenn die Auswirkungen neurotoxischer Verbindungen wie Tetrodotoxin untersucht werden, die ein betäubtes Tier durch Lähmung töten würden.
Periphere Nervenabschnitte sind ein einzigartiges Ex-vivo-System , da eine hohe Wahrscheinlichkeit besteht, dass die Fasern, die für aufgezeichnete neuronale Signale verantwortlich sind, kein Soma enthalten. Da sich diese normalerweise für Motoneuronen in der Wirbelsäule und für sensorische Neuronen in den dorsalen Wurzelganglien neben der Wirbelsäule befinden würden, kann die Vorbereitung eines Abschnitts des Säugetiernervs grob als eine Ansammlung von röhrenförmigen Membranen mit Ionenkanälen modelliert werden, die an beiden Enden offen sind9. Der Stoffwechsel wird durch die Mitochondrien aufrechterhalten, die sich zum Zeitpunkt der Gewebedissektion10 im Axon befinden. Das Nähen der offenen Enden des Axolemmas wird nach der Extraktion angeregt, um sie zu schließen und dadurch dazu beizutragen, bestehende ionische Gradienten über die Membran aufrechtzuerhalten, die für eine normale Nervenfunktion unerlässlich sind.
Um die Gewebehomöostase außerhalb des Körpers aufrechtzuerhalten, müssen mehrere Umweltvariablen streng kontrolliert werden. Dies sind Temperatur 11, Sauerstoffversorgung12, Osmolarität, pH13,14 und Zugang zu Glukose, um den Stoffwechsel aufrechtzuerhalten. Für dieses Protokoll besteht der Ansatz darin, einen modifizierten Krebs-Henseleit-Puffer15,16 (mKHB) zu verwenden, der kontinuierlich mit einer Mischung aus Sauerstoff und Kohlendioxid belüftet wird. Das mKHB gehört zur Familie der kardioplegikaischen Puffer 6,17, die zur Konservierung von seziertem Gewebe außerhalb des Körpers verwendet werden, beispielsweise in Ex-vivo-Experimenten. Diese Puffer enthalten kein Hämoglobin, keine Antibiotika oder Antimykotika und eignen sich daher nur für Präparate, bei denen kleine Gewebemengen für eine begrenzte Zeit verwendet werden. Die pH-Kontrolle wurde mit dem Karbonat- und Kohlendioxid-Redoxpaar erreicht, was eine ständige Belüftung des Puffers mit Kohlendioxid erfordert, um das pH-Gleichgewicht aufrechtzuerhalten. Dies dient dazu, die Verwendung anderer gängiger Puffermittel wie HEPES zu vermeiden, die die Nervenzellfunktion18 modifizieren können. Um den Puffer mit Sauerstoff zu versorgen und den pH-Wert zu kontrollieren, wurde eine Mischung aus 5% Kohlendioxid in Sauerstoff namens Carbogen (95%O2, 5% CO2) verwendet. Ein Heizrührer wurde zur Temperaturregelung eines Pufferbehälters verwendet, und der Puffer wurde durch ein Nervenbad perfundiert und dann in den Startbehälter zurückgeführt. Ein typisches Experiment würde 6-8 Stunden dauern, bevor der Nerv seine Lebensfähigkeit verliert und nicht mehr ausreichend auf die Stimulation anspricht, um Maßnahmen zu ergreifen, die für gesundes Gewebe repräsentativ sind.
Zur Optimierung des Signal-Rausch-Verhältnisses wurden für die Aufzeichnung Silberchlorid-Elektroden verwendet, die nach zuvor beschriebenen Verfahren19 hergestellt wurden. Zur Stimulation kann eine Kombination aus handelsüblichen Platin-Manschettenelektroden und maßgeschneiderten leitfähigen Polymer-Manschettenelektroden verwendet werden. Leitfähige Polymermanschettenelektroden haben deutlich höhere Ladungskapazitäten, die bei der Stimulation des Nervs mit Wellenformen mit hoher Amplitudenützlich sind 20.
Der in diesem Protokoll verwendete Stimulator wurde zuvorbeschrieben 20. Dokumentation, Entwurfsdateien und Softwareskripte für die Verwendung sind öffentlich verfügbar21. Andere Stimulatoren können verwendet werden, um dieses Protokoll auszuführen; Der kundenspezifische Stimulator ist jedoch auch in der Lage, den HFAC-Block 2,20 (High Frequency Alternative Current) zu bilden, was ein breiteres Spektrum an neurophysiologischen Experimenten ermöglicht. Um HFAC-Block zu verwenden, werden leitfähige Elastomermanschetten empfohlen, um eine Schädigung des Nervs zu vermeiden. Leitfähige Elastomer-Nervenmanschetten sind weiche und vollständig polymere Elektrodenarrays, die aus leitfähigen Elastomeren als leitfähige Komponente und Polydimethylsiloxan als Isolierung22 hergestellt werden. Die Geräte wurden in einer bipolaren Konfiguration unter Verwendung herkömmlicher Laser-Mikrofabrikationstechniken hergestellt.
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Protocol
Alle Tierpflege und -verfahren wurden unter entsprechenden Lizenzen durchgeführt, die vom britischen Innenministerium gemäß dem Animals (Scientific Procedures) Act (1986) ausgestellt und vom Animal Welfare and Ethical Review Board des Imperial College London genehmigt wurden.
1. Vorbereitung von Puffern
HINWEIS: Dieser Teil des Protokolls kann weit vor dem Rest des Protokolls durchgeführt werden, mit Ausnahme der letzten Schritte, die die Herstellung eines modifizierten Krebs-Henseleit-Puffers (mKHB) bei 1x-Konzentration beinhalten.
- Bereiten Sie 1 M CaCl2 Stammlösung vor
- 14.701 g CaCl 2-Dihydrat in ein sauberes 100-ml-Becherglas geben. Fügen Sie ~ 75 ml deionisiertes Wasser hinzu und rühren Sie bis zur vollständigen Auflösung des Salzes.
- Übertragen Sie die Lösung in einen 100 ml Messkolben und fügen Sie deionisiertes Wasser hinzu, bis ein Volumen von 100 ml erreicht ist. Die Lösung in eine Flasche geben und im Kühlschrank bei 4 °C lagern.
- Bereiten Sie 10x konzentrierten mKHB-Bestand vor
- 66,03 g Natriumchlorid (NaCl), 3,57 g Kaliumchlorid (KCl), 1,63 g Kaliumdihydrogenphosphat (KH 2 PO4) und 1,44 g Magnesiumsulfat in ein2l Becherglas geben.
- Geben Sie ~ 750 ml deionisiertes Wasser in das Becherglas und rühren Sie, bis sich die Salze aufgelöst haben (es können kleine Salzkristalle am Boden übrig sein). 25 ml 1 M CaCl2 Stammlösung (Schritt 1.1) zugeben und umrühren; Stellen Sie sicher, dass dies das letzte hinzugefügte Salz ist.
- Die Lösung wird in einen 1-L-Messkolben gegeben und mit entionisiertem Wasser ein Gesamtvolumen von 1 l erreicht. Die Lösung wird in eine 1-L-Flasche gegeben. Konzentriert 10x mKHB bei 4 °C im Kühlschrank lagern.
HINWEIS: Konzentrierter mKHB-Bestand kann vor dem Austausch ca. 1 Monat gelagert werden.
- Dissektions-Petrischale vorbereiten (Beschichtung)
- Bereiten Sie eine saubere Glas-Petrischale (120 mm Durchmesser) zum Beschichten vor, indem Sie die Schale sorgfältig waschen und trocknen.
- Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für die Verwendung und Aushärtung der konformen Alkoxybeschichtung, beschichten Sie den Boden der Petrischale mit ~ 3-5 mm Beschichtung, indem Sie die konforme Beschichtungsmischung vorsichtig in die Schale gießen, bis die gewünschte Dicke erreicht ist.
- Aushärten Sie die Beschichtung in einem Ofen bei 60 °C, bis sie sich fest anfühlt. Die Sezier-Petrischale ist nun fertig.
HINWEIS: Eine schonende Reinigung der Schale nach jedem Gebrauch stellt sicher, dass die Beschichtung jahrelang hält, bevor ein Austausch erforderlich ist. Stellen Sie beim Austausch der Beschichtung sicher, dass Sie das gesamte Beschichtungsmaterial entfernen, bevor Sie eine neue Beschichtung auftragen. Beachten Sie, dass die in diesem Protokoll verwendete konforme Alkoxybeschichtung (Materialtabelle) eine Haltbarkeit von weniger als einem Jahr hat.
2. Vorbereitungen vor der Dissektion
HINWEIS: Mit diesem Schritt wird das Experiment gestartet. Die folgenden Schritte müssen am selben Tag in dieser Reihenfolge durchgeführt werden.
- 1x mKHB vorbereiten
- Bereiten Sie ein sauberes 2 L Becherglas für den Puffer vor. Übertragen Sie 200 mL 10x mKHB-Vorrat auf das 2-Liter-Becherglas. 2,1 g Natriumcarbonat (NaHCO 3) und 0,99 g wasserfreie Dextrose (D-Glucose) in das 2-Liter-Becherglas geben.
- Fügen Sie dem Becherglas etwa 1 l entionisiertes Wasser hinzu. Umrühren, bis die Salze vollständig aufgelöst sind. Die Lösung wird in einen 2-L-Messkolben gegeben und mit deionisiertem Wasser ein Gesamtvolumen von 2 l erreicht.
- Übertragen Sie die Lösung auf eine 2-Liter-Glasflasche, die auf einem Heizrührer mit einer Temperatur von 37 ° C platziert wird.
HINWEIS: Kleinere Heizrührer können aufgrund der thermischen Trägheit großer Behälter voller Wasser oft nicht die Zieltemperatur von 37 ° C erreichen. Stellen Sie die Temperatur nach oben ein, so dass der Inhalt der Flasche unter Rühren 37 ° C erreicht. Überwachen Sie die Temperatur während des Experiments und senken Sie die eingestellte Temperatur im Falle eines Überschwingens. - Legen Sie ein Thermometer in die 2-Liter-Flasche, um die Temperatur zu überwachen, und verwenden Sie Greifer, um zu verhindern, dass das Thermometer vom rührenden Floh getroffen wird. Belüften Sie den Puffer mit Carbogen für mindestens 30 Minuten, um die Lösung mit Sauerstoff zu versorgen. Dies sollte den pH-Wert auf 7,4 einstellen. Messen Sie den pH-Wert mit einem pH-Messgerät, um sicherzustellen, dass er innerhalb von 0,1 pH-Einheiten von 7,4 (bei 37 °C) liegt.
HINWEIS: Um den pH-Wert auf 7,4 einzustellen, verwenden Sie bei Bedarf Salzsäure oder Natriumhydroxid. - Füllen Sie zwei 15 mL Zentrifugenröhrchen und eine 100 mL Flasche mit mKHB und legen Sie sie zum Abkühlen auf Eis.
HINWEIS: Die Zentrifugenröhrchen und die Flasche können nach jedem Experiment ohne Autoklavieren gereinigt und wiederverwendet werden. - Für spätere Teile des Experiments den Puffer in der 2-L-Flasche mit Carbogen bei 37 °C unter kontinuierlichem Rühren weiter belüften.
HINWEIS: Die unbeaufsichtigte Verwendung von carbogen kann gefährlich sein, wenn keine automatischen Systeme vorhanden sind, um den Gasfluss im Falle eines Lecks abzuschalten. Ein automatisierter Sensor und ein elektronisches Absperrventil können dies abschwächen; Andernfalls muss eine Person die Ausrüstung beaufsichtigen, wenn die Sezierung in einem anderen Raum stattfindet. In allen Fällen sollte ein Sauerstoffsensor in der Nähe des Setups verwendet werden, um den Bediener zu warnen, wenn die Umgebungssauerstoffkonzentration über 25% steigt. Verwenden Sie nach Möglichkeit einen Raum mit aktiver Belüftung.
- Schalten Sie das Signalerfassungsgerät, den rauscharmen Vorverstärker, den Leitungsrauschfilter und das Oszilloskop für die Aufnahme und Stimulation ein, um genügend Zeit für die Temperaturstabilisierung zu haben.
- Stellen Sie sicher, dass alle elektrischen Aufzeichnungsgeräte korrekt konfiguriert sind
- Stellen Sie den rauscharmen Vorverstärker auf einen AC-gekoppelten Eingang ein, wobei der Eingangsbandpassfilter auf 6 dB Roll-Off pro Jahrzehnt eingestellt ist und die Grenzfrequenzen für die Hochpass- bzw. Tiefpassfilter auf 30 Hz bzw. 3 kHz eingestellt sind.
- Stellen Sie die Verstärkung des rauscharmen Vorverstärkers auf 100 ein.
3. Tieranästhesie und Euthanasie
HINWEIS: Für die Studien wurden weibliche Ratten zwischen 250 und 330 g (Tabelle der Materialien) verwendet.
- Vorbereiten von chirurgischen Werkzeugen und Verbrauchsmaterialien: 12 cm gerade Schere (stumpf); 2 mm Schneidkante abgewinkelte Federschere; 4 cm feine Schere, scharf oder halbscharf; #7 Dumont Pinzette; 45° abgewinkelte feine Pinzette und 6-0 Nähseide oder Faden.
- Legen Sie die Ratte in einen Anästhesiebehälter oder eine Narkosekammer. Verbinden Sie Sauerstoff und den Anästhesiediffusor mit dem Behälter. Stellen Sie die Anästhesiekonzentration (Isofluran) auf 3,5% ein und warten Sie etwa 10 Minuten oder bis das Tier Anzeichen einer Anästhesie wie den Verlust des Aufrichtenden Reflexes zeigt.
- Nachdem die Ratte Anzeichen einer Anästhesie zeigt, bestätigen Sie den Bewusstseinsverlust mit einem Zehenklemmreflex-Reflextest. Fahren Sie nur fort, wenn es keine Zehenentnahme gibt; Überprüfen Sie andernfalls alle Anschlüsse und Anästhesiestufen im Diffusor und wiederholen Sie Schritt 3.2.
- Nehmen Sie das Tier aus dem Behälter und fahren Sie mit der Zervixluxation fort, gefolgt von einem Schnitt einer Oberschenkelarterie zur Bestätigung des Todes.
4. Sezierprotokoll
HINWEIS: Legen Sie das Tier mit seinem Bauch nach unten auf den Seziertisch. Wiederholen Sie die folgenden Schritte für beide Beine. Typischerweise wird das rechte Bein zuerst seziert.
- Halten Sie den Knöchel fest zwischen Daumen, Zeigefinger und Mittelfinger, durchtrennen Sie die Fersensehne mit einer 12 cm langen geraden stumpfen Schere.
- Machen Sie mit einer feinen scharfen Schere einen Hautschnitt von der Fersenspinne entlang der Rückseite des Beines bis zur Basis der Wirbelsäule und achten Sie darauf, das darunter liegende Muskelgewebe nicht zu sezieren.
- Machen Sie mit einer feinen Pinzette und einer feinen Schere vorsichtige Schnitte durch die Muskelschichten in der Nähe der Mitte der Rückseite des Beins, bis der Ischiasnerv freigelegt ist. Sobald der Ischiasnerv sichtbar ist, befeuchten Sie die Höhle mit eiskaltem mKHB, um ein Austrocknen des Nervs zu verhindern.
- Ziehen Sie mit Hämostaten die Hautlappen auf jeder Seite auseinander und halten Sie den Einschnitt für feinere Sezierarbeiten offen. Ausgehend von der Stelle des Fersensehnenschnitts unterbrechen Sie mit einer feinen Schere den Muskel auf der medialen Seite des Beins, um den Nerv zu befreien. Halten Sie den Feuchtigkeitsgehalt in der Region mit eiskaltem mKHB aufrecht.
- Wenn der Nerv freigelegt wird, während Sie sich das Bein hinaufbewegen, sezieren Sie das darüber liegende Muskelgewebe. Befreien Sie den Nerv näher an der Wirbelsäule vom Bindegewebe, bis Sie die Wirbelsäulenspalte erreichen, an der sich ein Knick im Nerv befindet. Versuchen Sie noch nicht, den Nerv zu reinigen, da Geschwindigkeit in diesem Stadium unerlässlich ist.
- Durchtrennen Sie den Nerv so nah wie möglich an der Wirbelsäule mit einer feinen Schere. Um die Dissektion zu erleichtern, ziehen Sie das Ende des Nervs in der Nähe des Knöchels mit einer Pinzette sehr vorsichtig an. Kneifen Sie niemals den Nerv in der Mitte, sondern nur die Enden. Ziehen Sie niemals einen Nerv straff.
OPTIONAL: An diesem Punkt, wenn es die Zeit erlaubt, kann die Naht beider Enden des Nervs durchgeführt werden, um die Lebensfähigkeit zu erhalten. Halten Sie die Handhabung auf ein Minimum, um Schäden zu vermeiden. Wenn die Zeit nicht ausreicht (siehe Schritt 4.5), überspringen Sie diesen Schritt, und führen Sie später Schritt 5.2 aus. - Legen Sie den sezierten Nerv in das mit mKHB gefüllte 15-ml-Zentrifugenröhrchen (Schritt 2.1.5), schließen Sie das Röhrchen und legen Sie das Röhrchen bis zum Beginn des Reinigungsvorgangs wieder auf Eis.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.7 für das andere Bein. Idealerweise sollte jeder Nerv 5-10 Minuten brauchen, um zu extrahieren, um die Lebensfähigkeit des Gewebes zu maximieren.
5. Nervenreinigungsverfahren
- Füllen Sie die beschichtete Petrischale etwa zur Hälfte mit gekühltem sauerstoffhaltigem mKHB. Legen Sie einen der sezierten Ischiasnerven in die Schale und befestigen Sie beide Enden des Nervs an der Schale, so dass der Nerv gerade ohne Knicke, Torsion oder Verdrehungen ist. Heften Sie den Nerv so nah wie möglich an den Enden fest.
- Binden Sie mit 6-0-Seidennähten oder feinem Faden einen Doppelknoten um jedes Ende des Nervs, um ein Austreten von Zytosol in den Puffer zu verhindern. Platzieren Sie die Knoten direkt neben den Insektenstiften auf der Seite, die näher an der Mitte des Nervs liegt, da dies das Austreten von Nervengewebe in den Puffer verhindert. Führen Sie diesen Schritt nicht durch, wenn der Nerv zuvor ligiert wurde.
- Mit dem Mikroskop für Präzision und der 2 mm abgewinkelten Federschere entfernen Sie Fett, Blutgefäße und Muskelgewebe aus dem Nerv. Beschneiden Sie alle Nervenäste, die nicht im Stimulations- und Aufzeichnungsprotokoll verwendet werden.
- Ersetzen Sie den Puffer alle 5 Minuten der Reinigung durch frisch gekühltes, sauerstoffreiches mKHB. Verwenden Sie feine Pinzetten, um an Bindegewebe, Fett und Blutgefäßen zu ziehen, um die Dissektion zu erleichtern.
- Legen Sie die Nerven zurück in die Transportröhrchen, die mit frisch oxygeniertem gekühltem mKHB gefüllt sind, und legen Sie die Schläuche auf Eis.
6. Einrichtung der Ausrüstung
HINWEIS: Der Geräteaufbau zur Durchführung von Experimenten ist in Abbildung 1 dargestellt. Kurz gesagt, es besteht aus einem Doppelkompartiment-Nervenbad, einer 2-L-Flasche, die auf einem Heizrührer platziert wird, einer Carbogenquelle für die Pufferbelüftung und einem Schlauch, damit der Puffer von der Flasche zum Bad und mit einer Peristaltikpumpe zurück zur Flasche fließen kann. Das Bad kann aus Plexiglas gefräst oder aus wasserdichten Materialien in 3D gedruckt werden. Es hat eine Tiefe von ca. 2 cm, und die Trennwand, die die beiden Kammern des Bades trennt, verfügt über ein Loch mit einem Durchmesser von 1,5 mm, um das Einfädeln eines peripheren Nervs über beide Kammern zu ermöglichen. Eine Kammer ist groß, muss mindestens 4 oder 5 cm lang sein und wird mit Puffer gefüllt. Die andere Kammer sollte mindestens 3 cm lang sein und mit Silikon oder Mineralöl gefüllt werden. Das Bad darf nicht zu groß gemacht werden, da dies die Kontrolle über Perfusion, Temperatur und pH-Wert beeinträchtigt. Je nach Größe des untersuchten Nervengewebes können unterschiedliche Badgrößen erforderlich sein.
- Bereiten Sie ein sauberes Zweikammer-Nervenbad vor (siehe Ergänzende Datei für Designspezifikationen). Platzieren Sie das Nervenbad unter dem Niveau der 2-L-Flasche, die auf dem Heizrührer platziert ist, mit Standard-Laborbossköpfen und Greifern. Schließen Sie den Abfluss des Bades an den peristaltischen Pumpeneinlass an.
- Schließen Sie den Auslass der Peristaltikpumpe an ein Rohr an, das zurück zur 2-L-Pufferflasche führt. Schließen Sie den Badeinlass mit einem einstellbaren Durchflussventil an ein Rohr an und legen Sie das Rohr in die 2-L-Flasche. Verwenden Sie ein Drei-Wege-Ventil mit einer Spritze, die mit dem mittleren Auslass verbunden ist, um das Rohr als Siphon für den schwerkraftunterstützten Pufferzufluss vorzubereiten.
- Grundieren Sie den Siphon, indem Sie die Spritze ziehen, bis Puffer in ihn hineinfließt. Konfigurieren Sie das Ventil so, dass der Durchfluss des Puffers in das Bad ~ 5-6 ml · min-1 beträgt. Der Durchfluss kann zunächst erhöht werden, um das Bad zu füllen. Sobald der Pufferstand des Bades den Abfluss erreicht hat, legen Sie die Nerven in das Bad.
- Sichern Sie mit einem Insektenstift das Ende des Nervs an der Ecke der mit Puffer gefüllten Badekammer. Verwenden Sie eine um 45° abgewinkelte feine Pinzette und klemmen Sie den Nerv nur an den Enden ein, fädeln Sie den Nerv vorsichtig ein, um durch das Loch in der Trennwand zwischen den beiden Badkammern stimuliert zu werden.
- Sichern Sie das andere Ende des Nervs in der Ölkammer des Bades mit einer Insektennadel, um sicherzustellen, dass der Nerv gerade ist, ohne gedehnt zu werden und frei von Knicken und Verdrehungen ist. Verwenden Sie Silikonfett, machen Sie eine Dichtung, um Pufferleckage von der Pufferkammer in die Ölkammer zu verhindern. Füllen Sie die Ölkammer mit Silikon oder Mineralöl.
- Legen Sie die Ag/AgCl-Aufzeichnungselektrodenhaken in die Ölbadkammer und sichern Sie sie mit Bossköpfen und Greifern. Drapieren Sie den Teil des Nervs im Ölbad über die Haken, ohne den Nerv straff zu ziehen. Kneifen Sie den Nerv nicht zusammen; Verwenden Sie abgewinkelte Pinzetten, um den Nerv ohne Einklemmen anzuheben.
- Stellen Sie die Silikonfettdichtung ein oder reparieren Sie sie, wenn nach dem Bewegen des Nervs eine Leckage beobachtet wird.
- Schließen Sie die Referenz-Ag/AgCl-Elektrode an die Verstärkermasse an und platzieren Sie die Elektrode in der puffergefüllten Badkammer, indem Sie sie mit einem Laborgreifer befestigen.
7. Elektrodenimplantation auf den Nerv im Bad
- Bereiten Sie eine saubere Nervenmanschettenelektrode zur Stimulation gemäß Referenz21 vor. Legen Sie die Elektrode in die puffergefüllte Badkammer. Öffnen Sie mit einer Pinzette oder einer feinen Pinzette mit stumpfen oder abgewinkelten Spitzen die Elektrode im Bad, um die Innenseite der Manschette zu benetzen.
- Wenn Blasen verbleiben, verwenden Sie eine feine Spritze, um Puffer aus dem Bad zu ziehen und die Blasen aus der Manschette zu drücken. Öffnen Sie mit einer Pinzette unter dem Nerv vorsichtig die Manschette und schieben Sie sie unter den Nerv. Schließen Sie die Manschette um den Nerv und achten Sie darauf, dass der Nerv geknickt oder verdreht wird.
- Verbinden Sie die Stimulationselektrode mit dem Stimulator und sichern Sie die Stimulationselektrodenleitung mit Klebeband. Verbinden Sie die Stromrücklaufelektrode mit dem Stimulator und sichern Sie das Kabel mit Klebeband. Wenn Sie eine quadratische Platinplatte als Stromrücklaufelektrode verwenden, positionieren Sie die Folie vom Nerv im Bad weg.
8. Stimulation und Aufzeichnung
- Schließen Sie den TTL-Signalausgang des Stimulators an Kanal 4 des Oszilloskops an, der zum Auslösen des Oszilloskops verwendet wird. Drücken Sie auf dem Oszilloskopbildschirm die Registerkarte Triggerkanal und geben Sie Kanal 4 als auslösenden Kanal an. Stellen Sie den Triggerpegel mit dem Pegelregler auf 1 V ein.
- Stellen Sie auf dem Oszilloskop die Zeitauflösung auf 1 ms/Division und die Spannungsauflösung auf 10 mV/Division ein. Zentrieren Sie die Triggerreferenz in der Zeit und stellen Sie den Triggerpegel auf 1 V ein.
HINWEIS: Führen Sie die Schritte 8.3 bis 8.6 aus, wenn Sie den benutzerdefinierten Stimulator verwenden (siehe Materialtabelle). Es wird davon ausgegangen, dass die MATLAB-Software und die Gerätetreiber auf dem Laborcomputer installiert wurden, wobei die kostenlos online bereitgestellten Anweisungen für den benutzerdefinierten neuronalen Stimulator21 verwendet wurden. Ansonsten befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für die Verwendung eines handelsüblichen Stimulators als Alternative. - Schließen Sie den Stimulator an den Laborcomputer an. Schalten Sie den Stimulator ein, indem Sie das Batterienetzteil an den Stromeingang anschließen. Starten Sie die MATLAB-Software auf dem Laborcomputer.
- Führen Sie das benutzerdefinierte MATLAB-Skript aus: HFAC_4ch_Stimulator_Initialization.m (Table of Materials).
HINWEIS: Das USB-Kommunikationskabel zwischen dem Computer und dem Stimulator sollte grün blinken. Wenn dies nicht der Fall ist, liegt ein Konfigurationsfehler vor, und die Stromversorgung und die Anschlüsse müssen überprüft werden. - Öffnen Sie das MATLAB-Skript: HFAC_4ch_Monophasic_Stimulation.m (Table of Materials). Wenn Sie das MATLAB-Skript direkt bearbeiten, legen Sie die Parameter wie folgt fest: Stimulatorpulsamplitude = -300 μA, Stimulatorpulsbreite = 300 μs, Stimulatoranzahl der Impulse = 10 und Stimulatorzeit zwischen den Impulsen = 1 s.
- Starten Sie das Stimulationsprotokoll, indem Sie in der MATLAB-Software auf Ausführen klicken.
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Representative Results
Repräsentative Ergebnisse, die mit diesem Protokoll erhalten werden können, sind die konsistenten zusammengesetzten Aktionspotentiale aus A-Typ-Nervenfasern innerhalb des Ischiasnervs. Diese Aktionspotentiale haben typischerweise eine Spitze-zu-Spitze-Amplitude von etwa 1 mV an der Elektrode und damit 100 mV einmal verstärkt (Abbildung 2). Ähnliche Stimulationsamplituden und Pulsbreiten sollten ähnliche CAP-Amplituden ergeben. Leitfähige Elastomer-Manschettenelektroden erfordern im Allgemeinen etwas höhere Stimulationsamplituden, um die gleiche CAP-Amplitude im Vergleich zu kommerziell erhältlichen Platin-Manschettenelektroden zu erhalten. Dieser Unterschied ist im Allgemeinen gering im Vergleich zu der Variation der Stimulationsamplitude, die erforderlich ist, um Nerven von verschiedenen Tieren zu stimulieren. Dies liegt daran, dass kleine Unterschiede in der Nervengröße und der Manschettenpassform einen großen Einfluss auf die erforderliche Stimulationsamplitude haben, um eine bestimmte CAP-Amplitude zu erhalten, unabhängig vom Manschettenmaterial. Damit lassen sich die Wirkungen verschiedener Pufferzusammensetzungen testen, wie z.B. unterschiedliche Ionenkonzentrationen oder die Zugabe von nervenerregenden oder hemmenden Substanzen wie Tetrodotoxin. Wenn das Pufferabfallrohr in einen zusätzlichen Behälter geleitet wird, kann die Zugabe von Nervenerregbarkeits-verändernden Substanzen für das Experiment vorübergehend gemacht werden, wobei die Auswaschraten von der Rate des Puffereinflusses abhängen.
Die minimale Stromdichte, berechnet als Stimulationsamplitude geteilt durch die Oberfläche der Stimulationselektroden, die erforderlich ist, um die A-Typ-Fasern zu aktivieren und ein beobachtbares zusammengesetztes Aktionspotential des Oszilloskops zu erhalten, wurde in Abbildung 3 im Vergleich zur Pulsbreite dargestellt. Die in Abbildung 3 gezeigten Ergebnisse stellen die typische Nervenerregbarkeit sowohl für kommerziell erhältliche Standard-Platin-Nervenmanschetten als auch für maßgeschneiderte leitfähige Elastomer-Nervenmanschetten dar.
Die extrahierten Nerven sollten nach der Extraktion etwa 6 h lebensfähig bleiben und daher müssen die Experimente in dieses Zeitfenster passen. Der Verlust der Nervenlebensfähigkeit führt zu einem fortschreitenden Rückgang der CAP-Amplitude und der Leitungsgeschwindigkeit. Nachdem die Amplitude des Aktionspotentials unter 50% der Anfangsamplitude (zu Beginn der Aufzeichnung) gesunken ist, sollte der Nerv als nicht mehr lebensfähig angesehen werden, da die Ergebnisse signifikant verzerrt sind. Repräsentative Ergebnisse in Bezug auf die Langlebigkeit der Nerven sind in Abbildung 4 dargestellt. Die rechten und linken Ischiasnerven wurden an einem bestimmten Tag zwischen 10:00 Uhr und 11:00 Uhr von einem Tier extrahiert. Anfängliche CAPs wurden vom rechten Ischiasnerv während der ersten Tests vor den Experimenten erhalten, und Standard-CAPs wurden am Ende der Experimente sowohl von linken als auch von rechten Ischiasnerven erhalten, die mit diesem Protokoll am Leben erhalten worden waren. Eine minimale CAP-Amplitudenreduktion wurde mit dem rechten Ischiasnerv beobachtet, während die CAP-Amplitude des linken Ischiasnervs bei etwa 3 mV der des rechten Ischiasnervs zu Beginn des Experiments mehr als 6 h nach der Nervenextraktion ähnlich war.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des im Protokoll verwendeten Versuchsaufbaus. Diese Zahl wurde gegenüber Rapeaux, A. et al. (2020)20 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Repräsentative CAPs, die ex vivo nach Stimulation durch metallische und leitfähige Elastomer-Nervenmanschettenarrays erhalten wurden. Nachdruck mit Modifikationen aus Cuttaz, E. A. et al. (2021)22. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: A-Faser-Aktivierungsschwelle von metallischen und leitfähigen Elastomer-Manschettenarrays. Fehlerbalken stellen ±1 Standardabweichung vom Mittelwert dar. Nachdruck mit Modifikationen aus Cuttaz, E. A. et al. (2021)22. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Repräsentative CAPs, die ex vivo über einen Tag der Experimente und unter Verwendung beider Ischiasnerven von einem Tier erhalten wurden. (A) A-Typ-Faser-CAP, die gegen Mittag aus dem rechten Ischiasnerv gewonnen wird. (B) A-Typ-Faser-CAP, die am Nachmittag aus dem linken Ischiasnerv gewonnen wird. (C) A-Typ-Faser-CAP, erhalten am Ende von Experimenten mit demselben linken Ischiasnerv in (B). Die x-Achse entspricht der Tageszeit, zu der die Aufnahmen aufgenommen wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Datei. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
In dieser Arbeit beschrieben wir ein Protokoll zur Vorbereitung von Rattenischiasnerven für die Ex-vivo-Neurophysiologie. Die Gewebeextraktion dauert ungefähr 30 Minuten, einschließlich Tierhandhabung, Anästhesie, Keulung und Dissektion, während die Nervenreinigung, die Platzierung im Bad und die Elektrodenimplantation zusätzliche 30 Minuten dauern sollten, bevor mit der Aufzeichnung begonnen werden kann. Die Puffervorbereitung kann in 30 min durchgeführt werden, obwohl dies vor dem Rest des Experiments erfolgen kann. Diese Art der Vorbereitung und des Experiments wurde in den letzten 7,12 verwendet und beschrieben, wobei ähnliche Puffer und für denselben Gewebetyp verwendet wurden. Nach Kenntnis der Autoren ist dies jedoch das erste Mal, dass eine Beschreibung der Puffervorbereitung, der Sezierung, des Geräteaufbaus und der anschließenden Aufzeichnung im selben Dokument gegeben wurde.
Dieses Protokoll kann eine Vielzahl von Experimenten in der Neurophysiologie ermöglichen, die weder im In-vitro- noch im In-vivo-Kontext möglich wären. Ein Vorteil von Ex-vivo-Präparaten besteht beispielsweise darin, dass sie die Makro- und Mikrostruktur des extrahierten Gewebes erhalten und dieses Gewebe vom Rest des Körpers isolieren. Dies führt zu einem einfacheren Aufbau, da die Anästhesie nicht aufrechterhalten werden muss, was sonst bei In-vivo-Experimenten eine Voraussetzung ist. Im Hinblick auf die Ermöglichung von Experimenten ermöglichen Ex-vivo-Präparate die Verwendung von Substanzen wie Tetrodotoxin, die in einem In-vivo-Kontext schwer zu rechtfertigen sind23, da sie ein hohes Risiko für das Tier bergen. Wenn die Verwendung solcher Stoffe der Untersuchung zugute kommt, sind sie in Ex-vivo-Zubereitungen leichter zu verwenden. Die Verwendung des kundenspezifischen Stimulators20 ermöglicht Experimente mit HFAC-Block zur Neuromodulation unter Verwendung dieses Versuchsaufbaus.
Der kritischste Schritt im Protokoll ist der Sezierschritt, denn schon ein kleiner Fehler mit der Dissektionsschere kann den Nerv beschädigen, wenn nicht genügend Sorgfalt walten gelassen wird. Die Geschwindigkeit in diesem Stadium ist ebenfalls von entscheidender Bedeutung, da das Gewebe schnell aus dem Körper extrahiert und in einen gekühlten Puffer gelegt werden muss, um die Lebensfähigkeit zu Beginn der Aufzeichnung zu maximieren. Während nach der Gewebeextraktion bei der Reinigung des Nervs und der Implantation von Elektroden Vorsicht geboten ist, ist das Protokoll in Bezug auf die Zeit flexibler und das Risiko von Bedienerfehlern ist daher geringer. Da die Nervendurchmesser und die Platzierung der Faszikel innerhalb der Nerven von Tier zu Tier variieren, sollte eine gewisse Variabilität der Ergebnisse erwartet werden, selbst wenn die gleichen Elektroden und das gleiche Stimulationsprotokoll verwendet werden. Der Effekt dieser Variabilität ist in den Fehlerbalken für Stimulationsschwellen in Abbildung 3 zu sehen. Es ist wichtig, den Nerv in keinem Stadium der Zubereitung zu kneifen, da dies zu irreversiblen Schäden am Gewebe führen kann. Behandeln Sie den Nerv nur an seinen Enden mit einer Pinzette und mit großer Sorgfalt, um den Nerv nicht zu straffen.
Mehrere Aspekte des Protokolls in seiner aktuellen Form können verbessert werden, indem die Menge der Ausrüstung und die Einrichtungszeit erhöht werden. Um bei der Diagnose potenzieller Probleme mit diesem Versuchsaufbau zu helfen, könnten automatisierte Messungen von pH-Wert und gelöstem Sauerstoff im Bad nützlich sein, wurden hier aber nicht implementiert. Beide Messungen können mit amperometrischen oder potentiometrischen Methodendurchgeführt werden 12,19. Ausrüstung, die regelmäßig gewartet werden muss, sind die Schläuche und Glaswaren, die im Laufe der Zeit Salzablagerungen ansammeln. Die AgCl-Aufzeichnungshaken müssen zusammen mit der AgCl-Referenz auch regelmäßig neu beschichtet oder ausgetauscht werden. Stimulationselektroden sollten nach jedem Gebrauch gereinigt werden, müssen aber im Allgemeinen nicht für viele Experimente ausgetauscht werden.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.
OPEN-ACCESS-ERKLÄRUNG:
Zum Zwecke des offenen Zugangs hat der Autor eine Creative Common Attribution (CC BY) -Lizenz (sofern dies nach UKRI zulässig ist, kann stattdessen die "Open Government License" oder die "Creative Commons Attribution No-derivatives (CC BY-ND) -Lizenz angegeben werden) auf jede vom Autor akzeptierte Manuskriptversion angewendet.
GEMEINSAME DATENNUTZUNG:
Die in den Abbildungen dieses Artikels verwendeten Rohdaten werden von den Autoren ohne unnötigen Vorbehalt zur Verfügung gestellt.
Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. Gerald Hunsberger von GlaxoSmithKline Pharmaceuticals, King of Prussia, PA, USA, und Galvani Bioelectronics (Stevenage, UK) dafür, dass sie ihre ursprüngliche Nervenvorbereitungstechnik mit uns geteilt haben. Die Autoren danken Robert Toth für das Zweikammer-Nervenbaddesign. Die Autoren würdigen die Finanzierung durch die Healthcare Technologies Challenge Awards (HTCA) des Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC). Die Autoren würdigen das High Performance Embedded and Distributed Systems Centre for Doctoral Training (HiPEDS CDT) des Imperial College London für die Förderung von Adrien Rapeaux (EP/L016796/1). Adrien Rapeaux wird derzeit vom UK Dementia Research Institute, Care Research and Technology Centre, finanziert. Die Autoren danken Zack Bailey vom Imperial College im Department of Bioengineering für die Hilfe bei Experimenten und den Zugang zu tierischem Gewebe während der Produktion des JoVE-Videoartikels.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1595 | Borosilicate glass |
| 1 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | 612-3626 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1596 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | BRND937254 | Borosilicate glass |
| Adaptor, pneumatic, 8 mm to 1/4 NPT | RS UK | 536-2599 | push-to-fit straight adaptor between oxygen hose and gas dispersion tube |
| Alkoxy conformal coating | Farnell | 1971829 | ACC15 Alkoxy conformal coating for dissection petri dish preparation |
| Anesthetic | Chanelle | N/A | Isoflurane inhalation anesthetic, 250 mL bottle |
| Beaker, 2 L | VWR International Ltd | 213-0469 | Borosilicate glass |
| Bipolar nerve cuff | Cortec GMBH | N/A | 800 micron inner diameter, perpendicular lead out, no connector termination |
| Bossheads | N/A | N/A | Standard wet laboratory bossheads for attaching grippers to rods |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902-500g | 500 g in plastic bottle |
| Carbogen canister | BOC | N/A | F-size canister |
| Centrifuge Tubes, 15 mL volume | VWR International Ltd | 734-0451 | Falcon tubes |
| Conductive elastomer nerve cuff | N/A | N/A | high charge capacity nerve cuff for stimulation, see protocol for fabrication reference |
| Connector, Termimate | Mouser UK | 538-505073-1100-LP | These should be soldered to wire terminated with crocodile clips (see entry 11) |
| Crocodile clip connectors | RS UK | 212-1203 | These should be soldered to wire terminated with TermiMate connectors (see entry 10) |
| Deionized Water | N/A | N/A | Obtained from deionized water dispenser |
| Forceps angled 45 degrees | InterFocus Ltd | 91110-10 | Fine forceps, student range |
| Forceps standard Dumont #7 | InterFocus Ltd | 91197-00 | Student range forceps |
| Gas Disperson Tube, Porosity 3 | Merck | 12547866 | N/A |
| Glucose anhydrous, powder | VWR International Ltd | 101174Y | 500 g in plastic bottle |
| Grippers | N/A | N/A | Standard wet laboratory rod-mounted grippers |
| Heating Stirrer | RS UK | 768-9672 | Stuart US152 |
| Hemostats | N/A | N/A | Any hemostat >12 cm in length is suitable |
| Insect Pins, stainless steel, size 2 | InterFocus Ltd | 26001-45 | N/A |
| Laptop computer | N/A | N/A | Any laboratory-safe portable computer with at least 2 unused USB ports is suitable |
| Line Noise Filter | Digitimer | N/A | Humbug noise eliminator (50 Hz line noise filter) |
| Low-Noise Preamplifier, SR560 | Stanford Research Systems | SR560 | Low-noise voltage preamplifier |
| Magnesium Sulphate salt | VWR International Ltd | 291184P | 500g in plastic bottle |
| MATLAB scripts | Github | https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch | Initialization, calibration and stimulation scripts for the custom stimulator |
| MATLAB software | Mathworks | N/A | Standard package |
| Microscope Light, PL-2000 | Photonic | N/A | Light source with swan necks. Product may be obtained from third party supplier |
| Microscope, SMZ 745 | Nikon | SM745 | Stereoscopic Microscope |
| Mineral oil, non-toxic | VWR International Ltd | 31911.A1 | Oil for nerve bath |
| Nerve Bath | N/A | N/A | Plexiglas machined nerve bath, see protocol for details. |
| Oscilloscope | LeCroy | N/A | 434 Wavesurfer. Product may be obtained from 3rd party suppliers |
| Oxygen Hose, 1 meter | BOC | N/A | 1/4" NPT terminations |
| Oxygen Regulator | BOC | C106X/2B:3.5BAR-BS3-1/4"NPTF 230Bar | N/A |
| Peristaltic Pump P-1 | Pharmacia Biotech | N/A | Product may be obtained from third party supplier |
| Petri Dish, Glass | VWR International Ltd | 391-0580 | N/A |
| Potassium Chloride salt | Sigma Aldrich | P5405-250g | 250 g in plastic bottle |
| Potassium Dihydrogen Sulphate salt | Merck | 1.04873.0250 | 250 g in plastic bottle |
| Rat | Charles River Laboratories | N/A | Sprague Dawley, 250-330 grams, female |
| Reference electrode, ET072 | eDaQ (Australia) | ET072-1 | Silver silver-chloride reference electrode |
| Rod | N/A | N/A | Standard wet laboratory rods with fittings for stands |
| Scale | Sartorius | N/A | M-Power scale, for weighing powders. Product may be obtained from third-party suppliers |
| Scissors straight 12 cm edge | InterFocus Ltd | 91400-12 | blunt-blunt termination, student range |
| Signal Acquisition Device | Cambridge Electronic Design | Micro3-1401 | Micro3-1401 Multichannel ADC |
| Silicone grease, non-toxic | Farnell | 3821559 | for sealing of bath partition |
| Silicone tubing, 2 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silicone tubing, 5 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silver wire | Alfa Aesar | 41390 | 0.5 mm, annealed |
| Sodium Bicarbonate salt | Sigma Aldrich | S5761-500g | 500 g in plastic bottle |
| Sodium Chloride salt | VWR International Ltd | 27810.295 | 1 kg in plastic bottle |
| Spring scissors angled 2 mm edge | InterFocus Ltd | 15010-09 | N/A |
| Stand | N/A | N/A | Standard wet laboratory stands with sockets for rods |
| Stimulator | Digitimer | DS3 | DS3 or Custom Stimulator (see references) |
| Stirring flea | VWR International Ltd | 442-0270 | For use with the heating stirrer |
| Syringe tip, blunt, 1 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe tip, blunt, 2 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe, plastic, 10 mL volume | N/A | N/A | syringe should have luer lock fitting |
| Tape, water-resistant | N/A | N/A | For securing tubing and wiring to workbench |
| Thermometer | VWR International Ltd | 620-0806 | glass thermometer |
| USB Power Bank | RS UK | 135-1000 | Custom Stimulator power supply, fully charge before experiment. Not needed if using DS3 |
| Valve, Leuer Lock, 3-Way | VWR International Ltd | 229-7440 | For attaching syringe to bath feed tube and priming siphon |
References
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