Summary
Qui presentiamo un metodo basato sulla citometria a flusso per la visualizzazione e la quantificazione di più marcatori associati alla senescenza in singole cellule.
Abstract
I farmaci chemioterapici possono indurre danni irreparabili al DNA nelle cellule tumorali, portando ad apoptosi o senescenza prematura. A differenza della morte cellulare apoptotica, la senescenza è un meccanismo fondamentalmente diverso che limita la propagazione delle cellule tumorali. Decenni di studi scientifici hanno rivelato i complessi effetti patologici delle cellule tumorali senescenti nei tumori e nei microambienti che modulano le cellule tumorali e le cellule stromali. Nuove prove suggeriscono che la senescenza è un potente fattore prognostico durante il trattamento del cancro, e quindi è essenziale un rilevamento rapido e accurato delle cellule senescenti nei campioni di cancro. Questo documento presenta un metodo per visualizzare e rilevare la senescenza indotta dalla terapia (TIS) nelle cellule tumorali. Le linee cellulari diffuse di linfoma a grandi cellule B (DLBCL) sono state trattate con mafosfamide (MAF) o daunorubicina (DN) ed esaminate per il marcatore di senescenza, la β-galattosidasi associata alla senescenza (SA-β-gal), il marcatore di sintesi del DNA 5-etinil-2′-deossiuridina (EdU) e il marcatore di danno al DNA gamma-H2AX (γH2AX). L'imaging del citometro a flusso può aiutare a generare immagini a singola cellula ad alta risoluzione in un breve periodo di tempo per visualizzare e quantificare simultaneamente i tre marcatori nelle cellule tumorali.
Introduction
Una varietà di stimoli può innescare la senescenza cellulare, facendo sì che le cellule entrino in uno stato di arresto stabile del ciclo cellulare. Questi stimoli includono cambiamenti intrinseci di segnalazione o stress estrinseci. I segnali intrinseci includono l'accorciamento progressivo dei telomeri, i cambiamenti nella struttura dei telomeri, la modificazione epigenetica, i disturbi della proteostasi, la disfunzione mitocondriale e l'attivazione degli oncogeni. Gli stress estrinseci includono segnali infiammatori e / o di danno tissutale, radiazioni o trattamenti chimici e privazione nutrizionale 1,2,3,4. Tra i tipi distinti di senescenza, i più comunemente visti e ben studiati sono la senescenza replicativa, la senescenza indotta da oncogeni (OIS), la senescenza indotta da radiazioni e la senescenza indotta dalla terapia (TIS). L'OIS è una risposta cellulare acuta al danno genotossico causato dallo stress replicativo generato dall'attivazione aberrante dell'oncogene e può in una certa misura prevenire la progressione patologica da una lesione preneoplastica a un tumore in piena regola. La TIS si verifica quando le cellule tumorali sono stressate da farmaci chemioterapici o radiazioni ionizzanti 5,6.
La senescenza è considerata un'arma a doppio taglio in patologia a causa della sua natura altamente dinamica. Inizialmente è stato descritto come un meccanismo benefico soppressivo del tumore per rimuovere le cellule danneggiate dal pool circolante di cellule in divisione, salvaguardando la normale funzione degli organi e inibendo la crescita tumorale 7,8,9. Tuttavia, le prove emergenti hanno suggerito un lato oscuro della senescenza. Le cellule senescenti secernono citochine proinfiammatorie, note come fenotipo secretorio associato alla senescenza (SASP), che portano alla fibrosi e agli organi malfunzionanti e promuovono l'inizio e la progressione del tumore10. Inoltre, le cellule tumorali senescenti subiscono una riprogrammazione epigenetica e di espressione genica in parallelo con il rimodellamento della cromatina e l'attivazione di una risposta sostenuta al danno al DNA (DDR)11,12, acquisendo di recente nuove proprietà delle cellule staminali tumorali3. Sebbene i tumori capaci di senescenza rispondano meglio all'intervento terapeutico rispetto a quelli incapaci di senescenza13, la persistenza delle cellule senescenti può portare a una prognosi a lungo termine sfavorevole se non vengono efficacemente identificati ed eliminati dai farmaci senolitici5. In entrambi i casi, un metodo affidabile per valutare la senescenza è di notevole interesse clinico, non solo per la prognosi del trattamento terapeutico, ma anche per lo sviluppo di nuove strategie mirate alle cellule senescenti.
Indipendentemente dai diversi fattori scatenanti, le cellule senescenti presentano alcune caratteristiche comuni, tra cui morfologia allargata, appiattita, multinucleata con grandi vacuoli, nuclei significativamente espansi, formazione di eterocromatina associata alla senescenza ricca di H3K9me3 (SAHF) nel nucleo, accumulo persistente di focolai di marcatore di danno al DNA γH2AX, p53-p21attivato CIP1 e Rb-p16INK4a meccanismi di regolazione del ciclo cellulare, arresto stabile del ciclo cellulare G1, induzione massiccia di SASP e elevata attività della β-galattosidasi (SA-β-gal) associata alla senescenza14. Poiché nessun singolo marcatore è sufficiente per definire la senescenza, la colorazione enzimatica per l'attività SA-β-gal, che è considerata il gold standard per il rilevamento della senescenza, è solitamente combinata con la colorazione immunoistochimica per H3K9me3 e Ki67 per rilevare TIS15. Tuttavia, il SA-β-gal a base cromogenica chimica è difficile da quantificare. Qui, abbiamo combinato il rilevamento SA-β-gal (fSA-β-gal) a base di fluorescenza a base di fluorescenza 5-dodecanoylaminofluorescein-di-β-D-galattopiranoside (C12FDG) con la colorazione immunofluorescente per γH2AX e il DNA incorporato in EdU per identificare le cellule senescenti C12FDG + EdU-γH2AX + utilizzando l'avanzato sistema di citometro a flusso di imaging, che combina la velocità, la sensibilità e le immagini dettagliate a singola cellula con informazioni spaziali che non possono essere fornite dalla citometria a flusso e dalla microscopia. Questo metodo consente una rapida generazione di immagini ad alta risoluzione che consentono il posizionamento e la quantificazione dei segnali fluorescenti all'interno delle celle, consentendo al contempo l'analisi rapida di più campioni mediante la costruzione di pipeline standard.
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Protocol
1. Linee cellulari DLBCL con trattamento con mafosfamide o daunorubicina per indurre la senescenza cellulare
NOTA: Il protocollo funziona anche per le cellule tumorali aderenti. A seconda delle dimensioni della cellula, il seme 1-2 × 105 cellule in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e incubare la piastra in un incubatore al 5% di CO2, 37 °C durante la notte prima del trattamento. I passaggi del protocollo sono gli stessi delle celle di sospensione, ma con due eccezioni. In primo luogo, le cellule devono essere tripsinate dalla piastra dopo il passaggio 3.4. In secondo luogo, le fasi di lavaggio vengono eseguite senza centrifugazione prima della tripsinizzazione.
- Contare le cellule DLBCL e il seme 1 × 106 cellule / mL in 4 mL di terreno per pozzo in una piastra di coltura a 6 pozzetti. Coltivare cellule DLBCL in mezzo RPMI-1640 integrate con siero bovino fetale al 10% (FBS) e 100 U / mL di penicillina / streptomicina.
- Aggiungere MAF (5 μg/mL) o DN (20 ng/mL) nella coltura cellulare e scuotere delicatamente la piastra per mescolare.
NOTA: MAF e DN non sono stabili. Dopo la dissoluzione in DMSO, la soluzione madre deve essere aliquotata e conservata a -20 °C. I cicli di congelamento/scongelamento dovrebbero essere evitati. - Incubare la piastra in un incubatore al 5% di CO2, 37 °C per 3 giorni.
- Dopo un'incubazione di 3 giorni, raccogliere le cellule DLBCL in tubi di centrifuga sterili da 15 ml e ruotare a 100 × g, 4 °C per 5 minuti.
- Scartare il surnatante, risospesciare i pellet cellulari con 4 ml di mezzo fresco e aggiungere nuovamente le sospensioni nella piastra a 6 pozzetti.
- Coltivare la piastra cellulare in un incubatore al 5% di CO2, 37 °C per altri 2 giorni prima della raccolta per l'analisi.
2. Preparare soluzioni per la colorazione (Tabella 1)
3. Macchie di cellule DLBCL con diversi marcatori di senescenza
NOTA: i campioni di cellule colorati con singoli marcatori (ad esempio, pacific blue-EdU, C12FDG o Alexa Fluor 647-γH2AX) sono preparati per generare una matrice di compensazione per correggere lo spillover di fluorescenza durante la misurazione. Sebbene altamente consigliato, questo passaggio potrebbe essere sospeso quando vi è una sovrapposizione omitabile (valore del coefficiente di compensazione ≤ 0,1) degli spettri di emissione tra diversi fluorofori. Tuttavia, gli utenti devono determinare passaggi di compensazione standardizzati quando si utilizzano diversi strumenti e pannelli fluorescenti.
- Aggiungere una soluzione edU da 10 mM con un rapporto di 1:1.000 nella coltura cellulare DLBCL generata dal passaggio 1.6 (la concentrazione finale di EdU è di 10 μM). Scuotere delicatamente la piastra per mescolare e incubare in un incubatore al 5% di CO2, 37 °C per 3 ore.
- Estrarre la piastra dall'incubatore e aggiungere 100 mM di soluzione di clorochina ad una concentrazione finale di 75 μM (vedere discussione). Scuotere delicatamente la piastra per mescolare e incubare in un incubatore al 5% di CO2, 37 °C per 30 minuti.
- Estrarre la piastra dall'incubatore e aggiungere una soluzione di 20 mM C12FDG a 1: 1.000 a una concentrazione finale di C12FDG di 20 μM. Scuotere delicatamente la piastra per mescolare e incubare in un incubatore al 5% di CO2, 37 °C per 1 ora.
- Estrarre la piastra dall'incubatore e aggiungere 100 mM di soluzione di 2-feniletil-β-D-tiogalattoside (PETG) a 1:50 per interrompere la colorazione fSA-β-gal (concentrazione finale di PETG di 2 mM). Ruotare delicatamente la piastra per mescolare.
- Trasferire le cellule in tubi centrifughi sterili da 15 mL e ruotare a 100 × g, 4 °C per 5 min. Scartare il surnatante e lavare le cellule con 4 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
- Ripetere la fase di lavaggio PBS. Scartare il surnatante e risospesciare i pellet cellulari in 500 μL di soluzione di fissazione della paraformaldeide al 4%.
- Dopo 10 min di incubazione a temperatura ambiente, centrifugare a 250 × g, temperatura ambiente per 5 min. Scartare il surnatante e lavare le cellule con 4 ml di PBS.
- Ripetere la fase di lavaggio PBS. Scartare il surnatante, risospesere il pellet cellulare in 200 μL di tampone di permeabilizzazione della saponina e trasferire la sospensione in un nuovo tubo da 1,5 mL. Dopo 10 min di incubazione a temperatura ambiente, centrifugare a 250 × g, temperatura ambiente per 5 min.
- Scartare il surnatante e risospese i pellet cellulari in 200 μL di soluzione anticorpale primaria (anticorpo 1:500 γH2AX in soluzione di incubazione anticorpale). Incubare a 4 °C durante la notte al buio.
- Centrifugare i tubi a 250 × g, 4 °C per 5 min. Scartare il surnatante e lavare con 100 μL di soluzione di lavaggio di saponina.
- Ripetere la fase di lavaggio altre due volte. Scartare il surnatante e risospesciare i pellet cellulari in 500 μL di cocktail di rilevamento EdU.
- Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti al buio. Centrifuga a 250 × g, temperatura ambiente per 5 min. Scartare il surnatante e lavare con 1 mL di soluzione di lavaggio di saponina.
- Ripetere la fase di lavaggio due volte. Scartare il surnatante e risospescere i pellet cellulari in 20-50 μL di PBS. Passare alla sezione 4 per la misurazione del campione.
4. Imaging dei marcatori di senescenza utilizzando il sistema di citometro a flusso di imaging
- Svuotare la bottiglia del fluido di scarico. Controllare i livelli di velocità perline, sterilizzatori, detergenti, debolbbler, guaine e reagenti di risciacquo (acqua deionizzata) per garantire liquidi sufficienti prima di accendere lo strumento (vedere la Tabella dei materiali).
- Accendere lo strumento e il software di imaging (vedere l'interfaccia software nella Figura 1A).
- Fare clic sul pulsante di avvio per inizializzare la fluidica e la calibrazione del sistema.
Nota : questa procedura richiede circa 45 min. - Imposta l'ingrandimento su 40x, imposta la velocità fluidica su bassa e accendi i laser necessari nell'esperimento. Attiva i laser a 405 nm, 488 nm e 642 nm per misurare rispettivamente Il blu EdU-Pacifico, C12FDG e Alexa Fluor 647-γH2AX (o Alexa Fluor 647-Ki67). Impostare Ch6 per canale scatter e Ch1 e Ch9 per brightfield.
- Inizia con il campione che dovrebbe avere la più alta fluorescenza per impostare l'intensità dei laser. Capovolgere delicatamente la provetta per mescolare. Aprire il coperchio del tubo e inserire il tubo campione sul dock. Fare clic su Carica per iniziare.
- Aprite un grafico a dispersione e selezionate le feature Area_M01 e Aspect Ratio_M01 rispettivamente per gli assi X e Y. Impostare un gate sopra le proporzioni di 0,5 per escludere i doppietti e gli aggregati di celle sotto e sul lato destro e la popolazione di perline di velocità sul lato sinistro (Figura 1B).
- Aprite un plottaggio di istogramma e selezionate la feature Sfumatura RMS_M01_Ch01 per l'asse X. Scegliere la popolazione singoletta e impostare il gate da selezionare per le celle focalizzate (Figura 1C).
NOTA: il sistema di imaging utilizzerà automaticamente le perle di velocità per regolare la messa a fuoco per l'imaging. Tuttavia, si consiglia di selezionare la metà destra del picco dell'istogramma per la popolazione più focalizzata. - Aprite un plottaggio di istogrammi e selezionate Intensità pixel massime non elaborate per l'asse X per ogni canale di colore (Ch2, 7 e 11). Regola le potenze laser (ad esempio, 488 nm, 405 nm e 642 nm laser per Ch2, 7 e 11, rispettivamente), in modo che ogni fluorocromo abbia un valore raw max Pixel compreso tra 100 e 4.000 per evitare la sovrasaturazione.
NOTA: per questo esperimento, l'impostazione della potenza laser è di 50 mW, 200 mW e 50 mW per i laser 488 nm, 405 nm e 642 nm, rispettivamente. - Scegli la popolazione focalizzata da registrare e fai clic su Acquisisci per misurare i campioni DLBCL con impostazioni coerenti. Quando si cambiano i campioni per la misurazione, fare clic su Ritorna per recuperare la provetta del campione. Premere Carica per eliminare il campione.
- Dopo aver misurato tutti i campioni, spegnere il campo luminoso e il laser a dispersione. Misurare campioni di controllo monocolore per generare una matrice di compensazione.
- Fare clic su Arresta per chiudere il sistema di imaging.
- Analizza i dati nel software di analisi delle immagini.
- Utilizza lo strumento Spot Wizard del software di analisi delle immagini per contare e quantificare automaticamente i focolai nucleari γH2AX nelle immagini di cellule vive. Selezionare due popolazioni di cellule (una con alto e una con basso numero di spot) per addestrare la procedura guidata spot per un'ulteriore analisi automatica del conteggio spot.
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Representative Results
Una matrice di compensazione è stata generata utilizzando un software di analisi delle immagini caricando i dati registrati dei campioni di controllo a colore singolo. Come mostrato nella Figura supplementare S1, è stata rilevata una ricaduta della luce non trascurabile (valore del coefficiente ≥ 0,1) da EdU a C12FDG con valore del coefficiente di diafonia 0,248, mentre la diafonia tra gli altri canali non era significativa. Quattro diverse linee cellulari DLBCL sono state trattate con 5 μg/mL MAF o 20 ng/mL DN per indurre la senescenza cellulare e analizzate utilizzando la colorazione SA-β-gal convenzionale o il metodo di citometria a flusso di imaging.
Più del 70% delle cellule KARPAS422, WSU-DLCL2 e OCI-LY1 è entrato nello stato di senescenza, indicato da SA-β-gal positivo, mentre SU-DHL6 era completamente resistente all'induzione della senescenza da parte di MAF e DN (Figura supplementare S2A). In particolare, MAF e DN hanno anche indotto la morte cellulare in tutte le cellule DLBCL, anche se non in modo drammatico (Figura supplementare S2B). Utilizzando il metodo della citometria a flusso di imaging, le immagini a singola cellula e la quantificazione basata sulla citometria a flusso hanno mostrato un aumento della popolazione senescente C12FDG + EdU-γH2AX + in KARPAS422, WSU-DLCL2 e OCI-LY1 ma non nelle cellule SU-DHL6 (Figura 2A-D), che era coerente con i risultati convenzionali della colorazione SA-β-gal. Tuttavia, la percentuale della popolazione senescente C12FDG+EdU-γH2AX+ era significativamente inferiore rispetto al metodo convenzionale di colorazione SA-β-gal (Figura 2 e Figura supplementare S2).
Inoltre, l'analisi della citometria a flusso di imaging ha mostrato una diversa inducibilità della senescenza tra diverse linee cellulari DLBCL, che non era chiaramente distinta dalla colorazione SA-β-gal convenzionale. La percentuale di cellule OCI-LY1 senescenti C12FDG+EdU-γH2AX+ (cioè 43,2% e 31,9% con MAF e DN, rispettivamente), era significativamente inferiore a quella di KARPAS422 (62,2% e 73,8% con MAF e DN, rispettivamente) e WSU-DLCL2 (60% e 58,1% con MAF e DN, rispettivamente) (Figura 2). È importante sottolineare che l'analisi basata sull'imaging ha presentato un numero significativamente più elevato di focolai γH2AX in KARPAS422, WSU-DLCL2 e OCI-LY1, ma non nelle cellule SU-DHL6 (Figura 3A, B).
Figura 1: Interfaccia software operativa e configurazione dello strumento. (A) Interfaccia software del citometro a flusso per immagini. Il pannello immagine live-cell (in alto a sinistra) contiene immagini live-cell di tutti i 12 canali immagine e strumenti di regolazione dell'immagine (ad esempio, zoom, selezione della popolazione cellulare, cambiamento di colore, maschera e regolazione delle proprietà dell'immagine). L'area di analisi della citometria a flusso (in basso a sinistra) contiene una barra degli strumenti per l'analisi della citometria a flusso, come il grafico dell'istogramma, il grafico a dispersione, il gating di varie regioni, il layout e le statistiche sulla popolazione. Il pannello di controllo (a destra) contiene menu per l'acquisizione e il salvataggio dei dati, l'impostazione dell'illuminazione, l'ingrandimento, il controllo della velocità fluidica, la messa a fuoco e la centratura. (B) Selezione della popolazione monocellulare. (C) Selezione della popolazione cellulare focalizzata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Visualizzazione e quantificazione di cellule senescenti a livello di singola cellula. Immagini rappresentative (pannello di sinistra) e analisi citometrica a flusso di cellule senescenti C12FDG+EdU-γH2AX+ (pannello destro) di (A) KARPAS422, (B) WSU-DLCL2, (C) OCI-LY1 e (D) SU-DHL6 trattate con 5 μg/mL MAF o 20 ng/mL DN per 5 giorni e colorate per fSA-β-gal, EdU e γH2AX. Le cellule trattate con DMSO sono state utilizzate come controllo. Abbreviazioni: C12FDG = 5-dodecanoylaminofluorescein-di-β-Dgalactopyranoside; EdU = 5-etinil-2′-deossiuridina; γH2AX = forma fosforilata dell'istone H2AX; DMSO = dimetilsolfossido; MAF = mafosfamide; DN = daunorubicina; fSA-β-gal = β-galattosidasi associata a senescenza a base di fluorescenza. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Quantificazione basata sull'imaging di focolai nucleari di γH2AX in cellule senescenti. (A) Immagini rappresentative di focolai di γH2AX in cellule DLBCL (vedere il testo della Figura 2 per i dettagli sul trattamento e sulla colorazione). (B) Frequenza (a sinistra) e quantificazione (a destra) dei focolai di γH2AX nelle cellule DLBCL. Abbreviazioni: γH2AX = forma fosforilata dell'istone H2AX; DMSO = dimetilsolfossido; MAF = mafosfamide; DN = daunorubicina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Soluzione | Commenti | |
| Soluzione EdU da 10 mM in DMSO | Conservare a -20 °C. | |
| Soluzione 20 mM C12FDG in DMSO | Conservare a -20 °C. | |
| 100 mM di soluzione di clorochina in acqua deionizzata | Conservare a -20 °C. | |
| 100 mM di soluzione di PETG in acqua deionizzata | Conservare a -20 °C. | |
| Soluzione di fissazione: 4% PFA (paraformaldeide) in PBS | Preparata; ATTENZIONE: il PFA è dannoso. Utilizzare con le opportune precauzioni. | |
| Tampone di permeabilizzazione: 1% saponina (p/v), 3% BSA (p/v) in PBS, preparato al momento. | Preparata | |
| Soluzione di incubazione anticorpale: 0,1% saponina (p/v), 3% BSA (p/v) in PBS | Preparata | |
| Soluzione di lavaggio: 0,1% di saponina (p/v), 0,5% di BSA (p/v) in PBS | Preparata | |
| Cocktail di rilevamento EdU: Diluito CuSO4 (100 mM) a 1:50, soluzione di azide blu pacifico a 1:200 e additivo tampone di reazione (200 mg/mL) a 1:100 in PBS | Preparata | |
Tabella 1: Soluzioni per la colorazione.
Figura supplementare S1: Matrice di compensazione di EdU-pacific blue, C12FDG-Fluorescein e AF647-γH2AX. Abbreviazioni: C12FDG = 5-dodecanoylaminofluorescein-di-β-Dgalactopyranoside; EdU = 5-etinil-2′-deossiuridina; γH2AX = forma fosforilata dell'istone H2AX; AF647 = Alexa Fluor 647. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S2: Senescenza indotta dalla terapia di linee cellulari DLBCL. (A) Colorazione SA-β-gal convenzionale (pannello di sinistra) e quantificazione (pannello di destra) delle linee cellulari DLBCL indicate trattate con 5 μg/mL MAF o 20 ng/mL DN. Barre di scala = 50 μm. (B) Percentuale di morte cellulare analizzata mediante citometria a flusso (pannello sinistro) e quantificazione (pannello destro) di linee cellulari DLBCL come in A. Le cellule sono state macchiate di blu colorante fantasma-pacifico a temperatura ambiente per 15 minuti. Abbreviazioni: DMSO = dimetilsolfossido; MAF = mafosfamide; DN = daunorubicina; SA-β-gal = β-galattosidasi associata alla senescenza. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S3: Immagini rappresentative e analisi citometrica a flusso. (A) Immagini rappresentative e analisi citometrica a flusso di cellule senescenti C12FDG+EdU-Ki67+ (B) di cellule KARPAS422 e WSU-DLCL2 trattate con MAF per 5 giorni e colorate per fSA-β-gal, EdU e Ki67. Le cellule trattate con DMSO sono state utilizzate come controllo. Abbreviazioni: C12FDG = 5-dodecanoylaminofluorescein-di-β-Dgalactopyranoside; EdU = 5-etinil-2′-deossiuridina; DMSO = dimetilsolfossido; MAF = mafosfamide; DN = daunorubicina; fSA-β-gal = β-galattosidasi associata a senescenza a base di fluorescenza. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Questo metodo ha esaminato la capacità di ingresso in senescenza di quattro diverse linee cellulari DLBCL durante il trattamento chemioterapico, con imaging a campo luminoso e quantificazione basata sulla citometria a flusso. A livello di singola cellula, abbiamo rilevato con successo le principali popolazioni senescenti C12FDG + EdU-Ki67 + nelle cellule TRATTATE KARPAS422 e WSU-DLCL2 e, in misura minore, nelle cellule OCI-LY1, mentre la linea cellulare SU-DHL6 era resistente al trattamento. La differenza nella capacità di ingresso in senescenza tra le linee cellulari può essere spiegata dai loro distinti difetti genomici16,17. Tuttavia, la densità di coltura cellulare inappropriata o la concentrazione di farmaci possono anche influenzare l'inducibilità della senescenza. Le diluizioni seriali della densità cellulare e della concentrazione del farmaco devono essere accuratamente selezionate per un esame più completo. In particolare, questo metodo era abbastanza sensibile da rilevare con precisione la popolazione senescente presente in natura nelle cellule DLBCL senza ulteriore stimolazione genotossica (C12FDG + EdU-Ki67 + gruppo trattato con DMSO nella Figura 3).
Il livello di attività della β-galattosidasi e il ritmo della sintesi del DNA variano significativamente tra i diversi tipi di cellule. Il tempo di incubazione dichiarato (cioè 3 ore per EdU e 1 ora per C12FDG) è generalmente sufficiente per discriminare la colorazione positiva e negativa in vitro. Tuttavia, in circostanze speciali (ad esempio, cellule a crescita lenta o cellule con attività estremamente elevata della β-galattosidasi), potrebbe essere necessario prolungare l'etichettatura EdU o abbreviare la colorazione C12FDG per una migliore discriminazione, rispettivamente. Si consiglia di eseguire un esperimento pilota con un tempo di incubazione seriale per ottimizzare le condizioni sperimentali (ad esempio, aumento di 30 minuti o diminuzione di 15 minuti per EdU o C12FDG, rispettivamente). Per distinguere meglio le differenze nella fSA-β-gal tra le cellule proliferanti e le loro controparti senescenti, si raccomanda la preincubazione con clorochina o bafilomicina A1 per abbassare l'attività lisosomiale basale inducendo alcalinizzazione lisosomiale18,19. Per le cellule con attività lisosomiale relativamente bassa, la fase di preincubazione può essere omessa.
La struttura intatta della membrana cellulare è essenziale per il rilevamento fSA-β-gal. In questo metodo, abbiamo usato EdU invece di BrdU (5-bromo-2'-deossiuridina) per misurare la sintesi del DNA. Rispetto all'incorporazione di BrdU, EdU ha bisogno di una condizione di colorazione relativamente lieve, che preserva la struttura intatta della membrana e consente la co-colorazione con fSA-β-gal. In particolare, il rilevamento mediato da anticorpi di proteine intracellulari o nucleari (ad esempio, γH2AX) qui descritte richiede anche la permeabilizzazione della membrana cellulare per consentire l'ingresso di anticorpi. Qui, la saponina è stata scambiata con il detergente forte Triton X-100 per evitare la tempra del segnale fSA-β-gal.
Il trattamento chemioterapico non solo innesca la senescenza, ma anche la morte cellulare nelle cellule DLBCL. Le cellule morte possono avere un impatto non trascurabile quando si quantifica la popolazione di senescenza in quanto possono causare falsi positivi o falsi negativi durante la colorazione. Sebbene la maggior parte dei detriti cellulari e dei corpi cellulari morti di piccole dimensioni saranno esclusi durante più fasi di lavaggio e centrifugazione, la restante popolazione di cellule morte può ancora avere un'influenza non trascurabile. Si suggerisce di ottimizzare la concentrazione del farmaco per evitare la morte cellulare drastica. Inoltre, la colorazione della vitalità cellulare (ad esempio, colorante fantasma) può essere impiegata per facilitare la discriminazione della popolazione di cellule morte e quantificare la popolazione di senescenza in modo più rigoroso.
L'avanzato sistema di citometria a flusso di imaging utilizzato in questo metodo è un citometro a flusso di imaging multicanale, che consente di quantificare le misurazioni basate sulla citometria a flusso e di ispezionare immagini multicolore di singole cellule in parallelo. Fornisce una soluzione quantitativa rapida, efficiente e accurata per il rilevamento della senescenza e, nel frattempo, genera immagini multicolore con risoluzione a cella singola con informazioni spaziali di più marcatori. Tuttavia, alcune limitazioni persistono. Ad esempio, la risoluzione dell'immagine è limitata rispetto al microscopio di fascia alta, il che impedisce un'analisi completa della localizzazione subcellulare quando si tracciano proteine situate in organelli più piccoli diversi dal nucleo. Rispetto al sofisticato software operativo e di analisi di un citometro a flusso standard, è meno conveniente e meno efficiente impostare o modificare le strategie di gating della popolazione. Anche la quantificazione e l'analisi statistica sono più complicate.
La colorazione fSA-β-gal presenta vantaggi significativi rispetto alla SA-β-gal convenzionale per una colorazione rapida e una quantificazione imparziale e ha il potenziale per l'efficace classificazione delle cellule senescenti. Questa tecnica è stata applicata con successo allo screening delle cellule senescenti che rientrano nel ciclo di divisione cellulare 3,18,19,20. In questo metodo, abbiamo fatto un ulteriore passo avanti per combinare fSA-β-gal con EdU e γH2AX per identificare le cellule senescenti in modo più accurato e affidabile. In particolare, sebbene fSA-β-gal, EdU e γH2AX siano stati scelti come marcatori associati alla senescenza in questo metodo, altri marcatori di senescenza affidabili possono essere facilmente adattati per sostituire o aggiungere ai tre marcatori. A causa dell'elevato interesse per la senescenza nel mondo accademico, sono stati identificati molti marcatori affidabili associati alla senescenza, come l'elevata produzione di specie reattive dell'ossigeno citoplasmatico (ROS), i fattori SASP secreti, il Ki67 sottoregolato, la perdita della proteina lamina B1 dell'involucro nucleare e l'aumento del marcatore eterocromatina H3K9me321,22. La Figura supplementare S3 ha mostrato il successo del rilevamento di popolazioni senescenti C12FDG + EdU-Ki67- nelle cellule TIS KARPAS422 e WSU-DLCL2.
Inoltre, ci sono molti marcatori di superficie cellulare di senescenza disponibili per essere testati utilizzando questo metodo, come ICAM-1, NOTCH1, NOTCH3, DDP4, CD36 e uPAR. Il rilevamento dei marcatori di superficie cellulare richiede solo un breve tempo di incubazione degli anticorpi senza fissazione e permeabilizzazione cellulare, che ridurrà la procedura di colorazione in un flusso di lavoro di 6 ore in combinazione con fSA-β-gal ed EdU, o anche in un esperimento di 2 ore in combinazione con fSA-β-gal e, cosa più importante, consente l'imaging di cellule vive. Il metodo modificato potrebbe potenzialmente servire come approccio rapido, affidabile e fattibile in clinica per identificare le cellule della senescenza in vivo, non solo per la valutazione diagnostica e prognostica, ma anche per supportare ulteriori interventi senolitici.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione a Yong Yu dell'Università Johannes Kepler di Linz (BERM16108001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody | Biolegend | 613407 | |
| Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647) | Biolegend | 350509 | |
| C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside) | Fisher Scientific | 11590276 | |
| Chloroquin -diphosphat | Sigma aldrich | C6628 | |
| Cleanser (Coulter Clenz) | Beckman Coulter | 8546929 | |
| Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit | Thermo Scientific | C10418 | |
| Daunorubicin | Medchemexpress | HY-13062A | |
| Debubbler (70% Isopropanol) | Millipore | 1.3704 | |
| Image Analysis software (Amnis IDEAS 6.3) | Luminex | CN-SW69-12 | |
| Instrument and imaging software (Amnis ImageStreamX Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software) | Luminex | 100220 | |
| KARPAS | DSMZ | ACC 31 | |
| mafosfamide cyclohexylamine | Niomech | D-17272 | |
| OCI-LY1 | DSMZ | ACC 722 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 11473704 | |
| PETG (2-Phenylethyl-β-D-thiogalactosid) | Sigma aldrich | P4902 | |
| saponin | Sigma aldrich | 47036 | |
| Sheath | Millipore | BSS-1006-B | |
| SpeedBead Kit for ImageStream | Luminex | 400041 | |
| Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite) | VWR | JT9416-1 | |
| SU-DHL6 | DSMZ | ACC 572 | |
| WSU-DLCL2 | DSMZ | ACC 575 |
References
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