Qui presentiamo un metodo basato sulla citometria a flusso per la visualizzazione e la quantificazione di più marcatori associati alla senescenza in singole cellule.
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Articolo metodologico
Imaging simultaneo e rilevamento basato sulla citometria a flusso di marcatori di senescenza fluorescenti multipli in cellule tumorali senescenti indotte dalla terapia
In questo articolo
Sommario
Abstract
I farmaci chemioterapici possono indurre danni irreparabili al DNA nelle cellule tumorali, portando ad apoptosi o senescenza prematura. A differenza della morte cellulare apoptotica, la senescenza è un meccanismo fondamentalmente diverso che limita la propagazione delle cellule tumorali. Decenni di studi scientifici hanno rivelato i complessi effetti patologici delle cellule tumorali senescenti nei tumori e nei microambienti che modulano le cellule tumorali e le cellule stromali. Nuove prove suggeriscono che la senescenza è un potente fattore prognostico durante il trattamento del cancro, e quindi è essenziale un rilevamento rapido e accurato delle cellule senescenti nei campioni di cancro. Questo documento presenta un metodo per visualizzare e rilevare la senescenza indotta dalla terapia (TIS) nelle cellule tumorali. Le linee cellulari diffuse di linfoma a grandi cellule B (DLBCL) sono state trattate con mafosfamide (MAF) o daunorubicina (DN) ed esaminate per il marcatore di senescenza, la β-galattosidasi associata alla senescenza (SA-β-gal), il marcatore di sintesi del DNA 5-etinil-2′-deossiuridina (EdU) e il marcatore di danno al DNA gamma-H2AX (γH2AX). L'imaging del citometro a flusso può aiutare a generare immagini a singola cellula ad alta risoluzione in un breve periodo di tempo per visualizzare e quantificare simultaneamente i tre marcatori nelle cellule tumorali.
Introduzione
Una varietà di stimoli può innescare la senescenza cellulare, facendo sì che le cellule entrino in uno stato di arresto stabile del ciclo cellulare. Questi stimoli includono cambiamenti intrinseci di segnalazione o stress estrinseci. I segnali intrinseci includono l'accorciamento progressivo dei telomeri, i cambiamenti nella struttura dei telomeri, la modificazione epigenetica, i disturbi della proteostasi, la disfunzione mitocondriale e l'attivazione degli oncogeni. Gli stress estrinseci includono segnali infiammatori e / o di danno tissutale, radiazioni o trattamenti chimici e privazione nutrizionale 1,2,3,4.
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Protocollo
1. Linee cellulari DLBCL con trattamento con mafosfamide o daunorubicina per indurre la senescenza cellulare
NOTA: Il protocollo funziona anche per le cellule tumorali aderenti. A seconda delle dimensioni della cellula, il seme 1-2 × 105 cellule in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e incubare la piastra in un incubatore al 5% di CO2, 37 °C durante la notte prima del trattamento. I passaggi del protocollo sono gli stessi delle celle di sospensione, ma con due eccezioni. In primo luogo, le cellule devono essere tripsinate dalla piastra dopo il passaggio 3.4. In secondo luogo, le fasi di lavaggio veng....
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Risultati
Una matrice di compensazione è stata generata utilizzando un software di analisi delle immagini caricando i dati registrati dei campioni di controllo a colore singolo. Come mostrato nella Figura supplementare S1, è stata rilevata una ricaduta della luce non trascurabile (valore del coefficiente ≥ 0,1) da EdU a C12FDG con valore del coefficiente di diafonia 0,248, mentre la diafonia tra gli altri canali non era significativa. Quattro diverse linee cellulari DLBCL sono state trattate con 5 μg/mL.......
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Discussione
Questo metodo ha esaminato la capacità di ingresso in senescenza di quattro diverse linee cellulari DLBCL durante il trattamento chemioterapico, con imaging a campo luminoso e quantificazione basata sulla citometria a flusso. A livello di singola cellula, abbiamo rilevato con successo le principali popolazioni senescenti C12FDG + EdU-Ki67 + nelle cellule TRATTATE KARPAS422 e WSU-DLCL2 e, in misura minore, nelle cellule OCI-LY1, mentre la linea cellulare SU-DHL6 era resistente a.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione a Yong Yu dell'Università Johannes Kepler di Linz (BERM16108001).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Anticorpo | Biolegend | 613407 | |
| Anticorpo monoclonale di topo anti-Ki-67 (Alexa Fluor 647) | Biolegend | 350509 | |
| C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside) | Fisher Scientific | 11590276 | |
| Clorochina-difosfato | Sigma aldrich | C6628 | |
| Detergente (Coulter Clenz) | Beckman Coulter | 8546929 | |
| Click-iT EdU Pacific Blue Kit di Citometria a Flusso | Thermo Scientific | C10418 | |
| Daunorubicina | Medchemexpress | HY-13062A | |
| Debubbler (70% Isopropanolo) | Millipore | 1.3704 | |
| Software di analisi delle immagini (Amnis IDEE 6.3) | Strumento Luminex | CN-SW69-12 | |
| e software di imaging (Amnis ImageStreamX Sistema di citometro a flusso con imaging Mk II e software INSPIRE) | Luminex | 100220 | |
| KARPAS | DSMZ | ACC 31 | |
| mafosfamide cicloesilammina | Niomech | D-17272 | |
| OCI-LY1 | DSMZ | ACC 722 | |
| Paraformaldeide | Fisher Scientific | 11473704 | |
| PETG (2-feniletil-β-D-tiogalattosid) | Sigma aldrich | P4902 | |
| saponina | Sigma aldrich | 47036 | |
| guaina | Millipore | BSS-1006-B | |
| Kit SpeedBead per sterilizzatore ImageStream | Luminex | 400041 | |
| (0,4-0,7% ipoclorito) | VWR | JT9416-1 | |
| SU-DHL6 | DSMZ | ACC 572 | |
| WSU-DLCL2 | DSMZ | ACC 575 |
Riferimenti
- Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes and Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).
- Di Micco, R., et al. Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication. Nature. 444 (7119),....
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Ristampe e permessi
