Summary
Hier stellen wir eine auf Durchflusszytometrie basierende Methode zur Visualisierung und Quantifizierung mehrerer seneszenzassoziierter Marker in einzelnen Zellen vor.
Abstract
Chemotherapeutika können irreparable DNA-Schäden in Krebszellen induzieren, was zu Apoptose oder vorzeitiger Seneszenz führt. Im Gegensatz zum apoptotischen Zelltod ist die Seneszenz eine grundlegend andere Maschinerie, die die Ausbreitung von Krebszellen hemmt. Jahrzehntelange wissenschaftliche Studien haben die komplexen pathologischen Wirkungen von seneszenten Krebszellen in Tumoren und Mikroumgebungen aufgedeckt, die Krebszellen und Stromazellen modulieren. Neue Erkenntnisse deuten darauf hin, dass Seneszenz ein starker prognostischer Faktor während der Krebsbehandlung ist, und daher ist ein schneller und genauer Nachweis seneszenter Zellen in Krebsproben unerlässlich. Dieses Papier stellt eine Methode zur Visualisierung und zum Nachweis von therapieinduzierter Seneszenz (TIS) in Krebszellen vor. Diffuse großzellige B-Zell-Lymphom (DLBCL)-Zelllinien wurden mit Mafosfamid (MAF) oder Daunrubicin (DN) behandelt und auf den Seneszenzmarker, Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase (SA-β-gal), den DNA-Synthesemarker 5-Ethynyl-2′-Desoxyuridin (EdU) und den DNA-Schadensmarker gamma-H2AX (γH2AX) untersucht. Die Bildgebung von Durchflusszytometern kann dazu beitragen, in kurzer Zeit hochauflösende Einzelzellbilder zu erzeugen, um die drei Marker in Krebszellen gleichzeitig zu visualisieren und zu quantifizieren.
Introduction
Eine Vielzahl von Reizen kann zelluläre Seneszenz auslösen, wodurch Zellen in einen Zustand stabilen Zellzyklusstillstands eintreten. Zu diesen Reizen gehören intrinsische Signalveränderungen oder extrinsische Spannungen. Intrinsische Signale umfassen progressive Telomerverkürzung, Veränderungen der Telomerstruktur, epigenetische Modifikation, Proteostasestörungen, mitochondriale Dysfunktion und Aktivierung von Onkogenen. Extrinsische Belastungen umfassen entzündliche und/oder Gewebeschädigungssignale, Bestrahlung oder chemische Behandlung und Nahrungsentzug 1,2,3,4. Unter den verschiedenen Arten der Seneszenz sind die am häufigsten beobachteten und gut untersuchten replizierte Seneszenzenz, Onkogen-induzierte Seneszenz (OIS), strahleninduzierte Seneszenz und therapieinduzierte Seneszenz (TIS). OIS ist eine akute zelluläre Reaktion auf genotoxische Schäden, die durch replizierenden Stress verursacht werden, der durch aberrante Onkogenaktivierung erzeugt wird, und kann bis zu einem gewissen Grad das pathologische Fortschreiten von einer präneoplastischen Läsion zu einem ausgewachsenen Tumor verhindern. TIS tritt auf, wenn Tumorzellen durch Chemotherapeutika oder ionisierende Strahlung gestresstwerden 5,6.
Seneszenz gilt aufgrund ihrer hochdynamischen Natur als zweischneidiges Schwert in der Pathologie. Es wurde ursprünglich als ein nützlicher tumorunterdrückender Mechanismus beschrieben, um beschädigte Zellen aus dem zirkulierenden Pool von sich teilenden Zellen zu entfernen, die normale Funktion der Organe zu sichern und das Tumorwachstum zu hemmen 7,8,9. Neue Beweise deuten jedoch auf eine dunkle Seite der Seneszenz hin. Seneszente Zellen sezernieren proinflammatorische Zytokine, bekannt als Seneszenz-assoziierter sekretorischer Phänotyp (SASP), was zu Fibrose und fehlfunktionellen Organen führt und die Tumorentstehung und -progressionfördert 10. Darüber hinaus durchlaufen seneszente Krebszellen eine epigenetische und Genexpressions-Reprogrammierung parallel zur Chromatin-Remodellierung und Aktivierung einer anhaltenden DNA-Schadensantwort (DDR)11,12 und erwerben neue Krebs-Stammzell-Eigenschaften3. Obwohl seneszenzfähige Tumore im Vergleich zu seneszenzunfähigen Tumoren besser auf therapeutische Interventionen ansprechen13, kann die Persistenz seneszenter Zellen zu einer schlechten Langzeitprognose führen, wenn sie nicht effektiv identifiziert und durch senolytische Medikamente eliminiertwerden 5. In jedem Fall ist eine zuverlässige Methode zur Beurteilung der Seneszenz von erheblichem klinischem Interesse, nicht nur für die Prognose der Therapiebehandlung, sondern auch für die Entwicklung neuartiger Strategien für seneszente Zellen.
Unabhängig von verschiedenen Auslösern weisen seneszente Zellen einige gemeinsame Merkmale auf, darunter vergrößerte, abgeflachte, mehrkernige Morphologie mit großen Vakuolen, signifikant expandierte Kerne, Bildung von H3K9me3-reichem Seneszenz-assoziiertem Heterochromatin (SAHF) im Zellkern, persistierende Ansammlung von DNA-Schadensmarker-γH2AX-Herden, aktiviertes p53-p21CIP1 und Rb-p16INK4a Zellzyklus-Regulationsmechanismen, stabiler G1-Zellzyklus-Stillstand, massive Induktion von SASP und erhöhte Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase-Aktivität (SA-β-gal) 14. Da kein einzelner Marker ausreicht, um die Seneszenz zu definieren, wird die enzymatische Färbung für die SA-β-gal-Aktivität, die als Goldstandard für den Seneszenznachweis gilt, normalerweise mit einer immunhistochemischen Färbung für H3K9me3 und Ki67 kombiniert, um TIS15 nachzuweisen. Chemisch-chromogenes SA-β-gal ist jedoch schwer zu quantifizieren. Hier kombinierten wir 5-Dodecanoylaminofluorescein-di-β-D-Galactopyranosid (C 12 FDG) fluoreszenzbasierten SA-β-gal (fSA-β-gal)-Nachweis mit Immunfluoreszenzfärbung für γH2AX und EdU-inkorporierte DNA, um C12FDG+EdU-γH2AX+ seneszente Zellen mit dem fortschrittlichen bildgebenden Durchflusszytometersystem zu identifizieren, das die Geschwindigkeit, Empfindlichkeit und detaillierte Einzelzellbilder mit räumlichen Informationen kombiniert, die durch Durchflusszytometrie und Mikroskopie nicht bereitgestellt werden können. Diese Methode ermöglicht die schnelle Generierung von hochauflösenden Bildern, die die Positionierung und Quantifizierung von Fluoreszenzsignalen innerhalb von Zellen ermöglichen, während die schnelle Analyse mehrerer Proben durch den Bau von Standardpipelines lizenziert wird.
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Protocol
1. DLBCL-Zelllinien mit Mafosfamid oder Daunrubicin Behandlung zur Induktion der zellulären Seneszenz
HINWEIS: Das Protokoll funktioniert auch für adhärente Krebszellen. Je nach Zellgröße 1-2 × 10 5 Zellen in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte einspeisen und die Platte in einem5 % CO2, 37 °C Inkubator über Nacht vor der Behandlung inkubieren. Die Protokollschritte sind die gleichen wie für Suspensionszellen, jedoch mit zwei Ausnahmen. Zuerst müssen Zellen nach Schritt 3.4 von der Platte trypsinisiert werden. Zweitens werden Waschschritte ohne Zentrifugation vor der Trypsinisierung durchgeführt.
- Zählen Sie DLBCL-Zellen und Samen Sie 1 × 10 6 Zellen / ml in 4 ml Medium pro Vertiefung in eine 6-Well-Kulturplatte. Kultivieren Sie DLBCL-Zellen in RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 100 U / ml Penicillin / Streptomycin.
- Geben Sie MAF (5 μg / ml) oder DN (20 ng / ml) in die Zellkultur und schaukeln Sie die Platte vorsichtig zum Mischen.
HINWEIS: MAF und DN sind nicht stabil. Nach dem Auflösen in DMSO sollte die Stammlösung aliquotiert und bei -20 °C gelagert werden. Frost-/Tauzyklen sollten vermieden werden. - Inkubieren Sie die Platte in einem 5% CO2, 37 °C Inkubator für 3 Tage.
- Nach einer 3-tägigen Inkubation sammeln Sie die DLBCL-Zellen in 15 ml sterilen Zentrifugenröhrchen und drehen Sie sie bei 100 × g, 4 °C für 5 min.
- Verwerfen Sie den Überstand, suspendieren Sie die Zellpellets mit 4 ml frischem Medium und fügen Sie die Suspensionen wieder in die 6-Well-Platte hinzu.
- Kultivieren Sie die Zellplatte in einem 5% CO 2, 37 °C Inkubator für weitere2 Tage, bevor Sie zur Analyse ernten.
2. Vorbereiten von Lösungen für die Färbung (Tabelle 1)
3. Färben Sie DLBCL-Zellen mit verschiedenen Seneszenzmarkern
HINWEIS: Zellproben, die mit einzelnen Markern (z. B. Pacific Blue-EdU, C12FDG oder Alexa Fluor 647-γH2AX) angefärbt sind, werden vorbereitet, um eine Kompensationsmatrix zu erzeugen, um den Fluoreszenz-Spillover während der Messung zu korrigieren. Obwohl dieser Schritt sehr nahegelegt wird, könnte er ausgesetzt werden, wenn es eine weglassende Überlappung (Kompensationskoeffizientenwert ≤ 0,1) der Emissionsspektren zwischen verschiedenen Fluorophoren gibt. Anwender müssen jedoch standardisierte Kompensationsschritte festlegen, wenn sie verschiedene Instrumente und Fluoreszenzpaneele verwenden.
- Geben Sie 10 mM EdU-Lösung in einem Verhältnis von 1:1.000 in die DLBCL-Zellkultur, die aus Schritt 1.6 erzeugt wird (die endgültige EdU-Konzentration beträgt 10 μM). Schaukeln Sie die Platte vorsichtig zum Mischen und Inkubieren in einem Inkubator mit 5% CO2, 37 °C für 3 h.
- Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und fügen Sie 100 mM Chloroquinlösung zu einer Endkonzentration von 75 μM hinzu (siehe Diskussion). Die Platte vorsichtig schaukeln, um sie zu mischen und in einem 5% CO2, 37 °C Inkubator für 30 min zu inkubieren.
- Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und fügen Sie 20 mM C 12 FDG-Lösung bei 1: 1.000 zu einer endgültigen C12FDG-Konzentration von 20 μM hinzu. Schaukeln Sie die Platte vorsichtig zum Mischen und Inkubieren in einem 5% CO2, 37 °C Inkubator für 1 h.
- Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und fügen Sie 100 mM 2-Phenylethyl-β-D-thiogalactoside (PETG) -Lösung bei 1:50 hinzu, um die fSA-β-gal-Färbung (endgültige PETG-Konzentration von 2 mM) zu stoppen. Drehen Sie die Platte vorsichtig zum Mischen.
- Übertragen Sie die Zellen auf 15 ml sterile Zentrifugenröhrchen und drehen Sie sie bei 100 × g, 4 °C für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen mit 4 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Wiederholen Sie den PBS-Waschschritt. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellpellets in 500 μL 4% paraformaldehydiger Fixierungslösung.
- Nach 10 min Inkubation bei Raumtemperatur, Zentrifuge bei 250 × g, Raumtemperatur 5 min. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen mit 4 ml PBS.
- Wiederholen Sie den PBS-Waschschritt. Verwerfen Sie den Überstand, suspendieren Sie das Zellpellet in 200 μL Saponinpermeabilisierungspuffer und übertragen Sie die Suspension in ein neues 1,5-ml-Röhrchen. Nach 10 min Inkubation bei Raumtemperatur zentrifugieren bei 250 × g, Raumtemperatur 5 min.
- Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellpellets in 200 μL primärer Antikörperlösung (1:500 γH2AX-Antikörper in Antikörper-Inkubationslösung). Bei 4 °C über Nacht im Dunkeln inkubieren.
- Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 250 × g, 4 °C für 5 min. Verwerfen Sie den Überstand und waschen Sie ihn mit 100 μL Saponin-Waschlösung.
- Wiederholen Sie den Waschschritt zwei weitere Male. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellpellets in einem 500 μL EdU-Detektionscocktail.
- Bei Raumtemperatur 30 min im Dunkeln inkubieren. Zentrifuge bei 250 × g, Raumtemperatur für 5 min. Verwerfen Sie den Überstand und waschen Sie ihn mit 1 ml Saponin-Waschlösung.
- Wiederholen Sie den Waschschritt zweimal. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellpellets in 20-50 μL PBS. Fahren Sie mit Abschnitt 4 für die Probenmessung fort.
4. Bildgebende Seneszenzmarker mit dem bildgebenden Durchflusszytometersystem
- Leeren Sie die Abfallflasche. Überprüfen Sie die Füllstände von Geschwindigkeitsperlen, Sterilisator, Reiniger, Debubbler, Mantel und Spülreagenzien (deionisiertes Wasser), um ausreichend Flüssigkeit zu gewährleisten, bevor Sie das Instrument einschalten (siehe Materialtabelle).
- Schalten Sie das Instrument und die Bildgebungssoftware ein (siehe Softwareschnittstelle in Abbildung 1A).
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Start, um die Fluidik und die Systemkalibrierung zu initialisieren.
HINWEIS: Dieser Vorgang dauert ca. 45 Minuten. - Stellen Sie die Vergrößerung auf 40x ein, stellen Sie die Fluidikgeschwindigkeit auf niedrig ein und schalten Sie die im Experiment benötigten Laser ein. Schalten Sie 405-nm-, 488-nm- und 642-nm-Laser ein, um EdU-pacific blue, C12FDG bzw. Alexa Fluor 647-γH2AX (oder Alexa Fluor 647-Ki67) zu messen. Stellen Sie Ch6 für den Streukanal und Ch1 und Ch9 für das Hellfeld ein.
- Beginnen Sie mit der Probe, von der erwartet wird, dass sie die höchste Fluoreszenz aufweist, um die Intensität der Laser einzustellen. Drehen Sie das Probenröhrchen vorsichtig um, um es zu mischen. Öffnen Sie den Röhrchendeckel und führen Sie das Probenröhrchen in das Dock ein. Klicken Sie auf Laden , um zu beginnen.
- Öffnen Sie ein Streudiagramm und wählen Sie die Features Area_M01 und Aspect Ratio_M01 für die X- bzw. Y-Achse aus. Legen Sie ein Gate oberhalb des Seitenverhältnisses von 0,5 fest, um Dubletten und Zellaggregate unterhalb und auf der rechten Seite sowie die Geschwindigkeitsperlenpopulation auf der linken Seite auszuschließen (Abbildung 1B).
- Öffnen Sie ein Histogrammdiagramm und wählen Sie das Feature-Verlaufs RMS_M01_Ch01 für die X-Achse aus. Wählen Sie die Singulett-Population aus, und legen Sie das Gate so fest, dass es für fokussierte Zellen ausgewählt wird (Abbildung 1C).
HINWEIS: Das Bildgebungssystem verwendet automatisch Geschwindigkeitsperlen, um den Fokus für die Bildgebung anzupassen. Es wird jedoch empfohlen, die richtige Hälfte des Histogramm-Peaks für die am besten fokussierte Population auszuwählen. - Öffnen Sie ein Histogrammdiagramm, und wählen Sie für jeden Farbkanal (Ch2, 7 und 11) die Option "Unformatierte maximale Pixelintensitäten" für die X-Achse aus. Stellen Sie die Laserleistungen ein (d. h. 488 nm, 405 nm und 642 nm Laser für Ch2, 7 bzw. 11), so dass jedes Fluorochrom einen Raw Max Pixel-Wert zwischen 100 und 4.000 hat , um eine Übersättigung zu vermeiden.
HINWEIS: Für dieses Experiment beträgt die Einstellung der Laserleistung 50 mW, 200 mW und 50 mW für Laser 488 nm, 405 nm bzw. 642 nm. - Wählen Sie die fokussierte Grundgesamtheit aus, die aufgezeichnet werden soll, und klicken Sie auf Erwerben , um die DLBCL-Stichproben mit konsistenten Einstellungen zu messen. Wenn Sie Proben für die Messung wechseln, klicken Sie auf Zurück, um das Probenröhrchen wiederherzustellen. Drücken Sie auf Laden , um das Beispiel zu verwerfen .
- Nachdem alle Proben gemessen wurden, schalten Sie den Hellfeld- und Streulaser aus. Messen Sie einfarbige Kontrollproben, um eine Kompensationsmatrix zu erstellen.
- Klicken Sie auf Herunterfahren, um das Imaging-System zu schließen.
- Analysieren Sie die Daten in der Bildanalysesoftware.
- Verwenden Sie das Spot-Wizard-Tool der Bildanalyse-Software, um Kern-γH2AX-Herde in Lebendzellbildern automatisch zu zählen und zu quantifizieren. Wählen Sie zwei Zellpopulationen aus (eine mit hoher und eine mit niedriger Punktzahl), um den Spot-Assistenten für eine weitere automatische Spot-Count-Analyse zu trainieren.
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Representative Results
Eine Kompensationsmatrix wurde mit Hilfe von Bildanalysesoftware generiert, indem aufgezeichnete Daten von einfarbigen Kontrollproben geladen wurden. Wie in Ergänzender Abbildung S1 gezeigt, wurde ein nicht zu vernachlässigender Lichtüberlauf (Koeffizientenwert ≥ 0,1) von EdU auf C12FDG mit einem Übersprechkoeffizientenwert von 0,248 festgestellt, während das Übersprechen unter anderen Kanälen nicht signifikant war. Vier verschiedene DLBCL-Zelllinien wurden mit 5 μg/ml MAF oder 20 ng/mL DN behandelt, um zelluläre Seneszenz zu induzieren, und entweder mit konventioneller SA-β-gal-Färbung oder der bildgebenden Durchflusszytometrie-Methode analysiert.
Mehr als 70% der KARPAS422-, WSU-DLCL2- und OCI-LY1-Zellen traten in den Seneszenzstatus ein, der durch positive SA-β-gal angezeigt wurde, während SU-DHL6 vollständig resistent gegen Seneszenzinduktion durch MAF und DN war (Supplemental Figure S2A). Insbesondere induzierten MAF und DN auch den Zelltod in allen DLBCL-Zellen, wenn auch nicht dramatisch (Supplemental Figure S2B). Unter Verwendung der bildgebenden Flusszytometrie-Methode, Einzelzellbildern und Durchflusszytometrie-basierter Quantifizierung zeigte sich eine erhöhte C12FDG + EdU-γH2AX + seneszente Population in KARPAS422, WSU-DLCL2 und OCI-LY1, jedoch nicht in SU-DHL6-Zellen (Abbildung 2A-D), was mit den herkömmlichen SA-β-gal-Färbeergebnissen übereinstimmte. Der Prozentsatz der C 12 FDG+EdU-γH2AX+ seneszenten Population war jedoch signifikant niedriger als bei der herkömmlichen SA-β-gal-Färbemethode (Abbildung 2 und Supplemental Figure S2).
Darüber hinaus zeigte die bildgebende Flusszytometrie-Analyse eine unterschiedliche Seneszenzinduzierbarkeit zwischen verschiedenen DLBCL-Zelllinien, die durch die herkömmliche SA-β-gal-Färbung nicht klar unterschieden wurde. Der Prozentsatz der C12FDG+EdU-γH2AX+ seneszenten OCI-LY1-Zellen (d. h. 43,2 % bzw. 31,9 % mit MAF bzw. DN) war signifikant niedriger als der von KARPAS422 (62,2 % bzw. 73,8 % mit MAF bzw. DN) und WSU-DLCL2 (60 % bzw. 58,1 % mit MAF bzw. DN) (Abbildung 2). Wichtig ist, dass die bildgebende Analyse eine signifikant höhere Anzahl von γH2AX-Herden in KARPAS422, WSU-DLCL2 und OCI-LY1 zeigte, jedoch nicht in SU-DHL6-Zellen (Abbildung 3A, B).
Abbildung 1: Bediensoftwareschnittstelle und Geräteeinrichtung . (A) Bildgebende Durchflusszytometer-Softwareschnittstelle. Das Live-Zellen-Bildbedienfeld (oben links) enthält Live-Cell-Bilder aller 12 Bildkanäle und Bildanpassungswerkzeuge (z. B. Zoom, Auswahl der Zellenpopulation, Farbänderung, Maske und Anpassung der Bildeigenschaften). Der Bereich Durchflusszytometrieanalyse (unten links) enthält eine Symbolleiste für die Durchflusszytometrieanalyse, z. B. Histogrammdiagramm, Streudiagramm, verschiedene Regionsgating, Layout und Bevölkerungsstatistiken. Das Bedienfeld (rechts) enthält Menüs zur Datenerfassung und -speicherung, Beleuchtungseinstellung, Vergrößerung, Fluidik-Geschwindigkeitsregelung, Fokus und Zentrierung. (B) Auswahl der Einzelzellpopulation. (C) Auswahl der fokussierten Zellpopulation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Visualisierung und Quantifizierung seneszenter Zellen auf Einzelzellebene. Repräsentative Bilder (linkes Bild) und Durchflusszytometrie-Analyse von C12FDG+EdU-γH2AX+ seneszenten Zellen (rechtes Bild) von (A) KARPAS422, (B) WSU-DLCL2, (C) OCI-LY1 und (D) SU-DHL6 Zellen, die 5 Tage lang mit 5 μg/ml MAF oder 20 ng/mL DN behandelt und für fSA-β-gal, EdU und γH2AX gefärbt wurden. DMSO-behandelte Zellen wurden als Kontrolle verwendet. Abkürzungen: C12FDG = 5-Dodecanoylaminofluorescein-di-β-Dgalactopyranosid; EdU = 5-ethynyl-2′-desoxyuridin; γH2AX = phosphorylierte Form von Histon H2AX; DMSO = Dimethylsulfoxid; MAF = Mafosfamid; DN = daunorubicin; fSA-β-gal = fluoreszenzbasierte Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Bildgebungsbasierte Quantifizierung von nukleären γH2AX-Herden in seneszenten Zellen. (A) Repräsentative Bilder von γH2AX-Herden in DLBCL-Zellen (siehe Text von Abbildung 2 für Behandlungs- und Färbedetails). (B) Häufigkeit (links) und Quantifizierung (rechts) der γH2AX-Herdenzahlen in DLBCL-Zellen. Abkürzungen: γH2AX = phosphorylierte Form von Histon H2AX; DMSO = Dimethylsulfoxid; MAF = Mafosfamid; DN = Daunrubicin Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Lösung | Kommentare | |
| 10 mM EdU-Lösung in DMSO | Bei -20 °C lagern. | |
| 20 mM C12FDG-Lösung in DMSO | Bei -20 °C lagern. | |
| 100 mM Chloroquinlösung in entionisiertem Wasser | Bei -20 °C lagern. | |
| 100 mM PETG-Lösung in entionisiertem Wasser | Bei -20 °C lagern. | |
| Fixationslösung: 4% PFA (Paraformaldehyd) in PBS | frisch zubereitet; ACHTUNG: PFA ist schädlich. Verwenden Sie mit geeigneten Vorsichtsmaßnahmen. | |
| Permeabilisierungspuffer: 1% Saponin (w/v), 3% BSA (w/v) in PBS, frisch zubereitet. | frisch zubereitet | |
| Antikörper-Inkubationslösung: 0,1% Saponin (w/v), 3% BSA (w/v) in PBS | frisch zubereitet | |
| Waschlösung: 0,1% Saponin (w/v), 0,5% BSA (w/v) in PBS | frisch zubereitet | |
| EdU-Detektionscocktail: Verdünnen Sie CuSO 4 (100 mM) bei 1:50, Pacific Blue Azid-Lösung bei 1:200 und Reaktionspufferadditiv (200 mg/ml) bei 1:100 in PBS | frisch zubereitet | |
Tabelle 1: Lösungen für die Färbung
Ergänzende Abbildung S1: Kompensationsmatrix aus EdU-Pacific Blue, C12FDG-Fluorescein und AF647-γH2AX. Abkürzungen: C12FDG = 5-Dodecanoylaminofluorescein-di-β-Dgalactopyranosid; EdU = 5-ethynyl-2′-desoxyuridin; γH2AX = phosphorylierte Form von Histon H2AX; AF647 = Alexa Fluor 647. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S2: Therapieinduzierte Seneszenz von DLBCL-Zelllinien. (A) Konventionelle SA-β-gal-Färbung (linkes Panel) und Quantifizierung (rechtes Panel) von angezeigten DLBCL-Zelllinien, die mit 5 μg/ml MAF oder 20 ng/mL DN behandelt wurden. Skalenbalken = 50 μm. (B) Prozentsatz des Zelltods, analysiert durch Durchflusszytometrie (linkes Panel) und Quantifizierung (rechtes Panel) von DLBCL-Zelllinien wie in A. Die Zellen wurden bei Raumtemperatur 15 min lang mit Geisterfarbstoff-Pazifikblau gefärbt. Abkürzungen: DMSO = Dimethylsulfoxid; MAF = Mafosfamid; DN = daunorubicin; SA-β-gal = Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S3: Repräsentative Bilder und Durchflusszytometrie-Analyse. (A) Repräsentative Bilder und Durchflusszytometrie-Analyse von C 12 FDG+EdU-Ki67+ seneszenten Zellen (B) von KARPAS422 und WSU-DLCL2 Zellen, die 5 Tage lang mit MAF behandelt und für fSA-β-gal, EdU und Ki67 gefärbt wurden. DMSO-behandelte Zellen wurden als Kontrolle verwendet. Abkürzungen: C12FDG = 5-Dodecanoylaminofluorescein-di-β-Dgalactopyranosid; EdU = 5-ethynyl-2′-desoxyuridin; DMSO = Dimethylsulfoxid; MAF = Mafosfamid; DN = daunorubicin; fSA-β-gal = fluoreszenzbasierte Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Diese Methode untersuchte die Seneszenzeintrittsfähigkeit von vier verschiedenen DLBCL-Zelllinien unter Chemotherapie mit Hellfeldbildgebung und Durchflusszytometrie-basierter Quantifizierung. Auf Einzelzellebene konnten wir erfolgreich wichtige C 12 FDG+EdU-Ki67+ seneszente Populationen in behandelten KARPAS422- und WSU-DLCL2-Zellen und in geringerem Maße in OCI-LY1-Zellen nachweisen, während die SU-DHL6-Zelllinie resistent gegen die Behandlung war. Der Unterschied in der Seneszenzeintrittsfähigkeit zwischen den Zelllinien kann durch ihre ausgeprägten genomischen Defekte erklärt werden16,17. Eine unangemessene Zellkulturdichte oder Wirkstoffkonzentration kann jedoch auch die Seneszenzinduzierbarkeit beeinflussen. Serielle Verdünnungen der Zelldichte und der Wirkstoffkonzentration sollten für eine umfassendere Untersuchung sorgfältig ausgewählt werden. Insbesondere war diese Methode empfindlich genug, um die natürlich vorkommende seneszente Population in DLBCL-Zellen ohne zusätzliche genotoxische Stimulation genau nachzuweisen (C12FDG + EdU-Ki67 + DMSO-behandelte Gruppe in Abbildung 3).
Das Niveau der β-Galactosidase-Aktivität und der Rhythmus der DNA-Synthese variieren signifikant zwischen verschiedenen Zelltypen. Die angegebene Inkubationszeit (d.h. 3 h für EdU und 1 h für C12FDG) reicht im Allgemeinen aus, um positive und negative Färbungen in vitro zu unterscheiden. Unter besonderen Umständen (z. B. langsam wachsende Zellen oder Zellen mit extrem hoher β-Galactosidase-Aktivität) kann es jedoch erforderlich sein, die EdU-Markierung zu verlängern bzw. dieC12-FDG-Färbungzu verkürzen, um eine bessere Unterscheidung zu erreichen. Es wird empfohlen, einen Pilotversuch mit einer seriellen Inkubationszeit durchzuführen, um die experimentellen Bedingungen zu optimieren (z. B. 30-minütige Erhöhung oder 15-minütige Abnahme für EdU bzw. C12FDG). Um die Unterschiede in fSA-β-gal zwischen proliferierenden Zellen und ihren seneszenten Gegenstücken besser unterscheiden zu können, wird die Präinkubation mit Chloroquin oder Bafilomycin A1 empfohlen, um die basale lysosomale Aktivität durch Induktion einer lysosomalen Alkalisierung zu senken18,19. Bei Zellen mit relativ geringer lysosomaler Aktivität kann der Präinkubationsschritt entfallen.
Eine intakte Zellmembranstruktur ist für die fSA-β-gal-Detektion unerlässlich. Bei dieser Methode verwendeten wir EdU anstelle von BrdU (5-Brom-2'-Desoxyuridin), um die DNA-Synthese zu messen. Im Vergleich zur BrdU-Einarbeitung benötigt EdU einen relativ milden Färbezustand, der die intakte Membranstruktur erhält und eine Co-Färbung mit fSA-β-gal ermöglicht. Insbesondere der hier beschriebene Antikörper-vermittelte Nachweis von intrazellulären oder nukleären Proteinen (z.B. γH2AX) erfordert auch eine Permeabilisierung der Zellmembran, um den Eintritt von Antikörpern zu ermöglichen. Hier wurde Saponin gegen das starke Reinigungsmittel Triton X-100 ausgetauscht, um ein Abschrecken des fSA-β-gal-Signals zu vermeiden.
Die chemotherapeutische Behandlung löst nicht nur die Seneszenz, sondern auch den Zelltod in DLBCL-Zellen aus. Tote Zellen können bei der Quantifizierung der Seneszenzpopulation einen nicht zu vernachlässigenden Einfluss haben, da sie während der Färbung zu falsch positiven oder falsch negativen Ergebnissen führen können. Obwohl die meisten Zelltrümmer und kleinformatigen toten Zellkörper während mehrerer Wasch- und Zentrifugationsschritte ausgeschlossen werden, kann die verbleibende tote Zellpopulation immer noch einen nicht zu vernachlässigenden Einfluss haben. Es wird empfohlen, die Arzneimittelkonzentration zu optimieren, um einen drastischen Zelltod zu vermeiden. Darüber hinaus kann die Färbung der Zelllebensfähigkeit (z. B. Geisterfarbstoff) eingesetzt werden, um die Unterscheidung der toten Zellpopulation zu erleichtern und die Seneszenzpopulation strenger zu quantifizieren.
Das fortschrittliche bildgebende Durchflusszytometriesystem, das bei dieser Methode verwendet wird, ist ein Mehrkanal-Bildgebungs-Durchflusszytometer, das die Quantifizierung von Durchflusszytometrie-basierten Messungen und die parallele Inspektion von Mehrfarbbildern einzelner Zellen ermöglicht. Es bietet eine schnelle, effiziente und genaue quantitative Lösung für die Seneszenzerkennung und generiert in der Zwischenzeit mehrfarbige Bilder mit einer Zellauflösung und räumlichen Informationen mehrerer Marker. Einige Einschränkungen bleiben jedoch bestehen. Zum Beispiel ist die Bildauflösung im Vergleich zum High-End-Mikroskop begrenzt, was eine umfassende Analyse der subzellulären Lokalisation bei der Verfolgung von Proteinen in kleineren Organellen außer dem Zellkern behindert. Im Vergleich zu einer ausgeklügelten Betriebs- und Analysesoftware eines Standard-Durchflusszytometers ist es weniger bequem und weniger effizient, Populations-Gating-Strategien einzurichten oder zu ändern. Quantifizierung und statistische Analyse sind ebenfalls komplizierter.
Die fSA-β-gal-Färbung hat gegenüber herkömmlichen SA-β-gal erhebliche Vorteile für eine schnelle Färbung und unvoreingenommene Quantifizierung und hat das Potenzial für die effektive Klassifizierung seneszenter Zellen. Diese Technik wurde erfolgreich angewendet, um nach seneszenten Zellen zu suchen, die wieder in den Zellteilungszyklus 3,18,19,20 eintreten. Bei dieser Methode sind wir noch einen Schritt weiter gegangen, um fSA-β-gal mit EdU und γH2AX zu kombinieren, um seneszente Zellen genauer und zuverlässiger zu identifizieren. Obwohl fSA-β-gal, EdU und γH2AX bei dieser Methode als seneszenzassoziierte Marker ausgewählt wurden, können andere zuverlässige Seneszenzmarker leicht angepasst werden, um die drei Marker zu ersetzen oder zu ergänzen. Aufgrund des hohen Interesses an Seneszenz in der Wissenschaft wurden viele zuverlässige seneszenzassoziierte Marker identifiziert, wie z.B. eine erhöhte Produktion zytoplasmatischer reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), sezernierte SASP-Faktoren, herunterreguliertes Ki67, Verlust des Kernumschlagproteins Lamin B1 und erhöhter Heterochromatinmarker H3K9me321,22. Ergänzende Abbildung S3 zeigte einen erfolgreichen Nachweis von C 12 FDG + EdU-Ki67- seneszenten Populationen in TIS KARPAS422- und WSU-DLCL2-Zellen.
Darüber hinaus gibt es viele Seneszenzzell-Oberflächenmarker, die mit dieser Methode getestet werden können, wie ICAM-1, NOTCH1, NOTCH3, DDP4, CD36 und uPAR. Der Nachweis von Zelloberflächenmarkern erfordert nur eine kurze Antikörper-Inkubationszeit ohne Zellfixierung und Permeabilisierung, was den Färbevorgang in Kombination mit fSA-β-gal und EdU zu einem 6-Stunden-Workflow oder sogar zu einem 2-Stunden-Experiment in Kombination mit fSA-β-gal verkürzt und vor allem die Bildgebung von lebenden Zellen ermöglicht. Die modifizierte Methode könnte möglicherweise als schneller, zuverlässiger und praktikabler Ansatz in der Klinik dienen, um Seneszenzzellen in vivo zu identifizieren, nicht nur für die diagnostische und prognostische Bewertung, sondern auch für die Unterstützung weiterer senolytischer Interventionen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium an Yong Yu von der Johannes Kepler Universität Linz (BERM16108001) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody | Biolegend | 613407 | |
| Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647) | Biolegend | 350509 | |
| C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside) | Fisher Scientific | 11590276 | |
| Chloroquin -diphosphat | Sigma aldrich | C6628 | |
| Cleanser (Coulter Clenz) | Beckman Coulter | 8546929 | |
| Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit | Thermo Scientific | C10418 | |
| Daunorubicin | Medchemexpress | HY-13062A | |
| Debubbler (70% Isopropanol) | Millipore | 1.3704 | |
| Image Analysis software (Amnis IDEAS 6.3) | Luminex | CN-SW69-12 | |
| Instrument and imaging software (Amnis ImageStreamX Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software) | Luminex | 100220 | |
| KARPAS | DSMZ | ACC 31 | |
| mafosfamide cyclohexylamine | Niomech | D-17272 | |
| OCI-LY1 | DSMZ | ACC 722 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 11473704 | |
| PETG (2-Phenylethyl-β-D-thiogalactosid) | Sigma aldrich | P4902 | |
| saponin | Sigma aldrich | 47036 | |
| Sheath | Millipore | BSS-1006-B | |
| SpeedBead Kit for ImageStream | Luminex | 400041 | |
| Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite) | VWR | JT9416-1 | |
| SU-DHL6 | DSMZ | ACC 572 | |
| WSU-DLCL2 | DSMZ | ACC 575 |
References
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