Summary
Здесь мы представляем метод визуализации и количественной оценки множественных маркеров, связанных со старением, в отдельных клетках.
Abstract
Химиотерапевтические препараты могут вызывать непоправимое повреждение ДНК в раковых клетках, что приводит к апоптозу или преждевременному старению. В отличие от апоптотической гибели клеток, старение является принципиально иным механизмом, сдерживающим размножение раковых клеток. Десятилетия научных исследований выявили сложные патологические эффекты стареющих раковых клеток в опухолях и микросредах, которые модулируют раковые клетки и стромальные клетки. Новые данные свидетельствуют о том, что старение является мощным прогностическим фактором во время лечения рака, и поэтому быстрое и точное обнаружение стареющих клеток в образцах рака имеет важное значение. В данной работе представлен метод визуализации и выявления вызванного терапией старения (ТИ) в раковых клетках. Диффузные крупные В-клеточные линии лимфомы (DLBCL) обрабатывали мафосфамидом (MAF) или даунорубицином (DN) и исследовали на наличие маркера старения, связанного со старением β-галактозидазы (SA-β-gal), маркера синтеза ДНК 5-этинил-2'-дезоксиуридина (EdU) и маркера повреждения ДНК gamma-H2AX (γH2AX). Визуализация проточного цитометра может помочь генерировать одноклеточные изображения с высоким разрешением за короткий период времени для одновременной визуализации и количественной оценки трех маркеров в раковых клетках.
Introduction
Различные стимулы могут вызвать клеточное старение, заставляя клетки входить в состояние остановки стабильного клеточного цикла. Эти стимулы включают внутренние сигнальные изменения или внешние стрессы. Внутренние сигналы включают прогрессирующее укорочение теломер, изменения в структуре теломер, эпигенетическую модификацию, нарушения протеостаза, митохондриальную дисфункцию и активацию онкогенов. Внешние стрессы включают воспалительные сигналы и /или повреждения тканей, радиационную или химическую обработку и лишение питания 1,2,3,4. Среди различных типов старения наиболее часто наблюдаемыми и хорошо изученными являются репликативное старение, онкоген-индуцированное старение (OIS), радиационно-индуцированное старение и старение, вызванное терапией (TIS). ОИС является острым клеточным ответом на генотоксическое повреждение, вызванное репликативным стрессом, вызванным активацией аберрантного онкогена, и может в некоторой степени предотвратить патологическое прогрессирование от пренеопластического поражения до полномасштабной опухоли. ТИС возникает, когда опухолевые клетки подвергаются стрессу химиотерапевтическими препаратами или ионизирующим излучением 5,6.
Старение считается обоюдоострым мечом в патологии из-за его высокодинамичной природы. Первоначально он был описан как полезный опухолеподавляющий механизм для удаления поврежденных клеток из циркулирующего пула делящихся клеток, защищая нормальную функцию органов и ингибируя рост опухоли 7,8,9. Тем не менее, новые данные свидетельствуют о темной стороне старения. Стареющие клетки секретируют провоспалительные цитокины, известные как секреторный фенотип, ассоциированный со старением (SASP), что приводит к фиброзу и сбоям в работе органов и способствует инициации и прогрессированию опухоли10. Кроме того, стареющие раковые клетки подвергаются эпигенетическому и экспрессии генов перепрограммированию параллельно с ремоделированием хроматина и активацией устойчивого ответа на повреждение ДНК (DDR)11,12, вновь приобретая новые свойства раковых стволовых клеток3. Хотя опухоли, способные к старению, лучше реагируют на терапевтическое вмешательство по сравнению с опухолями, неспособными к старению13, персистенция стареющих клеток может привести к плохому долгосрочному прогнозу, если они не будут эффективно идентифицированы и устранены сенолитическими препаратами5. В любом случае, надежный метод оценки старения представляет значительный клинический интерес не только для прогноза терапевтического лечения, но и для разработки новых стратегий, нацеленных на стареющие клетки.
Независимо от различных триггеров, стареющие клетки проявляют некоторые общие черты, включая увеличенную, уплощенную, многоядерную морфологию с большими вакуолями, значительно расширенные ядра, образование H3K9me3-богатого старением-ассоциированного гетерохроматина (SAHF) в ядре, стойкое накопление очагов маркера повреждения ДНК γH2AX, активированные p53-p21CIP1 и Rb-p16INK4a регуляторные механизмы клеточного цикла, стабильная остановка клеточного цикла G1, массивная индукция SASP и повышенная активность β-галактозидазы (SA-β-gal)14, связанная со старением. Поскольку ни один маркер не является достаточным для определения старения, ферментативное окрашивание для активности SA-β-gal, которое считается золотым стандартом для обнаружения старения, обычно сочетается с иммуногистохимическим окрашиванием для H3K9me3 и Ki67 для обнаружения TIS15. Тем не менее, химические хромогенные SA-β-gal трудно поддаются количественной оценке. Здесь мы объединили обнаружение флуоресценции 5-додеканоиламинофлуоресцеин-ди-β-D-галактопиранозида (C12FDG) на основе флуоресценции SA-β-gal (fSA-β-gal) с иммунофлуоресцентным окрашиванием для γH2AX и EdU-интегрированной ДНК для идентификации стареющих клеток C12FDG + EdU-γH2AX + с использованием передовой системы визуализации проточного цитометра, которая сочетает в себе скорость, чувствительность и подробные одноклеточные изображения с пространственной информацией, которая не может быть предоставлена проточной цитометрией и микроскопией. Этот метод позволяет быстро генерировать изображения с высоким разрешением, позволяющие позиционировать и количественно оценивать флуоресцентные сигналы в ячейках, одновременно лицензируя быстрый анализ нескольких образцов путем создания стандартных трубопроводов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Клеточные линии DLBCL с лечением мафосфамидом или даунорубицином для индуцирования клеточного старения
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол также работает для адгезивных раковых клеток. В зависимости от размера клетки, семена 1-2 × 105 клеток в одну лунку из 6-луночной пластины и инкубируют пластину в инкубаторе 5% CO2, 37 °C в течение ночи перед обработкой. Этапы протокола такие же, как и для суспензионных ячеек, но с двумя исключениями. Во-первых, клетки должны быть трипсинизированы с пластины после шага 3.4. Во-вторых, этапы промывки выполняются без центрифугирования перед трипсинизацией.
- Подсчитайте DLBCL клетки и семена 1 × 106 клеток/мл в 4 мл среды на скважину в 6-луночную культуральную пластину. Культивируют клетки DLBCL в среде RPMI-1640, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 100 ЕД/мл пенициллина/стрептомицина.
- Добавьте MAF (5 мкг/мл) или DN (20 нг/мл) в культуру клеток и осторожно качайте пластину для смешивания.
ПРИМЕЧАНИЕ: MAF и DN нестабильны. После растворения в ДМСО исходный раствор следует аликвотировать и хранить при -20 °С. Следует избегать циклов замораживания/оттаивания. - Инкубируют пластину в 5% CO2, 37 °C инкубаторе в течение 3 дней.
- После 3-дневной инкубации собирают клетки DLBCL в 15 мл стерильных центрифужных трубок и вращают при 100 × г, 4 °C в течение 5 мин.
- Выбросьте супернатант, повторно суспендируйте гранулы клеток с 4 мл свежей среды и добавьте суспензии обратно в 6-луночную пластину.
- Культивируйте клеточную пластину в инкубаторе 5% CO2, 37 °C еще за 2 дня до сбора урожая для анализа.
2. Подготовьте растворы для окрашивания (таблица 1)
3. Окрашивание клеток DLBCL различными маркерами старения
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы клеток, окрашенные отдельными маркерами (т.е. тихоокеанским синим EdU, C12FDG или Alexa Fluor 647-γH2AX), подготовлены к созданию компенсационной матрицы для коррекции флуоресцентного побочного эффекта во время измерения. Хотя этот этап настоятельно рекомендуется, он может быть приостановлен при наличии отсутствующего перекрытия (значение коэффициента компенсации ≤ 0,1) спектров излучения между различными флуорофорами. Тем не менее, пользователи должны определить стандартизированные шаги компенсации при использовании различных приборов и флуоресцентных панелей.
- Добавьте 10 мМ раствора EdU в соотношении 1:1000 в культуру клеток DLBCL, полученную на стадии 1,6 (конечная концентрация EdU составляет 10 мкМ). Аккуратно покачайте пластину, чтобы смешать и инкубировать в инкубаторе 5% CO2, 37 °C в течение 3 ч.
- Выньте пластину из инкубатора и добавьте 100 мМ раствора хлорохина до конечной концентрации 75 мкМ (см. обсуждение). Аккуратно покачайте пластину, чтобы смешать и инкубировать в инкубаторе 5% CO2, 37 °C в течение 30 мин.
- Выньте пластину из инкубатора и добавьте 20 мМ раствора C12FDG при 1:1000 до конечной концентрации C12FDG 20 мкМ. Аккуратно размажьте пластину для смешивания и инкубации в 5% CO2, 37 °C инкубаторе в течение 1 ч.
- Выньте пластину из инкубатора и добавьте 100 мМ 2-фенилэтил-β-D-тиогалактозида (ПЭТГ) раствор в 1:50, чтобы остановить окрашивание fSA-β-gal (конечная концентрация PETG 2 мМ). Аккуратно поверните пластину, чтобы перемешать.
- Переложите ячейки в 15 мл стерильных центрифужных трубок и вращайте при 100 × г, 4 °C в течение 5 мин. Выбросьте супернатант и промыть клетки 4 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS).
- Повторите шаг очистки PBS. Откажитесь от супернатанта и повторно суспендируйте клеточные гранулы в 500 мкл 4% раствора для фиксации параформальдегида.
- После 10 мин инкубации при комнатной температуре центрифугу при 250 × г, комнатной температуры в течение 5 мин. Выбросьте супернатант и промывайте ячейки 4 мл PBS.
- Повторите шаг очистки PBS. Выбросьте супернатант, повторно суспендируйте клеточную гранулу в 200 мкл буфера пермеабилизации сапонина и перенесите суспензию в новую трубку объемом 1,5 мл. После 10 мин инкубации при комнатной температуре центрифугу при 250 × г, комнатной температуры в течение 5 мин.
- Откажитесь от супернатанта и повторно суспендируйте клеточные гранулы в 200 мкл раствора первичного антитела (антитело 1:500 γH2AX в инкубационном растворе антител). Инкубировать при 4 °C ночью в темное время суток.
- Центрифугируют пробирки при 250 × г, 4 °С в течение 5 мин. Выбрасываем супернатант и промываем 100 мкл раствора сапонина для промывки.
- Повторите этап стирки еще два раза. Отбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулы клеток в 500 мкл коктейля обнаружения EdU.
- Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте. Центрифуга при 250 × г, комнатной температуры 5 мин. Выбросьте надосадочное вещество и промыть 1 мл промывочного раствора сапонина.
- Повторите этап стирки два раза. Откажитесь от супернатанта и повторно суспендируйте клеточные гранулы в 20-50 мкл PBS. Перейдите к разделу 4 для измерения образцов.
4. Визуализация маркеров старения с помощью системы цитометра потока визуализации
- Опорожните бутылку с жидкостью для отходов. Проверьте уровни скорости шариков, стерилизатора, очистителя, дебублера, оболочки и реагентов для промывки (деионизированной воды), чтобы обеспечить достаточное количество жидкости перед включением инструмента (см. Таблицу материалов).
- Включите прибор и программное обеспечение для обработки изображений (см. программный интерфейс на рисунке 1A).
- Нажмите кнопку «Запуск», чтобы инициализировать флюидику и калибровку системы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура занимает около 45 минут. - Установите увеличение в 40 раз, установите низкую скорость флюидики и включите лазеры, необходимые в эксперименте. Включите лазеры 405 нм, 488 нм и 642 нм для измерения EdU-pacific blue, C12FDG и Alexa Fluor 647-γH2AX (или Alexa Fluor 647-Ki67) соответственно. Установите Ch6 для канала рассеяния, а Ch1 и Ch9 для brightfield.
- Начните с образца, который, как ожидается, будет иметь самую высокую флуоресценцию для настройки интенсивности лазеров. Осторожно переверните пробирку для перемешивания. Откройте крышку трубки и вставьте пробу в док. Нажмите кнопку Загрузить , чтобы начать.
- Откройте точечную диаграмму и выберите объекты, Area_M01 и аспект Ratio_M01 для осей X и Y соответственно. Установите задворку выше соотношения сторон 0,5, чтобы исключить дублеты и агрегаты ячеек ниже и с правой стороны, а также популяцию бусин скорости с левой стороны (рисунок 1B).
- Откройте график гистограммы и выберите объект Градиент RMS_M01_Ch01 для оси X. Выберите синглетную популяцию и установите ворота для выбора сфокусированных ячеек (рисунок 1C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Система визуализации будет автоматически использовать бусины скорости для настройки фокуса для визуализации. Тем не менее, рекомендуется выбрать правильную половину пика гистограммы для наиболее сфокусированной популяции. - Откройте график гистограммы и выберите Необработанные максимальные интенсивности пикселей для оси X для каждого цветового канала (Ch2, 7 и 11). Отрегулируйте мощность лазера (например, лазеры 488 нм, 405 нм и 642 нм для Ch2, 7 и 11 соответственно), чтобы каждый фторхром имел значение Raw Max Pixel от 100 до 4000 , чтобы избежать перенасыщения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого эксперимента мощность лазера составляет 50 мВт, 200 мВт и 50 мВт для лазеров 488 нм, 405 нм и 642 нм соответственно. - Выберите сфокусированную популяцию для записи и нажмите « Получить », чтобы измерить образцы DLBCL с согласованными настройками. При замене образцов для измерения нажмите « Вернуть», чтобы восстановить пробу. Нажмите кнопку Загрузить , чтобы удалить образец.
- После того, как все образцы будут измерены, выключите яркое поле и рассейте лазер. Измерьте одноцветные контрольные образцы для создания компенсационной матрицы.
- Нажмите кнопку Shutdown (Завершение работы ), чтобы закрыть систему обработки изображений.
- Анализируйте данные в программном обеспечении для анализа изображений.
- Используйте инструмент Spot Wizard программного обеспечения для анализа изображений для автоматического подсчета и количественной оценки ядерных очагов γH2AX в изображениях живых клеток. Выберите две популяции клеток (одну с высоким и одну с низким количеством пятен), чтобы обучить мастера спотов дальнейшему автоматическому анализу спотов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Компенсационная матрица была сгенерирована с использованием программного обеспечения для анализа изображений путем загрузки записанных данных одноцветных контрольных образцов. Как показано на дополнительном рисунке S1, при значении коэффициента перекрестных помех 0,248 был обнаружен непренебреживаемый (значение коэффициента ≥ 0,1) световой поток отЭдУ до С12ФДГ, в то время как перекрестные помехи между другими каналами не были значительными. Четыре различные клеточные линии DLBCL обрабатывали 5 мкг/мл MAF или 20 нг/мл DN для индуцирования клеточного старения и анализировали с использованием либо обычного окрашивания SA-β-gal, либо метода визуализации проточной цитометрии.
Более 70% клеток KARPAS422, WSU-DLCL2 и OCI-LY1 вошли в статус старения, о чем свидетельствует положительный SA-β-gal, в то время как SU-DHL6 был полностью устойчив к индукции старения MAF и DN (дополнительный рисунок S2A). Примечательно, что MAF и DN также индуцировали гибель клеток во всех клетках DLBCL, хотя и не резко (дополнительный рисунок S2B). Использование метода визуализации проточной цитометрии, одноклеточных изображений и количественной оценки на основе проточной цитометрии показало увеличение C12FDG + EdU-γH2AX + стареющей популяции в KARPAS422, WSU-DLCL2 и OCI-LY1, но не в клетках SU-DHL6 (рисунок 2A-D), что соответствовало обычным результатам окрашивания SA-β-gal. Однако процент стареющей популяции C12FDG+EdU-γH2AX+ был значительно ниже, чем при обычном методе окрашивания SA-β gal (рисунок 2 и дополнительный рисунок S2).
Кроме того, анализ визуализации проточной цитометрии показал разнообразную индуцируемость старения среди различных клеточных линий DLBCL, которая не была четко различима обычным окрашиванием SA-β-gal. Процент C12FDG+EdU-γH2AX+ стареющих клеток OCI-LY1 (т.е. 43,2% и 31,9% с MAF и DN, соответственно) был значительно ниже, чем у KARPAS422 (62,2% и 73,8% с MAF и DN, соответственно) и WSU-DLCL2 (60% и 58,1% с MAF и DN, соответственно) (рисунок 2). Важно отметить, что анализ на основе визуализации показал значительно более высокое количество очагов γH2AX в KARPAS422, WSU-DLCL2 и OCI-LY1, но не в клетках SU-DHL6 (рисунок 3A, B).
Рисунок 1: Интерфейс операционного программного обеспечения и настройка прибора. (A) Программный интерфейс потокового цитометра для визуализации. Панель изображений live-cell (вверху слева) содержит изображения живых ячеек всех 12 каналов изображения и инструменты настройки изображения (например, масштабирование, выделение популяции ячеек, изменение цвета, маска и настройка свойств изображения). Область анализа проточной цитометрии (внизу слева) содержит панель инструментов для анализа проточной цитометрии, такую как график гистограммы, точечная диаграмма, различные области, макет и статистика населения. Панель управления (справа) содержит меню для сбора и сохранения данных, настройки освещения, увеличения, управления скоростью жидкости, фокусировки и центрирования. (B) Отбор одноклеточной популяции. (C) Отбор сфокусированной клеточной популяции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Визуализация и количественная оценка стареющих клеток на одноклеточном уровне. Репрезентативные изображения (левая панель) и анализ проточной цитометрии клеток C12FDG+EdU-γH2AX+ (правая панель) клеток (A) KARPAS422, (B) WSU-DLCL2, (C) OCI-LY1 и (D) SU-DHL6, обработанных 5 мкг/мл MAF или 20 нг/мл DN в течение 5 дней и окрашенных для fSA-β-gal, EdU и γH2AX. Клетки, обработанные ДМСО, использовались в качестве контроля. Сокращения: C12FDG = 5-додеканоиламинофлуоресцеин-ди-β-Дгалактопиранозид; EdU = 5-этинил-2'-дезоксиуридин; γH2AX = фосфорилированная форма гистона H2AX; ДМСО = диметилсульфоксид; МАФ = мафосфамид; DN = даунорубицин; fSA-β-gal = флуоресцентная β-галактозидаза, связанная со старением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Количественная оценка ядерных очагов γH2AX в стареющих клетках на основе визуализации. (A) Репрезентативные изображения очагов γH2AX в клетках DLBCL (см. текст рисунка 2 для деталей лечения и окрашивания). (B) Частота (слева) и количественная оценка (справа) количества очагов γH2AX в ячейках DLBCL. Сокращения: γH2AX = фосфорилированная форма гистона H2AX; ДМСО = диметилсульфоксид; МАФ = мафосфамид; DN = даунорубицин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Решение | Комментарии | |
| 10 мМ раствор EdU в DMSO | Хранить при -20 °C. | |
| 20 мМ C12FDG раствор в DMSO | Хранить при -20 °C. | |
| 100 мМ раствор хлорохина в деионизированной воде | Хранить при -20 °C. | |
| 100 мМ раствор PETG в деионизированной воде | Хранить при -20 °C. | |
| Раствор для фиксации: 4% PFA (параформальдегид) в PBS | Свежеприготовленный; ВНИМАНИЕ: PFA вреден. Используйте с соответствующими мерами предосторожности. | |
| Буфер пермеабилизации: 1% сапонина (мас./об.), 3% BSA (мас./об.) в PBS, свежеприготовленный. | Свежеприготовленный | |
| Раствор для инкубации антител: 0,1% сапонин (мас./об.), 3% BSA (мас./об.) в PBS | Свежеприготовленный | |
| Моющий раствор: 0,1% сапонин (мас./об.), 0,5% BSA (мас./об.) в PBS | Свежеприготовленный | |
| Коктейль обнаружения EdU: разбавляют CuSO4 (100 мМ) в 1:50, раствор азида тихоокеанского синего цвета в 1:200 и реакционную буферную добавку (200 мг / мл) в 1:100 в PBS | Свежеприготовленный | |
Таблица 1: Растворы для окрашивания.
Дополнительный рисунок S1: Компенсационная матрица EdU-тихоокеанского синего, C12FDG-флуоресцеина и AF647-γH2AX. Сокращения: C12FDG = 5-додеканоиламинофлуоресцеин-ди-β-Дгалактопиранозид; EdU = 5-этинил-2'-дезоксиуридин; γH2AX = фосфорилированная форма гистона H2AX; AF647 = Alexa Fluor 647. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S2: Вызванное терапией старение клеточных линий DLBCL. (A) Обычное окрашивание SA-β-gal (левая панель) и количественная оценка (правая панель) указанных клеточных линий DLBCL, обработанных 5 мкг/мл MAF или 20 нг/мл DN. Шкала баров = 50 мкм. (B) Процент гибели клеток, анализируемый с помощью проточной цитометрии (левая панель) и количественной оценки (правая панель) клеточных линий DLBCL, как в A. Клетки окрашивали призрачным красителем тихоокеанского синего цвета при комнатной температуре в течение 15 мин. Сокращения: ДМСО = диметилсульфоксид; МАФ = мафосфамид; DN = даунорубицин; SA-β-gal = β-галактозидаза, связанная со старением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S3: Репрезентативные изображения и анализ проточной цитометрии. (A) Репрезентативные изображения и анализ проточной цитометрии стареющих клеток C12FDG+EdU-Ki67+ (B) клеток KARPAS422 и WSU-DLCL2, обработанных MAF в течение 5 дней и окрашенных для fSA-β-gal, EdU и Ki67. Клетки, обработанные ДМСО, использовались в качестве контроля. Сокращения: C12FDG = 5-додеканоиламинофлуоресцеин-ди-β-Дгалактопиранозид; EdU = 5-этинил-2'-дезоксиуридин; ДМСО = диметилсульфоксид; МАФ = мафосфамид; DN = даунорубицин; fSA-β-gal = флуоресцентная β-галактозидаза, связанная со старением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот метод исследовал способность к проникновению в старение четырех различных клеточных линий DLBCL при химиотерапии с визуализацией яркого поля и количественной оценкой на основе проточной цитометрии. На одноклеточном уровне мы успешно обнаружили основные C12FDG + EdU-Ki67 + стареющие популяции в обработанных клетках KARPAS422 и WSU-DLCL2 и в меньшей степени в клетках OCI-LY1, в то время как клеточная линия SU-DHL6 была устойчива к лечению. Разница в способности к проникновению в старение между клеточными линиями может объясняться их отчетливыми геномными дефектами16,17. Однако неадекватная плотность клеточной культуры или концентрация лекарственного средства могут также влиять на индуцируемость старения. Серийные разведения клеточной плотности и концентрации препарата следует тщательно подбирать для более комплексного обследования. Примечательно, что этот метод был достаточно чувствительным, чтобы точно обнаружить естественную стареющую популяцию в клетках DLBCL без дополнительной генотоксической стимуляции (группа, обработанная C12FDG + EdU-Ki67 + DMSO на рисунке 3).
Уровень активности β-галактозидазы и ритм синтеза ДНК значительно различаются между различными типами клеток. Заявленное время инкубации (т.е. 3 ч для EdU и 1 ч для C12FDG), как правило, достаточно для различения положительного и отрицательного окрашивания in vitro. Однако в особых обстоятельствах (например, медленно растущие клетки или клетки с чрезвычайно высокой активностью β-галактозидазы) может потребоваться продлить маркировку EdU или сократить окрашивание C12FDG для лучшей дискриминации, соответственно. Предлагается провести пилотный эксперимент с последовательным временем инкубации для оптимизации экспериментальных условий (например, увеличение на 30 мин или снижение на 15 мин для EdU или C12FDG соответственно). Чтобы лучше различить различия в fSA-β-gal между пролиферирующими клетками и их стареющими аналогами, рекомендуется преинкубация хлорохином или бафиломицином A1 для снижения базальной лизосомальной активности путем индуцирования лизосомальной щелочности18,19. Для клеток с относительно низкой лизосомальной активностью стадия преинкубации может быть опущена.
Интактная структура клеточной мембраны имеет важное значение для обнаружения fSA-β-gal. В этом методе мы использовали EdU вместо BrdU (5-бром-2'-дезоксиуридин) для измерения синтеза ДНК. По сравнению с включением BrdU, EdU нуждается в относительно мягких условиях окрашивания, которые сохраняют неповрежденную структуру мембраны и позволяют совместно окрашивать с fSA-β-gal. Примечательно, что опосредованное антителами обнаружение внутриклеточных или ядерных белков (например, γH2AX), описанное здесь, также нуждается в пермеабилизации клеточной мембраны, чтобы обеспечить проникновение антител. Здесь сапонин обменивали на сильное моющее средство Triton X-100, чтобы избежать гашения сигнала fSA-β-gal.
Химиотерапевтическое лечение не только вызывает старение, но и гибель клеток в клетках DLBCL. Мертвые клетки могут оказывать незначительное влияние при количественной оценке популяции старения, поскольку они могут привести к ложноположительным или ложноотрицательным результатам во время окрашивания. Хотя большая часть клеточного мусора и небольших размеров мертвых клеточных тел будет исключена во время нескольких этапов промывки и центрифугирования, оставшаяся популяция мертвых клеток все еще может оказывать незначительное влияние. Рекомендуется оптимизировать концентрацию препарата, чтобы избежать резкой гибели клеток. Кроме того, окрашивание жизнеспособности клеток (например, призрачный краситель) может быть использовано для облегчения дискриминации популяции мертвых клеток и более строгой количественной оценки популяции старения.
Усовершенствованная система визуализации проточной цитометрии, используемая в этом методе, представляет собой многоканальный проточный цитометр визуализации, который позволяет количественно оценивать измерения на основе проточной цитометрии и параллельно проверять многоцветные изображения отдельных клеток. Он обеспечивает быстрое, эффективное и точное количественное решение для обнаружения старения и в то же время генерирует одноклеточные многоцветные изображения с пространственной информацией о нескольких маркерах. Однако некоторые ограничения сохраняются. Например, разрешение изображения ограничено по сравнению с высококлассным микроскопом, что препятствует всестороннему анализу субклеточной локализации при отслеживании белков, расположенных в меньших органеллах, отличных от ядра. По сравнению со сложным операционным и аналитическим программным обеспечением стандартного проточного цитометра, он менее удобен и менее эффективен для настройки или изменения стратегий измерения популяции. Количественная оценка и статистический анализ также являются более сложными.
Окрашивание fSA-β-gal имеет значительные преимущества по сравнению с обычным SA-β-gal для быстрого окрашивания и непредвзятой количественной оценки и имеет потенциал для эффективной классификации стареющих клеток. Этот метод был успешно применен для скрининга стареющих клеток, возвращающихся в цикл деления клеток 3,18,19,20. В этом методе мы сделали еще один шаг вперед, чтобы объединить fSA-β-gal с EdU и γH2AX для более точной и надежной идентификации стареющих клеток. Примечательно, что, хотя fSA-β-gal, EdU и γH2AX были выбраны в качестве маркеров, связанных со старением в этом методе, другие надежные маркеры старения могут быть легко адаптированы для замены или добавления к трем маркерам. Из-за высокого интереса к старению в академических кругах было идентифицировано много надежных маркеров, связанных со старением, таких как повышенная выработка цитоплазматических активных форм кислорода (АФК), секретируемые факторы SASP, пониженный уровень Ki67, потеря белка ядерной оболочки Lamin B1 и повышенный маркер гетерохроматина H3K9me321,22. Дополнительный рисунок S3 показал успешное обнаружение C12FDG+EdU-Ki67-стареющих популяций в клетках TIS KARPAS422 и WSU-DLCL2.
Кроме того, существует множество маркеров поверхности клеток старения, доступных для тестирования с использованием этого метода, таких как ICAM-1, NOTCH1, NOTCH3, DDP4, CD36 и uPAR. Обнаружение маркеров клеточной поверхности требует только короткого времени инкубации антител без фиксации клеток и пермеабилизации, что сократит процедуру окрашивания до 6-часового рабочего процесса в сочетании с fSA-β-gal и EdU или даже в 2-часовом эксперименте в сочетании только с fSA-β-gal, и, что более важно, это позволяет визуализировать живые клетки. Модифицированный метод потенциально может служить быстрым, надежным и осуществимым подходом в клинике к выявлению клеток старения in vivo не только для диагностической и прогностической оценки, но и для поддержки дальнейшего сенолитического вмешательства.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом Юн Ю от Университета Иоганна Кеплера в Линце (BERM16108001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody | Biolegend | 613407 | |
| Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647) | Biolegend | 350509 | |
| C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside) | Fisher Scientific | 11590276 | |
| Chloroquin -diphosphat | Sigma aldrich | C6628 | |
| Cleanser (Coulter Clenz) | Beckman Coulter | 8546929 | |
| Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit | Thermo Scientific | C10418 | |
| Daunorubicin | Medchemexpress | HY-13062A | |
| Debubbler (70% Isopropanol) | Millipore | 1.3704 | |
| Image Analysis software (Amnis IDEAS 6.3) | Luminex | CN-SW69-12 | |
| Instrument and imaging software (Amnis ImageStreamX Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software) | Luminex | 100220 | |
| KARPAS | DSMZ | ACC 31 | |
| mafosfamide cyclohexylamine | Niomech | D-17272 | |
| OCI-LY1 | DSMZ | ACC 722 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 11473704 | |
| PETG (2-Phenylethyl-β-D-thiogalactosid) | Sigma aldrich | P4902 | |
| saponin | Sigma aldrich | 47036 | |
| Sheath | Millipore | BSS-1006-B | |
| SpeedBead Kit for ImageStream | Luminex | 400041 | |
| Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite) | VWR | JT9416-1 | |
| SU-DHL6 | DSMZ | ACC 572 | |
| WSU-DLCL2 | DSMZ | ACC 575 |
References
- Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S.
- Di Micco, R., et al. Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication. Nature. 444 (7119), 638-642 (2006).
- Milanovic, M., et al. Senescence-associated reprogramming promotes cancer stemness. Nature. 553 (7686), 96-100 (2018).
- Passos, J. F., et al. Feedback between p21 and reactive oxygen production is necessary for cell senescence. Molecular Systems Biology. 6 (1), 347 (2010).
- Lee, S., Schmitt, C. A. The dynamic nature of senescence in cancer. Nature Cell Biology. 21 (1), 94-101 (2019).
- Toussaint, O., et al. Stress-induced premature senescence or stress-induced senescence-like phenotype: one in vivo reality, two possible definitions. The Scientific World Journal. 2, 230-247 (2002).
- Collado, M., Blasco, M. A., Serrano, M. Cellular senescence in cancer and aging. Cell. 130 (2), 223-233 (2007).
- Munoz-Espin, D., et al. Programmed cell senescence during mammalian embryonic development. Cell. 155 (5), 1104-1118 (2013).
- Faget, D. V., Ren, Q., Stewart, S. A. Unmasking senescence: context-dependent effects of SASP in cancer. Nature Reviews Cancer. 19 (8), 439-453 (2019).
- Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy. Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).
- Chandra, T., et al. Global reorganization of the nuclear landscape in senescent cells. Cell Rep. 10 (4), 471-483 (2015).
- Rodier, F., et al. Persistent DNA damage signalling triggers senescence-associated inflammatory cytokine secretion. Nature Cell Biology. 11 (8), 973-979 (2009).
- Schleich, K., et al. H3K9me3-mediated epigenetic regulation of senescence in mice predicts outcome of lymphoma patients. Nature Communications. 11 (1), 3651 (2020).
- Di Micco, R., Krizhanovsky, V., Baker, D., d'Adda di Fagagna, F. Cellular senescence in ageing: from mechanisms to therapeutic opportunities. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (2), 75-95 (2021).
- Fan, D. N., Schmitt, C. A. Detecting markers of therapy-induced senescence in cancer cells. Methods in Molecular Biology. 1534, 41-52 (2017).
- Schmitt, C. A., Lowe, S. W. Apoptosis and chemoresistance in transgenic cancer models. Journal of Molecular Medicine. 80 (3), 137-146 (2002).
- Dorr, J. R., et al. Synthetic lethal metabolic targeting of cellular senescence in cancer therapy. Nature. 501 (7467), 421-425 (2013).
- Fan, D. N. Y., Schmitt, C. A.
- Noppe, G., et al. Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts. Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).
- Biran, A., et al. Quantitative identification of senescent cells in aging and disease. Aging Cell. 16 (4), 661-671 (2017).
- Rossi, M., Abdelmohsen, K. The emergence of senescent surface biomarkers as senotherapeutic targets. Cells. 10 (7), 1740 (2021).
- Gonzalez-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Munoz-Espin, D. A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo. The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).
