Здесь мы представляем метод визуализации и количественной оценки множественных маркеров, связанных со старением, в отдельных клетках.
Химиотерапевтические препараты могут вызывать непоправимое повреждение ДНК в раковых клетках, что приводит к апоптозу или преждевременному старению. В отличие от апоптотической гибели клеток, старение является принципиально иным механизмом, сдерживающим размножение раковых клеток. Десятилетия научных исследований выявили сложные патологические эффекты стареющих раковых клеток в опухолях и микросредах, которые модулируют раковые клетки и стромальные клетки. Новые данные свидетельствуют о том, что старение является мощным прогностическим фактором во время лечения рака, и поэтому быстрое и точное обнаружение стареющих клеток в образцах рака имеет важное значение. В данной работе представлен метод визуализации и выявления вызванного терапией старения (ТИ) в раковых клетках. Диффузные крупные В-клеточные линии лимфомы (DLBCL) обрабатывали мафосфамидом (MAF) или даунорубицином (DN) и исследовали на наличие маркера старения, связанного со старением β-галактозидазы (SA-β-gal), маркера синтеза ДНК 5-этинил-2′-дезоксиуридина (EdU) и маркера повреждения ДНК gamma-H2AX (γH2AX). Визуализация проточного цитометра может помочь генерировать одноклеточные изображения с высоким разрешением за короткий период времени для одновременной визуализации и количественной оценки трех маркеров в раковых клетках.
Различные стимулы могут вызвать клеточное старение, заставляя клетки входить в состояние остановки стабильного клеточного цикла. Эти стимулы включают внутренние сигнальные изменения или внешние стрессы. Внутренние сигналы включают прогрессирующее укорочение теломер, изменения в структуре теломер, эпигенетическую модификацию, нарушения протеостаза, митохондриальную дисфункцию и активацию онкогенов. Внешние стрессы включают воспалительные сигналы и /или повреждения тканей, радиационную или химическую обработку и лишение питания 1,2,3,4. Среди различных типов старения наиболее часто наблюдаемыми и хорошо изученными являются репликативное старение, онкоген-индуцированное старение (OIS), радиационно-индуцированное старение и старение, вызванное терапией (TIS). ОИС является острым клеточным ответом на генотоксическое повреждение, вызванное репликативным стрессом, вызванным активацией аберрантного онкогена, и может в некоторой степени предотвратить патологическое прогрессирование от пренеопластического поражения до полномасштабной опухоли. ТИС возникает, когда опухолевые клетки подвергаются стрессу химиотерапевтическими препаратами или ионизирующим излучением 5,6.
Старение считается обоюдоострым мечом в патологии из-за его высокодинамичной природы. Первоначально он был описан как полезный опухолеподавляющий механизм для удаления поврежденных клеток из циркулирующего пула делящихся клеток, защищая нормальную функцию органов и ингибируя рост опухоли 7,8,9. Тем не менее, новые данные свидетельствуют о темной стороне старения. Стареющие клетки секретируют провоспалительные цитокины, известные как секреторный фенотип, ассоциированный со старением (SASP), что приводит к фиброзу и сбоям в работе органов и способствует инициации и прогрессированию опухоли10. Кроме того, стареющие раковые клетки подвергаются эпигенетическому и экспрессии генов перепрограммированию параллельно с ремоделированием хроматина и активацией устойчивого ответа на повреждение ДНК (DDR)11,12, вновь приобретая новые свойства раковых стволовых клеток3. Хотя опухоли, способные к старению, лучше реагируют на терапевтическое вмешательство по сравнению с опухолями, неспособными к старению13, персистенция стареющих клеток может привести к плохому долгосрочному прогнозу, если они не будут эффективно идентифицированы и устранены сенолитическими препаратами5. В любом случае, надежный метод оценки старения представляет значительный клинический интерес не только для прогноза терапевтического лечения, но и для разработки новых стратегий, нацеленных на стареющие клетки.
Независимо от различных триггеров, стареющие клетки проявляют некоторые общие черты, включая увеличенную, уплощенную, многоядерную морфологию с большими вакуолями, значительно расширенные ядра, образование H3K9me3-богатого старением-ассоциированного гетерохроматина (SAHF) в ядре, стойкое накопление очагов маркера повреждения ДНК γH2AX, активированные p53-p21CIP1 и Rb-p16INK4a регуляторные механизмы клеточного цикла, стабильная остановка клеточного цикла G1, массивная индукция SASP и повышенная активность β-галактозидазы (SA-β-gal)14, связанная со старением. Поскольку ни один маркер не является достаточным для определения старения, ферментативное окрашивание для активности SA-β-gal, которое считается золотым стандартом для обнаружения старения, обычно сочетается с иммуногистохимическим окрашиванием для H3K9me3 и Ki67 для обнаружения TIS15. Тем не менее, химические хромогенные SA-β-gal трудно поддаются количественной оценке. Здесь мы объединили обнаружение флуоресценции 5-додеканоиламинофлуоресцеин-ди-β-D-галактопиранозида (C12FDG) на основе флуоресценции SA-β-gal (fSA-β-gal) с иммунофлуоресцентным окрашиванием для γH2AX и EdU-интегрированной ДНК для идентификации стареющих клеток C12FDG + EdU-γH2AX + с использованием передовой системы визуализации проточного цитометра, которая сочетает в себе скорость, чувствительность и подробные одноклеточные изображения с пространственной информацией, которая не может быть предоставлена проточной цитометрией и микроскопией. Этот метод позволяет быстро генерировать изображения с высоким разрешением, позволяющие позиционировать и количественно оценивать флуоресцентные сигналы в ячейках, одновременно лицензируя быстрый анализ нескольких образцов путем создания стандартных трубопроводов.
Этот метод исследовал способность к проникновению в старение четырех различных клеточных линий DLBCL при химиотерапии с визуализацией яркого поля и количественной оценкой на основе проточной цитометрии. На одноклеточном уровне мы успешно обнаружили основные C12FDG + EdU-Ki67</sup…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантом Юн Ю от Университета Иоганна Кеплера в Линце (BERM16108001).
Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody | Biolegend | 613407 | |
Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647) | Biolegend | 350509 | |
C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside) | Fisher Scientific | 11590276 | |
Chloroquin -diphosphat | Sigma aldrich | C6628 | |
Cleanser (Coulter Clenz) | Beckman Coulter | 8546929 | |
Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit | Thermo Scientific | C10418 | |
Daunorubicin | Medchemexpress | HY-13062A | |
Debubbler (70% Isopropanol) | Millipore | 1.3704 | |
Image Analysis software (Amnis IDEAS 6.3) | Luminex | CN-SW69-12 | |
Instrument and imaging software (Amnis ImageStreamX Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software) | Luminex | 100220 | |
KARPAS | DSMZ | ACC 31 | |
mafosfamide cyclohexylamine | Niomech | D-17272 | |
OCI-LY1 | DSMZ | ACC 722 | |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 11473704 | |
PETG (2-Phenylethyl-β-D-thiogalactosid) | Sigma aldrich | P4902 | |
saponin | Sigma aldrich | 47036 | |
Sheath | Millipore | BSS-1006-B | |
SpeedBead Kit for ImageStream | Luminex | 400041 | |
Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite) | VWR | JT9416-1 | |
SU-DHL6 | DSMZ | ACC 572 | |
WSU-DLCL2 | DSMZ | ACC 575 |