Her præsenterer vi en flowcytometribaseret metode til visualisering og kvantificering af flere ældningsrelaterede markører i enkeltceller.
Kemoterapeutiske lægemidler kan fremkalde uoprettelig DNA-skade i kræftceller, hvilket fører til apoptose eller for tidlig ældning. I modsætning til apoptotisk celledød er ældning et fundamentalt anderledes maskineri, der begrænser udbredelsen af kræftceller. Årtiers videnskabelige undersøgelser har afsløret de komplekse patologiske virkninger af senescente kræftceller i tumorer og mikromiljøer, der modulerer kræftceller og stromale celler. Nye beviser tyder på, at ældning er en potent prognostisk faktor under kræftbehandling, og derfor er hurtig og præcis påvisning af senescente celler i kræftprøver afgørende. Dette papir præsenterer en metode til at visualisere og detektere terapiinduceret ældning (TIS) i kræftceller. Diffuse store B-celle lymfom (DLBCL) cellelinjer blev behandlet med mafosfamid (MAF) eller daunorubicin (DN) og undersøgt for ældningsmarkøren, ældningsassocieret β-galactosidase (SA-β-gal), DNA-syntesemarkøren 5-ethynyl-2′-deoxyuridin (EdU) og DNA-skademarkøren gamma-H2AX (γH2AX). Flowcytometerbilleddannelse kan hjælpe med at generere højopløsnings enkeltcellebilleder på kort tid for samtidig at visualisere og kvantificere de tre markører i kræftceller.
En række stimuli kan udløse cellulær ældning, hvilket får celler til at komme ind i en tilstand af stabil cellecyklusstop. Disse stimuli omfatter iboende signalændringer eller ydre belastninger. Iboende signaler omfatter progressiv telomerforkortelse, ændringer i telomerstruktur, epigenetisk modifikation, proteostaseforstyrrelser, mitokondrie dysfunktion og aktivering af onkogener. Ydre belastninger omfatter inflammatoriske og / eller vævsskadesignaler, stråling eller kemisk behandling og ernæringsmæssig deprivation 1,2,3,4. Blandt forskellige typer ældning er de mest almindeligt sete og velundersøgte replikativ ældning, onkogeninduceret ældning (OIS), strålingsinduceret ældning og terapiinduceret ældning (TIS). OIS er et akut cellulært respons på genotoksisk skade forårsaget af replikativ stress genereret af afvigende onkogen aktivering og kan til en vis grad forhindre den patologiske progression fra en præneoplastisk læsion til en fuldblæst tumor. TIS sker, når tumorceller er stresset af kemoterapeutiske lægemidler eller ioniserende stråling 5,6.
Ældning betragtes som et tveægget sværd i patologi på grund af dets meget dynamiske natur. Det blev oprindeligt beskrevet som en gavnlig tumorundertrykkende mekanisme til at fjerne beskadigede celler fra den cirkulerende pool af delende celler, beskytte organernes normale funktion og hæmme tumorvækst 7,8,9. Imidlertid har nye beviser antydet en mørk side af ældning. Senescente celler udskiller proinflammatoriske cytokiner, kendt som ældningsassocieret sekretorisk fænotype (SASP), hvilket fører til fibrose og funktionsfejlsorganer og fremmer tumorinitiering og progression10. Desuden gennemgår senescente kræftceller epigenetisk og genekspressionsomprogrammering parallelt med kromatinombygning og aktivering af et vedvarende DNA-skaderespons (DDR)11,12, der for nylig har erhvervet nye kræft-stamcelleegenskaber3. Selvom ældningskompatible tumorer reagerer bedre på terapeutisk intervention sammenlignet med ældnings-uundgåelige13, kan persistensen af senescente celler føre til en dårlig langsigtet prognose, hvis de ikke effektivt identificeres og elimineres af senolytiske lægemidler5. Uanset hvad er en pålidelig metode til vurdering af ældning af betydelig klinisk interesse, ikke kun for prognosen for terapibehandling, men også for udviklingen af nye strategier rettet mod senescente celler.
Uanset forskellige udløsere udviser senescente celler nogle fælles træk, herunder forstørret, fladt, multinukleeret morfologi med store vakuoler, signifikant udvidede kerner, dannelse af H3K9me3-rig ældningsassocieret heterochromatin (SAHF) i kernen, vedvarende akkumulering af DNA-skademarkør γH2AX-foci, aktiveret p53-p21CIP1 og Rb-p16INK4a cellecyklusregulerende mekanismer, stabil G1-cellecyklusstop, massiv induktion af SASP og forhøjet ældningsassocieret β-galactosidase (SA-β-gal) aktivitet14. Da ingen enkelt markør er tilstrækkelig til at definere ældning, kombineres enzymatisk farvning til SA-β-gal-aktivitet, som betragtes som guldstandarden til ældningsdetektion, normalt med immunohistokemisk farvning til H3K9me3 og Ki67 for at detektere TIS15. Imidlertid er kemisk kromogenbaseret SA-β-gal vanskelig at kvantificere. Her kombinerede vi 5-dodecanoylaminofluorescein-di-β-D-galactopyranosid (C12FDG) fluorescensbaseret SA-β-gal (fSA-β-gal) detektion med immunofluorescerende farvning til γH2AX og EdU-inkorporeret DNA for at identificere C12FDG + EdU-γH2AX + senescent celler ved hjælp af det avancerede billeddannelsesflowcytometersystem, som kombinerer hastighed, følsomhed og detaljerede enkeltcellebilleder med rumlig information, der ikke kan leveres af flowcytometri og mikroskopi. Denne metode muliggør hurtig generering af billeder i høj opløsning, der muliggør positionering og kvantificering af fluorescerende signaler i celler, samtidig med at den muliggør hurtig analyse af flere prøver ved at bygge standardrørledninger.
Denne metode undersøgte ældnings-indtastningsevnen for fire forskellige DLBCL-cellelinjer ved kemoterapibehandling med lysfeltbilleddannelse og flowcytometribaseret kvantificering. På enkeltcelleniveau påviste vi med succes større C12FDG+EdU-Ki67+ senescent populationer i behandlede KARPAS422- og WSU-DLCL2-celler og i mindre grad i OCI-LY1-celler, mens SU-DHL6-cellelinjen var resistent over for behandlingen. Forskellen i ældnings-indtastningsevne blandt cellelinjer kan fo…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af et tilskud til Yong Yu fra Johannes Kepler University Linz (BERM16108001).
Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody | Biolegend | 613407 | |
Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647) | Biolegend | 350509 | |
C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside) | Fisher Scientific | 11590276 | |
Chloroquin -diphosphat | Sigma aldrich | C6628 | |
Cleanser (Coulter Clenz) | Beckman Coulter | 8546929 | |
Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit | Thermo Scientific | C10418 | |
Daunorubicin | Medchemexpress | HY-13062A | |
Debubbler (70% Isopropanol) | Millipore | 1.3704 | |
Image Analysis software (Amnis IDEAS 6.3) | Luminex | CN-SW69-12 | |
Instrument and imaging software (Amnis ImageStreamX Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software) | Luminex | 100220 | |
KARPAS | DSMZ | ACC 31 | |
mafosfamide cyclohexylamine | Niomech | D-17272 | |
OCI-LY1 | DSMZ | ACC 722 | |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 11473704 | |
PETG (2-Phenylethyl-β-D-thiogalactosid) | Sigma aldrich | P4902 | |
saponin | Sigma aldrich | 47036 | |
Sheath | Millipore | BSS-1006-B | |
SpeedBead Kit for ImageStream | Luminex | 400041 | |
Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite) | VWR | JT9416-1 | |
SU-DHL6 | DSMZ | ACC 572 | |
WSU-DLCL2 | DSMZ | ACC 575 |