Summary
Her præsenterer vi en flowcytometribaseret metode til visualisering og kvantificering af flere ældningsrelaterede markører i enkeltceller.
Abstract
Kemoterapeutiske lægemidler kan fremkalde uoprettelig DNA-skade i kræftceller, hvilket fører til apoptose eller for tidlig ældning. I modsætning til apoptotisk celledød er ældning et fundamentalt anderledes maskineri, der begrænser udbredelsen af kræftceller. Årtiers videnskabelige undersøgelser har afsløret de komplekse patologiske virkninger af senescente kræftceller i tumorer og mikromiljøer, der modulerer kræftceller og stromale celler. Nye beviser tyder på, at ældning er en potent prognostisk faktor under kræftbehandling, og derfor er hurtig og præcis påvisning af senescente celler i kræftprøver afgørende. Dette papir præsenterer en metode til at visualisere og detektere terapiinduceret ældning (TIS) i kræftceller. Diffuse store B-celle lymfom (DLBCL) cellelinjer blev behandlet med mafosfamid (MAF) eller daunorubicin (DN) og undersøgt for ældningsmarkøren, ældningsassocieret β-galactosidase (SA-β-gal), DNA-syntesemarkøren 5-ethynyl-2′-deoxyuridin (EdU) og DNA-skademarkøren gamma-H2AX (γH2AX). Flowcytometerbilleddannelse kan hjælpe med at generere højopløsnings enkeltcellebilleder på kort tid for samtidig at visualisere og kvantificere de tre markører i kræftceller.
Introduction
En række stimuli kan udløse cellulær ældning, hvilket får celler til at komme ind i en tilstand af stabil cellecyklusstop. Disse stimuli omfatter iboende signalændringer eller ydre belastninger. Iboende signaler omfatter progressiv telomerforkortelse, ændringer i telomerstruktur, epigenetisk modifikation, proteostaseforstyrrelser, mitokondrie dysfunktion og aktivering af onkogener. Ydre belastninger omfatter inflammatoriske og / eller vævsskadesignaler, stråling eller kemisk behandling og ernæringsmæssig deprivation 1,2,3,4. Blandt forskellige typer ældning er de mest almindeligt sete og velundersøgte replikativ ældning, onkogeninduceret ældning (OIS), strålingsinduceret ældning og terapiinduceret ældning (TIS). OIS er et akut cellulært respons på genotoksisk skade forårsaget af replikativ stress genereret af afvigende onkogen aktivering og kan til en vis grad forhindre den patologiske progression fra en præneoplastisk læsion til en fuldblæst tumor. TIS sker, når tumorceller er stresset af kemoterapeutiske lægemidler eller ioniserende stråling 5,6.
Ældning betragtes som et tveægget sværd i patologi på grund af dets meget dynamiske natur. Det blev oprindeligt beskrevet som en gavnlig tumorundertrykkende mekanisme til at fjerne beskadigede celler fra den cirkulerende pool af delende celler, beskytte organernes normale funktion og hæmme tumorvækst 7,8,9. Imidlertid har nye beviser antydet en mørk side af ældning. Senescente celler udskiller proinflammatoriske cytokiner, kendt som ældningsassocieret sekretorisk fænotype (SASP), hvilket fører til fibrose og funktionsfejlsorganer og fremmer tumorinitiering og progression10. Desuden gennemgår senescente kræftceller epigenetisk og genekspressionsomprogrammering parallelt med kromatinombygning og aktivering af et vedvarende DNA-skaderespons (DDR)11,12, der for nylig har erhvervet nye kræft-stamcelleegenskaber3. Selvom ældningskompatible tumorer reagerer bedre på terapeutisk intervention sammenlignet med ældnings-uundgåelige13, kan persistensen af senescente celler føre til en dårlig langsigtet prognose, hvis de ikke effektivt identificeres og elimineres af senolytiske lægemidler5. Uanset hvad er en pålidelig metode til vurdering af ældning af betydelig klinisk interesse, ikke kun for prognosen for terapibehandling, men også for udviklingen af nye strategier rettet mod senescente celler.
Uanset forskellige udløsere udviser senescente celler nogle fælles træk, herunder forstørret, fladt, multinukleeret morfologi med store vakuoler, signifikant udvidede kerner, dannelse af H3K9me3-rig ældningsassocieret heterochromatin (SAHF) i kernen, vedvarende akkumulering af DNA-skademarkør γH2AX-foci, aktiveret p53-p21CIP1 og Rb-p16INK4a cellecyklusregulerende mekanismer, stabil G1-cellecyklusstop, massiv induktion af SASP og forhøjet ældningsassocieret β-galactosidase (SA-β-gal) aktivitet14. Da ingen enkelt markør er tilstrækkelig til at definere ældning, kombineres enzymatisk farvning til SA-β-gal-aktivitet, som betragtes som guldstandarden til ældningsdetektion, normalt med immunohistokemisk farvning til H3K9me3 og Ki67 for at detektere TIS15. Imidlertid er kemisk kromogenbaseret SA-β-gal vanskelig at kvantificere. Her kombinerede vi 5-dodecanoylaminofluorescein-di-β-D-galactopyranosid (C12FDG) fluorescensbaseret SA-β-gal (fSA-β-gal) detektion med immunofluorescerende farvning til γH2AX og EdU-inkorporeret DNA for at identificere C12FDG + EdU-γH2AX + senescent celler ved hjælp af det avancerede billeddannelsesflowcytometersystem, som kombinerer hastighed, følsomhed og detaljerede enkeltcellebilleder med rumlig information, der ikke kan leveres af flowcytometri og mikroskopi. Denne metode muliggør hurtig generering af billeder i høj opløsning, der muliggør positionering og kvantificering af fluorescerende signaler i celler, samtidig med at den muliggør hurtig analyse af flere prøver ved at bygge standardrørledninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. DLBCL-cellelinjer med mafosfamid- eller daunorubicinbehandling for at inducere cellulær ældning
BEMÆRK: Protokollen virker også for vedhængende kræftceller. Afhængigt af cellestørrelse × frø 1-2 105 celler i en brønd af en 6-brøndplade og inkuberer pladen i en 5% CO2, 37 ° C inkubator natten over før behandling. Protokoltrinnene er de samme som for suspensionsceller, men med to undtagelser. Først skal celler prøves af pladen efter trin 3.4. For det andet udføres vasketrin uden centrifugering før trypsinisering.
- Tæl DLBCL-celler og frø 1 × 106 celler / ml i 4 ml medium pr. Brønd i en 6-brønds kulturplade. Dyrk DLBCL-celler i RPMI-1640-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 100 U / ml penicillin / streptomycin.
- Tilsæt MAF (5 μg /ml) eller DN (20 ng / ml) i cellekulturen, og vip forsigtigt pladen for at blande.
BEMÆRK: MAF og DN er ikke stabile. Efter opløsning i DMSO skal stamopløsningen alikvoteres og opbevares ved -20 °C. Fryse-/optøningscyklusser bør undgås. - Inkuber pladen i en 5% CO2, 37 ° C inkubator i 3 dage.
- Efter en 3 dages inkubation opsamles DLBCL-cellerne i 15 ml sterile centrifugerør og spindes ved 100 × g, 4 °C i 5 min.
- Kassér supernatanten, resuspender cellepillerne med 4 ml frisk medium, og tilsæt suspensionerne tilbage i 6-brøndpladen.
- Cellepladen dyrkes i en 5% CO2, 37 °C inkubator i yderligere 2 dage før høst til analyse.
2. Forbered opløsninger til farvning (tabel 1)
3. Plet DLBCL-celler med forskellige ældningsmarkører
BEMÆRK: Celleprøver farvet med individuelle markører (dvs. pacific blue-EdU, C12FDG eller Alexa Fluor 647-γH2AX) er forberedt til at generere en kompensationsmatrix for at korrigere fluorescensafsmitningen under måling. Selv om dette trin er stærkt foreslået, kan det suspenderes, når der er en overlapning uden sidestykke (kompensationskoefficientværdi ≤ 0,1) af emissionsspektrene mellem forskellige fluoroforer. Brugere skal dog bestemme standardiserede kompensationstrin, når de bruger forskellige instrumenter og fluorescerende paneler.
- Der tilsættes 10 mM EdU-opløsning i et forhold på 1:1.000 i DLBCL-cellekulturen genereret fra trin 1.6 (endelig EdU-koncentration er 10 μM). Vip forsigtigt pladen for at blande og inkubere i en 5% CO2, 37 ° C inkubator i 3 timer.
- Tag pladen ud af inkubatoren og tilsæt 100 mM chloroquinopløsning til en slutkoncentration på 75 μM (se diskussion). Vip forsigtigt pladen for at blande og inkubere i en 5% CO2, 37 ° C inkubator i 30 min.
- Tag pladen ud af inkubatoren og tilsæt 20 mM C12FDG opløsning ved 1: 1.000 til en endelig C12FDG koncentration på 20 μM. Vip forsigtigt pladen for at blande og inkubere i en 5% CO2, 37 ° C inkubator i 1 time.
- Tag pladen ud af inkubatoren og tilsæt 100 mM 2-phenylethyl-β-D-thiogalactosid (PETG) opløsning kl. 1:50 for at stoppe fSA-β-gal farvning (endelig PETG-koncentration på 2 mM). Drej forsigtigt pladen for at blande.
- Cellerne overføres til 15 ml sterile centrifugerør og drejes ved 100 × g, 4 °C i 5 min. Supernatanten kasseres, og cellerne vaskes med 4 ml fosfatbufferet saltvand (PBS).
- Gentag PBS-vasketrinnet. Supernatanten kasseres, og cellepillerne resuspenderes i 500 μL 4% paraformaldehydfikseringsopløsning.
- Efter 10 minutters inkubation ved stuetemperatur centrifugeres ved 250 × g, stuetemperatur i 5 min. Supernatanten kasseres, og cellerne vaskes med 4 ml PBS.
- Gentag PBS-vasketrinnet. Supernatanten kasseres, cellepillen resuspenderes i 200 μL saponinpermeabiliseringsbuffer, og suspensionen overføres til et nyt 1,5 ml rør. Efter 10 minutters inkubation ved stuetemperatur centrifugeres ved 250 × g, stuetemperatur i 5 min.
- Supernatanten kasseres, og cellepillerne resuspenderes i 200 μL primær antistofopløsning (1:500 γH2AX-antistof i antistofinkubationsopløsning). Inkuberes ved 4 °C natten over i mørke.
- Rørene centrifugeres ved 250 × g, 4 °C i 5 min. Kassér supernatanten og vask med 100 μL saponin vaskeopløsning.
- Gentag vasketrinnet yderligere to gange. Supernatanten kasseres, og cellepillerne resuspenderes i 500 μL EdU-detektionscocktail.
- Inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter i mørke. Centrifuge ved 250 × g, stuetemperatur i 5 min. Kassér supernatanten og vask med 1 ml saponin vaskeopløsning.
- Gentag vasketrinnet to gange. Supernatanten kasseres, og cellepillerne genanvendes i 20-50 μL PBS. Fortsæt til punkt 4 for prøvemåling.
4. Billeddannelse af ældningsmarkører ved hjælp af billeddannelsesflowcytometersystemet
- Tøm affaldsvæskeflasken. Kontroller niveauerne af hastighedsperler, sterilisator, rengøringsmiddel, debubbler, kappe og skyllereagenser (deioniseret vand) for at sikre tilstrækkelige væsker, inden instrumentet tændes (se materialetabellen).
- Tænd for instrumentet og billedbehandlingssoftwaren (se softwaregrænsefladen i figur 1A).
- Klik på knappen Startup for at initialisere fluidik og systemkalibrering.
BEMÆRK: Denne procedure tager ca. 45 min. - Indstil forstørrelsen til 40x, indstil fluidics-hastigheden til lav, og tænd for de lasere, der er nødvendige i eksperimentet. Tænd for 405 nm, 488 nm og 642 nm lasere for at måle henholdsvis EdU-pacific blue, C12FDG og Alexa Fluor 647-γH2AX (eller Alexa Fluor 647-Ki67). Indstil Ch6 til scatter kanal, og Ch1 og Ch9 til brightfield.
- Start med prøven, der forventes at have den højeste fluorescens for at indstille lasernes intensitet. Vend forsigtigt prøverøret for at blande. Åbn rørlåget, og indsæt prøverøret på docken. Klik på Indlæs for at starte.
- Åbn et punktdiagram, og vælg funktionerne Area_M01 og Aspect Ratio_M01 for henholdsvis X- og Y-akserne. Indstil en port over billedformatet på 0,5 for at udelukke dubletter og celleaggregater under og på højre side og hastighedsperlepopulationen i venstre side (figur 1B).
- Åbn et histogramdiagram, og vælg funktionen Gradient RMS_M01_Ch01 for X-aksen. Vælg singletpopulationen, og indstil porten til at vælge for fokuserede celler (Figur 1C).
BEMÆRK: Billedbehandlingssystemet bruger automatisk hastighedsperler til at justere fokus til billeddannelse. Det anbefales dog at vælge den rigtige halvdel af histogramtoppen for den bedst fokuserede befolkning. - Åbn et histogramdiagram, og vælg Raw Max Pixel Intensities for X-akse for hver farvekanal (Ch2, 7 og 11). Juster laserkræfterne (dvs. 488 nm, 405 nm og 642 nm lasere for henholdsvis Ch2, 7 og 11), så hver fluorokrom har en Raw Max Pixel-værdi mellem 100 og 4.000 for at undgå overmætning.
BEMÆRK: Til dette eksperiment er lasereffektindstillingen 50 mW, 200 mW og 50 mW for lasere henholdsvis 488 nm, 405 nm og 642 nm. - Vælg den fokuserede population, der skal registreres, og klik på Hent for at måle DLBCL-prøverne med ensartede indstillinger. Når du ændrer prøver til måling, skal du klikke på Retur for at gendanne prøverøret. Tryk på Indlæs for at kassere prøven.
- Når alle prøverne er målt, skal du slukke for brightfield og scatter laser. Mål enkeltfarvekontrolprøver for at generere en kompensationsmatrix.
- Klik på Shutdown for at lukke billedbehandlingssystemet.
- Analyser dataene i billedanalysesoftwaren.
- Brug spotguideværktøjet i billedanalysesoftwaren til automatisk at tælle og kvantificere nukleare γH2AX-foci i levende cellebilleder. Vælg to cellepopulationer (en med høj og en med lavt antal pletter) for at træne spotguiden til yderligere automatisk analyse af antallet af pletter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En kompensationsmatrix blev genereret ved hjælp af billedanalysesoftware ved at indlæse registrerede data fra enkeltfarvekontrolprøver. Som vist i supplerende figur S1 blev der påvist en ikke ubetydelig (koefficientværdi ≥ 0,1) let afsmitning fra EdU til C12FDG med krydstalekoefficientværdien 0,248, mens krydstalen blandt andre kanaler ikke var signifikant. Fire forskellige DLBCL-cellelinjer blev behandlet med 5 μg / ml MAF eller 20 ng / ml DN for at inducere cellulær ældning og analyseret ved hjælp af enten konventionel SA-β-gal farvning eller billeddannelsesflowcytometrimetoden.
Mere end 70% af KARPAS422-, WSU-DLCL2- og OCI-LY1-cellerne fik ældningsstatus, indikeret ved positiv SA-β-gal, mens SU-DHL6 var fuldt resistent over for ældningsinduktion af MAF og DN (supplerende figur S2A). Især inducerede MAF og DN også celledød i alle DLBCL-celler, men ikke dramatisk (supplerende figur S2B). Ved hjælp af billeddannelsesflowcytometrimetoden viste enkeltcellebilleder og flowcytometribaseret kvantificering en øget C12FDG + EdU-γH2AX + senescent population i KARPAS422, WSU-DLCL2 og OCI-LY1, men ikke i SU-DHL6-celler (figur 2A-D), hvilket var i overensstemmelse med de konventionelle SA-β-gal farvningsresultater. Procentdelen af C12FDG+EdU-γH2AX+ senescent populationen var imidlertid signifikant lavere end den konventionelle SA-β-gal farvningsmetode (figur 2 og supplerende figur S2).
Desuden viste billeddannelsesflowcytometrianalyse forskellig ældningsinducerbarhed blandt forskellige DLBCL-cellelinjer, som ikke klart blev kendetegnet ved konventionel SA-β-gal farvning. Procentdelen af C12FDG+EdU-γH2AX+ senescent OCI-LY1-celler (dvs. henholdsvis 43,2 % og 31,9 % med MAF og DN) var signifikant lavere end for KARPAS422 (henholdsvis 62,2 % og 73,8 % med MAF og DN) og WSU-DLCL2 (henholdsvis 60 % og 58,1 % med MAF og DN) (figur 2). Det er vigtigt, at billeddannelsesbaseret analyse præsenterede signifikant højere antal γH2AX-foci i KARPAS422, WSU-DLCL2 og OCI-LY1, men ikke i SU-DHL6-celler (figur 3A, B).
Figur 1: Betjeningssoftwaregrænseflade og instrumentopsætning. (A) Imaging flow-cytometer software interface. Live-celle billedpanelet (øverst til venstre) indeholder live-celle billeder af alle 12 billedkanaler og billedjusteringsværktøjer (f.eks. zoom, valg af cellepopulation, farveændring, maske og justering af billedegenskaber). Flowcytometrianalyseområdet (nederst til venstre) indeholder en værktøjslinje til flowcytometrianalyse, såsom histogramplot, spredningsplot, forskellige regionsgating, layout og befolkningsstatistik. Kontrolpanelet (højre) indeholder menuer til dataindsamling og -lagring, belysningsindstilling, forstørrelse, fluidics hastighedskontrol, fokus og centrering. (B) Udvælgelse af enkeltcellepopulation. (C) Udvælgelse af fokuseret cellepopulation. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Visualisering og kvantificering af senescente celler på enkeltcelleniveau. Repræsentative billeder (venstre panel) og flowcytometrianalyse af C12FDG + EdU-γH2AX + senescentceller (højre panel) af (A) KARPAS422, (B) WSU-DLCL2, (C) OCI-LY1 og (D) SU-DHL6 celler behandlet med 5 μg / ml MAF eller 20 ng / ml DN i 5 dage og farvet til fSA-β-gal, EdU og γH2AX. DMSO-behandlede celler blev anvendt som kontrol. Forkortelser: C12FDG = 5-dodecanoylaminofluorescein-di-β-Dgalactopyranoside; EdU = 5-ethynyl-2′-deoxyuridin; γH2AX = phosphoryleret form af histon H2AX; DMSO = dimethylsulfoxid; MAF = mafosfamid; DN = daunorubicin; fSA-β-gal = fluorescensbaseret ældningsassocieret β-galactosidase. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Billeddannelsesbaseret kvantificering af nukleare γH2AX-foci i senescente celler. (A) Repræsentative billeder af γH2AX-foci i DLBCL-celler (se teksten i figur 2 for behandlings- og farvningsdetaljer). (B) Frekvens (venstre) og kvantificering (højre) af γH2AX-focitællinger i DLBCL-celler. Forkortelser: γH2AX = phosphoryleret form af histon H2AX; DMSO = dimethylsulfoxid; MAF = mafosfamid; DN = daunorubicin. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Opløsning | Kommentarer | |
| 10 mM EdU-løsning i DMSO | Opbevares ved -20 °C. | |
| 20 mM C12FDG-opløsning i DMSO | Opbevares ved -20 °C. | |
| 100 mM klorokinopløsning i deioniseret vand | Opbevares ved -20 °C. | |
| 100 mM PETG-opløsning i deioniseret vand | Opbevares ved -20 °C. | |
| Fikseringsopløsning: 4% PFA (paraformaldehyd) i PBS | Frisklavede; FORSIGTIG: PFA er skadelig. Brug med passende forholdsregler. | |
| Permeabiliseringsbuffer: 1% saponin (w/v), 3% BSA (w/v) i PBS, frisklavet. | Frisklavede | |
| Antistofinkubationsopløsning: 0,1 % saponin (w/v), 3 % BSA (w/v) i PBS | Frisklavede | |
| Vaskeopløsning: 0,1 % saponin (w/v), 0,5 % BSA (w/v) i PBS | Frisklavede | |
| EdU-detektionscocktail: Fortynd CuSO4 (100 mM) ved 1:50, pacific blue azidopløsning ved 1:200 og reaktionsbufferadditiv (200 mg/ml) ved 1:100 i PBS | Frisklavede | |
Tabel 1: Opløsninger til farvning.
Supplerende figur S1: Kompensationsmatrix af EdU-pacific blue, C12FDG-Fluorescein og AF647-γH2AX. Forkortelser: C12FDG = 5-dodecanoylaminofluorescein-di-β-Dgalactopyranoside; EdU = 5-ethynyl-2′-deoxyuridin; γH2AX = phosphoryleret form af histon H2AX; AF647 = Alexa Fluor 647. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S2: Terapiinduceret ældning af DLBCL-cellelinjer. (A) Konventionel SA-β-gal farvning (venstre panel) og kvantificering (højre panel) af angivne DLBCL-cellelinjer behandlet med 5 μg/ml MAF eller 20 ng/ml DN. Skalastænger = 50 μm. (B) Procentdel af celledød analyseret ved flowcytometri (venstre panel) og kvantificering (højre panel) af DLBCL-cellelinjer som i A. Celler blev farvet med spøgelsesfarvestof-pacific blue ved stuetemperatur i 15 minutter. Forkortelser: DMSO = dimethylsulfoxid; MAF = mafosfamid; DN = daunorubicin; SA-β-gal = ældningsassocieret β-galactosidase. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S3: Repræsentative billeder og flowcytometrianalyse. (A) Repræsentative billeder og flowcytometrianalyse af C12FDG + EdU-Ki67 + senescente celler (B) af KARPAS422 og WSU-DLCL2 celler behandlet med MAF i 5 dage og farvet for fSA-β-gal, EdU og Ki67. DMSO-behandlede celler blev anvendt som kontrol. Forkortelser: C12FDG = 5-dodecanoylaminofluorescein-di-β-Dgalactopyranoside; EdU = 5-ethynyl-2′-deoxyuridin; DMSO = dimethylsulfoxid; MAF = mafosfamid; DN = daunorubicin; fSA-β-gal = fluorescensbaseret ældningsassocieret β-galactosidase. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metode undersøgte ældnings-indtastningsevnen for fire forskellige DLBCL-cellelinjer ved kemoterapibehandling med lysfeltbilleddannelse og flowcytometribaseret kvantificering. På enkeltcelleniveau påviste vi med succes større C12FDG+EdU-Ki67+ senescent populationer i behandlede KARPAS422- og WSU-DLCL2-celler og i mindre grad i OCI-LY1-celler, mens SU-DHL6-cellelinjen var resistent over for behandlingen. Forskellen i ældnings-indtastningsevne blandt cellelinjer kan forklares ved deres forskellige genomiske defekter16,17. Imidlertid kan uhensigtsmæssig cellekulturtæthed eller lægemiddelkoncentration også påvirke ældningsinducerbarhed. Serielle fortyndinger af celletæthed og lægemiddelkoncentration bør vælges omhyggeligt til en mere omfattende undersøgelse. Især var denne metode følsom nok til nøjagtigt at detektere den naturligt forekommende senescente population i DLBCL-celler uden yderligere genotoksisk stimulering (C12FDG + EdU-Ki67 + DMSO-behandlet gruppe i figur 3).
Niveauet af β-galactosidaseaktivitet og rytmen af DNA-syntese varierer signifikant mellem forskellige celletyper. Den angivne inkubationstid (dvs. 3 timer for EdU og 1 time for C12FDG) er generelt tilstrækkelig til at diskriminere positiv og negativ farvning in vitro. Under særlige omstændigheder (f.eks. langsomt voksende celler eller celler med ekstremt høj β-galactosidaseaktivitet) kan det imidlertid være nødvendigt at forlænge EdU-mærkning eller forkorte C12FDG-farvning for bedre diskrimination henholdsvis. Det foreslås at udføre et pilotforsøg med en seriel inkubationstid for at optimere eksperimentelle forhold (f.eks. 30 minutters stigning eller 15 minutters fald for henholdsvis EdU eller C12FDG). For bedre at skelne forskellene i fSA-β-gal mellem prolifererende celler og deres senescente modstykker anbefales præinkubation med chloroquin eller bafilomycin A1 at sænke den basale lysosomale aktivitet ved at inducere lysosomal alkalisering18,19. For celler med relativt lav lysosomal aktivitet kan præinkuberingstrinnet udelades.
Intakt cellemembranstruktur er afgørende for fSA-β-gal detektion. I denne metode brugte vi EdU i stedet for BrdU (5-brom-2'-deoxyuridin) til at måle DNA-syntese. Sammenlignet med BrdU-inkorporering har EdU brug for en relativt mild farvningstilstand, som bevarer den intakte membranstruktur og tillader co-farvning med fSA-β-gal. Især antistofmedieret påvisning af intracellulære eller nukleare proteiner (f.eks. γH2AX), der er beskrevet her, har også brug for permeabilisering af cellemembranen for at tillade antistofindtastning. Her blev saponin udskiftet med det stærke vaskemiddel Triton X-100 for at undgå slukning af fSA-β-gal signal.
Kemoterapeutisk behandling udløser ikke kun ældning, men også celledød i DLBCL-celler. Døde celler kan have en ikke-ubetydelig indvirkning ved kvantificering af ældningspopulationen, da de kan resultere i falske positive eller falske negativer under farvning. Selvom det meste af celleaffaldet og små døde cellelegemer vil blive udelukket under flere vaske- og centrifugeringstrin, kan den resterende døde cellepopulation stadig have en ikke-ubetydelig indflydelse. Det foreslås at optimere lægemiddelkoncentrationen for at undgå drastisk celledød. Derudover kan farvning af cellelevedygtighed (f.eks . Spøgelsesfarvestof) anvendes til at lette diskriminerende dødcellepopulation og kvantificere ældningspopulation strengere.
Det avancerede billeddannelsesflowcytometrisystem, der anvendes i denne metode, er et flerkanals billeddannelsesflowcytometer, som gør det muligt at kvantificere flowcytometribaserede målinger og inspicere flerfarvebilleder af enkeltceller parallelt. Det giver en hurtig, effektiv og nøjagtig kvantitativ løsning til ældningsdetektering og genererer i mellemtiden enkeltcelleopløsning, flerfarvebilleder med rumlig information om flere markører. Der er dog stadig visse begrænsninger. For eksempel er billedopløsningen begrænset sammenlignet med high-end mikroskopet, hvilket forhindrer en omfattende analyse af subcellulær lokalisering ved sporing af proteiner placeret i andre mindre organeller end kernen. Sammenlignet med sofistikeret drifts- og analysesoftware af et standard flowcytometer er det mindre praktisk og mindre effektivt at oprette eller ændre population gating strategier. Kvantificering og statistisk analyse er også mere kompliceret.
fSA-β-gal farvning har betydelige fordele i forhold til konventionelle SA-β-gal til hurtig farvning og upartisk kvantificering og har potentialet til effektiv klassificering af senescente celler. Denne teknik er med succes blevet anvendt til at screene for senescente celler, der genindtræder i celledelingscyklussen 3,18,19,20. I denne metode tog vi et skridt videre for at kombinere fSA-β-gal med EdU og γH2AX for at identificere senescente celler mere præcist og pålideligt. Især, selvom fSA-β-gal, EdU og γH2AX blev valgt som ældningsrelaterede markører i denne metode, kan andre pålidelige ældningsmarkører let tilpasses til at erstatte eller tilføje til de tre markører. På grund af den store interesse for ældning i den akademiske verden er der identificeret mange pålidelige ældningsrelaterede markører, såsom forhøjet cytoplasmisk reaktiv iltart (ROS) produktion, udskillede SASP-faktorer, nedreguleret Ki67, tab af nukleart omsluttende protein Lamin B1 og øget heterochromatinmarkør H3K9me321,22. Supplerende figur S3 viste vellykket påvisning af C12FDG + EdU-Ki67- senescent populationer i TIS KARPAS422 og WSU-DLCL2 celler.
Desuden er der mange ældningscelleoverflademarkører tilgængelige til at blive testet ved hjælp af denne metode, såsom ICAM-1, NOTCH1, NOTCH3, DDP4, CD36 og uPAR. Påvisning af celleoverflademarkører kræver kun en kort antistofinkubationstid uden cellefiksering og permeabilitet, hvilket vil forkorte farvningsproceduren til en 6 timers arbejdsgang i kombination med fSA-β-gal og EdU eller endda i et 2 timers eksperiment i kombination med kun fSA-β-gal, og endnu vigtigere tillader det levende cellebilleddannelse. Den modificerede metode kan potentielt tjene som en hurtig, pålidelig og gennemførlig tilgang i klinikken til at identificere ældningsceller in vivo, ikke kun til diagnostisk og prognostisk evaluering, men også til støtte for yderligere senolytisk intervention.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af et tilskud til Yong Yu fra Johannes Kepler University Linz (BERM16108001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody | Biolegend | 613407 | |
| Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647) | Biolegend | 350509 | |
| C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside) | Fisher Scientific | 11590276 | |
| Chloroquin -diphosphat | Sigma aldrich | C6628 | |
| Cleanser (Coulter Clenz) | Beckman Coulter | 8546929 | |
| Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit | Thermo Scientific | C10418 | |
| Daunorubicin | Medchemexpress | HY-13062A | |
| Debubbler (70% Isopropanol) | Millipore | 1.3704 | |
| Image Analysis software (Amnis IDEAS 6.3) | Luminex | CN-SW69-12 | |
| Instrument and imaging software (Amnis ImageStreamX Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software) | Luminex | 100220 | |
| KARPAS | DSMZ | ACC 31 | |
| mafosfamide cyclohexylamine | Niomech | D-17272 | |
| OCI-LY1 | DSMZ | ACC 722 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 11473704 | |
| PETG (2-Phenylethyl-β-D-thiogalactosid) | Sigma aldrich | P4902 | |
| saponin | Sigma aldrich | 47036 | |
| Sheath | Millipore | BSS-1006-B | |
| SpeedBead Kit for ImageStream | Luminex | 400041 | |
| Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite) | VWR | JT9416-1 | |
| SU-DHL6 | DSMZ | ACC 572 | |
| WSU-DLCL2 | DSMZ | ACC 575 |
References
- Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S.
- Di Micco, R., et al. Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication. Nature. 444 (7119), 638-642 (2006).
- Milanovic, M., et al. Senescence-associated reprogramming promotes cancer stemness. Nature. 553 (7686), 96-100 (2018).
- Passos, J. F., et al. Feedback between p21 and reactive oxygen production is necessary for cell senescence. Molecular Systems Biology. 6 (1), 347 (2010).
- Lee, S., Schmitt, C. A. The dynamic nature of senescence in cancer. Nature Cell Biology. 21 (1), 94-101 (2019).
- Toussaint, O., et al. Stress-induced premature senescence or stress-induced senescence-like phenotype: one in vivo reality, two possible definitions. The Scientific World Journal. 2, 230-247 (2002).
- Collado, M., Blasco, M. A., Serrano, M. Cellular senescence in cancer and aging. Cell. 130 (2), 223-233 (2007).
- Munoz-Espin, D., et al. Programmed cell senescence during mammalian embryonic development. Cell. 155 (5), 1104-1118 (2013).
- Faget, D. V., Ren, Q., Stewart, S. A. Unmasking senescence: context-dependent effects of SASP in cancer. Nature Reviews Cancer. 19 (8), 439-453 (2019).
- Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy. Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).
- Chandra, T., et al. Global reorganization of the nuclear landscape in senescent cells. Cell Rep. 10 (4), 471-483 (2015).
- Rodier, F., et al. Persistent DNA damage signalling triggers senescence-associated inflammatory cytokine secretion. Nature Cell Biology. 11 (8), 973-979 (2009).
- Schleich, K., et al. H3K9me3-mediated epigenetic regulation of senescence in mice predicts outcome of lymphoma patients. Nature Communications. 11 (1), 3651 (2020).
- Di Micco, R., Krizhanovsky, V., Baker, D., d'Adda di Fagagna, F. Cellular senescence in ageing: from mechanisms to therapeutic opportunities. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (2), 75-95 (2021).
- Fan, D. N., Schmitt, C. A. Detecting markers of therapy-induced senescence in cancer cells. Methods in Molecular Biology. 1534, 41-52 (2017).
- Schmitt, C. A., Lowe, S. W. Apoptosis and chemoresistance in transgenic cancer models. Journal of Molecular Medicine. 80 (3), 137-146 (2002).
- Dorr, J. R., et al. Synthetic lethal metabolic targeting of cellular senescence in cancer therapy. Nature. 501 (7467), 421-425 (2013).
- Fan, D. N. Y., Schmitt, C. A.
- Noppe, G., et al. Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts. Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).
- Biran, A., et al. Quantitative identification of senescent cells in aging and disease. Aging Cell. 16 (4), 661-671 (2017).
- Rossi, M., Abdelmohsen, K. The emergence of senescent surface biomarkers as senotherapeutic targets. Cells. 10 (7), 1740 (2021).
- Gonzalez-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Munoz-Espin, D. A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo. The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).
