Summary
O protocolo descreve a captação cirúrgica e subsequente descelularização de retalhos suínos vascularizados pela perfusão de detergente dodecil sulfato de sódio através da vasculatura do retalho em um biorreator de perfusão personalizado.
Abstract
Defeitos de tecido mole de grande volume levam a déficits funcionais e podem afetar muito a qualidade de vida do paciente. Embora a reconstrução cirúrgica possa ser realizada usando transferência autóloga de retalho livre ou alotransplante composto vascularizado (VCA), tais métodos também apresentam desvantagens. Questões como morbidade no local do doador e disponibilidade tecidual limitam a transferência autóloga de retalho livre, enquanto a imunossupressão é uma limitação significativa da VCA. Tecidos modificados em cirurgia reconstrutiva utilizando métodos de descelularização/recelularização representam uma possível solução. Os tecidos descelularizados são gerados usando métodos que removem o material celular nativo, preservando a microarquitetura da matriz extracelular subjacente (ECM). Esses andaimes acelulares podem então ser subsequentemente recelularizados com células específicas do receptor.
Este protocolo detalha os métodos de aquisição e descelularização utilizados para alcançar andaimes acelulares em um modelo suíno. Além disso, também fornece uma descrição do projeto e configuração do biorreator de perfusão. Os retalhos incluem o omento suíno, o tensor da fáscia lata e o antebraço radial. A descelularização é realizada via perfusão ex vivo de detergente dodecil sulfato de sódio (SDS) de baixa concentração, seguido de tratamento enzimático DNase e esterilização por ácido peracético em um biorreator de perfusão personalizado.
A descelularização tecidual bem-sucedida é caracterizada por uma aparência branco-opaca de retalhos macroscopicamente. Os retalhos acelulares mostram a ausência de núcleos na coloração histológica e uma redução significativa no conteúdo de DNA. Este protocolo pode ser usado de forma eficiente para gerar andaimes de tecidos moles descelularizados com MEC preservada e microarquitetura vascular. Tais andaimes podem ser utilizados em estudos subsequentes de recelularização e têm potencial para tradução clínica em cirurgia reconstrutiva.
Introduction
A lesão traumática e a remoção do tumor podem levar a defeitos grandes e complexos dos tecidos moles. Esses defeitos podem prejudicar a qualidade de vida do paciente, causar perda de função e resultar em incapacidade permanente. Embora técnicas como a transferência autóloga do retalho tecidual tenham sido comumente praticadas, problemas com a disponibilidade do retalho e a morbidade do local doador são as principais limitações 1,2,3. O alotransplante composto vascularizado (VCA) é uma alternativa promissora que transfere tecidos compostos, por exemplo, músculo, pele, vasculatura, como uma única unidade para os receptores. No entanto, a VCA requer imunossupressão em longo prazo, o que leva à toxicidade medicamentosa, infecções oportunistas e neoplasias malignas 4,5,6.
Os andaimes acelulares de engenharia tecidual são uma solução potencial para essas limitações7. Os andaimes de tecido acelular podem ser obtidos usando métodos de descelularização, que removem o material celular dos tecidos nativos, preservando a microarquitetura da matriz extracelular subjacente (ECM). Em contraste com o uso de materiais sintéticos na engenharia de tecidos, o uso de andaimes biologicamente derivados oferece um substrato biomimético de ECM que permite a biocompatibilidade e o potencial de tradução clínica8. Após a descelularização, a subsequente recelularização de andaimes com células específicas do receptor pode gerar tecidos funcionais, vascularizados, com pouca ou nenhuma imunogenicidade 9,10,11. Ao desenvolver um protocolo eficaz para obter tecidos acelulares usando técnicas de descelularização por perfusão, uma ampla gama de tipos de tecidos pode ser projetada. Por sua vez, a construção desta técnica permite a aplicação em tecidos mais complexos. Até o momento, a descelularização perfusional de tecidos moles vascularizados tem sido investigada utilizando tecidos vascularizados simples, como retalho fasciocutâneo de espessura total em roedores 12, suínos13 e humanos14, bem como músculo esquelético reto abdominal suíno15. Além disso, tecidos vascularizados complexos também foram descelularizados por perfusão, como demonstrado nos modelos de orelha suína e humana 16,17 e nos modelos de enxerto de face inteira humana18.
Aqui, o protocolo descreve a descelularização de retalhos livres vascularizados utilizando andaimes de MEC derivados biologicamente. Apresentamos a descelularização de três retalhos clinicamente relevantes: 1) o omento, 2) o tensor fáscia lata e 3) o antebraço radial, todos representativos de retalhos de cavalos de trabalho utilizados rotineiramente em cirurgia reconstrutiva e não foram previamente examinados em estudos com animais no contexto da descelularização tecidual. Esses retalhos de bioengenharia oferecem uma plataforma versátil e prontamente disponível que tem o potencial para aplicações clínicas para uso no campo da reparação e reconstrução de grandes defeitos de tecidos moles.
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Protocol
Todos os procedimentos envolvendo sujeitos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Rede de Saúde da Universidade (IACUC) e são realizados de acordo com o protocolo e os procedimentos do Centro de Recursos Animais da Rede de Saúde da Universidade e as Diretrizes do Conselho Canadense de Cuidados com Animais. Cinco porcos Yorkshire (35-50 kg; idade aproximada de 12 semanas de idade) foram utilizados para todos os experimentos.
1. Fabricação de biorreator de perfusão
- Ver figura 1 para todos os componentes utilizados no biorreator de perfusão. Para a fabricação da câmara de tecido, use recipientes de bloqueio de polipropileno comercialmente disponíveis com tampas estanques e herméticas contendo um revestimento de vedação de silicone. Certifique-se de que os recipientes sejam compatíveis com autoclave.
- Faça dois furos de 1/4 ao longo das laterais do recipiente e rosque um segmento curto de tubos de silicone revestidos de platina L/S-16. Uma tubulação carregará o perfusato de entrada e a outra é para a saída.
- Para a tubulação de entrada, prenda um conector Luer macho na porção interna que será usada para se conectar à cânula de tecido. Conecte um conector Luer fêmea na extremidade externa da tubulação de entrada que será usada para se conectar a uma torneira de três vias.
- Faça um único furo de 1/4 na tampa da câmara e rosque outro segmento curto de tubos de silicone revestidos de platina L/S-16. Esta tubulação servirá como a saída de ar.
- Faça a tubulação de entrada e saída medindo aproximadamente 50 cm de tubulação de silicone revestida de platina L/S-16. Conecte uma extremidade a uma tubulação amarela de bomba de três paradas e a outra extremidade a uma pipeta sorológica estéril de 2 mL para transportar o perfusato dos reservatórios de detergente para a câmara do biorreator.
- Autoclave todos os componentes (câmara e tubo) em embalagens estéreis embaladas individualmente.
Figura 1: Fabricação do biorreator de perfusão. O biorreator de perfusão consiste em (A) uma câmara de tecido de polipropileno plástico (B) com orifícios laterais perfurados para acomodar tubos de perfusão com tampa estanque a ar e a água. (C) As torneiras são presas à tubulação para permitir a fixação da tubulação de perfusão que transporta agentes de descelularização do reservatório de detergente para resíduos de forma de passagem única. (D) de bomba compatíveis são usadas para conectar a tubulação de três paradas à bomba peristáltica. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
2. Preparação de soluções de descelularização
- Preparar solução salina normal heparinizada (15 UI/mL) diluindo 1,5 mL de 1000 UI/mL de solução de estoque de heparina em 100 mL de solução salina normal.
- Preparar solução de dodecil sulfato de sódio (SDS) a 0,05% p/v, adicionando lentamente 9 g de pó SDS a 18 L de água desionizada destilada autoclavada. Use um garrafão de polipropileno (PP) de grande volume para acomodar a solução SDS. A solução está pronta para uso quando totalmente dissolvida. Armazenar à temperatura ambiente.
- Preparar a solução de trabalho DNase I. Em primeiro lugar, reconstituir a DNase I liofilizada para uma concentração de estoque de 10 mg/mL com CaCl 2 5 mM em dH2O. Armazenar a solução de DNase I de estoque reconstituída como alíquotas em um freezer de -20 °C até estar pronta para uso. No dia do uso, diluir DNase I estoque 1:100 com Mg++ (1,29 mM) e Ca++ (1,98 mM) em dH2O estéril até uma concentração final de 0,1 mg/mL.
NOTA: A atividade DNase será degradada, a menos que armazenada congelada. Apenas a solução de DNase fresca de trabalho deve ser utilizada para a digestão enzimática do ADN à temperatura ambiente. - Preparar 1x solução de PBS diluindo 10x PBS estoque 1:10 com água autoclavada estéril em um volume final de 5 L em um garrafão PP. Armazenar à temperatura ambiente.
- Prepare 1% de antibióticos/antimicóticos (A/A) em PBS. Diluir 100x antibióticos/antimicóticos 1:100 com solução estéril de 1x PBS até um volume final de 1 L. Conservar à temperatura ambiente.
- Preparar 0,1% (v/v) de ácido peracético (PAA)/4% (v/v) de etanol (EtOH) adicionando 3,13 mL de PAA + 40 mL de etanol a 100% + 956 mL de dH2O. Trazer o volume final para 1.000 mL e armazenar em temperatura ambiente.
3. Aquisição de retalhos suínos
NOTA: Este é um procedimento terminal. Um porco foi usado para obter todos os três retalhos. Eutanasiar humanamente o animal após a aquisição de todas as abas.
- Cuidados pré-operatórios
- Porcos rápidos pelo menos 12 h antes da cirurgia. Sedadar os animais com cetamina (20 mg/kg intramuscular, IM), atropina (0,04 mg/kg IM) e midazolam (0,3 mg/kg IM).
- Induzir anestesia por inalação de isoflurano a 5% através de uma máscara a uma taxa de fluxo de 22-44 mL/kg/min para inserção e intubação de linhas periféricas. Manter a anestesia com isoflurano a 0,5%-2% a 22-44 mL/kg/min. Garantir uma profundidade adequada da anestesia, verificando a estabilidade hemodinâmica e observando a ausência de reflexos de retirada palpebral/pedal ou tônus muscular da mandíbula para denotar um nível apropriado de anestésico administrado. Administrar infusão intravenosa de taxa contínua de remifentanil (10-20 μg/kg/h) durante a cirurgia para analgesia.
- Intubar o porco com um tubo endotraqueal apropriado (7-8 mm) e conectar o tubo a um ventilador ajustado a um volume corrente de 8 mL/kg, PEEP de 5 cm H 2 0,FiO2 de 0,5 e frequência respiratória de 14.
- Insira um cateter angiocath 22 G na veia da orelha. Uma vez obtido o acesso intravenoso (IV), infundir solução salina quente 0,9% normal a 5-10 mL/kg/h durante todo o procedimento para manter a pressão arterial média entre 60 mmHg e 90 mmHg.
- Monitore continuamente a frequência cardíaca, a oximetria de pulso e o CO2 final da maré. Avalie a pressão arterial e a temperatura corporal a cada 5 min.
- Aplique pomada ocular para evitar a secura ocular durante a anestesia. Prepare todo o campo cirúrgico com iodopovidona. Drape o campo cirúrgico com toalhas estéreis.
- Retalho ocmental
- Coloque o porco em decúbito dorsal e realize uma laparotomia xifo-umbilical.
- Ao entrar no abdômen, mobilize o estômago cefálico para visualizar o omento maior. Colocar cuidadosamente o omento no campo operatório e identificar os vasos gastroepiplóicos que correm ao longo da maior curvatura do estômago (Figura 2A).
- Comece no aspecto esquerdo da curvatura maior, onde a artéria gastroepiplóica esquerda se junta à artéria esplênica. Usando tesouras de tenotomia de Stevens retas, esqueletizar tanto a artéria e veia gastroepiplóica esquerda. Em seguida, divida ambos separadamente usando laços cirúrgicos ou clipes.
- Prossiga ao longo da curvatura maior do estômago da esquerda para a direita. Ligue e divida os ramos vasculares curtos que surgem do omento supondo a maior curvatura do estômago. Tome cuidado para não ferir o pedículo gastroepiplóico principal do omento durante esta etapa.
- Continue a mobilização do omento maior até que a junção dos vasos gastroepiplóicos direitos e da artéria gastroduodenal seja encontrada. Com clipes ou laços, ligue então divida a artéria gastroepiplóica direita e as veias separadamente para liberar o retalho omental.
- Uma vez liberado, o omento pode ser dividido ao longo do meio em duas metades, com cada metade acompanhada por uma respectiva artéria e veia gastroepiplóica. Isso permite a aquisição de dois retalhos livres omentais de uma operação animal. Individualmente canular os vasos gastro-epiplóicos com uma cânula de 20-22 G e, em seguida, fixar com laços de seda 3-0.
- Lavar soro fisiológico heparinizado (15 UI/mL) na cânula arterial gastroepiplóica até que se observe um fluxo venoso claro.
- Retalho tensor da fáscia lata
NOTA: O protocolo baseia-se em uma descrição prévia do retalho de fáscia lata do tensor suíno por Haughey et al.19. A modificação é feita para isolar apenas a porção fascial do retalho tensor da fáscia lata.- Coloque o porco na posição de decúbito lateral e raspe todo o membro posterior superior bilateralmente. Prepare e cubra usando os procedimentos estéreis usuais.
- Marque o limite anterior do retalho com uma linha que se estende da espinha ilíaca anterossuperior (EIAS) em direção à patela lateral. A localização do pedículo é de aproximadamente 6-8 cm do ASIS ao longo desta linha.
- Marque uma linha posterior paralela a aproximadamente 8 cm a 10 cm da incisão anterior ao longo do eixo do fêmur para incluir a largura do retalho. Marque a borda distal do retalho na patela lateral.
- Comece a dissecção na margem distal na patela com uma incisão afiada da pele usando um bisturi. Aprofunde a incisão da pele com cauterização através do tecido subcutâneo até que a fáscia que recobre o reto femoral seja encontrada.
- Continue as incisões cutâneas em direção ao ASIS ao longo dos limites anteriores e posteriores marcados descritos acima. Para isolar o retalho fascial sozinho, remova o componente da pele sobrejacente da camada fascial subjacente. Ligue ou cauterize quaisquer pequenos vasos perfuradores na pele.
- Retornar à borda distal do retalho e incidir a fáscia profunda para permitir a mobilização do músculo vasto lateral subjacente. Mobilize a fáscia em direção ao ASIS.
- Durante a mobilização, identificar o pedículo vascular que emerge entre os músculos vasto lateral e reto femoral (Figura 2B). Tome cuidado para evitar a tração excessiva para não ferir os vasos pediculares.
- Dissecar o aspecto proximal da SAIS enquanto protege o pedículo vascular. Dissecar até que o retalho esteja suficientemente mobilizado em torno de seu pedículo.
- Trace o pedículo em direção aos vasos femorais profundos. Esqueletizar tanto a artéria femoral circunflexa lateral quanto a veia que supre o retalho fascial. Ligate então divide ambos os vasos proximalmente onde eles se juntam aos vasos femorais profundos.
- Canular os vasos pediculares individualmente com angiocateteres 20 G a 24 G, fixados com laços de seda 3-0. Lavar solução salina heparinizada (15 UI/mL) na cânula arterial do retalho até que se observe um fluxo venoso claro.
- Retalho radial do antebraço
NOTA: O protocolo abaixo baseia-se em uma descrição publicada do modelo de retalho radial do antebraço suíno por Khachatryan et al.20.- Coloque o porco na mesa de operação na posição de decúbito lateral. Posicione o membro anterior dependente dentro do campo operatório.
- Marque um retalho cutâneo aproximado de 3 cm x 3 cm quadrado no antebraço radial. Desenhe uma linha entre o ponto médio da margem do retalho proximal e a fossa antecubital para denotar o curso aproximado do pedículo da artéria radial. Confirme o curso arterial com palpação.
NOTA: No modelo suíno, os vasos radiais estão localizados relativamente mais profundamente do que nos seres humanos. Sua localização é entre o flexor radial do carpo e o braquiorradial. - Incise a pele usando um bisturi no aspecto distal com uma profundidade até a fáscia antebraquial. Dissecar com tesoura de tenotomia até que a artéria radial distal e suas duas veias comitantes sejam encontradas. Ligate a artéria e veias com laços cirúrgicos individualmente e dividir.
- Continue as incisões cutâneas nas margens radial e ulnar do quadrado da pele marcado. Mobilize o retalho do osso radial subjacente com uma lâmina cirúrgica procedendo de uma direção radial para ulnar, ao mesmo tempo em que eleva o retalho cutâneo proximalmente em direção à fossa antecubital.
NOTA: Manter um plano de dissecção subfascial para garantir que o pedículo da artéria radial permaneça associado à camada cutânea sobrejacente. - Na margem proximal, retrair o espaço entre o braquiorradial e o flexor radial do carpo com um afastador auto-retentor para expor a artéria radial proximal e suas veias comitantes (Figura 2C).
- Usando tesoura de tenotomia, esqueletizar a artéria radial e as veias comitantes proximalmente na fossa antecubital, onde se unem à artéria braquial e às veias, respectivamente. Dissecar os vasos dos tecidos fibrogordurosos circundantes para alcançar um comprimento pedicular suficiente de aproximadamente 5-6 cm. Ligue e divida a artéria e as veias separadamente para liberar o retalho radial do antebraço.
- Canular os vasos pediculares com angiocateteres 20 G a 24 G, fixados com laços de seda 3-0. Lavar soro fisiológico heparinizado (15 UI/mL) na cânula arterial do retalho até que se observe um fluxo venoso claro.
- Após a obtenção do retalho, manter os retalhos em solução salina fria a 4 °C até estarem prontos para a descelularização. Sob anestesia com isoflurano profundo, eutanasiar os animais com injeção intravenosa de cloreto de potássio (100 mg/kg IV). Confirmar a morte pela ausência de sinais vitais.
Figura 2: Captação de três retalhos vascularizados suínos . (A) Omento. As artérias gastroepiplóicas direita (i) e esquerda (ii) são canuladas no retalho omental (iii). (B) Tensor da fáscia lata. O pedículo do retalho (iv) é o ramo ascendente da artéria circunflexa femoral lateral (v). (C) Retalho radial do antebraço. A aquisição do retalho radial do antebraço (vi) baseia-se na artéria radial e na veia comitante (vii) como pedículo vascular (NOTA: Os drenos foram omitidos para fins de demonstração). Barras de escala: 3 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
4. Configuração do sistema de descelularização
- Monte a câmara de tecido com abas em condições estéreis em um gabinete de biossegurança de fluxo laminar.
- Anexe uma torneira de três vias às portas de entrada e saída do biorreator. Fixe um filtro de 0,2 μm à porta de ventilação de ar na tampa da câmara de tecido. Prepare a tubulação de entrada com solução salina heparinizada estéril para eliminar bolhas de ar.
- Coloque as abas na câmara. Usando hemostatos estéreis, conecte as abas à tubulação de entrada usando o conector Luer macho. Parafuse a respectiva cânula arterial de cada aba no Luer macho e garanta uma vedação apertada.
- Lavar soro fisiológico heparinizado através da torneira para verificar se a conexão Luer está sem vazamentos e se os retalhos podem ser perfundidos com evidências de saída venosa. Feche a tampa da câmara de tecido.
- Conecte a tubulação de entrada com uma tubulação de bomba amarela de três paradas à torneira de entrada da câmara de tecido. Além disso, conecte um transdutor de sensor de pressão em linha à torneira de três vias de entrada para permitir o monitoramento da pressão de perfusão.
- Ligue a bomba peristáltica de entrada. Na tela inicial, vá para a terceira guia usando a tecla de seta para definir o ID da tubulação para 1,85 mm. Em seguida, prossiga para a segunda guia para definir a taxa de perfusão. Taxa de entrada como o modo de entrega e ajustada para 2 mL/min. Verifique se a direção do fluxo está correta, conforme exibido na tela. Carregue a tubulação da bomba de três paradas na bomba peristáltica com um compatível.
- Repita o procedimento para a bomba peristáltica de saída semelhante à acima. Defina a configuração da bomba de saída para uma taxa de 4 mL/min. Conecte a tubulação de saída com uma tubulação de bomba amarela de três paradas à torneira de saída da câmara de tecido. Carregue a tubulação da bomba de três paradas na bomba peristáltica com um compatível. Inicie o fluxo para ambas as bombas pressionando o botão liga/desliga .
NOTA: A maior taxa da bomba de saída é uma medida de segurança crucial para evitar o transbordamento da câmara de tecido, garantindo que a saída da câmara sempre exceda o fluxo de entrada durante o curso da descelularização. Toda a configuração de descelularização montada é representada na Figura 3.
Figura 3: Sistema de descelularização de perfusão montado. (A) Esquema do sistema de descelularização de perfusão. A tubulação de entrada transporta perfusato do reservatório de detergente para a câmara de tecido de forma única com monitoramento do sensor de pressão. A tubulação de saída remove o perfusato ativamente da câmara de tecido para o recipiente de resíduos. Setas pretas denotam a direção do fluxo de perfusão. Uma bomba peristáltica é usada com a bomba esquerda para controlar o fluxo de entrada. O fluxo de saída é ativamente removido usando uma segunda bomba peristáltica através da respectiva tubulação. Figura criada com BioRender.com. (B) Fotografia do sistema de descelularização de perfusão montado na bancada com a bomba peristáltica de entrada (i) conectada às câmaras de tecido (ii) e, em seguida, a bomba peristáltica de saída (iii). A pressão de perfusato de entrada é monitorada com um sensor de pressão em linha (iv) antes de entrar na câmara de tecido. Aqui, três retalhos são descelularizados em paralelo. Tanto o detergente quanto os reservatórios de resíduos estão abaixo da bancada e não são fotografados. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
5. Descelularização de retalhos suínos
- Execute todas as etapas a seguir para descelularização por perfusão à temperatura ambiente. Para um resumo das taxas de perfusão e durações, ver Tabela 1. Iniciar a perfusão de solução salina heparinizada a 2 mL/min usando uma bomba peristáltica e perfundir os retalhos com solução salina heparinizada na câmara de tecido por 15 min para remover quaisquer coágulos sanguíneos retidos.
- Após a conclusão da perfusão salina heparinizada, aspirar solução salina residual na câmara tecidual. Encha a câmara tecidual com aproximadamente 500 mL de solução de descelularização SDS para submergir suficientemente o retalho.
- Transfira o tubo de entrada para a solução de descelularização SDS e perfunda o tecido a 2 mL/min. A duração da perfusão varia dependendo do retalho; perfundir SDS por 2 dias para o omento, 3 dias para a fáscia tensorial e 5 dias para o retalho fascio-cutâneo radial do antebraço.
- Após a conclusão da descelularização da SDS, aspirar o perfusato SDS existente contido dentro da câmara tecidual. Transfira a tubulação de entrada para 1x solução de PBS e perfunda os retalhos por 1 dia a 2 mL/min.
- Remova a solução PBS anterior e transfira a tubulação de entrada para a solução de trabalho DNase. Perfundir por 2 h a 2 mL/min. Remova a solução de DNase da câmara de tecido e coloque a tubulação de entrada em 1x solução de PBS. Submergir os tecidos com 1x solução de PBS na câmara e perfundir 1x solução de PBS por 1 dia a 2 mL/min.
- Esterilizar os retalhos com solução de PAA/EtOH. Transfira a tubulação de entrada para PAA/EtOH em solução de dH2O e submerja os tecidos na mesma solução. Perfundir PAA/EtOH a 2 mL/min por 3 h. Quando a esterilização PAA/EtOH estiver concluída, desconecte a tubulação das torneiras de três vias.
- Remova os retalhos usando técnica asséptica e coloque os instrumentos estéreis em PBS contendo 1% de antibióticos/antimicóticos (A/A). Mergulhe os retalhos com PBS + 1% A/A por 15 min em duas lavagens separadas para neutralizar totalmente o ácido residual. Manter os retalhos em PBS + 1% A/A a 4 °C até estarem prontos para a recelularização.
- Verifique a esterilidade dos andaimes realizando uma cultura de swab em placas de ágar e examine o crescimento microbiano. Inocular placas de ágar com zaragatoas retiradas de cada superfície do retalho. Cultivar as placas de ágar a 37 °C durante um período máximo de 2 semanas. A esterilidade é demonstrada pela ausência de crescimento de colônias microbianas.
Tabela 1: Resumo dos parâmetros do protocolo de perfusão-descelularização. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
6. Avaliação da descelularização
- Usando uma biópsia por punção, obtenha amostras de 3 mm a 10 mm de espessura dos retalhos.
- Para histologia, fixar biópsias em histológicas em formalina tamponada normal por 24 h à temperatura ambiente.
- Lave as de biópsia em água ou PBS por 15 minutos e coloque-as em etanol a 70% até que estejam prontas para o processamento tecidual. Processe as em um processador de tissue de acordo com protocolos padrão.
- Incorpore as biópsias em parafina, permitindo que a cera se solidifique por 10-15 minutos em uma placa fria. Seção de blocos de parafina em um micrótomo de 5 μm de espessura. Coloração das lâminas com hematoxilina e eosina (H&E) de acordo com os protocolos padrão. Imagem das lâminas de tecido com microscopia de luz.
- Para a quantificação do teor de ADN, obter o peso seco das biópsias teciduais após secagem dos tecidos durante a noite numa estufa a 60 °C. Digerir as amostras num tampão de extracção de papaína a 65 °C durante a noite. Centrifugar as amostras digeridas a 10.000 x g e transferir o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga fresco. Teste o conteúdo de DNA com um kit comercial de extração de DNA de acordo com as instruções do fabricante.
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Representative Results
Este protocolo de descelularização de retalhos suínos vascularizados baseia-se na perfusão de um detergente de base iônica, SDS, através da vasculatura do retalho em um biorreator de perfusão personalizado. Antes da descelularização, três retalhos vascularizados em modelo suíno foram colhidos e canulados de acordo com seus principais vasos fornecedores. Os retalhos foram imediatamente lavados após a aquisição, a fim de manter uma vasculatura patente e perfusível para permitir uma descelularização bem-sucedida. Usando recipientes herméticos de tampa de encaixe, um biorreator personalizado foi projetado para permitir a perfusão de retalhos dentro de um ambiente fechado. A perfusão de retalhos dentro do biorreator foi realizada de forma de passagem única usando duas bombas peristálticas conectadas à câmara tecidual. A pressão de perfusão foi monitorada com um sensor de pressão em linha.
Durante a descelularização, a duração da exposição à SDS foi dependente do tipo de tecido a ser processado. Com a técnica de descelularização da perfusão descrita, os retalhos omento, fáscia tensorial e antebraço radial foram descelularizados com SDS a 0,05% por 2 dias, 3 dias e 5 dias, respectivamente. A esterilização bem-sucedida após a descelularização foi demonstrada pela ausência de crescimento de colônias microbianas após swabbing dos retalhos e cultura dos swabs em placas de ágar por 14 dias. As pressões de perfusão foram monitoradas a uma taxa de fluxo de 2 mL/min e variaram entre 20-60 mmHg durante todos os estágios de descelularização para os três retalhos. Após a conclusão da descelularização, os retalhos foram lavados sob controle manual e demonstraram evidências de saída de uma cânula venosa esquerda para drenagem livre (Vídeo Suplementar 1, Vídeo Suplementar 2, Vídeo Suplementar 3).
Um total de 15 retalhos foram descelularizados, com cinco repetições para cada um dos três tipos de tecidos. Ao exame, a morfologia macroscópica dos tecidos nativos aparecia de cor rosa (Figura 4A,E,I), enquanto os tecidos descelularizados eram caracteristicamente brancos/opacos na aparência (Figura 4C,G, K). O exame histológico dos tecidos nativos com H&E mostra a presença de núcleos azuis (Figura 4B,F,J). Nos retalhos descelularizados, a coloração H&E mostrou perda de material celular com ausência de coloração nuclear azul (Figura 4D,H,L), indicando um andaime tecidual acelular. A quantificação adicional do conteúdo de DNA nas cinco repetições mostrou uma diminuição estatisticamente significativa do DNA nos andaimes acelulares em comparação com os tecidos nativos por um teste t de Student para cada retalho (Figura 5). No omento, o DNA diminuiu de 460 ng/mg ± 124 ng/mg de tecido seco no retalho nativo para 25,8 ng/mg ± 5,90 ng/mg de tecido seco no retalho descelularizado (n = 5, p < 0,05). Na fáscia lata tensorial, o DNA diminuiu de 297 ng/mg ± 68,2 ng/mg para 58,3 ng/mg ± 13,5 ng/mg entre retalhos nativos e descelularizados, respectivamente (n = 5, p < 0,05). O retalho radial do antebraço mostrou diminuição do DNA de 1180 ng/mg ± 241 ng/mg no retalho nativo para 162 ng/mg ± 34,9 ng/mg no retalho descelularizado (n = 5, p < 0,05).
Figura 4: Descelularização de três retalhos suínos. O exame macroscópica dos retalhos (A) do omento nativo, (E) do tensor da fáscia lata e (I) do antebraço radial demonstram a aparência rosa dos retalhos imediatamente após a aquisição. A coloração histológica dos tecidos nativos demonstra coloração clara de hematoxilina dos núcleos celulares com H&E (B,F,J). Após a descelularização, o (C) omento, (G) tensor fáscia lata e (K) antebraço radial aparecem grosseiramente brancos e opacos. Histologicamente, os três retalhos descelularizados mostram ausência de coloração nuclear com H&E (D,H,L). Barras de escala: 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Quantificação do conteúdo de DNA em andaimes acelulares. Os valores são normalizados para mg de massa seca do andaime. Amostras de tecido fresco de tecidos nativos, não descelularizados (n = 5) e tecidos descelularizados (n = 5) foram secas e pesadas antes da digestão noturna em papaína antes da quantificação. O teste estatístico utilizou o teste t de Student com nível de significância (**) definido como p-valor < 0,05. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 1 suplementar. Exame temporais da progressão da perfusão-descelularização do omento usando dodecil sulfato de sódio a 0,05% durante 5 dias por exame macroscópica (barras de escala = 3 cm) e histologia de H & E (barras de escala = 200 μm). Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura 2 suplementar. Exame tempo-curso da progressão da perfusão-descelularização do tensor fáscia lata usando dodecil sulfato de sódio a 0,05% durante 5 dias por exame macroscópica (barras de escala = 3 cm) e histologia de H & E (barras de escala = 200 μm). Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura 3 suplementar. Exame temporais da progressão da perfusão-descelularização do retalho radial do antebraço usando dodecil sulfato de sódio a 0,05% durante 5 dias por exame macroscópica (barras de escala = 3 cm) e histologia de H & E (barras de escala = 200 μm). Clique aqui para baixar este arquivo.
Vídeo Suplementar 1. Perfusão manual representativa do retalho omentário descelularizado através da cânula arterial (rosa) demonstrando saída da cânula venosa de drenagem livre (amarela). Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo Suplementar 2. Perfusão manual representativa do retalho tensor descelularizado da fáscia lata através da cânula arterial (rosa) demonstrando saída da cânula venosa de drenagem livre (azul). Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo Suplementar 3. Perfusão manual representativa do retalho radial descelularizado do antebraço através da cânula arterial (azul) demonstrando saída da cânula venosa de drenagem livre (amarela). Clique aqui para baixar este vídeo.
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Discussion
O protocolo proposto utiliza a perfusão de SDS de baixa concentração para descelularizar uma gama de retalhos derivados de suínos. Com este procedimento, o omento acelular, o tensor da fáscia lata e os retalhos radiais do antebraço podem ser descelularizados com sucesso usando um protocolo que favorece a SDS de baixa concentração. Experimentos preliminares de otimização determinaram que a SDS em baixa concentração (0,05%) entre 2 dias a 5 dias é capaz de remover material celular para o omento, tensor da fáscia lata e retalho radial do antebraço quando analisado com técnicas histológicas (Figura Suplementar 1, Figura Suplementar 2, Figura Suplementar 3). Este método oferece uma abordagem direta que alcança a descelularização dentro de um curto período de tempo e a um custo razoável. Em nossa experiência, a descelularização e esterilização de retalhos suínos levam entre 2-5 dias, com maior duração de descelularização necessária para tecidos com maior densidade (por exemplo, pele do antebraço em 5 dias vs. omento em 2 dias). Além disso, a baixa concentração de SDS utilizada neste protocolo foi selecionada com base na justificativa de que uma baixa concentração de SDS a 0,05% cai abaixo da concentração micelar crítica de SDS (aproximadamente a 0,2%21) e, assim, permite que o surfactante efetivamente solubilize as membranas celulares, deixando intactos importantes componentes bioativos da ECM. O uso de SDS de baixa concentração neste protocolo contrasta com o uso de concentrações relativamente maiores de SDS (por exemplo, 1%) para perfusão-descelularização de retalhos fascio-cutâneos vascularizados, conforme relatado por autores anteriores13,22. Altas concentrações de SDS, embora eficazes na descelularização, têm o custo de incorrer em efeitos prejudiciais sobre o andaime de ECM, como GAG e depleção do fator de crescimento, bem como a desnaturação de proteínas como colágeno e vimentina23,24. De fato, trabalhos futuros na perfusão-descelularização de retalhos vascularizados suínos se beneficiarão de estudos adicionais de caracterização para examinar os efeitos do agente de descelularização sobre a MEC nos níveis estrutural e molecular e suas implicações para a recelularização a jusante25,26,27 . Ensaios para componentes da ECM, como colágeno, elastina ou conteúdo de GAG, podem ser usados para avaliar quantitativamente as alterações na ECM após a descelularização. Além disso, o teste de resistência mecânica é uma modalidade útil para estudar mudanças nas propriedades biomecânicas após a descelularização. Por fim, a avaliação da vascularidade por meio de técnicas como angiografia ou microTC também ajudará a caracterizar a arquitetura vascular em nível sistêmico como requisito para a geração de retalhos vascularizados perfusíveis28.
Várias considerações técnicas devem ser observadas com este protocolo. Em primeiro lugar, deve-se tomar extremo cuidado durante o manuseio do retalho e a montagem do biorreator para evitar a decanulação acidental, pois a reanulação em um ambiente ex vivo é comparativamente mais difícil. Em segundo lugar, durante a obtenção do retalho, a obtenção de um retalho intacto com pedículo vascular perfusável e intacto é fundamental para o sucesso da descelularização. Deve-se tomar cuidado durante a aquisição para garantir que os pontos de vazamento distais no andaime sejam cortados ou amarrados à mão. Isso ajudará a reduzir o vazamento, que pode causar perfusão incompleta de soluções através da vasculatura do retalho. Um período inicial de perfusão com soro fisiológico heparinizado após a colheita impede a retenção de coágulos sanguíneos e verifica uma vasculatura perfusível evidenciada pelo fluxo de perfusato venoso. Os tecidos descelularizados também podem ser lavados novamente após a conclusão da descelularização para verificar possíveis obstruções intravasculares (por exemplo, de detritos celulares/êmbolos aéreos) que possam impedir a perfusibilidade do retalho. Em nossa experiência, os retalhos descelularizados não apresentaram resistência intravascular ao rubor de seringas seguindo esse protocolo, enquanto a saída venosa pôde ser novamente observada a partir do retalho descelularizado após o rubor (Vídeo Suplementar 1, Vídeo Suplementar 2, Vídeo Suplementar 3). Isso foi indicativo de uma alça vascular arterial a venosa patente com capilares de conexão que podem ser perfundidos.
Outra consideração é feita em relação aos parâmetros de perfusão durante a descelularização. Nesse protocolo, foi selecionada uma perfusão de fluxo constante com vazão alvo de 2 mL/min, que estava dentro da faixa das vazões operacionais utilizadas em estudos de descelularização de tecidos de retalho suíno previamente publicados13,29. Além disso, nosso sistema de descelularização incorpora uma capacidade de monitoramento de pressão em linha em tempo real, a fim de monitorar possíveis flutuações na resistência intravascular ao longo da perfusão; este método pode ajudar a evitar altas pressões de perfusão decorrentes de uma possível oclusão intravascular que pode danificar a MEC microvascular.
Finalmente, a esterilização do andaime resultante é outra consideração técnica importante. Incorporamos uma fase de esterilização como a última etapa do protocolo de descelularização para abordar a contaminação ambiental incidental que pode ocorrer durante a descelularização. A esterilidade do retalho é especialmente importante para que os retalhos possam ser usados no futuro para recelularização. A perfusão de ácido peracético a 0,1%/EtOH a 4% como esterilizante já foi relatada previamente por grupos para esterilização de andaimes acelulares30,31 e também se mostrou eficaz com esse protocolo. A esterilidade foi verificada examinando-se culturas de swab de retalho em placas de ágar e observando-se crescimento ausente após 14 dias de incubação.
O biorreator de perfusão personalizado projetado para os experimentos é relativamente econômico, bem como simples e rápido de montar. Além disso, todos os componentes deste biorreator de perfusão são autoclaváveis e adaptáveis para o trabalho de recelularização, mantendo a esterilidade dos retalhos. O circuito de biorreator personalizado pode ser facilmente modificado para permitir a perfusão de circuito aberto que pode circular meios de cultura celular através de um andaime recelularizado após experimentos de semeadura celular. No entanto, algumas limitações do sistema de biorreator merecem destaque. Em primeiro lugar, o uso de duas bombas comerciais, embora necessário para evitar o transbordamento inadvertido do sistema, particularmente quando grandes volumes de perfusato são usados, prejudica o baixo custo da configuração de perfusão. Além disso, o baixo rendimento do atual sistema de biorreator de perfusão pode apresentar desafios logísticos quando se precisa executar inúmeras replicações experimentais em paralelo; sistemas de rendimento comparativamente mais alto desenvolvidos para a descelularização renal suína32 podem um dia ser adaptados para a descelularização do retalho suíno, a fim de aliviar esses desafios logísticos. Finalmente, embora o biorreator desenvolvido seja simples de configurar, a supervisão humana e a operação manual ainda são necessárias regularmente e com frequência para garantir que não ocorra mau funcionamento do sistema. Modificações no biorreator incorporando capacidades de automação que possam monitorar e reajustar o desempenho do biorreator com intervenção humana mínima ou nenhuma intervenção humana podem ser buscadas a fim de avançar a tecnologia de biorreator de perfusão-descelularização no futuro33,34.
A principal aplicação dos retalhos descelularizados é permitir a subsequente recelularização desses andaimes acelulares com populações celulares que possam regenerar a vasculatura. Embora muitas pesquisas futuras sejam necessárias para determinar o número de células, populações, estratégias de semeadura e condições de biorreatores apropriados para regenerar o tecido vascularizado funcional e viável, esse protocolo representa o trabalho fundamental inicial em direção a esse objetivo. Métodos futuros de recelularização ajudarão a estabelecer estratégias para projetar retalhos de tecidos moles com uma rede vascular perfusável intacta e contribuirão para potencialmente regenerar tecidos compostos mais complexos, como aloenxertos faciais e de extremidades. Esses andaimes podem um dia contornar a morbidade e a imunossupressão do local doador para pacientes submetidos à reconstrução de tecidos moles em larga escala, melhorando assim seus resultados clínicos e qualidade de vida.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Acknowledgments
Nenhum
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm pore Acrodisk Filter | VWR | CA28143-310 | |
| 0.9 % Sodium Chloride Solution (Normal Saline) | Baxter | JF7123 | |
| 20 L Polypropylene Carboy | Cole-Parmer | RK-62507-20 | |
| 3-0 Sofsilk Nonabsorbable Surgical Tie | Covidien | LS639 | |
| 3-way Stopcock | Cole-Parmer | UZ-30600-04 | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution, 100X | Wisent | 450-115-EL | |
| Atropine Sulphate 15 mg/30ml | Rafter 8 Products | 238481 | |
| BD Angiocath 20-Gauge | VWR | BD381134 | |
| BD Angiocath 22-Gauge | VWR | BD381123 | |
| BD Angiocath 24-Gauge | VWR | BD381112 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | DNAse Co-factor |
| DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
| DPBS, 10X | Wisent | 311-415-CL | without Ca++/Mg++ |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Heparin, 1000 I.U./mL | Leo Pharma A/S | 453811 | |
| Ketamine Hydrochloride 5000 mg/50 ml | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 612316 | |
| Ismatec Pump Tygon 3-Stop Tubing | Cole-Parmer | RK-96450-40 | Internal Diameter: 1.85 mm |
| Ismatec REGLO 4-Channel Pump | Cole-Parmer | 78001-78 | |
| Ismatec Tubing Cassettes | Cole-Parmer | RK-78016-98 | |
| Isoflurane 99.9%, 250 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2231929 | |
| LB Agar Lennox | Bioshop Canada | LBL406.500 | Sterility testing agar plates |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | DNAse Co-factor |
| Masterflex L/S 16 Tubing | Cole-Parmer | RK-96410-16 | |
| Midazolam 50 mg/10 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2242905 | |
| Monopolar Cautery Pencil | Valleylab | E2100 | |
| Normal Buffered Formalin, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| N°11 scalpel blade | Swann Morton | 303 | |
| Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Peracetic Acid | Sigma-Aldrich | 269336 | |
| Plastic Barbed Connector for 1/4" to 1/8" Tube ID | McMaster-Carr | 5117K61 | |
| Plastic Barbed Tube 90° Elbow Connectors | McMaster-Carr | 5117K76 | |
| Plastic Quick-Turn Tube Plugs | McMaster-Carr | 51525K143 | Male Luer |
| Plastic Quick-Turn Tube Sockets | McMaster-Carr | 51525K293 | Female Luer |
| Punch Biopsy Tool | Integra Miltex | 3332 | |
| Potassium Chloride 40 mEq/20 ml | Hospira Healthcare Corporation | 37869 | |
| Povidone-Iodine, 10% | Rougier | 833133 | |
| Serological Pipet, 2mL | Fisher Science | 13-678-27D | |
| Snap Lid Airtight Containers | SnapLock | 142-3941-4 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate Powder | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Surgical Metal Ligation Clips, Small | Teleflex | 001200 | |
| Stevens Tenotomy Scissors, 115 mm, straight | B. Braun | BC004R | |
| TruWave Pressure Monitoring Set | Edwards Lifesciences | PX260 |
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