Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kombinere 3D magnetisk kraftaktuator og multifunksjonell fluorescensavbildning for å studere kjernemekanobiologi

Published: July 5, 2022 doi: 10.3791/64098
Automatic Translation
1,5, 1,5, 1, 1, 2, 3,5, 4, 5,6,7, 1, 1,5,8,9
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Herbert Wertheim College of Engineering, University of Florida, 2Department of Materials Science and Engineering, University of Florida, 3Department of Biostatistics, University of Florida, 4Department of Biomedical Engineering, College of Engineering (COE), University of Delaware (UD), 5UF Health Cancer Center, University of Florida, 6Department of Physics, College of Liberal Arts and Sciences, University of Florida, 7Department of Anatomy and Cell Biology, College of Medicine, University of Florida, 8J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering, University of Florida, 9Department of Physiology and Functional Genomics, University of Florida

Summary

Denne studien presenterer en ny protokoll for direkte å anvende mekanisk kraft på cellekjernen gjennom magnetiske mikroperler levert inn i cytoplasma og å gjennomføre samtidig levende celle fluorescerende bildebehandling.

Abstract

Et grunnleggende spørsmål i mekanobiologi er hvordan levende celler sanser ekstracellulære mekaniske stimuli i sammenheng med cellefysiologi og patologi. Den cellulære mekano-følelsen av ekstracellulære mekaniske stimuli antas å være gjennom membranreseptorene, det tilhørende proteinkomplekset og cytoskelettet. Nylige fremskritt innen mekanobiologi viser at cellekjernen i cytoplasma selv uavhengig kan fornemme mekaniske stimuli samtidig. Imidlertid mangler en mekanistisk forståelse av hvordan cellekjernen sanser, transduserer og reagerer på mekaniske stimuli, hovedsakelig på grunn av de tekniske utfordringene med å få tilgang til og kvantifisere kjernemekanikken ved konvensjonelle verktøy. Dette papiret beskriver design, fabrikasjon og implementering av en ny magnetisk kraftaktuator som bruker presise og ikke-invasive 3D-mekaniske stimuli for å deformere cellekjernen direkte. Ved hjelp av CRISPR / Cas9-konstruerte celler demonstrerer denne studien at dette verktøyet, kombinert med høyoppløselig konfokal fluorescerende avbildning, muliggjør åpenbaring av sanntidsdynamikken til et mekanofølsomt ja-assosiert protein (YAP) i enkeltceller som en funksjon av kjernedeformasjon. Denne enkle metoden har potensial til å bygge bro over dagens teknologigap i mekanobiologimiljøet og gi svar på kunnskapsgapet som eksisterer i forholdet mellom kjernemekanotransduksjon og cellefunksjon.

Introduction

Denne studien tar sikte på å utvikle og anvende en ny teknikk for å belyse kjernemekanobiologi ved å kombinere magnetiske aktuatorer som bruker mekanisk kraft direkte på cellekjernen og konfokal fluorescensmikroskopi som samtidig bilder de strukturelle og funksjonelle subcellulære endringene. Celler registrerer ekstracellulære biofysiske signaler inkludert vevsstivhet 1,2,3,4, interstitielt væsketrykk og skjærspenning 5,6,7, overflatetopologi/geometri 8,9,10,11,12 og spennings-/kompresjonsspenning13,14, 15,16. Biofysiske signaler omdannes til biokjemiske signaler og utløser potensielle nedstrøms endringer i genuttrykk og celleoppførsel - en prosess kjent som mekanotransduksjon 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . For å studere mekanotransduksjonsprosesser er det utviklet et mylder av teknikker for å anvende mekanisk kraft på cellene, for eksempel atomkraftmikroskopi28, cellestrekkenhet29, bio-MEMS (mikroelektromekaniske systemer) kraftsensor 15,30,31, skjærreologi 32 og Stereo Vision System 33 . En nylig gjennomgang oppsummerer tilnærmingene til å bruke ekstracellulære mekaniske signaler og forstyrre mekanosensing34. Til dags dato bruker de fleste av disse metodene kraft på celleplasmamembranen, og celler mottar direkte disse ekstracellulære biofysiske signalene via membranreseptorer som integrin, cadherin, ionkanaler og G-proteinkoblede reseptorer. Deretter overfører de signalet til det intracellulære cytoskelettet og kjernen. For eksempel, ved bruk av ja-assosiert protein (YAP) translokasjon som en indikator på mekano-sensing, er celler vist å fornemme de mekaniske signalene av substratstivhet og ekstracellulær spenning fra cellemembranen og overføre dem gjennom cytoskelettet inn i kjernen for å indusere YAP cytoplasma-til-kjerne-translokasjon28,35.

Nylige bevis tyder på at selve cellekjernen er en uavhengig mekano-sensor 8,36,37. Dette er bevist ved eksperimenter utført på den isolerte kjernen høstet fra celler, hvor det ble avslørt at kjerner adaptivt endrer stivheten som svar på den mekaniske kraften som er direkte påført dem36. Under mange fysiologiske forhold registrerer kjerner i både tumor og friske celler ekstracellulære biofysiske signaler og endrer mekaniske egenskaper og samlinger38,39,40. For eksempel, ved ekstravasasjon, reduseres kjernestivheten til tumorceller og opprettholder mykhet i over 24 timer38. Under migrasjon gjennom begrenset interstitial plass, kjernene av tumorceller ofte miste og gjenopprette sin strukturelle integritet39. Imidlertid er måten kjernen registrerer det biofysiske signalet ukjent, selv om flere kjernekonvoluttproteiner og familier av proteiner har blitt funnet å være involvert, for eksempel Lamin A / C og linker av nukleoskeleton og cytoskelett (LINC) kompleks38,41. Derfor vil nye ikke-invasive metoder som direkte kan bruke kraft på kjernen, koble effekten av kraftoverføring fra celleplasmamembranen og cytoskelettet, og vil bidra til å belyse de tidligere utilgjengelige molekylære mekanismene for nukleær mekano-sensing.

Forskning som benyttet optisk pinsett for å manipulere organeller42 og mikroperler injisert i celler43 viste den teknologiske evnen til direkte å påføre kraft på kjernen. Imidlertid har den optiske pinsettteknikken flere begrensninger: (1) lav gjennomstrømning-optisk pinsett manipulerer ofte bare en celle eller mikroperle om gangen; og (2) potensiell fotoskade og temperaturartefaktdeformasjon av kjernekraft krever titalls pN36, og den tilsvarende nødvendige lasereffekten er ca. 10 mW per pN44,45. Slik laserintensitet er tilstrekkelig til å utløse fotoskader i cellene og forstyrre cellefunksjonene under forsøket46.

Magnetisk kraft påført gjennom mikroperler i levende celler viser potensialet til å direkte påføre kraft på kjernen og overvinne begrensningene til optisk pinsett. Når mikroperler leveres inn i cytoplasma, kan et magnetfelt utøve en magnetisk kraft på flere mikroperler samtidig på en høy gjennomstrømningsmåte. Magnetfeltet påvirker ikke cellefunksjonene47, men genererer kraft fra pN til nN, noe som er nok til å indusere kjernedeformasjon 36,48,49. Hittil har manipulering av magnetiske mikroperler blitt brukt på celleplasmamembran48, inne i cytoplasma50, på F-aktin51, inne i kjernen47 og på den isolerte kjernen36. Imidlertid har magnetisk manipulering av mikroperler aldri blitt brukt til å påføre direkte mekanisk kraft på atomkonvolutten for å studere mekanotransduksjon i kjernen.

I dette papiret utvikles en enkel teknikk for ikke-invasivt å levere magnetiske mikroperler inn i cytoplasma og bruke disse mikroperlene til å påføre mekanisk kraft på kjernen (figur 1). Her brukes CRISPR / Cas9-konstruerte menneskelige normale B2B-cellelinjer som endogent uttrykker mNeonGreen21-10/11-merket YAP for å validere metoden. YAP er et mekanofølsomt protein, og translokasjonen av YAP reguleres av nukleær mekano-sensing14,28. Den CRISPR/Cas9-regulerte knock-in-tilnærmingen ble valgt for å merke endogen YAP med et fluorescerende protein (FP) mNeonGreen21-10/11. Selv om CRISPR-redigering er kjent for å ha ufullstendig effektivitet og off-target-effekt, integrerte protokollene i tidligere publikasjoner fluorescenssortering for å velge riktig innsetting av åpen leseramme52,53,54. Med dette ekstra laget av utvelgelse ble det ikke observert noen merkingshendelse utenfor målet i 20+ cellelinjer som tidligere ble generert52,53,54,55. Dette er en delt fluorescerende proteinkonstruksjon, men i prinsippet kan enhver ekspressibel fluorescerende tag være brukbar. Denne merkingsmetoden er overlegen transgene eller antistoffmetoder. For det første, i motsetning til transgenuttrykket, opprettholder det merkede proteinet enkeltkopi-gendosering og uttrykker seg i den fysiologiske konteksten til det opprinnelige genreguleringsnettverket, og begrenser avvik i proteinkonsentrasjon, lokalisering og interaksjon. Merkingsmetoden som brukes i denne studien, oppnår over en størrelsesorden høyere gjennomstrømning og effektivitet enn full FP-merking. Det unngår også utfordringer forbundet med immunfluorescens på grunn av fikseringsartefakter og begrenset tilgjengelighet av antistoffer av høy kvalitet med høy spesifisitet. For det andre gjør tilnærmingen som brukes i dette papiret minimal forstyrrelse av cellefysiologien og muliggjør sanntids åpenbaring av alle endogene YAPs autentisk. I motsetning til dette fører andre vanlige transgene metoder ofte til overekspresjon av YAP. Den resulterende kunstige fordelingen kan potensielt forårsake cytotoksisitet og påvirke mekano-sensing av celler56,57,58.

Denne studien presenterer en protokoll for direkte å påføre kraft på kjernen gjennom magnetiske mikroperler levert inn i cytoplasma og for å gjennomføre samtidig levende celle fluorescerende bildebehandling. Oppsummert viser protokollene som presenteres her hvordan man (1) leverer magnetiske mikroperler inn i cellen mens de er utenfor kjernen, (2) manipulerer mikroperlene for å påføre magnetisk kraft på kjernen, (3) utfører konfokal fluorescerende avbildning av cellene under manipulering, og (4) kvantitativt analyserer YAP nukleær / cytoplasma (N / C) -forholdet gjennom kraftapplikasjonsprosessen. Resultatene antyder at (1) gjennom endocytose kan magnetiske mikroperler ikke-invasivt leveres inn i cytoplasmaet til B2B-celler innen 7 timer (figur 2 og figur 3); og (2) kvantifisert magnetisk kraft direkte påført kjernen (figur 4, figur 5 og figur 6) alene kan utløse forskjellige endringer av YAP N / C-forhold i CRISPR / Cas9-konstruerte B2B-celler (figur 7 og figur 8).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Vedlikehold av CRISPR/Cas9-konstruerte B2B-celler

  1. Kultur B2B-celler i en T25-kolbe med RPMI-1640 supplert med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin.
  2. Oppretthold B2B-cellene i en fuktet inkubator ved 37 °C med 5 % CO2.
  3. Subkultur B2B-cellene når sammenløpet når 70% til 80%.
  4. Oppbevar B2B-cellelinjen i RPMI-1640 kulturmedium med 10% (v / v) DMSO i en -80 ° C fryser.
  5. Bruk B2B-cellene med et passasjenummer mindre enn 10 i forsøkene.

2. Cellekultur

  1. Frø cellene på en petriskål med glassbunn.
    1. Flytt kolben som inneholder B2B-celler inne fra inkubatoren til biosikkerhetsskapet.
    2. Fjern kulturmediet i kolben ved hjelp av en aspirasjonspipette med en vakuumpumpe tilkoblet.
    3. Vask kolben med 2 ml fosfatbufret saltvann (PBS).
    4. Fjern PBS ved hjelp av aspirasjonspipetten.
    5. Tilsett 0,5 ml 0,05% Trypsinoppløsning for å løsne celler fra bunnen av kolbesubstratet.
    6. Sett kolben i inkubatoren i 5 minutter.
    7. Flytt kolben til biosikkerhetsskapet. Tilsett 5 ml nytt kulturmedium i kolben og pipetten løsningen opp og ned.
    8. Deponer 50 μL av mediet med celler (300 celler / μL) på petriskålen med glassbunn. Tilsett 2 ml kulturmedium i petriskålen.
    9. Plasser petriskålen i inkubatoren. Vent i 12 timer til cellene fester seg.
  2. Dyrk cellene med magnetiske mikroperler.
    1. Vei 0,2 g 7 μm middeldiameter karbonyljernmikroperler (heretter kalt 7 μm mikroperler, se materialtabellen).
    2. Bruk en pipette til å henge opp mikroperlene i 1 ml RPMI-1640 kulturmedium.
    3. Ta petriskålen med B2B-celler til biosikkerhetsskapet.
    4. Tilsett 200 μL av mediet som inneholder mikroperler i petriskålen.
      MERK: Tilsett mediet raskt for å unngå utfelling av mikroperlene.
    5. Sett petriskålen tilbake i inkubatoren til mikroperler er internalisert av cellene. Kontroller internaliseringen hver 6. time for å bestemme den optimale tiden for internalisering for forskjellige cellelinjer.
    6. For å kontrollere internaliseringen, utfør konfokal fluorescensavbildning for å visualisere mikroperle-, atom- og cellegrensen. Hvis mikroperlen internaliseres av cellen, vil den være innenfor cellegrensen.

3. Visualisering av kjernen

  1. Varm 1,5 ml av kulturmediet i inkubatoren i 15 minutter.
  2. Slå av lyset på biosikkerhetsskapet. Ta petriskålen som inneholder cellen, det oppvarmede kulturmediet, atomflekken og Verapamil HCl inn i biosikkerhetsskapet.
    MERK: Kjernefysiske fargekomponenter er følsomme for lys. Unngå eksponering for lys under drift.
  3. Fortynn 1000x kjernefysisk flekk med DMSO til 100x.
  4. Fortynn 100 mM Verapamil HCl med DMSO til 10 mM.
  5. Tilsett 15 μL 100x kjernefysisk flekk og 15 μL 10 mM Verapamil HCl til 1,5 ml kulturmedium. Bland godt ved pipettering opp og ned.
  6. Fjern kulturmediet fra petriskålen. Tilsett kulturmediet som inneholder kjernefysisk farging i petriskålen.
  7. Sett cellene tilbake i inkubatoren i over 2 timer.

4. Klargjøring av maskinvare for magnetisk kraftapplikasjon

  1. 3D-printe alle deler ved hjelp av akrylnitrilbutadienstyren (ABS) og montere dem etter CAD-design (figur 1A). CAD-designet er inkludert i materialtabellen.
  2. Bruk dobbeltsidig tape til å feste magneten til den magnetbevegelige enheten (figur 1A).
  3. Sett magnetbevegelsesenheten ved siden av mikroskoptrinnet. Bruk de tre knottene til å justere magnetens romlige plassering til den kan bevege seg over petriskålen mellom 13 mm og 120 mm.
    MERK: Forsikre deg om at den øvre grensen for avstanden mellom magneten og petriskålen er så stor som mulig for å unngå uønsket kraftpåføring på magnetiske mikroperler. 120 mm er maksimumsverdien i dette eksperimentelle oppsettet. Sørg for at magneten ikke forstyrrer mikroskopdeler, inkludert mål og motoriserte trinn.
  4. Sett magneten til høyeste z-posisjon (ved 120 mm).

5. Tving applikasjon og levende celleavbildning

  1. Oppsett av miljøkammeret for langtidsavbildning
    1. Påfør 75% etanoloppløsning for å sterilisere og rengjøre miljøkammeret grundig.
    2. Plasser miljøkammeret på det motoriserte stadiet av det omvendte mikroskopet.
    3. Åpne CO 2-tanken og sett CO2-tilstrømningshastigheten til 160 ml/min.
    4. Juster temperaturen på kammeret til 44 °C (topp), 42 °C (badekar) og 40 °C (trinn).
    5. Tilsett 20 ml renset vann i badekaret i miljøkammeret for å opprettholde 90% fuktighet.
    6. Ta ut petriskålen med glassbunn som inneholder målceller fra vevskulturinkubatoren og plasser den i kammeret.
    7. Påfør metallklemmen i miljøkammeret for å fikse petriskålposisjonen.
      MERK: Petriskålen må klemmes fast i kammeret fordi den magnetiske kraften kan bevege parabolen hvis den ikke klemmes.
    8. Lukk lokket på kammeret.
  2. Optimalisering av bildeparametere
    1. Optimaliser pinhole-størrelsen: Pinhole blokkerer fotonene som er ute av fokus. En større pinhole-størrelse gir flere ufokuserte fotoner, men et lysere bilde. En mindre pinhole-størrelse gir et mer fokusert og dimmere bilde. Sørg for å optimalisere pinhole-størrelsen for å få konfokale bilder i fokus med riktig signal-til-støy-forhold.
    2. Optimaliser laserintensiteten: Laserintensiteten bestemmer intensiteten av eksitasjon og dermed utslippslys. Den lave laserintensiteten gir et lavt signal-til-støy-forhold. For høy laserintensitet vil forårsake fotobleking. Juster laserintensiteten tilsvarende.
    3. Optimaliser trinnstørrelsen og trinnene: Trinn og trinnstørrelse bestemmer hvor mange bilder som skal tas i en Z-stabel. Mindre trinnstørrelser og flere trinn vil øke Z-stack-oppløsningen, men vil også øke fotoblekingen. I dette eksperimentet ble 1 μm trinnstørrelse brukt for cellene med ~ 15 μm cellehøyde.
    4. Optimaliser eksponeringstiden: Eksponeringstiden bestemmer hvor lenge cellen skal eksponeres for eksitasjonslaseren. En lav eksponeringstid vil redusere signal-til-støy-forholdet. En høy eksponeringstid vil føre til fotobleking. En eksponeringstid på 1 ramme per 4 s ble brukt i dette eksperimentet.
    5. Optimalisering av bildeparametere: Endre en av de fire parameterne iterativt og hold de andre parametrene konsistente. Hver gang måler du YAP N / C-forholdet for hvert bilde og sammenligner YAP N / C-forholdsendringen for å bestemme fotoblekingsnivået. Gjenta optimaliseringsprosessen til du oppnår en balanse mellom signal-til-støy-forholdet, bildehastigheten og fotoblekingen.
    6. Definer bildekonfigurasjonene ved hjelp av de optimaliserte bildeparameterne for raskere bildeinnstillinger under eksperimentene.
      MERK: Konfigurasjonene som ble brukt i denne studien er beskrevet i pkt. 5.3 i bildeparametere. Hvis du vil optimalisere bildeparametere for konfigurasjoner i avsnitt 5.3, bruker du samme metode som i trinn 5.2.5.
  3. Liten kraftapplikasjon og konfokal bildebehandling
    MERK: Nikon Ti2-E mikroskop ble brukt til avbildning i denne studien, og detaljerte trinn for bildeopptak er gitt nedenfor.
    1. Åpne det omvendte mikroskopet. Åpne programvaren Elements.
    2. Definer konfigurasjon magnetic_find. Sjekk bare FITC-kanal. Sett PMT HV = 70, Offset = 0, Laser intensitet = 10. Sett skannehastigheten til 1 ramme per 2 s ved å klikke på 1/2-knappen . Sett pinhole-størrelsen til 1.2 AU ved å klikke på 1.2 A.U. -knappen. Denne konfigurasjonen vil bli brukt i trinn 5.3.5.
    3. Definer konfigurasjon magnetic_YAP_Nucleus. Sjekk FITCH-kanalen. Sett PMT HV = 70, Offset = 0, Laser intensitet = 10. Sett skannehastigheten til 1 ramme per 4 s ved å klikke på 1/2-knappen . Sett pinhole-størrelsen til 1.2 AU ved å klikke på 1.2 A.U. -knappen. For å avbilde kjernegrensen og kjernefysisk flekkintensitet, sjekk Cy5-kanalen. Sett PMT HV = 70, Offset = 0, Laser intensitet = 10. Pinhole-størrelsen er optimalisert for 3D YAP-bildebehandling. Ikke klikk på 1.2 A.U.- knappen igjen etter å ha sjekket Cy5-kanalen. Denne konfigurasjonen vil bli brukt i trinn 5.3.7.
    4. Slå på DIA gjennom Elements om nødvendig. Åpne SpinView, bruk et lyst felt, og juster fokuset på objektet for å få et klart fokusbilde av celler. Bruk et 10x mål for å finne passende flere enkeltceller under tre forhold: med en enkelt mikroperle inni, med flere mikroperler inni, og uten mikroperle inni. Bytt til 40x mål. Navngi denne stillingen med riktig posisjonsnummer.
    5. Åpne elementer. Klikk på magnetic_find. Klikk på Fjern interlock-knappen.
    6. Klikk på Skann og juster Z-posisjonen til fokalplanet. Klikk på Topp - og Bunn-knappene for å angi nedre og øvre grense for Z-stakken for de valgte cellene. Stopp skanningen ved å klikke på Skann på nytt.
    7. Bytt til magnetic_YAP_Nucleus konfigurasjon. Angi filnavnet som before_small_force.nd2. Klikk på Kjør-knappen med den innspilte Z-stacken.
    8. Bytt til riktig lysbane og slå på DIA. Åpne SpinView og klikk på opptaksknappen . I mellomtiden snurrer du knappen på den magnetbevegelige enheten for å flytte magneten ned til 46 mm over petriskålbunnen. Lagre lysfeltbildesekvens eller video. Sjekk videoen for å bekrefte at mikroperler viser forskyvning indusert av magnetisk kraft.
    9. Gjenta trinn 5.3.5-5.3.7; Sett filnavnet til after_small_force.nd2.
    10. Bytt til riktig lysbane og slå på DIA. Deretter åpner du SpinView og klikker på Innspilling knapp. I mellomtiden spinner du knappen på den magnetbevegelige enheten for å flytte magneten opp til 120 mm over petriskålbunnen. Lagre lysfeltbildesekvens eller video.
    11. Gjenta trinn 5.3.5-5.3.7 og sett filnavnet til before_large_force.nd2.
  4. Stor kraftapplikasjon og konfokal bildebehandling
    1. Fjern lokket på miljøkammeret slik at magneten når 13 mm over petriskålbunnen.
    2. Bytt til riktig lysbane og slå på DIA. Åpne SpinView og klikk på opptaksknappen . I mellomtiden snurrer du knappen på den magnetbevegelige enheten for å flytte magneten ned til 13 mm over petriskålbunnen. Lagre lysfeltbildesekvens eller video. Sjekk videoen for å bekrefte at mikroperler viser forskyvning indusert av magnetisk kraft.
    3. Gjenta trinn 5.3.5-5.3.7 og sett filnavnet til after_large_force.nd2.
    4. Bytt til riktig lysbane og slå på DIA. Deretter åpner du SpinView og klikker på Innspilling knapp. I mellomtiden spinner du knappen på den magnetbevegelige enheten for å flytte magneten opp til 120 mm over petriskålbunnen. Lagre lysfeltbildesekvens eller video.
    5. Gjenta trinn 5.3.5-5.3.7; Sett filnavnet til retract_large_force.nd2.
    6. Lukk lokket på miljøkammeret.
  5. Gjenta trinn 5.2 og 5.3 for flere synsfelt for å få mer data om nødvendig.

6. Bildebehandling og dataanalyse

  1. Kvantifisering av YAP N / C-forhold
    1. Åpne Fiji ImageJ. Åpne .nd2-bildene som ble tatt i trinn 5.
    2. Klikk på Analyser > Angi målinger. Kontroller område, integrert tetthet, gjennomsnittlig gråverdi og formbeskrivelser.
    3. Bruk Cy5-kanalen til å identifisere kjernen. Klikk Frihåndsmarkeringer for å bruke frimerkeverktøyet til å skissere kjernen. Sjekk også den automatiske kjernemaskemakroen i ImageJ (se materialtabellen).
    4. Klikk på Analyser > mål i FITC-kanalen. Den målte verdien av gjennomsnittet er den gjennomsnittlige nukleære YAP-intensiteten DN.
    5. Bruk Cy5-kanalen til å identifisere kjernen. Bruk FITC-kanalen til å identifisere cellen. Klikk Frihåndsvalg for å bruke frivalgsverktøyet til å velge et område av interesse i cytoplasma og unngå den magnetiske mikroperlen. Denne regionen av interesse må ikke inkludere kjernen.
    6. Klikk på Analyser > mål i FITC-kanalen. Den målte verdien av gjennomsnittet er den gjennomsnittlige cytoplasmatiske YAP-intensiteten DC.
    7. Beregn YAP N / C-forholdet = D N / DC.
  2. Kvantifisering av nukleær form og normalisert kjernefysisk flekkintensitet
    1. Åpne Fiji ImageJ. Åpne .nd2-bildene som ble tatt i trinn 5.
    2. Klikk på Analyser > Angi målinger. Kontroller område, integrert tetthet, gjennomsnittlig gråverdi og formbeskrivelser.
    3. Bruk Cy5-kanalen til å identifisere kjernen. Klikk Frihåndsmarkeringer for å bruke frimerkeverktøyet til å skissere kjernen.
    4. Klikk på Analyser > mål i Cy5-kanal. Den målte verdien av gjennomsnittet er atomflekkintensiteten. Den målte verdien av Circ. er kjernefysisk sirkularitet.
    5. For å sammenligne atomflekkintensiteten ved forskjellig krafttilstand, er all kjernefysisk flekkintensitet delt med atomflekkintensiteten i "before_small_force.nd2" for å generere den normaliserte kjernefysiske flekkintensiteten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Design av en magnetbevegelig enhet og anvendelse av magnetisk kraft
For å påføre kraft på kjernen gjennom de magnetiske mikroperlene, ble en magnetbevegelig enhet designet og bygget for å kontrollere magnetens romlige posisjon. Den magnetbevegelige enheten inneholder en sentral ramme, tre knotter og skinner for å bevege den vedlagte magneten i x-, y- og z-retninger uavhengig ved den romlige oppløsningen på 1,59 mm per syklus (figur 1A). Når magneten er flyttet nær de 7 μm mikroperlene som leveres inn i cellene (figur 1B), tiltrekker den magnetisk mikroperlene og bruker kraft på kjernen (figur 1C). Kraftretningen og størrelsen styres av den relative posisjonen mellom magneten og mikroperlene.

I dette papiret ble to forskjellige størrelser av kraft påført mikroperlene: (1) en relativt liten kraft når magneten ble plassert 46 mm over cellen; og (2) en relativt stor kraft når magneten ble plassert 13 mm over cellen. Den magnetiske kraften som påføres mikroperlen F kan beregnes ved ligningen59: Equation 1, hvor Nd er demagnetiseringsfaktoren (0, 33 for en sfære), μ er permeabiliteten i vakuum (6, 3 × 10-3 H / m for jern), Vp er volumet av mikroperlen (178 μm 3 for en 7 μm mikroperle), og H er magnetfeltintensiteten med enheten A/m. H er proporsjonal med magnetisk flukstetthet B med enhet Tesla. Siden den magnetiske kraften som virker på en enkelt 7 μm mikroperle ble forventet å være ekstremt liten og vanskelig å oppdage av en krafttransduser, ble den magnetiske flukstettheten B som referanse målt for å indikere størrelsen på den magnetiske kraften som ble påført mikroperlene. En Hall-sensor ble introdusert på plasseringen av petriskålbunnen for å måle den magnetiske flukstettheten, og magneten ble plassert i en avstand på 13 mm eller 46 mm fra bunnen av petriskålen. Fordi de 7 μm mikroperlene påvirker magnetfeltet, ble den magnetiske flukstettheten målt med og uten mikroperler. Uavhengig av tilstedeværelsen av 7 μm mikroperler ble den samme magnetiske fluxdensiteten oppnådd: B = 60 , 1 mT i en avstand på 13 mm og B = 3, 7 mT i en avstand på 46 mm. Denne målingen viser at effekten av 7 μm mikroperler på magnetfeltet generert av den sylindriske magneten med 12,7 mm diameter og 12,7 mm høyde (se materialtabellen) ikke kunne påvises av Hall-sensoren som ble brukt i denne studien. Imidlertid var den magnetiske flukstettheten i tilfelle med 13 mm avstand omtrent 16 ganger høyere enn den med en 46 mm avstand. Eksperimentell kalibrering av den magnetiske kraften er beskrevet i følgende avsnitt (figur 6).

Levering av magnetiske mikroperler i cytoplasma
12 timer etter sådd av celler på petriskålen med glassbunn, tilsettes 7 μm mikroperler i kulturmediet. Mikroperler blir spontant internalisert av cellene. Fordi mikroperlene ikke avgir fluorescens under lasereksitasjon i FITC- eller Cy5-kanal, kan plasseringen av de internaliserte mikroperlene identifiseres ved plasseringen av den mørke hulen med konfokal avbildning av fluorescens av YAP og kjerne. Både 2D- og 3D-bilder viser at mikroperlen er i cytoplasma utenfor kjernen (figur 2).

Internaliseringsnivåene av mikroperler i cellene avhenger av varigheten av samkulturen av celler og mikroperler. Dermed ble cellene kategorisert i tre typer i henhold til mengden internaliserte mikroperler - ingen mikroperle, enkelt mikroperle og multimikroperler (figur 3A). Ved 7 timers samkultur internaliserte 62% av cellene ingen mikroperle, 15% av cellene internaliserte en enkelt mikroperle, og 23% av cellene internaliserte multimikroperler (totalt antall celler = 13). Ved 12 timers samkultur internaliserte 53% av cellene ingen mikroperle, 26% av cellene internaliserte en enkelt mikroperle, og 21% av cellene internaliserte multimikroperler (totalt antall celler = 62). Ved 24 timers samkultur internaliserte 20% av cellene ingen mikroperle, 28% av cellene internaliserte en enkelt mikroperle, og 53% av cellene internaliserte multimikroperler (totalt antall celler = 40) (figur 3B).

Mikroperler i cytoplasma påvirker ikke nukleær form og YAP-aktivitet
For å undersøke effekten av internalisering av mikroperler på kjerneform og proteinaktivitet, ble kjerneformen først kvantifisert av henholdsvis sirkularitet og YAP-aktiviteten ved YAP N / C-forhold. Sirkularitet beregnes ved sirkularitet = 4μ (areal / omkrets2). De detaljerte trinnene for å kvantifisere YAP N / C-forholdet ble beskrevet i en tidligere publikasjon60. Kort fortalt ble YAP N / C-forholdet beregnet ved å dele den gjennomsnittlige YAP-intensiteten i kjernen med den gjennomsnittlige YAP-intensiteten i cytoplasma. Med tanke på muligheten for at samkultur av mikroperler og celler kan påvirke kjerneformen selv om ingen mikroperle er internalisert, cellene uten samkultur (svarte prikker, kontroll #1, Sirkularitet = 0,806 ± 0,037, n = 20), celler co-dyrket med mikroperler, men uten internalisering (grå prikker, kontroll # 2, Sirkularitet = 0,806 ± 0,035, n = 22), celler internalisere enkelt mikroperle (røde prikker, enkelt mikroperle, Sirkularitet = 0,793 ± 0,048, n = 15), og celler som internaliserer multimikroperler (blå prikker, multimikroperler, n = 7) (figur 3C) ble sammenlignet. Resultatet viser at blant alle de fire testede gruppene hadde kjernefysisk sirkularitet ingen signifikant forskjell (figur 3C).

Deretter, for å undersøke om YAP N / C-forholdet påvirkes av internalisering av mikroperler, ble cellene co-dyrket med mikroperler, men uten internalisering (grå prikker, kontroll # 2, YAP N / C-forhold = 1,155 ± 0,074, n = 35) bare sammenlignet med cellene med enkelt- eller multi-mikroperle internalisering (røde prikker, celle med mikroperler, YAP N / C-forhold = 1,140 ± 0,078, n = 36) ved samkulturens 12. time (figur 3D). Cellene uten kokultur ble ikke sammenlignet fordi parabolen med mikroperler viser lavere celletetthet, noe som kan påvirke YAP N / C-forholdet12. Resultatet viser ingen signifikant forskjell (p-verdi = 0,667) i YAP N / C-forholdet mellom de to gruppene, noe som indikerer at internalisering av mikroperler ikke påvirker YAP-aktiviteten (figur 3D).

Magnetisk kraft deformerer kjernen
Først vises deformasjonen av kjernen. Deformasjonen av kjernen er forårsaket av kompresjonskraften påført av mikroperlene (figur 4A og figur 4A1-3) i celler som inneholder cytoskelett. Disse dataene (dvs. kjernen som deformeres av mikrobeadens kompresjon) støtter at mikroperlen faktisk bruker en kraft på kjernen i den overfylte cytoplasma. En lysfeltvideo som viser kraftpåføringsprosessen er inkludert i tilleggsmaterialet (tilleggsvideo 1). For det andre, fordi det er mulig at mikroperlen samtidig bruker kraft på det omkringliggende cytoskelettet og deformerer kjernen indirekte, ble kompresjonseksperimentene gjentatt i celler som har de forstyrrede aktinfilamentene (behandling av Cyto D (2,5 μM, 1 time); Figur 4B). Denne studien viser at aktinfilamentene faktisk depolymeriseres (figur 4B), og kjernen deformeres av mikroperlene (figur 4B1-3). Disse dataene støtter at mikroperlene bruker en kraft direkte på kjernen i fravær av sammenflettet omkringliggende cytoskelett. Samlet viser disse dataene at protokollene og verktøyene kan bruke en kraft direkte på kjernen.

Romlig og tidsmessig kontroll av intracellulære magnetiske mikroperler
For å oppnå romlig kontroll av mikroperlene ble et par magneter brukt til å flytte mikroperlen og kontrollere plasseringen av innrykket på kjernen (figur 5A). Perlen kan bare flyttes med opptil 2,2 μm forskyvning (Figur 5A1-4), men kan fleksibelt påføre innrykk på kjernen på tilsvarende steder. Det omkringliggende aktincytoskjelettet kan begrense bevegelsen av mikroperler. Derfor ble aktincytoskjelettet forstyrret av Cyto D-behandling (2,5 μM, 1 time), og mikroperleplasseringen ble manipulert, men viste lignende resultater. Derfor kan en hypotese foreslås: mikroperlen kan fysisk/kjemisk binde seg til kjernen og andre omkringliggende organeller i cytoplasmaet, noe som begrenser dens store romlige bevegelse (>2,2 μm).

For å oppnå romlig kontroll av mikroperlene ble det brukt et par magneter som styrer mikroperlene for å påføre og frigjøre kraften to ganger (med forskjellig kraftstørrelse) på samme plassering av kjernen (figur 5B og figur 5B1-B4). Den nåværende tidsvarigheten for en syklus med kraftapplikasjon og frigjøring er 12 s. Hastigheten til tidsmessig kontroll bestemmes av driftshastigheten til XYZ-flytteren.

Kalibrering av magnetkraften
Den perlepåførte kraften på kjernen ble estimert ved eksperimentelt å måle kraften påført av en kalibrert atomkraftmikroskopi (AFM) som forårsaker en lignende deformasjon av kjernen. Spesielt ble aktincytoskjelettet først oppløst av CytoD (2,5 μM; 1 time, figur 4B) fordi AFM bruker kraft på cellens apikale overflate, og fjerning av aktinbark og cytoskelett tillater mer direkte kontakt mellom AFM-spiss og cellekjerne. Cellene som har sin aktinbark og cytoskjelett oppløst, er i live basert på sammenligning av nukleær form og nukleær fargeintensitet med de i friske celler (supplerende figur 1). For det andre ble den ikke-funksjonaliserte AFM-spissen (halvsfærisk, radius = 5 μm) som har en lignende størrelse og form som mikroperlene, brukt til å rykke inn cellens apikale overflate på en kraftstyrt måte og samtidig skaffe 3D konfokale bilder av celle- og kjernelegemene (figur 6A). Størrelsen på trykkkraften fra 0, 8 nN til 2, 0 nN ble valgt fordi, basert på litteraturen24, kraft med en størrelse på 1, 5 nN var kjent for å deformere kjernen tilstrekkelig. For det tredje ble den normale deformasjonen av kjernen som ble forårsaket av AFM-innrykket målt gjennom kvantitativ bildeanalyse. Også kalibreringskurven som gir det kvantitative AFM-kraftforskyvningsforholdet (figur 6B) ble oppnådd. For det fjerde ble en trykkkraft påført den laterale overflaten av kjernen ved å kontrollere mikroperler som har lignende størrelse og form (radius = 7 μm; Figur 6C), og deformasjonen av kjernemembranen ble målt via bildeanalyse. Den perlepåførte kraften estimeres basert på AFM-kraftforskyvningsforholdet.

For eksempel, i figur 6C, er deformasjonen av kjernen forårsaket av magnetiske mikroperler (diameter = ~ 7 μm) ved 'stor kraft' rundt 1,5 μm. I figur 6D ble en AFM-spiss som har en 5 μm semisfærisk sonde brukt til å rykke inn cellen på toppen av kjernen for å oppnå 1,5 μm kjernedeformasjon. Den tilsvarende kraften registrert av AFM er 1,4 nN. Derfor er kraften som påføres av mikroperlene estimert til å være ~ 1,4 nN. Etter samme tilnærming kalibreres den magnetiske kraften ved 'liten kraft' som 0,8 nN, og den forårsaket 0,4 μm nukleær innrykk.

Denne studien vurderer at den AFM-målte kraften kan representere den mikroperlepåførte kraften basert på følgende forutsetninger: (1) Stivheten til kjernen i forskjellige celler er lik. (2) Kjernens mekaniske egenskaper er ikke avhengig av atomstedene som innrykket ble påført på. Den magnetiske kraften påføres horisontalt på sidens sider av kjernen, mens AFM-kraften påføres vertikalt på de apikale sidene av kjernen. Den mekaniske forskjellen mellom dem antas å være ubetydelig. (3) I AFM-eksperimenter påfører sonden direkte kraft gjennom cellemembranen og cytoskjelettet på kjernen. Etter å ha forstyrret aktinfilamenter, er den AFM-påførte kraften på kjernen lik den mikroperlepåførte kraften på kjernen, til tross for membranen som fortsatt ligger mellom AFM-sonden og kjernen i det tidligere tilfellet.

Magnetisk kraft utløser endring av YAP N / C-forhold
For å bevise at den magnetiske kraften som påføres mikroperlene kan deformere kjernen og indusere YAP-translokasjon, ble YAP N / C-forholdet mellom cellene med mikroperler internalisering kvantifisert i tre trinn: (1) før påføring av kraften, (2) etter påføring av kraften, og (3) etter frigjøring av kraften. Noen celler viste en endring av kjerneform og YAP N / C-forhold når kraften ble påført eller frigjort (figur 7A, C). Intensitetsendringene i YAP kan tilskrives av to mulige mekanismer: (1) YAP-FP-proteiner translokerer fra cytoplasma til kjernen etter kraftpåføring. I dette tilfellet bør kjernefarging ikke vise noen signalendringer. Kjernefysisk fargeintensitet bør ikke endres i stor grad; (2) YAP-FP-proteiner translokerer ikke etter kraftpåføring. De observerte YAP-intensitetsendringene skyldes den kraftinduserte kjernevolumendringen og den resulterende YAP-FP-konsentrasjonsendringen. I dette tilfellet bør atomfargingsintensiteten endres i en lignende trend som YAP-kjerneintensiteten fordi konsentrasjonen av fargestoff også endres etter hvert som kjernevolumet endres. Derfor ble den kjernefysiske fargeintensitetsendringen fra den røde kanalen (eksitasjon: 650 nm; utslipp: 681 nm) målt. Intensiteten endres i YAP i den grønne kanalen, men det er ingen intensitetsendringer i kjernefarging i den røde kanalen. Dermed eksisterer sannsynligvis den første mekanismen (figur 7B). Samlet viser resultatene at den magnetiske kraftinduserte nukleære deformasjonen utløser YAP-translokasjon.

Deretter ble nettoendringen av YAP N / C-forholdet kvantifisert innenfor to grupper av celler: (1) celler uten mikroperle internalisert (grå prikker, kontroll, n = 9); og (2) valgte celler med internalisert mikroperle (er) som viser endring av YAP N / C-forhold (grønne prikker for liten kraft, røde prikker for stor kraft, n = 11). Ved 0,8 nN-kraft viser celler med internalisert mikroperle(r) netto YAP N/C-forholdsendring = -0,030 ± 0,029, n = 11; kontrollceller viser netto YAP N / C-forholdsendring = -0,003 ± 0,012, n = 9. Ved 1,4 nN-kraft viser celler med internalisert mikroperle(r) netto YAP N/C-forholdsendring = 0,011 ± 0,040, n = 11; kontrollceller viser netto YAP N / C-forholdsendring = 0,005 ± 0,005, n = 9 (figur 8A). Ved 0,8 nN-kraft viser celler med internalisert mikroperle(r) absolutt netto YAP N/C-forholdsendring = 0,057 ± 0,017, n = 11; kontrollceller viser netto YAP N / C-forholdsendring = 0,021 ± 0,007, n = 9. Forskjellen er signifikant (p-verdi = 0,0093, **). Ved 1,4 nN-kraft viser celler med internalisert mikroperle(r) absolutt netto YAP N/C-forholdsendring = 0,070 ± 0,020, n = 11; kontrollceller viser netto YAP N / C-forholdsendring = 0,010 ± 0,003, n = 9. Forskjellen er signifikant (p-verdi = 0,0007, ***) (figur 8B). Sammen bekrefter disse resultatene at den magnetiske kraften som påføres mikroperlene i cytoplasma, faktisk kan indusere YAP-translokasjon og endre YAP N / C-forhold.

Figure 1
Figur 1: Design av magnetisk bevegelig enhet og skjematisk kraftapplikasjon i cellen ved magnetiske mikroperler . (A) Tredimensjonalt skjema for enheten implementert for å holde magneten og flytte den i x-, y- og z-retninger. Enheten består av en base 241, 3 mm i bredde og 104, 1 mm i høyde, to knotter, en stang og en magnet. Knappene vil bli splined i riktig driftsrotasjonsretning, som vil levere bevegelse i tilsvarende retning. Magneten vil bli senket nærmere / hevet videre til parabolen for å påføre magnetisk kraft med forskjellig størrelse og retning på magnetiske mikroperler. (B) Eksempel skanning elektronmikroskop (SEM) bilde av 7 μm jern mikroperle. (C) Magnetiske mikroperler levert inne i cytoplasma kan påføre kraft til organeller som kjernen når et magnetfelt påføres. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Representative bilder som viser magnetisk mikroperle (svart hul spiss med blå pil) internaliseres i cellen (indikert med YAP) og utenfor kjernen. (A) X-Y tverrsnitt av en celle av YAP (grønn), kjerne (rød) og lysfelt. (B) 3D-rekonstruksjon av cellen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Mikroperler internalisert av cellene påvirker ikke kjerneformen og YAP N / C-forholdet . (A) Representative lysfelt- og fluorescensbilder av celler uten mikroperle, enkeltmikroperle og multimikroperle internalisering. Blå piler indikerer posisjonen til mikroperler inne i cytoplasma. (B) Ved 7 timer (n = 13), 12 timer (n = 62) og 24 timer (n = 40) samkultur, viser prosentandelen av cellene ingen mikroperle, enkelt mikroperle og multimikroperle internalisering. (C) Nukleær sirkularitet viser ingen signifikant forskjell mellom kontrollceller og celler med mikroperle internalisering. Kontroll #1 (uten mikroperle-samkultur): Sirkularitet = 0,806 ± 0,037, n = 20; Kontroll #2 (med mikroperle-samkultur, uten mikroperle-internalisering): Sirkularitet = 0,806 ± 0,035, n = 22; Enkel mikroperle internalisering: Sirkularitet = 0,793 ± 0,048, n = 15; multi-mikroperle internalisering: Sirkularitet = 0,780 ± 0,061, n = 7. (D) YAP N / C-forhold viser ingen signifikant forskjell (p-verdi = 0,667) mellom kontrollceller (med mikroperle-kokultur, uten mikroperle-internalisering, YAP N / C-forhold = 1,155 ± 0,074, n = 35) og celler med mikroperle-internalisering (YAP N / C-forhold = 1,140 ± 0,078, n = 36). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Direkte kraftpåføring på kjerne med og uten aktinfilamenter. (A) Celler viser aktinfilamenter (gul). (A1) Bilde av kjernen når ingen kraft påføres. (A2) Bilde av kjernen etter at kraften er påført. (A3) Overlappende bilde av atomgrensen før og etter kraftapplikasjonen viser kjernefysisk innrykk. (B) Celler viser forstyrrede aktinfilamenter (gul) etter Cyto D-behandling (2,5 μM, 1 time). (B1) Bilde av kjernen når ingen kraft påføres. (B2) Bilde av kjernen etter at kraften er påført. (B3) Overlappingsbilde av atomgrensen før og etter kraftapplikasjonen viser nukleær innrykk med det forstyrrede aktincytoskjelettet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Romlig og tidsmessig kontroll av intracellulær magnetisk mikroperle . (A) Et par magneter styrer romlig den magnetiske mikroperlen. (A1) Lysfeltbilde av cellegrense (grønn linje), atomgrense (rød linje) og magnetisk mikroperle (gul linje) i posisjon 1. (A2) Magnetisk mikroperle innrykker kjernen i posisjon 1. (A3) Magnetisk mikroperle flyttes til posisjon 2 (gul linje). Posisjon 1 vises som en referanse (gul stiplet linje). (A4) Magnetisk mikroperle innrykker kjernen i posisjon 2. (B) Et par magneter styrer midlertidig magnetisk mikroperle. (B1) Lysfeltbilde av en celle uten kraft påført ved tidspunkt I. (B2) Magnetisk mikroperle tilfører en kraft på kjernen ved tidspunkt II. (B3) Magnetisk mikroperle frigjør kraften fra kjernen ved tidspunkt III. (B4) Magnetisk mikroperle bruker en større kraft på kjernen ved tidspunkt IV. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6. Kalibrering av mikroperlepåført kraft på kjernen ved bruk av AFM-innrykk. (A) Skjematisk illustrasjon av kalibreringsprosessen. Magnetisk mikroperle bruker horisontal kompresjon på kjernen (venstre), og AFM-sonden rykker vertikalt på kjernen. (B) AFM innrykkskraft vs. kjernefysisk deformasjon. (C) Representativt bilde av kjernedeformasjon (1,5 μm) før og etter kraftpåføring ved magnetisk mikroperle. (D) Representativt bilde av lignende kjernedeformasjon (1,5 μm) før og etter AFM-innrykk med 1,4 nN-kraft. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Representative data som viser YAP N / C-forholdsendring, induseres av magnetisk kraftapplikasjon og frigjøring . (A) X-Y tverrsnitt av YAP (grønn) og kjerne (rød) fluorescerende bilde av cellen uten kraft, kraft på og kraft av. I force-on-tilstanden reduseres cytoplasmatisk YAP-intensitet på stedet som pekes av en gul pil mens nukleær YAP-intensitet øker. YAP N / C-forholdet øker. (B) YAP N / C-forholdet øker når kraften på (fra 1,0791 til 1,2327) og reduseres når den slås av (fra 1,2327 til 1,1548). Normalisert kjernefysisk flekkintensitet viser mindre endring med kraftpåføring (1,00117) og frigjøring (0,95578). (C) X-Z tverrsnitt av YAP (grønn) og kjerne (rød) bilde av cellen uten kraft, kraft på og kraft av. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: YAP N / C-forholdsendring indusert av magnetisk kraftapplikasjon. (A) Ved 0,8 nN-kraft viser celler med internalisert mikroperle(r) netto YAP N/C-forholdsendring = -0,030 ± 0,029, n = 11; kontrollceller viser netto YAP N / C-forholdsendring = -0,003 ± 0,012, n = 9. Ved 1,4 nN-kraft viser celler med internalisert mikroperle(r) netto YAP N/C-forholdsendring = 0,011 ± 0,040, n = 11; kontrollceller viser netto YAP N / C-forholdsendring = 0,005 ± 0,005, n = 9. (B) Ved 0,8 nN-kraft viser celler med internalisert mikroperle(r) absolutt netto YAP N/C-forholdsendring = 0,057 ± 0,017, n = 11; kontrollceller viser netto YAP N / C-forholdsendring = 0,021 ± 0,007, n = 9. Forskjellen er signifikant (p-verdi = 0,0093, **). Ved 1,4 nN-kraft viser celler med internalisert mikroperle(r) absolutt netto YAP N/C-forholdsendring = 0,070 ± 0,020, n = 11; kontrollceller viser netto YAP N / C-forholdsendring = 0,010 ± 0,003, n = 9. Forskjellen er signifikant (p-verdi = 0,0007, ***) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplerende figur 1: Nukleær form og kjernefysisk fargeintensitet. (A) Uten Cyto D-behandling, (B) med Cyto D-behandling og (C) Dødcelle. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsvideo 1: En lysfeltvideo som viser kraftsøknadsprosessen. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Internalisering av magnetiske mikroperler (seksjon 2.2) er kritisk fordi ekstracellulære mikroperler ikke kan bruke kraft direkte på kjernen. Kraftapplikasjon og avbildning (avsnitt 5.3) er kritiske trinn i dette eksperimentet, og kraften som trengs for å deformere kjernen og indusere meningsfulle biologiske konsekvenser, kan være prøveavhengig. Kraftstørrelsen i dette eksperimentet (0,8 nN og 1,4 nN) kan økes ytterligere for å utløse kjernefysisk mekano-sensing i mindre følsomme celler.

For å anvende magnetisk kraft på en kvantitativ måte med høy gjennomstrømning, er internaliseringen av en enkelt mikroperle en ideell tilnærming. I denne studien var prosentandelen av cellene med enkeltmikroperle internalisering lik ved 12 timer (26%) og 24 timer (28%), mens cellene uten mikroperle internalisering var høyere ved 12 timer (53%) enn ved 24 timer (20%) (figur 3B). Det antas at 12 timer er den optimale tiden for kraftapplikasjonseksperiment fordi flere enkeltmikroperler kan inkluderes, og celler kan kontrolleres. For forskjellige cellelinjer og mikroperlestørrelser bør kokulturtid og mikroperlekonsentrasjon testes for å bestemme de tilsvarende optimale forholdene.

I forsøkene ble ikke mikroperlene belagt for å spesifikt binde seg til kjernen. Derfor er kraften som overføres direkte fra mikroperlene til kjernen, sannsynligvis bare komprimerende. Resultatene viser at YAP N / C-forholdet øker og reduserer cellepopulasjonen (figur 8A). En mulig årsak er at den magnetiske kraften som påføres via mikroperlene, kan forårsake positiv eller negativ spenningsendring i cytoskelettet og regulere YAP N / C-forholdet for å øke eller redusere, henholdsvis28. Tidligere forskning viser at trykkkraft på kjernen induserer en økning i YAP N / C-forholdet28. I fremtidige eksperimenter, for å studere den direkte kraftføleren av kjernen, kan cytoskelettet forstyrres for å eliminere kraftoverføringen fra cytoskelettet til kjernen.

Det er to potensielle ulemper ved dagens metoder. For det første, i disse eksperimentene, ble 3D-moveren (figur 1A) brukt til å justere perlenes bevegelse, som overvåkes av sanntids konfokal avbildning og tar sikte på å bruke en trykkkraft på kjernen. På grunn av den glatte naturen til kjernemembranen og det komplekse miljøet i cytoplasma, kan retningen av den perlepåførte kraften imidlertid ikke være rent komprimerende (dvs. ikke helt vinkelrett på kjernemembranoverflaten). Denne ufullkommenheten kan føre til at en skjærkraft påføres kjernemembranen. For det andre er de nåværende mikroperlene som brukes i denne studien ikke konjugert med antistoffet for å binde seg til kjernen, fordi den romlige mobiliteten til perlene er kritisk i det nåværende eksperimentet for å demonstrere fordelen med ikke-kontakt magnetisk aktuator. Derfor kan den nåværende metoden ikke anvende spenning på kjernemembranen.

I fremtiden vil (1) perler med anti-nesprin-1 antistoff bli konjugert for å spesifikt binde seg til kjernen. Dette kan garantere direkte og spesifikk kraftoverføring mellom mikroperler og målproteinene. (2) Kraftretningen vil bli kalibrert ved å manipulere den ene magnetiske mikroperlen i myk hydrogel innebygd med fluorescerende perler. 3D-forskyvningen av fluorescerende perler kan brukes til å beregne deformasjonsfeltet til hydrogelen og bestemme kraftretningen som en funksjon av det påførte magnetfeltet. Etter at mikroperlen er kjemisk bundet med kjernen, vil påføring av en kraft med en kjent retning bestemme krafttypen (spenning, kompresjon eller skjær). (3) 3D-avbildningen av kjernefarging vil bli brukt til å bygge en 3D-simulering FEM-modell av kjernen. Kraftretningen kan verifiseres ved å sammenligne kjernedeformasjonen før og etter magnetisk kraftapplikasjon.

Den unike teknikken utviklet i denne studien gir flere potensielle fordeler: (1) Sammenlignet med vertikal innrykk av AFM-sonder, kan magnetiske mikroperler bruke kraft i alle retninger. Celler dyrket på 2D-substratoverflater kan ha heterogen proteinfordeling og orientering på sine vertikale og horisontale flater av plasmamembranen og kjernefysisk konvolutt. Bruk av kraft horisontalt kan indusere tidligere uobserverte mekanoserende responser. (2) Når mikroperlene er funksjonelt belagt for å binde seg til kjernene, kan både skyve- og trekkkrefter påføres direkte på kjernen for å studere den differensielle kjernefysiske mekano-sensingen på grunn av de forskjellige kraftretningene. (3) Ved å kontrollere den spesifikke bindingen av mikroperler til visse nukleære konvoluttproteiner, kan tidligere underundersøkte mekanismer for kjernekraftmåling belyses. Nye bevis viser at kjernen sannsynligvis er en mekano-sensor36, og kjernefysisk mekano-sensing er den mest direkte regulatoren av YAP-translokasjon28. Mekanismen for nukleærregulert YAP-translokasjon studeres aktivt og flere kandidater til mekano-sensor eller parametere i kjernen foreslås, inkludert nukleær porestørrelse28, nukleær form 25,61, LINC-kompleks og kjernefysisk konvoluttspenning20. Manipulering av magnetiske mikroperler åpner muligheten for detaljert utforskning av slike mekanismer ved direkte kraftapplikasjon på LINC-komplekset og kontrollerte forskrifter for kjernekonvoluttspenning og form. (4) I tillegg til å påføre krefter på kjernen, er mikroperler også egnet til å bli konstruert for å binde seg til innsiden av plasmamembranen for å avsløre hvordan de intracellulære domenene til membranproteiner og deres kompleks reagerer på biofysiske signaler.

Oppsummert demonstrerte dette papiret en metode som (1) leverer jernmikroperler i mikrostørrelse til cytoplasma uten å påvirke nukleær morfologi og proteinfunksjoner, (2) bruker kraft på kjernen ved magnetiske mikroperler, og (3) utfører konfokal fluorescens levende celleavbildning under kraftapplikasjonen. Disse ikke-invasive verktøyene åpner mulighetene for direkte epigenetisk manipulering av organeller i enkeltceller, superoppløsningsbildebasert undersøkelse av kjernemekanotransduksjon og detaljert utforskning av kraftregulert 3D-kromosomorganisasjon (i kombinasjon med Hi-C: høyoppløselig kromosombekreftelsesfangst) og omprogrammering i sammenheng med cellefysiologi og patobiologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Det er ingen interessekonflikter å oppgi.

Acknowledgments

Dette prosjektet er finansiert av UF Gatorade Award Start-up Package (X. T.), UFHCC Pilot Award (X. T. og Dr. Dietmar Siemann), UF Opportunity Seed Fund (X. T.) og UFHCC University Scholars Program (H. Y. Wang). Vi setter stor pris på de intellektuelle diskusjonene med og den tekniske støtten fra Dr. Jonathan Licht (UFHCC), Dr. Rolf Renne (UFHCC), Dr. Christopher Vulpe (UFHCC), Dr. Blanka Sharma (BME), Dr. Sheplak (MAE & ECE), Dr. Daniel Ferris (BME), Dr. Malisa Sarntinoranont (MAE), Dr. Ashok Kumar (MAE), Dr. Benjamin Keselowsky (BME), Dr. Brent Gila (RSC), Dr. Philip Feng (ECE), Dr. Gregory A. Hudalla (BME), Dr. Steven Ghivizzani (OSSM), Dr. Yenisel Cruz-Almeida (CDBS), Dr. Roger Fillingim (CD-BS), Dr. Robert Caudle (OMS), Dr. John Neubert (DN-OR), Dr. Justin Hiliard (Nevrokirurgi), Dr. Tian He (Harvard University), Dr. Youhua Tan (Hong Kong Polytechnic University), Dr. Jessie LS Au (Institutt for kvantitativ systemfarmakologi), Dr. David Hahn (University of Arizona), og støtteteamet til Nikon (Dr. Jose Serrano-Velez, Larry Kordon og Jon Ekman). Vi er dypt takknemlige for den effektive støtten fra alle medlemmer av Tangs, Yamaguchis, Sharmas, Au's, Siemanns og Guans forskningslaboratorier og alle ansatte i UF MAE-avdelingen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05 % Trypsin Corning 25-051-CI
25 cm2 flask Corning 156340
7-µm mean diameter carbonyl iron microbeads N/A N/A
A1R confocal system Nikon
Carbonyl Iron Powder CM BASF 30042253 Magnetic microbead
Culture medium (RPMI-1640) Gibco 11875093
Desktop Computer Dell with Windows 10 operating system
Environmental chamber TIZB Tokai Hit TIZB
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 26140
Fiji ImageJ National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Glass-bottom petri dish MatTek P35G-1.5-14-C
Magnet K&J Magnetics, Inc. D99-N52
Monochrome Camera FLIR BFS-U3-70S7M-C
NIS-Elements software platform Nikon software platform
Nucleus mask ImageJ macro https://github.com/KOLIUG/Nuclear mask
NucSpot Live 650 Biotium #40082 Nuclear stain
Penicillin-streptomycin Gibco 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 10010023
Ti2-E inverted microscope Nikon
XYZ mover (CAD files) https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  2. Janmey, P. A., Fletcher, D. A., Reinhart-King, C. A. Stiffness sensing by cells. Physiological Reviews. 100 (2), 695-724 (2020).
  3. Bajaj, P., Tang, X., Saif, T. A., Bashir, R. Stiffness of the substrate influences the phenotype of embryonic chicken cardiac myocytes. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 95 (4), 1261-1269 (2020).
  4. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
  5. Hofmann, M., et al. Lowering of tumor interstitial fluid pressure reduces tumor cell proliferation in a xenograft tumor model. Neoplasia. 8 (2), 89-95 (2006).
  6. Yankaskas, C. L., et al. The fluid shear stress sensor TRPM7 regulates tumor cell intravasation. Science Advances. 7 (28), (2021).
  7. Kim, E., et al. A biosynthetic hybrid spidroin-amyloid-mussel foot protein for underwater adhesion on diverse surfaces. ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (41), 48457-48468 (2021).
  8. Tajik, A., et al. Transcription upregulation via force-induced direct stretching of chromatin. Nature Materials. 15 (12), 1287-1296 (2016).
  9. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Matrix directed adipogenesis and neurogenesis of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow. Acta Biomaterialia. 42, 46-55 (2016).
  10. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation. Biomaterials. 69, 174-183 (2015).
  11. Ren, B., et al. Study of sacrificial ink-assisted embedded printing for 3D perfusable channel creation for biomedical applications. Applied Physics Reviews. 9 (1), 011408 (2022).
  12. Coyle, S., et al. Cell alignment modulated by surface nano-topography-Roles of cell-matrix and cell-cell interactions. Acta Biomaterialia. 142, 149-159 (2022).
  13. Sawada, Y., et al. Force sensing by mechanical extension of the Src family kinase substrate p130Cas. Cell. 127 (5), 1015-1026 (2006).
  14. Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
  15. Tang, X., et al. Specific and non-specific adhesion in cancer cells with various metastatic potentials. Mechanobiology of Cell-Cell and Cell-Matrix Interactions. , Springer. Boston, MA. 105-122 (2011).
  16. Tang, X., Saif, T. A. Adhesivity of colon cancer cells during in vitro metastasis. International Journal of Applied Mechanics. 5 (03), 1350025 (2013).
  17. Chaudhuri, O., et al. Effects of extracellular matrix viscoelasticity on cellular behaviour. Nature. 584 (7822), 535-546 (2020).
  18. Ohashi, K., Fujiwara, S., Mizuno, K. Roles of the cytoskeleton, cell adhesion and rho signalling in mechanosensing and mechanotransduction. The Journal of Biochemistry. 161 (3), 245-254 (2017).
  19. Hamill, O. P., Martinac, B. Molecular basis of mechanotransduction in living cells. Physiological Reviews. 81 (2), 685-740 (2001).
  20. Liang, C., et al. Towards an integrative understanding of cancer mechanobiology: Calcium, YAP, and microRNA under biophysical Forces. Soft Matter. 18, 1112-1148 (2022).
  21. Tan, Y., et al. Matrix softness regulates plasticity of tumour-repopulating cells via H3K9 demethylation and Sox2 expression. Nature Communications. 5 (1), 1-12 (2014).
  22. Poh, Y., et al. Dynamic force-induced direct dissociation of protein complexes in a nuclear body in living cells. Nature Communications. 3 (1), 1-10 (2012).
  23. Tang, X., et al. A mechanically-induced colon cancer cell population shows increased metastatic potential. Molecular Cancer. 13 (1), 1-15 (2014).
  24. Wu, J., et al. Effects of dynein on microtubule mechanics and centrosome positioning. Molecular Biology of the Cell. 22 (24), 4834-4841 (2011).
  25. Tang, X., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8 (27), 7197-7206 (2011).
  26. Tang, X., Bajaj, P., Bashir, R., Saif, T. A. How far cardiac cells can see each other mechanically. Soft Matter. 7 (13), 6151-6158 (2011).
  27. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
  28. Elosegui-Artola, A., et al. Force triggers YAP nuclear entry by regulating transport across nuclear pores. Cell. 171 (6), 1397-1410 (2017).
  29. Gudipaty, S. A., et al. Mechanical stretch triggers rapid epithelial cell division through Piezo1. Nature. 543 (7643), 118-121 (2017).
  30. Tang, X., et al. Attenuation of cell mechanosensitivity in colon cancer cells during in vitro metastasis. PLoS One. 7 (11), 50443 (2012).
  31. Cha, C., et al. Top-down synthesis of versatile polyaspartamide linkers for single-step protein conjugation to materials. Bioconjugate Chemistry. 22 (12), 2377-2382 (2012).
  32. Chen, X., et al. Glycosaminoglycans modulate long-range mechanical communication between cells in collagen networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (15), (2022).
  33. Boyle, J. J., Pless, R. B., Thomopoulos, S., Genin, G. M. Direct estimation of surface strain fields from a stereo vision system. Journal of Biomechanical Engineering. 142 (7), 074503 (2020).
  34. Kim, S., Uroz, M., Bays, J. L., Chen, C. S. Harnessing mechanobiology for tissue engineering. Developmental Cell. 56 (2), 180-191 (2021).
  35. Driscoll, T. P., et al. Cytoskeletal to nuclear strain transfer regulates YAP signaling in mesenchymal stem cells. Biophysical Journal. 108 (12), 2783-2793 (2015).
  36. Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nature Cell Biology. 16 (4), 376-381 (2014).
  37. Vashisth, M. Scaling concepts in 'omics: Nuclear lamin-B scales with tumor growth and often predicts poor prognosis, unlike fibrosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (48), (2021).
  38. Roberts, A. B., et al. Tumor cell nuclei soften during transendothelial migration. Journal of Biomechanics. 121, 110400 (2021).
  39. Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
  40. Raab, M., et al. ESCRT III repairs nuclear envelope ruptures during cell migration to limit DNA damage and cell death. Science. 352 (6283), 359-362 (2016).
  41. Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. The Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).
  42. Shelby, J., Patrick, J., Edgar, S., Chiu, D. T. Monitoring cell survival after extraction of a single subcellular organelle using optical trapping and pulsed-nitrogen laser ablation. Photochemistry and Photobiology. 81 (4), 994-1001 (2005).
  43. Caspi, A., Granek, R., Elbaum, M. Diffusion and directed motion in cellular transport. Physical Review E. 66 (1), 011916 (2002).
  44. Svoboda, K., Block, S. M. Biological applications of optical forces. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23 (1), 247-285 (1994).
  45. Rohrbach, A. Stiffness of optical traps: quantitative agreement between experiment and electromagnetic theory. Physical Review Letters. 95 (16), 168102 (2005).
  46. Neuman, K. C., et al. Characterization of photodamage to Escherichia coli in optical traps. Biophysical Journal. 77 (5), 2856-2863 (1999).
  47. Kanger, J. S., Subramaniam, V., Driel, R. V. Intracellular manipulation of chromatin using magnetic microbeads. Chromosome Research. 16 (3), 511-522 (2008).
  48. Bausch, A. R., et al. Local measurements of viscoelastic parameters of adherent cell surfaces by magnetic microbead microrheometry. Biophysical Journal. 75 (4), 2038-2049 (1998).
  49. Fisher, J. K., et al. Three-dimensional force microscope: a nanometric optical tracking and magnetic manipulation system for the biomedical sciences. Review of Scientific Instruments. 76 (5), 053711 (2005).
  50. Berret, J. -F. Local viscoelasticity of living cells measured by rotational magnetic spectroscopy. Nature Communications. 7, 10134 (2016).
  51. Hu, B., Dobson, J., El Haj, A. J. Control of smooth muscle α-actin (SMA) up-regulation in HBMSCs using remote magnetic microbead mechano-activation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 10 (1), 45-55 (2014).
  52. Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
  53. Feng, S., et al. Improved split fluorescent proteins for endogenous protein labeling. Nature Communications. 8, 370 (2017).
  54. Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 3501-3508 (2016).
  55. Tulpule, A., et al. Kinase-mediated RAS signaling via membraneless cytoplasmic protein granules. Cell. 184 (10), 2649-2664 (2021).
  56. Ansari, A. M., et al. Cellular GFP toxicity and immunogenicity: potential confounders in in vivo cell tracking experiments. Stem Cell Reviews and Reports. 12 (5), 553-559 (2016).
  57. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
  58. Ratz, M., et al. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5, 9592 (2015).
  59. Suzuki, H., Ho, C., Kasagi, N. A chaotic mixer for magnetic microbead-based micro cell sorter. Journal of Microelectromechanical Systems. 13 (5), 779-790 (2004).
  60. Luo, Q., et al. All-optical mechanobiology interrogation of yes-associated protein in human cancer and normal cells using a multi-functional system. Journal of Visualized Experiments. (178), e62934 (2021).
  61. Koushki, N., et al. Lamin A redistribution mediated by nuclear deformation determines dynamic localization of YAP. BioRxiv. , (2020).

Tags

Biologi utgave 185 Nucleus mekanobiologi magnetisk kraft CRISPR/Cas9 mekanotransduksjon myk aktiv materie ja-assosiert protein (YAP) fluorescerende funksjonell bildebehandling digital bildebehandling optogenetikk epigenetikk
Kombinere 3D magnetisk kraftaktuator og multifunksjonell fluorescensavbildning for å studere kjernemekanobiologi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huang, M., Wang, H., Delgado, A. A., … More

Huang, M., Wang, H., Delgado, A. A., Reid, T. A., Long, J., Wang, S., Sussman, H., Guan, J., Yamaguchi, H., Tang, X. Combining 3D Magnetic Force Actuator and Multi-Functional Fluorescence Imaging to Study Nucleus Mechanobiology. J. Vis. Exp. (185), e64098, doi:10.3791/64098 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter