Summary
पील-ब्लॉट तकनीक एक क्रायो-ईएम ग्रिड तैयारी विधि है जो मोटाई को कम करने, नमूना एकाग्रता बढ़ाने और छवि प्रसंस्करण की सुविधा के लिए एकल परतों में बहुस्तरीय और केंद्रित जैविक नमूनों को अलग करने की अनुमति देती है।
Abstract
पील-ब्लॉट क्रायो-ईएम ग्रिड तैयार करने की तकनीक बहु-स्तरीय नमूनों की परतों में कमी प्राप्त करने के उद्देश्य से एक महत्वपूर्ण रूप से संशोधित बैक-इंजेक्शन विधि है। ठंड से पहले परतों को हटाने से नमूना मोटाई को क्रायो-ईएम डेटा संग्रह के लिए उपयुक्त स्तर तक कम करने, नमूना फ्लैटनेस में सुधार करने और छवि प्रसंस्करण की सुविधा में सहायता मिल सकती है। पील-ब्लॉट तकनीक मल्टीलैमेलर झिल्ली को एकल परतों में, स्तरित 2 डी क्रिस्टल को अलग-अलग क्रिस्टल में विभाजित करने की अनुमति देती है, और घुलनशील प्रोटीन की स्टैक्ड, शीट जैसी संरचनाओं को एकल परतों में भी अलग किया जा सकता है। इस प्रकार के नमूनों की उच्च नमूना मोटाई अक्सर क्रायो-ईएम डेटा संग्रह और क्रायो-ईएम छवि प्रसंस्करण के लिए दुर्गम समस्याएं पैदा करती है, खासकर जब माइक्रोस्कोप चरण को डेटा संग्रह के लिए झुका होना चाहिए। इसके अलावा, इनमें से किसी भी नमूने की उच्च सांद्रता के ग्रिड को कुशल डेटा संग्रह के लिए तैयार किया जा सकता है क्योंकि ग्रिड तैयारी से पहले नमूना एकाग्रता बढ़ाई जा सकती है और पील-ब्लॉट तकनीक को एकल-स्तरित नमूने के घने वितरण के परिणामस्वरूप समायोजित किया जा सकता है।
Introduction
पील-ब्लॉट तकनीक को क्रायो-ईएम 2 डी और 3 डी डेटा संग्रह के लिए उपयुक्त रूप से पतले नमूने प्राप्त करने और छवि प्रसंस्करण 1 की सुविधा के लिए झिल्ली प्रोटीन के स्टैक्ड दो-आयामी क्रिस्टल को एकल परतों में अलग करने के लिए विकसितकिया गया था। प्रोटोकॉल अन्य प्रकार के मल्टीलैमेलर नमूनों के साथ-साथ जेड में मोटाई बढ़ाए बिना ग्रिड पर नमूना प्रकार की उच्च नमूना सांद्रता प्राप्त करने के लिए समान रूप से उपयुक्त है।
नमूना परतों को एक परत तक कम करना एक प्रोटोकॉल में केशिका दबाव और कतरन बलों के संयोजन को लागू करके प्राप्त किया जाता है जो बैक-इंजेक्शन विधि2 पर काफी हद तक फैला हुआ है और संशोधित करता है। पहले ब्लोटिंग चरण के परिणामस्वरूप बैक-इंजेक्शन विधि में 20-25 μm फिल्टर पेपर पोर आकार के बजाय सबमाइक्रोन पर ब्लोटिंग के दौरान कार्बन फिल्म और बहु-स्तरीय नमूने के दोनों ओर एक ग्रिड बार होता है। एक अलग परत का पृथक्करण, या छीलना, सैंडविच परतों के पृथक्करण को मजबूर करने पर होता है जब ग्रिड को ट्रेहलोस ड्रॉप पर लंबवत रूप से दबाया जाता है, जिससे कार्बन फिल्म को ग्रिड बार से दूर कर दिया जाता है (चित्रा 1)। ग्रिड बार के साथ मूल संपर्क बिंदु से दूर कार्बन फिल्म की पुनर्स्थापना अगले चरण में होती है, जब ग्रिड को एक बार फिर सबमाइक्रोन फिल्टर पेपर पर धब्बा लगाया जाता है। इन चरणों के पुनरावृत्तियों की संख्या को विशिष्ट नमूनों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल का उपयोग जेड में एकत्रीकरण से बचने के दौरान नमूना सांद्रता को बढ़ाने के लिए किया जा सकता है। ग्रिड बार और कार्बन फिल्म के पालन के साथ-साथ बलपूर्वक पृथक्करण पर निर्भरता के कारण, यह दृष्टिकोण अत्यधिक नाजुक अणुओं जैसे कि कुछ नाजुक और / या अस्थिर प्रोटीन और प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है।
पील-ब्लॉट तकनीक को न तो विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है और न ही महंगी आपूर्ति की। हालांकि, विशिष्ट नमूनों के लिए प्रयोज्यता को जैविक मापदंडों के सावधानीपूर्वक विचार की आवश्यकता होगी। 2 डी क्रिस्टल के लिए निर्णय आसान है क्योंकि फ्लैटनेस सुनिश्चित करने के लिए कार्बन फिल्म की आवश्यकता होती है, फिर भी पील-ब्लॉट तकनीक के माध्यम से हेरफेर नमूने या क्रिस्टलीय क्रम की जैविक अखंडता को प्रभावित कर सकता है। एकल कणों के लिए पील-ब्लॉट तकनीक की उपयुक्तता उन लोगों तक सीमित है और परीक्षण किया जा सकता है जिन्हें कार्बन फिल्म की आवश्यकता होती है और हेरफेर के लिए स्थिर होते हैं। परतों के बीच महत्वपूर्ण जैविक बातचीत वाले नमूने इस तरह के इंटरैक्शन के व्यवधान के कारण पील-ब्लॉट तकनीक की मदद से लक्षण वर्णन के लिए उपयुक्त नहीं हो सकते हैं।
पील-ब्लॉट तकनीक ("पील-ब्लोट") को कमरे के तापमान पर टीईएम द्वारा नकारात्मक दाग या बिना दाग वाले नमूनों के साथ परीक्षण और स्क्रीनिंग द्वारा सबसे जल्दी अनुकूलित किया जाता है। एक बार जब पील-ब्लॉट पुनरावृत्तियों की इष्टतम संख्या की पहचान हो जाती है, तो विट्रीफिकेशन से पहले मोटाई को नियंत्रित करने का समय निर्धारित किया जा सकता है।
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Protocol
1. पील-ब्लोट तकनीक के लिए तैयारी चरण
नोट: तैयारी के लिए निम्नलिखित वस्तुओं को एक दूसरे से सटे रखने की आवश्यकता होती है।
- 20-25 μm छिद्र आकार फ़िल्टर पेपर के दो टुकड़ों को ढेर करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- फिल्टर पेपर के बगल में ~ 8 सेमी x 10 सेमी लंबी पैराफिन फिल्म रखें, जिसमें पेपर ऊपर की ओर हो।
- # 4 फिल्टर पेपर के दो अतिरिक्त टुकड़ों के शीर्ष पर सबमाइक्रोन फिल्टर पेपर का एक टुकड़ा रखें (चित्रा 1-1)।
- एंटी-केशिका बल को मुड़े हुए पैर के सामने और सीधे पैर को नीचे की ओर रखें। फिर, चिकनी / चमकदार साइड अप के साथ 600-जाल ग्रिड का चयन करें। अन्य वस्तुओं के साथ स्वच्छ ग्रिड के संपर्क से बचने के लिए पेट्री डिश या अन्य उभरी हुई सतह पर फोर्सप्स रखें।
- पैराफिन फिल्म से पेपर निकालें और एक छोटा रिम बनाने के लिए पक्षों (~ 5 मिमी) को खींचें। पिपेट ने पैराफिन फिल्म के एक छोटे पक्ष से ~ 1-2 सेमी और पैराफिन फिल्म पर ~ 1 सेमी की दूरी पर 4% ट्रेहलोस घोल की दो 150 μL बूंदें छोड़ दीं।
- एक अलग बेंच पर या फर्श पर, एक छोटे पॉलीस्टाइनिन फोम कंटेनर में तरल नाइट्रोजन डालें ( सामग्री की तालिका देखें)।
सावधानी: ठंढ के काटने से बचने के लिए दस्ताने और फेस शील्ड का उपयोग करके उचित हैंडलिंग के लिए प्रशिक्षण प्राप्त करें। - तरल नाइट्रोजन में एक छोटा क्रायो-ईएम ग्रिड कंटेनर रखें और पॉलीस्टाइनिन फोम कंटेनर को लिंट-फ्री वाइप्स के साथ कवर करें।
2. कार्बन फिल्म को ग्रिड पर रखना
- ट्रेहलोस घोल की बूंदों में से एक पर नीचे की ओर (~ 20 ° -40 °) पर अभ्रक के एक तरफ को स्पर्श करके अभ्रक से कार्बन फिल्म को तैरने के लिए ड्यूमोंट # 5 फोर्सप्स (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें और धीरे-धीरे अभ्रक को नीचे की ओर ले जाकर कार्बन फिल्म से पानी के तनाव को उठाने दें। बूंद की सतह पर कार्बन फिल्म तैरने के बाद अभ्रक जारी करें।
- फ्रैक्चर के रूप में क्षति के साथ कार्बन का उपयोग करने से बचने के लिए कार्बन फिल्म का नेत्रहीन निरीक्षण करें।
- एंटी-केशिका बल द्वारा एक कोण (~ 20 ° -30 ° ) पर रखे गए ग्रिड को एक ट्रेहलोस ड्रॉप में बगल की स्थिति में डालें, और फिर कार्बन फिल्म के नीचे केंद्रित करें। कार्बन फिल्म उठाओ (चित्र 1-2)।
- ग्रिड को उसी अभिविन्यास में रखें और धीरे-धीरे इसे बूंद की सतह के तनाव को तोड़े बिना ट्रेहलोस की दूसरी बूंद की सतह पर कम करें ताकि अनावश्यक कार्बन फिल्म को हटाया जा सके जो ग्रिड के रिम के चारों ओर खुरदरी तरफ लपेटा गया हो।
3. एकल परतों में बहु-स्तरीय 2 डी क्रिस्टल का पृथक्करण
- एंटी-केशिका बलों को घुमाएं (सामग्री की तालिका देखें) और उन्हें पेट्री डिश पर ग्रिड के कार्बन पक्ष के साथ रखें (चित्र 1-3)।
- ग्रिड के शीर्ष पर मामूली ट्रेहलोस मेनिस्कस में नमूने का 1.3 μL। ग्रिड के दोनों किनारों पर ट्रेहलोस और नमूने को मिलाने और वितरित करने के लिए समाधान ~ 8-10 बार पाइप करें।
- 1 मिनट के लिए घोल को इनक्यूबेट करते समय, पैराफिन फिल्म पर ट्रेहलोस घोल की एक या अधिक 1.7 μL बूंदों को पाइप करें।
- ग्रिड को कार्बन फिल्म के सामने के साथ अपनी मूल स्थिति में वापस घुमाएं।
- सबमाइक्रोन फिल्टर पेपर (चित्रा 1-4) पर ग्रिड दबाने के लिए एंटी-केशिका बल का उपयोग करें। एक बार जब समाधान फिल्टर पेपर द्वारा अवशोषित हो जाता है और कार्बन फिल्म सपाट पड़ी होती है, तो ग्रिड को उठाने से पहले 3 सेकंड तक प्रतीक्षा करें और इसे ट्रेहलोस समाधान की 1.7 μL बूंद पर लंबवत रूप से ले जाएं (चित्र 1-5)।
नोट: अत्यधिक स्टैक किए गए नमूनों के लिए इस चरण को कई बार दोहराएं, या ग्रिड अगले चरणों में विट्रीफिकेशन के लिए तैयार है। - फ़िल्टर पेपर के दो टुकड़ों पर ग्रिड को ब्लॉट करें, और फिर फ़िल्टर पेपर से ग्रिड उठाएं (चित्रा 1-6)। आर्द्रता और नमूना बफर के आधार पर लगभग 13 सेकंड के बाद, ग्रिड को छोटे स्टायरोफोम कंटेनर में तरल नाइट्रोजन में डुबोएं और ग्रिड को क्रायो-ईएम ग्रिड कंटेनर में रखें या इसे सीधे क्रायो-ईएम स्क्रीनिंग या डेटा संग्रह के लिए स्थानांतरित करें।
नोट: प्रोटोकॉल को तेजी से अनुकूलित करने के लिए, इस चरण में छिलके-धब्बेदार ग्रिड को तरल नाइट्रोजन में डुबोने के बजाय नकारात्मक रूप से दाग दें। ग्रिड पर 1% यूरिनिल एसीटेट के 3 μL को लागू करके नमूने को नकारात्मक रूप से दाग दें, ग्रिड को 30 सेकंड के लिए इनक्यूबेट करें, और इसे 20-25 μm छिद्र आकार फिल्टर पेपर के फटे टुकड़े के साथ धब्बा दें। ट्रेहलोस, टैनिन, या ग्लूकोज में विट्रीफाइड 2 डी क्रिस्टल के ग्रिड को नियमित रूप से विट्रीफिकेशन के लिए हाथ से डुबोया जाता है क्योंकि ट्रेहलोस, टैनिन और ग्लूकोज हाथ सेगिरने के लिए उपयोग की जाने वाली दरों पर क्रिस्टलीय बर्फ के गठन को रोकते हैं।
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Representative Results
एक सफल पील-ब्लॉट प्रयोग के परिणामस्वरूप अक्सर उच्च सांद्रता पर नमूनों की एकल परतें होंगी। यह उम्मीद की जानी चाहिए कि अधिकांश ग्रिड वर्गों में कुछ क्षेत्रों में अभी भी कई परतें होंगी, खासकर पील-ब्लॉट चरणों के पुनरावृत्तियों की कम संख्या पर। हालांकि, अधिकांश ग्रिड वर्गों में एकल परतों के व्यापक क्षेत्र होंगे जैसा कि मानव ल्यूकोट्रिएन सी4 सिंथेज़ (चित्रा 2) और लिपोसोम्स (चरण 3.2, चित्रा 3 में जोड़ा गया) के 2 डी क्रिस्टल के लिए देखा गया है। अतिरिक्त पील-ब्लॉट चरणों को उन नमूनों के लिए परीक्षण करने की आवश्यकता हो सकती है जो परतों में वांछित कमी नहीं दिखाते हैं।
एक सफल पील-ब्लॉट प्रयोग का सबसे महत्वपूर्ण संकेत उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रायो-ईएम डेटा संग्रह और छवि प्रसंस्करण के बाद देखी गई डेटा गुणवत्ता और जैविक अखंडता होगी। डेटा व्याख्या में परतों के बीच संपर्क क्षेत्रों में संभावित क्षति या विकृति का सावधानीपूर्वक विचार शामिल करने की आवश्यकता होगी।
ईएम ग्रिड के क्षेत्र जिनमें पील ब्लोटिंग हुई है, आमतौर पर उन क्षेत्रों की तुलना में नमूने की उच्च सांद्रता प्रदर्शित करते हैं जिनमें यह नहीं हुआ है। यह स्पष्ट ध्यान केंद्रित प्रभाव कार्बन फिल्म और ग्रिड बार सतहों दोनों के लिए मल्टीलैमेलर नमूने के पालन के कारण होता है, इसके बाद पील-ब्लॉट तैयारी के दौरान दोनों सतहों का अतिरिक्त पालन होता है क्योंकि वे बार-बार अलग होते हैं, थोड़ा सा पुनर्स्थापित करते हैं, और फिर से संपर्क करते हैं। परिणाम यह है कि मूल बहु-लैमेलर नमूने की विभिन्न परतें एक बड़े पार्श्व क्षेत्र (चित्रा 3 और चित्रा 4) में अलग-अलग फैली हुई हैं। इन क्षेत्रों में बड़े 2 डी क्रिस्टल या झिल्ली भी हो सकते हैं। दोनों घटनाओं को आसानी से देखा जाता है और उन क्षेत्रों में तुलना की जाती है जहां एक "छिलका क्षेत्र" एक ऐसे क्षेत्र से सटे होते हैं जो पील-ब्लॉट चरण से प्रभावित नहीं होता है (चित्रा 3)। आंकड़े 2-4 में छवियों को ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ 120 केवी के तेज वोल्टेज पर कम खुराक की स्थिति में एकत्र किया गया था (सामग्री की तालिका देखें)।
चित्रा 1: पील-ब्लॉट तकनीक का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। पील-ब्लॉट तकनीक के पहले दो चरण (1-2 और 1-3) और अंतिम चरण (1-6) बैक-इंजेक्शन विधि2 पर आधारित हैं और मध्यवर्ती चरण पील-ब्लॉट प्रोटोकॉल (जॉनसन एट अल.1 से संशोधित) का पालन करते हैं। चरण 1 में, (ए) 20-25 μm छिद्र आकार फिल्टर पेपर के दो टुकड़े ढेर किए जाते हैं, (B) ट्रेहलोस समाधान की दो बूंदों के साथ पैराफिन फिल्म के एक टुकड़े से सटे होते हैं और (C) फ़िल्टर पेपर के दो अतिरिक्त टुकड़ों पर सबमाइक्रोन फ़िल्टर पेपर का एक टुकड़ा होता है। चरण 2 में, (ए) कार्बन फिल्म को पहली ट्रेहलोस बूंद पर तैराया जाता है और (बी) एंटी-केशिका बल के साथ उठाया जाता है, जिसके बाद इसे परिधि से अतिरिक्त कार्बन फिल्म को हटाने के लिए सतह के तनाव को तोड़े बिना दूसरी बूंद (नहीं दिखाया गया) की सतह पर छुआ जाता है। चरण 3 में, (ए) ग्रिड को पकड़ने वाले बलों को 180 ° से घुमाया जाता है (ग्रिड का कार्बन फिल्म पक्ष अब नीचे की ओर है) और (बी) नमूने को ट्रेहलोस के मेनिस्कस में पाइप किया जाता है। चरण 4 में, ग्रिड को कार्बन फिल्म के सामने के साथ मूल अभिविन्यास में वापस घुमाया गया है और नमूना धीरे-धीरे सबमाइक्रोन फिल्टर पेपर पर उतारा जाता है। ग्रिड को ऊपर उठाया जाता है और चरण 5 में ट्रेहलोस समाधान की 1.7 μL बूंद पर लंबवत रूप से उतारा जाता है। चरण 4 और 5 को "पील-ब्लोटिंग" के रूप में संदर्भित किया जाता है और स्टैकिंग की मात्रा के आधार पर तीन या अधिक बार इसे दोहराया जा सकता है। पुनरावृत्तियों की संख्या को विभिन्न नमूनों के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है। चरण 6 में, (ए) नमूना 20-25 μm छिद्र आकार फिल्टर पेपर की दो परतों पर धब्बा लगाया जाता है, इससे पहले कि (बी) इसे तरल नाइट्रोजन में डाल दिया जाए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: पील-ब्लोट विधि के अधीन एक 2 डी क्रिस्टल नमूना। तीर के बाईं ओर का क्षेत्र काफी हद तक कार्बन फिल्म और ग्रिड बार के बीच एक संपर्क क्षेत्र में एकल-स्तरित 2 डी क्रिस्टल तक कम हो गया था, जिसे छील-धब्बा किया गया था और फिर स्थानांतरित कर दिया गया था, जबकि तीर के दाईं ओर का क्षेत्र छिलके-धब्बा से प्रभावित क्षेत्र में नहीं था। छिलके के धब्बेदार क्षेत्रों को आसानी से चुना जा सकता है और अधिकांश ग्रिड पर देखा जाता है। दिखाए गए 2 डी क्रिस्टल मानव ल्यूकोट्रिएन सी4 सिंथेज़ के स्टैक्ड और सिंगल-लेयर 2 डी क्रिस्टल हैं। स्केल पट्टी 10 μm से मेल खाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: लिपोसोम्स पील-ब्लोट के अधीन हैं। पील-ब्लॉट को ढह गए लिपोसोम और पुटिकाओं के किनारों को बाधित करने के लिए सफलतापूर्वक लागू किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप बड़े, ज्यादातर एकल-स्तरित फॉस्फोलिपिड बाइलेयर वाले क्षेत्र होते हैं जैसा कि छवि के निचले आधे हिस्से में देखा गया है। ऊपरी आधा हिस्सा ग्रिड बार और कार्बन फिल्म के बीच संपर्क क्षेत्र में नहीं था और इस प्रकार इसमें दो फॉस्फोलिपिड बाइलेयर के साथ पूर्ण लिपोसोम होते हैं। स्केल पट्टी 1 μm से मेल खाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 4: पील-ब्लॉट पदचिह्न। 400-जाल ग्रिड का ग्रिड वर्ग ग्रिड बार के पदचिह्न (लेबल "बी") और परिणामस्वरूप छिलके-धब्बेदार क्षेत्रों के साथ-साथ उन क्षेत्रों ("सी" लेबल) को दर्शाता है जो ग्रिड बार के संपर्क में नहीं थे, या कम पील-ब्लॉट पुनरावृत्तियों के अधीन थे। स्केल पट्टी 10 μm से मेल खाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5: कार्बन फिल्म का उपयोग करके एक सबमाइक्रोन फिल्टर पेपर पर बैक-इंजेक्शन द्वारा तैयार एक ईएम ग्रिड को ब्लोटिंग करना जो बहुत पतला है। छवियां एक वीडियो से एकल फ्रेम हैं ( वीडियो 1 देखें) (ए) झिल्ली के साथ प्रारंभिक संपर्क, (बी) संपर्क के बाद 1000 एमएस, और (सी) संपर्क के बाद 2000 एमएस। तीर ग्रिड वर्गों को इंगित करता है जिसमें केशिका दबाव ने कार्बन फिल्म को तोड़ दिया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
वीडियो 1: ग्रिड को पील-ब्लॉट चरण के लिए सबमाइक्रोन फिल्टर पेपर पर रखा गया है। कार्बन फिल्म को धीरे-धीरे और कसकर ग्रिड पर निचले बाएं से ऊपरी दाईं ओर की दिशा में सक्शन किया जाता है, जो ग्रिड बार और कार्बन फिल्म के बीच कसकर सैंडविच नमूना लेता है। कार्बन फिल्म और इस प्रकार व्यक्तिगत नमूना परतों को प्रत्येक बाद के पील-ब्लॉट चरण में विस्थापित किया जाता है, जिससे अधिक उच्च स्तरित नमूनों के लिए अतिरिक्त पुनरावृत्तियों के साथ अनुकूलन की अनुमति मिलती है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
पील-ब्लॉट क्रायो-ईएम डेटा संग्रह और छवि प्रसंस्करण के लिए बहु-स्तरित 2 डी क्रिस्टल और इसी तरह के नमूनों के स्टैकिंग और मोटाई को दूर करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है। पील-ब्लॉट के उपयोग पर निर्णय नमूने के जैविक मापदंडों पर आधारित होगा और 3 डी क्रायो-ईएम मॉडल उपलब्ध होने के बाद मूल्यांकन की भी आवश्यकता होगी। संपर्कों का जैविक महत्व और संपर्क क्षेत्रों का संभावित लचीलापन इस मूल्यांकन में विशेष रूप से महत्वपूर्ण होगा।
पील-ब्लोट्स की संख्या शुरू में मानक नकारात्मक दाग ग्रिड तैयारी के बाद अवलोकन के माध्यम से स्थापित की जाएगी, जहां अत्यधिक परतों या मोटाई को मानक क्रायो-ईएम ग्रिड तैयारी के लिए वैकल्पिक रणनीतियों की आवश्यकता होगी। पतले बहु-स्तरित क्रिस्टल जो रजिस्टर में ढेर होते हैं, उनका उपयोग सीधे मोटे क्रिस्टल4 के मामले में माइक्रोईडी3 या एफआईबी-मिल्ड के लिए किया जा सकता है। पील-ब्लॉट आमतौर पर डबल-लेयर्ड 2 डी क्रिस्टल के लिए आवश्यक नहीं होगा क्योंकि परतों को व्यक्तिगत रूप से या एक साथ संसाधित किया जा सकता है, जब परतें रजिस्टर5 में होती हैं। यह संभावित रूप से झिल्ली प्रोटीन 2 डी क्रिस्टल के दोनों किनारों को लिगेंड या इनहिबिटर के लिए उजागर करने के लिए फायदेमंद हो सकता है, हालांकि, एक बार छिलके-सोख्ता से पहले समाधान में, और एक बार अंतिम छिलके-सोख्ता चरण के बाद। इसके अलावा, बड़े, अच्छी तरह से आदेशित डबल-लेयर्ड 2 डी क्रिस्टल को कम करने से इलेक्ट्रॉन विवर्तन 6,7 की अनुमति मिल सकती है। झिल्ली और घुलनशील प्रोटीन के 2 डी क्रिस्टल की बहु-परतें, या तो प्रेरित या जैविक रूप से होती हैं, पील-ब्लोट के लिए सबसे संभावित लक्ष्य होंगी, भले ही प्रोटोकॉल को नमूनों की एक श्रृंखला पर लागू किया जा सकता है और क्रायो-ईएम के लिए विभिन्न नमूनों को केंद्रित करने का काम कर सकता है (चित्रा 4)।
नकारात्मक दाग के साथ प्रारंभिक परीक्षण नाटकीय रूप से नमूनों को अनुकूलित करने के लिए समय और लागत को कम कर देगा क्योंकि ठंड, क्रायो-ईएम नमूना धारकों की तैयारी, क्रायो-ईएम में स्थानांतरण और क्रायो-ईएम के उपयोग की आवश्यकता नहीं है। ठंड के चरण से पहले केवल सुखाने के समय को अलग से अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी। सुखाने का समय एक ही नमूने1 के मानक बैक-इंजेक्शन ग्रिड को सुखाने के लिए उपयोग किए जाने वाले समय के समान या बहुत समान होगा।
जबकि 600-जाल ग्रिड आम तौर पर कार्बन फिल्म के अच्छे संरक्षण के परिणामस्वरूप होते हैं, पील-ब्लॉट पुनरावृत्तियों और पतली कार्बन फिल्म परतों की बढ़ती संख्या से कार्बन फिल्म टूटने में वृद्धि हो सकती है (चित्रा 5)। स्टैक्ड 2 डी क्रिस्टल, लिपोसोम, और घुलनशील प्रोटीन के बड़े सरणी के स्तरित नमूने सफलतापूर्वक अलग किए जा सकते हैं (आंकड़े 2-4)।
नमूना की गुणवत्ता पर प्रतिकूल प्रभाव से बचने के लिए क्रायो-ईएम द्वारा नमूने का सावधानीपूर्वक मूल्यांकन किया जाता है। यह स्टैक्ड और अनस्टैक्ड क्रिस्टल की छवियों की तुलना करने के लिए छवि प्रसंस्करण द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। मूल्यांकन उद्देश्यों के लिए और 3 डी मॉडल के लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, छवि प्रसंस्करण फोकस 8,9 में उपलब्ध 2 डीएक्स कार्यक्रमों के माध्यम से आयोजित किया जाता है, जो मूल 2 डी क्रिस्टल10 की अंतर्निहित गुणवत्ता पर नाटकीय रूप से वृद्धि की संभावना के साथ जाली अपूर्णताओं और प्रोटीन विषमता को संबोधित करने के लिए एकल कण दृष्टिकोण को भी लागू करता है।
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Disclosures
लेखकों के पास प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित या हितों के अन्य टकराव नहीं हैं।
Acknowledgments
इस काम का एक हिस्सा एनआईएच अनुदान एचएल090630 (आईएसके) द्वारा समर्थित था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 600-mesh grids | SPI | 2060-C-XA | |
| Anti-capillary forceps | Ted Pella | 510-5 | |
| Carbon to coat mica | |||
| Cryo-EM | Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV. High-resolution data is collected at 300 kV. | ||
| Dumpont #5 forceps | Ted Pella | 5622 | |
| Grid box for cryo-EM storage | Ted Pella | 160-40 | |
| Kim Wipes | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mica | Ted Pella | 56 | The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid. The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots. |
| Negative stain | 1-2% uranyl acetate is suitable for many samples. Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted. | ||
| Parafilm | |||
| Polystyrene container | Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil. | ||
| Submicron filter paper | MilliporeSigma | DAWP04700 | |
| Transmission electron microscope | JEOL | JEM-1400 | Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids. |
| Trehalose | Prepare 4% trehalose solution. | ||
| Whatman #4 filter paper | MilliporeSigma | WHA1004150 | This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol. |
References
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