Summary
La técnica peel-blot es un método de preparación de rejilla crio-EM que permite la separación de muestras biológicas concentradas y de múltiples capas en capas individuales para reducir el espesor, aumentar la concentración de la muestra y facilitar el procesamiento de imágenes.
Abstract
La técnica de preparación de rejilla crio-EM peel-blot es un método de retroinyección significativamente modificado con el objetivo de lograr una reducción en las capas de muestras de múltiples capas. Esta eliminación de capas antes de la congelación por inmersión puede ayudar a reducir el grosor de la muestra a un nivel adecuado para la recopilación de datos crio-EM, mejorar la planitud de la muestra y facilitar el procesamiento de imágenes. La técnica peel-blot permite la separación de membranas multilamelares en capas individuales, de cristales 2D en capas en cristales individuales, y de estructuras apiladas, en forma de lámina, de proteínas solubles que también se separan en capas individuales. El alto espesor de muestra de este tipo de muestras con frecuencia plantea problemas insuperables para la recopilación de datos crio-EM y el procesamiento de imágenes crio-EM, especialmente cuando la etapa del microscopio debe inclinarse para la recopilación de datos. Además, se pueden preparar rejillas de altas concentraciones de cualquiera de estas muestras para una recopilación de datos eficiente, ya que la concentración de la muestra antes de la preparación de la rejilla se puede aumentar y ajustar la técnica de peel-blot para dar como resultado una distribución densa de muestras de una sola capa.
Introduction
La técnica peel-blot se desarrolló con el fin de separar cristales bidimensionales apilados de proteínas de membrana en capas individuales para obtener muestras adecuadamente delgadas para la recolección de datos crio-EM 2D y 3D y facilitar el procesamiento de imágenes1. El protocolo es igualmente adecuado para otros tipos de muestras multilaminares, así como para lograr altas concentraciones de muestra de cualquier tipo de muestra en la rejilla sin aumentar el grosor en Z.
La reducción de las capas de muestra a una capa se logra aplicando una combinación de presión capilar y fuerzas de cizallamiento en un protocolo que amplía sustancialmente y modifica el método de inyección posterior2. Un primer paso de secado da como resultado un sándwich apretado y adherencia a la película de carbono y una barra de rejilla a cada lado de la muestra de varias capas durante la secado en submicrónico en lugar del tamaño de poro del papel de filtro de 20-25 μm en el método de inyección posterior. La separación, o pelado, de una capa individual ocurre al forzar la separación de las capas intercaladas una vez que la rejilla se presiona verticalmente sobre una gota de trehalosa, forzando la película de carbono lejos de la barra de rejilla (Figura 1). El reposicionamiento de la película de carbono lejos del punto de contacto original con la barra de rejilla se produce en el siguiente paso, cuando la rejilla se borra una vez más en papel de filtro submicrónico. El número de iteraciones de estos pasos se puede optimizar para muestras específicas. Además, el protocolo se puede utilizar para aumentar las concentraciones de la muestra evitando la agregación en Z. Debido a la dependencia de la adherencia a la barra de rejilla y la película de carbono, así como a la separación forzada, este enfoque puede no ser adecuado para moléculas altamente frágiles como ciertas proteínas delicadas y / o inestables y complejos de proteínas.
La técnica peel-blot no requiere equipo especializado ni suministros costosos. Sin embargo, la aplicabilidad a muestras específicas requerirá consideraciones cuidadosas de los parámetros biológicos. La decisión es más fácil para los cristales 2D, ya que se requiere una película de carbono para garantizar la planitud, pero la manipulación a través de la técnica peel-blot puede afectar la integridad biológica de la muestra o el orden cristalino. La idoneidad de la técnica peel-blot para partículas individuales está restringida y puede probarse para aquellas que requieren película de carbono y son estables a la manipulación. Los especímenes con interacciones biológicas críticas entre capas pueden no ser adecuados para la caracterización con la ayuda de la técnica peel-blot debido a la interrupción de tales interacciones.
La técnica peel-blot ("peel-blot") se optimiza más rápidamente mediante pruebas y cribado con tinción negativa o muestras no teñidas por TEM a temperatura ambiente. Una vez que se ha identificado el número óptimo de iteraciones de peel-blot, se puede determinar el tiempo para controlar el grosor antes de la vitrificación.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Pasos de preparación para la técnica peel-blot
NOTA: La preparación requiere que los siguientes elementos se coloquen uno al lado del otro.
- Apile dos piezas de papel de filtro de tamaño de poro de 20-25 μm (consulte la Tabla de materiales).
- Coloque una película de parafina de ~8 cm x 10 cm de largo adyacente al papel de filtro con el papel hacia arriba.
- Coloque un trozo de papel de filtro submicrónico encima de dos trozos adicionales de papel de filtro #4 (Figura 1-1).
- Coloque las pinzas anticapilares con la pierna doblada hacia arriba y la pierna recta hacia abajo. Luego, seleccione una cuadrícula de malla 600 con el lado liso / brillante hacia arriba. Coloque las pinzas sobre una placa de Petri u otra superficie elevada para evitar el contacto de la rejilla limpia con otros elementos.
- Retire el papel de la película de parafina y tire de los lados (~ 5 mm) para crear un borde pequeño. Pipetear dos gotas de 150 μL de solución de trehalosa al 4% ~1-2 cm de un lado corto de la película de parafina y ~1 cm de distancia en la película de parafina.
- En un banco separado o en el piso, vierta nitrógeno líquido en un recipiente pequeño de espuma de poliestireno (consulte la Tabla de materiales).
PRECAUCIÓN: Reciba capacitación para el manejo adecuado con guantes y un protector facial para evitar la picadura de escarcha. - Coloque un pequeño recipiente de rejilla crio-EM en el nitrógeno líquido y cubra el recipiente de espuma de poliestireno con toallitas sin pelusa.
2. Colocación de la película de carbono en la rejilla
- Use pinzas Dumont #5 (consulte la Tabla de materiales) para hacer flotar la película de carbono de la mica tocando un lado de la mica en un ligero ángulo hacia abajo (~ 20 ° -40 °) en una de las gotas de solución de trehalosa y lentamente deje que la tensión del agua se levante de la película de carbono moviendo la mica hacia abajo. Libere la mica una vez que la película de carbono flote en la superficie de la gota.
- Inspeccione visualmente la película de carbono para evitar el uso de carbono con daños en forma de fracturas.
- Inserte la rejilla sujeta por las pinzas anticapilares en un ángulo (~ 20 ° -30 °) en una gota de trehalosa en una posición adyacente y luego centrada debajo de la película de carbono. Recoja la película de carbono (Figura 1-2).
- Mantenga la rejilla en la misma orientación y bájela lentamente sobre la superficie de la segunda gota de trehalosa sin romper la tensión superficial de la gota para eliminar la película de carbono innecesaria que puede haberse envuelto alrededor del borde de la rejilla hacia el lado áspero.
3. Separación de cristales 2D multicapa en capas individuales
- Gire las pinzas anticapilares (consulte la Tabla de materiales) y colóquelas en una placa de Petri con el lado de carbono de la rejilla hacia abajo (Figura 1-3).
- Pipetear 1,3 μL de la muestra en el menisco de trehalosa leve en la parte superior de la rejilla. Pipetear la solución ~8-10 veces para mezclar y distribuir la trehalosa y la muestra en ambos lados de la rejilla.
- Mientras incuba la solución durante 1 minuto, pipete una o más gotas de 1,7 μL de solución de trehalosa sobre la película de parafina.
- Gire la rejilla a su posición original con la película de carbono hacia arriba.
- Utilice las pinzas anticapilares para presionar la rejilla sobre el papel de filtro submicrónico (Figura 1-4). Una vez que la solución haya sido absorbida por el papel de filtro y la película de carbono esté plana, espere 3s antes de levantar la rejilla y moverla verticalmente sobre la gota de 1,7 μL de solución de trehalosa (Figura 1-5).
NOTA: Repita este paso varias veces para muestras muy apiladas, o la cuadrícula se prepara para la vitrificación en los pasos siguientes. - Seque la rejilla en las dos piezas de papel de filtro y luego levante la rejilla del papel de filtro (Figura 1-6). Después de aproximadamente 13 s, dependiendo de la humedad y el tampón de muestra, sumerja la rejilla en el nitrógeno líquido en el recipiente pequeño de espuma de poliestireno y coloque la rejilla en el contenedor de rejilla crio-EM o transfiérala directamente para la detección crio-EM o la recopilación de datos.
NOTA: Para optimizar rápidamente el protocolo, manche negativamente la rejilla borrada en este paso en lugar de sumergirla en nitrógeno líquido. Tiñe negativamente la muestra aplicando 3 μL de acetato de uranilo al 1% a la rejilla, incubar la rejilla durante 30 s y secarla con un trozo rasgado de papel de filtro de 20-25 μm de tamaño de poro. Las rejillas de cristales 2D vitrificados en trehalosa, tanino o glucosa se sumergen rutinariamente a mano para la vitrificación, ya que la trehalosa, el tanino y la glucosa evitan la formación de hielo cristalino a las tasas utilizadas para la inmersión manual2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Un experimento exitoso de peel-blot dará como resultado capas individuales de muestras a concentraciones a menudo altas. Es de esperar que algunas regiones en la mayoría de los cuadrados de cuadrícula todavía contengan múltiples capas, especialmente en un menor número de iteraciones de los pasos de peel-blot. La mayoría de los cuadrados de cuadrícula, sin embargo, contendrán extensas regiones de capas individuales como se observa para cristales 2D de leucotrieno humano C4 sintasa (Figura 2) y liposomas (agregado en el paso 3.2, Figura 3). Es posible que sea necesario analizar pasos adicionales de peel-blot para detectar muestras que no muestren la reducción deseada en capas.
La indicación más importante de un experimento exitoso de peel-blot será la calidad de los datos y la integridad biológica observada después de la recopilación de datos crio-EM de alta resolución y el procesamiento de imágenes. La interpretación de los datos deberá incluir una cuidadosa consideración del daño potencial o la distorsión de las regiones de contacto entre capas.
Las regiones de la cuadrícula EM en las que se ha producido la secación de la cáscara suelen mostrar una mayor concentración de muestra que las regiones en las que no se ha producido. Este aparente efecto concentrador es causado por la adherencia de la muestra multilamelar tanto a la película de carbono como a las superficies de la barra de rejilla, seguida de una adherencia adicional a ambas superficies durante la preparación de peel-blot a medida que se separan repetidamente, se reposicionan ligeramente y vuelven a hacer contacto. El resultado es que las diferentes capas de la muestra multilamelar original se separan en un área lateral más grande (Figura 3 y Figura 4). Estas regiones pueden incluso contener cristales o membranas 2D más grandes. Ambos fenómenos se observan y comparan fácilmente en áreas donde una "zona de peeling" es adyacente a un área no afectada por el paso peel-blot (Figura 3). Las imágenes de las Figuras 2-4 se recogieron en condiciones de baja dosis a una tensión de aceleración de 120 kV con un microscopio electrónico de transmisión (ver Tabla de materiales).
Figura 1: Representación esquemática de la técnica peel-blot. Los dos primeros pasos (1-2 y 1-3) y el último paso (1-6) de la técnica peel-blot se basan en el método de inyección posterior 2 y los pasos intermedios siguen el protocolo peel-blot (modificado de Johnson et al.1). En el paso 1, (A) se apilan dos piezas de papel de filtro de tamaño de poro de 20-25 μm, (B) adyacente a un trozo de película de parafina con dos gotas de solución de trehalosa y (C) un trozo de papel de filtro submicrónico en dos trozos adicionales de papel de filtro. En el paso 2, (A) la película de carbono flota en la primera gota de trehalosa y (B) se recoge con pinzas anticapilares, después de lo cual se toca la superficie de la segunda gota (no se muestra) sin romper la tensión superficial para eliminar el exceso de película de carbono de la periferia. En el paso 3, (A) las pinzas que sostienen la rejilla se giran 180 ° (el lado de la película de carbono de la rejilla ahora está hacia abajo) y (B) la muestra se pipetea en el menisco de la trehalosa. En el paso 4, la rejilla se ha girado de nuevo a la orientación original con la película de carbono hacia arriba y la muestra se baja lentamente sobre el papel de filtro submicrónico. La rejilla se levanta y en el paso 5 se baja verticalmente sobre una gota de 1,7 μL de solución de trehalosa. Los pasos 4 y 5 se denominan "peel-blotting" y se pueden iterar tres o más veces, dependiendo de la cantidad de apilamiento. Es posible que sea necesario optimizar el número de iteraciones para diferentes muestras. En el paso 6, (A) la muestra se seca en dos capas de papel de filtro de tamaño de poro de 20-25 μm, antes de (B) se sumerge a mano en nitrógeno líquido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Una muestra de cristal 2Dsometida al método peel-blot. La región a la izquierda de la flecha se redujo en gran medida a cristales 2D de una sola capa en una región de contacto entre la película de carbono y la barra de rejilla que se borró y luego se desplazó, mientras que la región a la derecha de la flecha no estaba en una región afectada por la mancha de cáscara. Las regiones borradas se pueden seleccionar fácilmente y se observan en la mayor parte de la cuadrícula. Los cristales 2D mostrados son cristales 2D apilados y de una sola capa de leucotrieno humanoC4 sintasa. La barra de escala corresponde a 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Liposomas sometidos al peel-blot. El peel-blot se puede aplicar con éxito para interrumpir los bordes de liposomas y vesículas colapsadas para dar como resultado regiones con grandes bicapas de fosfolípidos de una sola capa, como se observa en la mitad inferior de la imagen. La mitad superior no estaba en una zona de contacto entre la barra de rejilla y la película de carbono y, por lo tanto, contiene liposomas completos con dos bicapas de fosfolípidos. La barra de escala corresponde a 1 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: La huella de peel-blot. El cuadrado de cuadrícula de una cuadrícula de 400 mallas muestra la huella (etiquetada "B") de la barra de cuadrícula y las regiones resultantes borradas de pelado, así como las regiones (etiquetadas como "C") que no estaban en contacto con una barra de cuadrícula o sometidas a menos iteraciones de borrado de pelado. La barra de escala corresponde a 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Secado de una rejilla EM preparada por inyección inversa en un papel de filtro submicrónico, utilizando una película de carbono demasiado delgada. Las imágenes son fotogramas individuales de un video (ver Video 1) tomadas en (A) contacto inicial con la membrana, (B) 1000 ms después del contacto y (C) 2000 ms después del contacto. La flecha indica cuadrados de cuadrícula en los que la presión capilar ha roto la película de carbono. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Video 1: La rejilla se coloca en el papel de filtro submicrónico para el paso de peel-blot . La película de carbono se aspira lenta y firmemente en la rejilla en la dirección de la parte inferior izquierda a la superior derecha, que intercala firmemente la muestra entre la barra de la rejilla y la película de carbono. La película de carbono y, por lo tanto, las capas de muestra individuales se desplazan en cada paso posterior de peel-blot, lo que permite la optimización con iteraciones adicionales para muestras de capas más altas. Haga clic aquí para descargar este video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El peel-blot es un método poderoso para superar el apilamiento y el grosor de cristales 2D de múltiples capas y muestras similares para la recopilación de datos crio-EM y el procesamiento de imágenes. La decisión sobre el uso del peel-blot se basará en los parámetros biológicos de la muestra y también requerirá una evaluación una vez que esté disponible un modelo 3D crio-EM. La importancia biológica de los contactos y la flexibilidad potencial de las regiones de contacto serán particularmente importantes en esta evaluación.
El número de peel-blots se establecerá inicialmente mediante observación después de la preparación estándar de la rejilla de tinción negativa, donde las capas o el grosor excesivos requerirán estrategias alternativas a la preparación estándar de la rejilla crio-EM. Los cristales delgados de varias capas que se apilan en registro pueden usarse directamente para microED3 o molidos con FIB en el caso de cristales más gruesos4. La cáscara-blot generalmente no será necesaria para cristales 2D de doble capa, ya que las capas se pueden procesar individualmente o juntas, cuando las capas están en el registro5. Sin embargo, podría ser potencialmente beneficioso para exponer ambos lados de los cristales 2D de proteína de membrana a ligandos o inhibidores, una vez en solución antes de la exfoliación y una vez después del paso final de exfoliación. Además, la reducción de cristales 2D de doble capa grandes y bien ordenados puede permitir la difracción de electrones 6,7. Las capas múltiples, ya sean inducidas o biológicas, de cristales 2D de membrana y proteínas solubles serán los objetivos más probables para el peel-blot, aunque el protocolo se puede aplicar a una variedad de especímenes y sirve para concentrar varias muestras para crio-EM (Figura 4).
Las pruebas iniciales con tinción negativa reducirán drásticamente el tiempo y el costo para optimizar las muestras, ya que no se requiere congelación, preparación de soportes de muestras crio-EM, transferencia a un crio-EM y uso de un crio-EM. Solo el tiempo de secado antes del paso de congelación deberá optimizarse por separado. El tiempo de secado será idéntico o muy similar al tiempo utilizado para secar una rejilla de retroinyección estándar de la misma muestra1.
Si bien las rejillas de malla 600 generalmente resultan en una buena conservación de la película de carbono, un mayor número de iteraciones de borrado de pelado y capas de película de carbono más delgadas pueden conducir a una mayor rotura de la película de carbono (Figura 5). Los cristales 2D apilados, los liposomas y las muestras en capas de grandes matrices de proteínas solubles se pueden separar con éxito (Figuras 2-4).
La muestra se evalúa cuidadosamente mediante crio-EM para garantizar que se eviten los efectos adversos sobre la calidad de la muestra. Esto se puede lograr mediante el procesamiento de imágenes para comparar imágenes de cristales apilados y no apilados. Tanto para fines de evaluación como para lograr el objetivo de un modelo 3D, el procesamiento de imágenes se lleva a cabo a través de los programas 2dx disponibles en Focus8,9, que también implementa enfoques de partículas individuales para abordar las imperfecciones de la red y la heterogeneidad de proteínas con la posibilidad de aumentar drásticamente la calidad inherente de los cristales 2D originales10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos u otros conflictos de intereses.
Acknowledgments
Parte de este trabajo fue apoyado por la subvención HL090630 (ISK) de los NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 600-mesh grids | SPI | 2060-C-XA | |
| Anti-capillary forceps | Ted Pella | 510-5 | |
| Carbon to coat mica | |||
| Cryo-EM | Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV. High-resolution data is collected at 300 kV. | ||
| Dumpont #5 forceps | Ted Pella | 5622 | |
| Grid box for cryo-EM storage | Ted Pella | 160-40 | |
| Kim Wipes | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mica | Ted Pella | 56 | The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid. The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots. |
| Negative stain | 1-2% uranyl acetate is suitable for many samples. Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted. | ||
| Parafilm | |||
| Polystyrene container | Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil. | ||
| Submicron filter paper | MilliporeSigma | DAWP04700 | |
| Transmission electron microscope | JEOL | JEM-1400 | Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids. |
| Trehalose | Prepare 4% trehalose solution. | ||
| Whatman #4 filter paper | MilliporeSigma | WHA1004150 | This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol. |
References
- Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).
- Kühlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 Å resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207 (4), 823-828 (1989).
- Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 1-8 (2018).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27 (3), 545-548 (2019).
- Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438 (7068), 633-638(2005).
- Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).
- Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).
- Gipson B., Zeng X., Zhang Z. Y., Stahlberg, H. 2dx-user-friendly image processing for 2D crystals. Journal of Structural Biology. 157 (1), 64-72 (2007).
- Biyani, N. et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
- Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).
