Summary
ピールブロット法は、多層および濃縮された生物学的サンプルを単層に分離して、厚さを減らし、サンプル濃度を高め、画像処理を容易にするクライオEMグリッド調製法です。
Abstract
ピールブロットクライオEMグリッド調製技術は、多層サンプルの層の削減を達成することを目的として、大幅に変更されたバックインジェクション法です。急落凍結の前にこのように層を除去することで、クライオEMデータ収集に適したレベルまでサンプルの厚さを薄くし、サンプルの平坦性を改善し、画像処理を容易にすることができます。ピールブロット法により、多層膜を単層に、層状2D結晶を個々の結晶に分離し、可溶性タンパク質の積層シート状構造を同様に単層に分離することができます。これらのタイプのサンプルの厚さが高いと、特にデータ収集のために顕微鏡ステージを傾ける必要がある場合、クライオEMデータ収集およびクライオEM画像処理に克服できない問題が発生することがよくあります。さらに、グリッド調製前のサンプル濃度を高め、ピールブロット技術で単層サンプルの密な分布をもたらすように調整できるため、これらのサンプルのいずれかの高濃度のグリッドを調製して効率的なデータ収集を行うことができます。
Introduction
ピールブロット法は、膜タンパク質の積層2次元結晶を単層に分離し、クライオEM 2Dおよび3Dデータ収集に適した薄いサンプルを取得し、画像処理を容易にするために開発されました1。このプロトコルは、他のタイプの多層サンプルにも同様に適しており、Zの厚さを増やすことなく、グリッド上のいずれかのサンプルタイプの高濃度を達成するのにも適しています。
サンプル層を1層に減らすことは、毛細管圧とせん断力の組み合わせを、バックインジェクション法2に実質的に拡張して変更するプロトコルに適用することによって達成されます。最初のブロッティングステップでは、バックインジェクション法の20〜25μmのろ紙の孔径ではなく、サブミクロンでのブロッティング中に、多層サンプルの両側にあるカーボンフィルムとグリッドバーにしっかりと挟まれ、接着されます。個々の層の分離または剥離は、グリッドがトレハロースドロップに垂直に押し付けられ、炭素膜がグリッドバーから強制的に離れると、挟まれた層を強制的に分離したときに発生します(図1)。グリッドバーとの元の接触点から離れたカーボンフィルムの再配置は、グリッドがサブミクロン濾紙上で再び吸い取られる次のステップで発生します。これらのステップの反復回数は、特定のサンプルに対して最適化できます。さらに、このプロトコルは、Zでの凝集を回避しながらサンプル濃度を高めるために使用できます。 グリッドバーと炭素膜への付着、および強制的な分離に依存するため、このアプローチは、特定の繊細で不安定なタンパク質やタンパク質複合体などの非常に壊れやすい分子には適さない場合があります。
ピールブロット技術は、特殊な機器や高価な消耗品を必要としません。ただし、特定のサンプルに適用するには、生物学的パラメータを慎重に検討する必要があります。2D結晶では平坦性を確保するために炭素膜が必要であるため、決定は簡単ですが、ピールブロット法 による 操作は、サンプルの生物学的完全性または結晶秩序に影響を与える可能性があります。単一粒子に対するピールブロット技術の適合性は、炭素膜を必要とし、操作に対して安定なものに限定され、試験され得る。層間に重要な生物学的相互作用を有する標本は、そのような相互作用の破壊のために、ピールブロット技術の助けを借りての特性評価に適さない可能性があります。
ピールブロット法(「ピールブロット」)は、室温のTEMによる陰性染色または未染色サンプルでの試験およびスクリーニングによって最も迅速に最適化されます。ピールブロットの反復の最適な回数が特定されたら、ガラス化前の厚さを制御する時間を決定できます。
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Protocol
1. ピールブロット法の準備手順
注:準備には、次のアイテムを互いに隣接して配置する必要があります。
- 20〜25μmの孔径ろ紙を2枚積み重ねます( 材料表を参照)。
- ~8 cm x 10 cmの長さのパラフィンフィルムを、紙を上に向けてろ紙の隣に置きます。
- サブミクロンのろ紙を、さらに2枚の#4ろ紙の上に置きます(図1-1)。
- 曲がった脚を上に向けてまっすぐな脚を下に向けて、毛細血管防止鉗子を配置します。次に、滑らかな/光沢のある面を上にして600メッシュのグリッドを選択します。きれいなグリッドが他のアイテムと接触しないように、鉗子をペトリ皿または他の隆起した面に置きます。
- パラフィンフィルムから紙を取り除き、側面(~5 mm)を引っ張って小さなリムを作成します。パラフィンフィルムの片方の短辺から~1-2 cm、パラフィンフィルム上に~1 cm離して、4%トレハロース溶液の150 μLを2滴滴ピペットでピペットします。
- 別のベンチまたは床に、小さな発泡スチロール容器に液体窒素を注ぎます(材料の表を参照)。
注意: 凍傷を避けるために、手袋とフェイスシールドを使用して適切な取り扱いのためのトレーニングを受けてください。 - 小さなクライオEMグリッド容器を液体窒素に入れ、発泡スチロール容器を糸くずの出ないワイプで覆います。
2.カーボンフィルムをグリッドに配置する
- デュモン#5鉗子( 材料の表を参照)を使用して、トレハロース溶液の滴の1つにマイカの片側をわずかに下向き(~20°-40°)で触れてマイカからカーボンフィルムを浮かせ、マイカを下方に動かして水圧をゆっくりとカーボンフィルムから持ち上げます。カーボン膜が液滴の表面に浮いたら、マイカを放出します。
- カーボン膜を目視検査して、破壊の形で損傷のあるカーボンを使用しないようにします。
- 毛細管防止鉗子によって角度(~20°-30°)で保持されているグリッドを、カーボンフィルムに隣接し、次にカーボンフィルムの下の中央にあるトレハロースドロップに挿入します。カーボン膜を拾います(図1-2)。
- グリッドを同じ方向に保ち、ドロップの表面張力を壊さずにトレハロースの2番目のドロップの表面にゆっくりと下げて、グリッドの縁を粗い側に巻き付けた可能性のある不要なカーボンフィルムを取り除きます。
3. 多層2次元結晶の単層分離
- 毛細管防止鉗子を回転させ( 材料の表を参照)、グリッドのカーボン側を下に向けてペトリ皿に置きます(図1-3)。
- 1.3 μLのサンプルをグリッド上部のわずかなトレハロースメニスカスにピペットで入れます。溶液を~8〜10回ピペットでピペットで、トレハロースとサンプルをグリッドの両側に混合して分配します。
- 溶液を1分間インキュベートしながら、1滴以上のトレハロース溶液をパラフィンフィルム上にピペットで移します。
- グリッドを回転させて、カーボンフィルムを上に向けて元の位置に戻します。
- 毛細管防止鉗子を使用して、グリッドをサブミクロンのろ紙に押し付けます(図1-4)。溶液がろ紙に吸収され、炭素膜が平らになったら、3秒間待ってからグリッドを持ち上げ、1.7 μLのトレハロース溶液滴上に垂直に移動します(図1-5)。
注:高度に積み重ねられたサンプルに対してこの手順を複数回繰り返すか、次のステップでグリッドをガラス化の準備をします。 - 2 枚のろ紙のグリッドを拭き取り、グリッドをろ紙から持ち上げます(図 1-6)。約13秒後、湿度とサンプルバッファーに応じて、グリッドを小さな発泡スチロール容器の液体窒素に突っ込み、グリッドをクライオEMグリッドコンテナに入れるか、クライオEMスクリーニングまたはデータ収集のために直接転送します。
注意: プロトコルを迅速に最適化するには、液体窒素に突っ込むのではなく、このステップでピールブロットグリッドを負に染色します。3 μLの1%酢酸ウラニルをグリッドに適用してサンプルを陰性染色し、グリッドを30秒間インキュベートし、20〜25 μmの孔径ろ紙の破れた部分で拭き取ります。トレハロース、タンニン、またはグルコースでガラス化された2D結晶のグリッドは、トレハロース、タンニン、およびグルコースが手急落に使用される速度で結晶氷の形成を妨げるため、ガラス化のために定期的に手で急落されます2。
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Representative Results
ピールブロット実験が成功すると、多くの場合、高濃度のサンプルの単層が得られます。ほとんどのグリッド正方形の一部の領域には、特にピールブロットステップの反復回数が少ない場合、依然として複数の層が含まれることが予想されます。ただし、グリッドの正方形の大部分は、ヒトロイコトリエンC4シンターゼ(図2)とリポソーム(ステップ3.2、 図3で追加)の2D結晶で観察されたように、単層の広範な領域を含みます。追加のピールブロットステップは、層に望ましい減少を示さないサンプルについてテストする必要がある場合があります。
ピールブロット実験の成功を示す最も重要な指標は、高解像度のクライオEMデータ収集と画像処理の後に観察されたデータ品質と生物学的完全性です。データの解釈には、レイヤー間の接触領域への潜在的な損傷または歪みを慎重に考慮する必要があります。
剥離ブロッティングが発生したEMグリッドの領域は、通常、剥離ブロッティングが発生していない領域よりも高い濃度のサンプルを表示します。この見かけの濃縮効果は、多層サンプルがカーボンフィルムとグリッドバーの両方の表面に付着し、その後、ピールブロット調製中に両方の表面が繰り返し分離し、わずかに再配置し、再び接触するときに、両方の表面がさらに付着することによって引き起こされます。その結果、元の多層サンプルのさまざまな層が、より広い横方向の領域に広がっています(図3および図4)。これらの領域には、より大きな2D結晶または膜を含めることもできます。両方の現象は、「ピールゾーン」がピールブロットステップの影響を受けない領域に隣接している領域で簡単に観察および比較できます(図3)。図2〜4の画像は、透過型電子顕微鏡を用いて加速電圧120kVの低線量条件下で収集したものです(材料の表を参照)。
図1:ピールブロット法の概略図。 ピールブロット技術の最初の2つのステップ(1-2および1-3)および最後のステップ(1-6)は、バックインジェクション法2に基づいており、中間ステップはピールブロットプロトコル(Johnsonら1から修正)に従います。ステップ1では、(A)2枚の20〜25μmの孔径濾紙を積み重ね、(B)2滴のトレハロース溶液を含むパラフィンフィルム片に隣接し、(C)サブミクロン濾紙を2枚の追加の濾紙上に積み重ねる。工程2では、(A)カーボン膜を第1のトレハロース液滴上に浮かせ、(B)毛細管防止鉗子でピックアップし、その後、表面張力を壊すことなく第2の液滴(図示せず)の表面に触れさせて、周囲から余分な炭素膜を除去する。ステップ3では、(A)グリッドを保持している鉗子を180°回転させ(グリッドの炭素膜側が下を向いている)、(B)サンプルをトレハロースのメニスカスにピペットで入れます。ステップ4では、カーボンフィルムを上に向けてグリッドを元の向きに回転させ、サンプルをサブミクロンのろ紙にゆっくりと下げます。グリッドを持ち上げ、ステップ5で1.7μL滴のトレハロース溶液上に垂直に下げます。ステップ4と5は「ピールブロッティング」と呼ばれ、スタッキングの量に応じて3回以上繰り返すことができます。反復回数は、サンプルごとに最適化する必要がある場合があります。ステップ6では、(A)サンプルを20〜25μmの孔径ろ紙の2層に吸い取り、(B)液体窒素に手で突っ込みます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ピールブロット法に供した2D結晶サンプル。矢印の左側の領域は、剥離ブロットされてからシフトした炭素膜とグリッドバーとの接触領域で単層2D結晶に大きく縮小されましたが、矢印の右側の領域はピールブロットの影響を受けない領域でした。ピールブロット領域は簡単に選択でき、ほとんどのグリッドで観察されます。示されている2D結晶は、ヒトロイコトリエンC4シンターゼの積層および単層2D結晶である。スケールバーは10μmに相当します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ピールブロットに供したリポソーム。 ピールブロットは、崩壊したリポソームおよび小胞のエッジを中断するためにうまく適用され、画像の下半分で観察されるように、大きな、ほとんどが単層のリン脂質二重層を有する領域をもたらすことができる。上半分はグリッドバーと炭素膜の間の接触ゾーンになかったため、2つのリン脂質二重層を持つ完全なリポソームが含まれています。スケールバーは1μmに相当します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ピールブロットフットプリント。 400メッシュグリッドのグリッド四角形は、グリッドバーのフットプリント(「B」とラベル付け)と、結果として生じるピールブロット領域、およびグリッドバーと接触しなかった領域(「C」とラベル付け)、またはピールブロット反復回数が少ない領域(「C」とラベル付け)を示します。スケールバーは10μmに相当します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:サブミクロン濾紙にバックインジェクションで作製したEMグリッドを、薄すぎる炭素膜を用いて吸い取った。画像は、(A)メンブレンとの最初の接触、(B)接触後1000ミリ秒、および(C)接触後2000ミリ秒で撮影されたビデオ(ビデオ1を参照)からの単一フレームです。矢印は、毛細管圧が炭素膜を破裂させたグリッドの正方形を示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ1:グリッドは、ピールブロットステップのためにサブミクロン濾紙に配置されます。 カーボン膜は、左下から右上の方向にグリッド上にゆっくりとしっかりと吸引され、グリッドバーとカーボンフィルムの間にサンプルをしっかりと挟みます。カーボン膜、したがって個々のサンプル層は、後続の各ピールブロットステップで変位するため、より高度に層化されたサンプルの追加反復による最適化が可能になります。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ピールブロットは、クライオ電子顕微鏡データ収集と画像処理のための多層2D結晶および類似サンプルのスタッキングと厚さを克服するための強力な方法です。ピールブロットの使用に関する決定は、サンプルの生物学的パラメータに基づいて行われ、3DクライオEMモデルが利用可能になったら評価も必要になります。接触の生物学的重要性と接触領域の潜在的な柔軟性は、この評価で特に重要になります。
ピールブロットの数は、標準的なネガティブステイングリッド調製後の観察によって最初に確立され、過剰な層または厚さには、標準的なクライオEMグリッド調製に代わる戦略が必要になります。レジスターに積層された薄い多層結晶は、microED3に直接使用してもよいし、より厚い結晶4の場合はFIBミル化してもよい。ピールブロットは、層がレジスター5にある場合、層を個別にまたは一緒に処理できるため、通常、2層構造の2D結晶には必要ありません。膜タンパク質の2D結晶の両側をリガンドまたは阻害剤にさらすには、ピールブロッティングの前に溶液中で1回、最後のピールブロッティングステップの後に1回、潜在的に有益である可能性があります。さらに、大きくて秩序の整然とした二重層2D結晶を還元すると、電子回折が可能になる可能性があります6,7。このプロトコルはさまざまな検体に適用でき、クライオ電子顕微鏡用のさまざまなサンプルを濃縮するのに役立ちますが、膜と可溶性タンパク質の2D結晶の誘導または生物学的に発生する多層がピールブロットの最も可能性の高いターゲットになります(図4)。
陰性染色による初期検査は、凍結、クライオEMサンプルホルダーの準備、クライオEMへの移行、クライオEMの使用が不要なため、サンプルを最適化するための時間とコストを大幅に削減します。凍結ステップ前の乾燥時間のみを個別に最適化する必要があります。乾燥時間は、同じサンプル1の標準的なバックインジェクショングリッドを乾燥させるために使用される時間と同一または非常に類似するであろう。
600メッシュグリッドは一般に炭素膜の保存性を良好にしますが、ピールブロットの反復回数を増やし、炭素膜層を薄くすると、炭素膜の破損が増加する可能性があります(図5)。積層された2D結晶、リポソーム、および可溶性タンパク質の大規模なアレイの層状サンプルを正常に分離できます(図2-4)。
サンプルはクライオEMによって慎重に評価され、サンプル品質への悪影響が回避されます。これは、積層された結晶と積み重ねられていない結晶の画像を比較するための画像処理によって達成され得る。評価目的と3Dモデルの目標を達成するための両方で、画像処理はFocus 8,9で利用可能な2dxプログラムを介して行われ、格子の不完全性とタンパク質の不均一性に対処するための単一粒子アプローチも実装されており、元の2D結晶の固有の品質を劇的に向上させる可能性があります10。
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Disclosures
著者は、競合する金銭的利益やその他の利益相反を持っていません。
Acknowledgments
この作業の一部は、NIH助成金HL090630(ISK)によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 600-mesh grids | SPI | 2060-C-XA | |
| Anti-capillary forceps | Ted Pella | 510-5 | |
| Carbon to coat mica | |||
| Cryo-EM | Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV. High-resolution data is collected at 300 kV. | ||
| Dumpont #5 forceps | Ted Pella | 5622 | |
| Grid box for cryo-EM storage | Ted Pella | 160-40 | |
| Kim Wipes | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mica | Ted Pella | 56 | The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid. The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots. |
| Negative stain | 1-2% uranyl acetate is suitable for many samples. Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted. | ||
| Parafilm | |||
| Polystyrene container | Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil. | ||
| Submicron filter paper | MilliporeSigma | DAWP04700 | |
| Transmission electron microscope | JEOL | JEM-1400 | Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids. |
| Trehalose | Prepare 4% trehalose solution. | ||
| Whatman #4 filter paper | MilliporeSigma | WHA1004150 | This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol. |
References
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