Summary
필 블롯 기술은 다층 및 농축된 생물학적 샘플을 단일 레이어로 분리하여 두께를 줄이고 샘플 농도를 높이며 이미지 처리를 용이하게 하는 Cryo-EM 그리드 준비 방법입니다.
Abstract
필 블롯 Cryo-EM 그리드 준비 기술은 다층 시료의 층을 줄이기 위해 크게 수정된 역주입 방법입니다. 플런지 동결 전에 층을 제거하면 시료 두께를 Cryo-EM 데이터 수집에 적합한 수준으로 줄이고 시료 평탄도를 개선하며 이미지 처리를 용이하게 하는 데 도움이 될 수 있습니다. 필 블롯 기술은 다층 멤브레인을 단일 층으로 분리하고, 층상 2D 결정을 개별 결정으로, 용해성 단백질의 적층 된 시트 모양의 구조를 단일 층으로 분리 할 수 있습니다. 이러한 유형의 시료의 높은 시료 두께는 특히 데이터 수집을 위해 현미경 스테이지를 기울여야 하는 경우 Cryo-EM 데이터 수집 및 Cryo-EM 이미지 처리에 극복할 수 없는 문제를 자주 제기합니다. 또한, 그리드 준비 이전의 샘플 농도를 증가시킬 수 있고 필 블롯 기술을 조정하여 단층 표본의 조밀 한 분포를 초래할 수 있기 때문에 이러한 샘플 중 임의의 고농도의 그리드를 효율적으로 데이터 수집을 위해 준비 할 수 있습니다.
Introduction
필 블롯 기술은 적층된 막 단백질의 2차원 결정을 단층으로 분리하여 Cryo-EM 2D 및 3D 데이터 수집에 적합한 얇은 샘플을 얻고이미지 처리를 용이하게 하기 위해 개발되었습니다1. 이 프로토콜은 다른 유형의 다층 샘플뿐만 아니라 Z 단위의 두께를 늘리지 않고 그리드에서 두 샘플 유형의 높은 샘플 농도를 달성하는 데에도 적합합니다.
샘플 층을 하나의 층으로 감소시키는 것은 역주입 방법(2) 상에서 실질적으로 연장되고 변형되는 프로토콜에서 모세관 압력과 전단력의 조합을 적용함으로써 달성된다. 첫 번째 블로팅 단계는 백 주입 방법에서 20-25μm 여과지 기공 크기가 아닌 서브 마이크론에서 블로팅하는 동안 다층 샘플의 양쪽에 탄소 필름과 그리드 바를 단단히 샌드위치하고 부착시킵니다. 개별 층의 분리 또는 박리는 그리드가 트레할로스 드롭에 수직으로 눌려지면 샌드위치 된 층을 강제로 분리 할 때 발생하여 탄소 필름이 그리드 막대에서 멀어집니다 (그림 1). 그리드 바와의 원래 접촉점에서 멀리 떨어진 탄소 필름의 위치 변경은 그리드가 서브 마이크론 여과지에서 다시 한번 블롯 될 때 다음 단계에서 발생합니다. 이러한 단계의 반복 횟수는 특정 샘플에 대해 최적화할 수 있습니다. 또한 이 프로토콜을 사용하여 Z의 응집을 피하면서 샘플 농도를 높일 수 있습니다. 그리드 바 및 탄소 필름에 대한 부착과 강제 분리에 의존하기 때문에 이 접근법은 특정 섬세하거나 불안정한 단백질 및 단백질 복합체와 같은 매우 깨지기 쉬운 분자에는 적합하지 않을 수 있습니다.
필 블롯 기술은 특수 장비나 값비싼 소모품이 필요하지 않습니다. 그러나 특정 샘플에 대한 적용 가능성은 생물학적 매개 변수에 대한 신중한 고려가 필요합니다. 평탄도를 보장하기 위해 탄소 필름이 필요하기 때문에 2D 결정의 경우 결정이 더 쉽지만 필 블롯 기술을 통한 조작은 샘플의 생물학적 무결성 또는 결정 순서에 영향을 미칠 수 있습니다. 단일 입자에 대한 필 블롯 기술의 적합성은 탄소 필름이 필요하고 조작에 안정적인 것으로 제한되며 테스트 될 수 있습니다. 층 사이에 중요한 생물학적 상호 작용이있는 표본은 이러한 상호 작용의 중단으로 인해 필 블롯 기술의 도움으로 특성화에 적합하지 않을 수 있습니다.
필 블롯 기술("필 블롯")은 실온에서 TEM에 의한 음성 염색 또는 염색되지 않은 샘플로 테스트 및 스크리닝함으로써 가장 빠르게 최적화됩니다. 최적의 필 블롯 반복 횟수가 확인되면 유리화 전에 두께를 제어하는 시간을 결정할 수 있습니다.
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Protocol
1. 필 블롯 기술의 준비 단계
알림: 준비하려면 다음 항목을 서로 인접하게 배치해야 합니다.
- 20-25 μm 기공 크기 여과지 두 장을 쌓습니다( 재료 표 참조).
- ~8cm x 10cm 길이의 파라핀 필름을 여과지 옆에 놓고 용지가 위를 향하도록 합니다.
- 두 개의 추가 #4 여과지 위에 서브미크론 여과지를 놓습니다(그림 1-1).
- 구부러진 다리가 위를 향하고 곧은 다리가 아래를 향하도록 모세관 방지 집게를 놓습니다. 그런 다음 매끄럽고 반짝이는 면이 위로 오도록 600메쉬 그리드를 선택합니다. 깨끗한 그리드가 다른 품목과 접촉하지 않도록 집게를 페트리 접시 또는 기타 융기된 표면에 놓습니다.
- 파라핀 필름에서 용지를 제거하고 측면(~5mm)을 당겨 작은 테두리를 만듭니다. 파라핀 필름의 한쪽 짧은 면과 파라핀 필름에서 ~1cm 떨어진 4% 트레할로스 용액 150μL 방울 2개를 피펫팅합니다.
- 별도의 벤치 또는 바닥에 작은 폴리스티렌 폼 용기에 액체 질소를 붓습니다 ( 재료 표 참조).
주의 : 동상 물림을 피하기 위해 장갑과 안면 보호대를 사용하여 올바른 취급에 대한 교육을 받으십시오. - 작은 Cryo-EM 그리드 용기를 액체 질소에 넣고 보풀이 없는 물티슈로 폴리스티렌 폼 용기를 덮습니다.
2. 그리드에 탄소 필름 배치
- Dumont #5 집게( 재료 표 참조)를 사용하여 트레할로스 용액 방울 중 하나에서 운모의 한쪽을 아래쪽(~20°-40°)으로 약간 아래쪽으로 만져 운모에서 탄소 필름을 띄우고 운모를 아래쪽으로 이동하여 물의 장력이 탄소 필름에서 천천히 해제되도록 합니다. 탄소 필름이 물방울 표면에 떠 있으면 운모를 방출하십시오.
- 균열 형태의 손상이있는 탄소를 사용하지 않도록 탄소 필름을 육안으로 검사하십시오.
- 모세관 방지 집게가 고정한 그리드를 비스듬히 (~20°-30°) 인접한 위치의 트레할로스 방울에 삽입한 다음 탄소 필름 아래 중앙에 삽입합니다. 탄소 필름을 들어 올립니다(그림 1-2).
- 그리드를 동일한 방향으로 유지하고 드롭의 표면 장력을 깨지 않고 트레할로스 두 번째 방울의 표면 위로 천천히 내려 그리드 테두리를 거친 쪽으로 감았을 수 있는 불필요한 탄소 필름을 제거합니다.
3. 다층 2D 결정을 단층으로 분리
- 모세관 방지 집게(재료 표 참조)를 회전시키고 그리드의 탄소 면이 아래를 향하도록 페트리 접시에 놓습니다(그림 1-3).
- 1.3 μL의 샘플을 그리드 상단의 약간의 트레할로스 메니스커스에 피펫팅한다. 용액을 ~8-10회 피펫팅하여 트레할로스와 샘플을 그리드의 양쪽에 혼합하고 분배합니다.
- 용액을 1분 동안 인큐베이션하는 동안, 하나 이상의 트레할로스 용액 1.7 μL 방울을 파라핀 필름 상에 피펫팅한다.
- 탄소 필름이 위를 향하도록 그리드를 원래 위치로 다시 돌립니다.
- 모세관 방지 집게를 사용하여 그리드를 서브미크론 여과지에 누릅니다(그림 1-4). 용액이 여과지에 흡수되고 탄소 필름이 평평하게 놓이면 그리드를 들어 올리고 트레할로스 용액의 1.7μL 방울 위로 수직으로 이동하기 전에 3초 동안 기다립니다(그림 1-5).
알림: 고도로 쌓인 샘플에 대해 이 단계를 여러 번 반복하거나 다음 단계에서 유리화를 위해 그리드가 준비됩니다. - 두 개의 여과지에 격자를 닦은 다음 여과지에서 격자를 들어 올립니다(그림 1-6). 습도 및 시료 버퍼에 따라 약 13초 후, 그리드를 작은 스티로폼 용기의 액체 질소에 넣고 그리드를 Cryo-EM 그리드 용기에 넣거나 Cryo-EM 스크리닝 또는 데이터 수집을 위해 직접 옮깁니다.
참고: 프로토콜을 신속하게 최적화하려면 이 단계에서 박리 얼룩이 있는 그리드를 액체 질소에 넣지 말고 부정적으로 얼룩지게 합니다. 그리드에 1% 우라닐 아세테이트 3μL를 적용하여 샘플을 부정적으로 염색하고 그리드를 30초 동안 배양한 다음 20-25μm 공극 크기 여과지의 찢어진 조각으로 얼룩지게합니다. 트레할로스, 탄닌 또는 포도당으로 유리화된 2D 결정 그리드는 트레할로스, 탄닌 및 포도당이 수동 급락에 사용되는 속도로 결정질 얼음의 형성을 방지하기 때문에 유리화를 위해 일상적으로 손으로 떨어진다2.
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Representative Results
성공적인 필 블롯 실험은 종종 고농도의 단일 샘플 층을 생성합니다. 대부분의 그리드 사각형의 일부 영역에는 여전히 여러 레이어가 포함될 것으로 예상되며, 특히 필 블롯 단계의 반복 횟수가 적습니다. 그러나 대부분의 그리드 사각형에는 인간 류코트리엔 C4 합성 효소 (그림 2) 및 리포좀 (3.2 단계, 그림 3에 추가됨)의 2D 결정에서 관찰 된 바와 같이 광범위한 단층 영역이 포함됩니다. 층에서 원하는 감소를 나타내지 않는 샘플에 대해 추가 필 블롯 단계를 테스트해야 할 수 있습니다.
성공적인 필 블롯 실험의 가장 중요한 지표는 고해상도 Cryo-EM 데이터 수집 및 이미지 처리 후 관찰된 데이터 품질과 생물학적 무결성입니다. 데이터 해석에는 레이어 간의 접촉 영역에 대한 잠재적 손상 또는 왜곡에 대한 신중한 고려가 포함되어야 합니다.
박리 블로팅이 발생한 EM 그리드의 영역은 일반적으로 발생하지 않은 영역보다 더 높은 농도의 샘플을 표시합니다. 이 겉보기 농축 효과는 다층 샘플이 탄소 필름과 그리드 바 표면 모두에 부착된 후 필 블롯 준비 중에 반복적으로 분리되고 약간 재배치되고 다시 접촉할 때 두 표면에 추가로 부착되기 때문에 발생합니다. 그 결과 원래의 다중 라멜라 샘플의 여러 층이 더 넓은 측면 영역에 걸쳐 분산됩니다(그림 3 및 그림 4). 이러한 영역에는 더 큰 2D 결정 또는 멤브레인이 포함될 수도 있습니다. 두 현상 모두 "필 영역"이 필 블롯 단계의 영향을 받지 않는 영역에 인접한 영역에서 쉽게 관찰되고 비교됩니다(그림 3). 그림 2-4의 이미지는 투과 전자 현미경으로 120kV의 가속 전압에서 저선량 조건에서 수집되었습니다(재료 표 참조).
그림 1: 필 블롯 기법의 개략적 표현. 필-블롯 기술의 처음 두 단계(1-2 및 1-3)와 마지막 단계(1-6)는 백주입 방법(2)을 기반으로 하고 중간 단계는 필-블롯 프로토콜(Johnson et al.1에서 수정됨)을 따릅니다. 1단계에서 (A) 20-25μm 기공 크기의 여과지 두 장을 쌓고, (B) 트레할로스 용액 두 방울이 있는 파라핀 필름 조각에 인접하고, (C) 두 개의 추가 여과지에 서브미크론 여과지 한 장을 쌓습니다. 단계 2에서, (A) 탄소 필름은 제 1 트레할로스 액적 상에 부유되고, (B) 모세관 방지 겸자로 집어 올려지고, 그 후 표면 장력을 깨지 않고 제 2 액적 (미도시)의 표면에 접촉되어 주변으로부터 과잉의 탄소 막을 제거한다. 3단계에서 (A) 그리드를 고정하는 포셉이 180° 회전하고(그리드의 탄소 필름 쪽이 이제 아래를 향함) (B) 샘플을 트레할로스의 메니스커스에 피펫팅합니다. 4단계에서 그리드는 탄소 필름이 위를 향하도록 원래 방향으로 다시 회전하고 샘플은 서브미크론 여과지 위로 천천히 내려갑니다. 그리드를 들어 올리고 5단계에서 트레할로스 용액 1.7μL 방울 위로 수직으로 내립니다. 4단계와 5단계를 "필 블로팅"이라고 하며 스태킹의 양에 따라 3회 이상 반복할 수 있습니다. 반복 횟수는 다른 샘플에 대해 최적화해야 할 수 있습니다. 단계 6에서, (A) 샘플을 20-25 μm 공극 크기의 여과지의 두 층에 블롯팅하고, (B) 액체 질소에 손으로 담그기 전에. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 필 블롯 방법을 거친 2D 결정 샘플. 화살표의 왼쪽 영역은 탄소 필름과 그리드 막대 사이의 접촉 영역에서 단층 2D 결정으로 크게 축소되어 박리 블롯 된 다음 이동되었으며, 화살표의 오른쪽 영역은 필 블롯의 영향을받는 영역에 없었습니다. 박리 블롯 영역은 쉽게 선택할 수 있으며 대부분의 그리드에서 관찰됩니다. 도시된 2D 결정은 인간 류코트리엔C4 합성효소의 적층 및 단층 2D 결정입니다. 스케일 바는 10 μm에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 필 블롯을 거친 리포좀. 필 블롯은 붕괴 된 리포솜과 소포의 가장자리를 차단하여 이미지의 아래쪽 절반에서 관찰되는 것처럼 크고 대부분 단층 인지질 이중층이있는 영역을 생성하는 데 성공적으로 적용될 수 있습니다. 상반부는 그리드 바(grid bar)와 탄소 필름 사이의 접촉 영역에 있지 않았고, 따라서 두 개의 인지질 이중층을 갖는 완전한 리포좀을 함유한다. 스케일 바는 1μm에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 필 블롯 풋프린트. 400 메쉬 그리드의 그리드 사각형은 그리드 막대의 풋프린트("B"로 레이블이 지정됨)와 결과 필 블롯 영역뿐만 아니라 그리드 막대와 접촉하지 않았거나 더 적은 필 블롯 반복을 거친 영역("C"로 레이블이 지정됨)을 보여줍니다. 스케일 바는 10 μm에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 너무 얇은 탄소 필름을 사용하여 서브미크론 여과지에 역주입하여 준비한 EM 그리드를 블로팅합니다. 이미지는 (A) 멤브레인과의 초기 접촉, (B) 접촉 후 1000ms 및 (C) 접촉 후 2000ms에서 촬영된 비디오(비디오 1 참조)의 단일 프레임입니다. 화살표는 모세관 압력이 탄소 필름을 파열시킨 격자 사각형을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1: 그리드는 필 블롯 단계를 위해 서브미크론 여과지에 놓입니다. 탄소 필름은 왼쪽 하단에서 오른쪽 상단 방향으로 그리드에 천천히 단단히 흡입되어 그리드 바와 탄소 필름 사이에 샘플을 단단히 끼 웁니다. 탄소 필름과 개별 샘플 층은 각각의 후속 필 블롯 단계에서 변위되어 더 높은 계층화 된 샘플에 대한 추가 반복으로 최적화를 허용합니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
필 블롯은 Cryo-EM 데이터 수집 및 이미지 처리를 위해 다층 2D 결정 및 유사한 샘플의 적층 및 두께를 극복하는 강력한 방법입니다. 필 블롯 사용에 대한 결정은 샘플의 생물학적 파라미터를 기반으로 하며 3D Cryo-EM 모델을 사용할 수 있게 되면 평가도 필요합니다. 접촉의 생물학적 중요성과 접촉 영역의 잠재적 유연성은이 평가에서 특히 중요합니다.
필 블롯의 수는 처음에는 표준 네거티브 스테인 그리드 준비 후 관찰을 통해 설정되며, 과도한 층 또는 두께에는 표준 Cryo-EM 그리드 준비에 대한 대체 전략이 필요합니다. 레지스터에 적층된 얇은 다층 결정은 더 두꺼운 결정4의 경우microED3 또는 FIB-밀링에 직접 사용될수 있다. 필 블롯은 일반적으로 층이 레지스터5에있을 때 층을 개별적으로 또는 함께 처리 할 수 있기 때문에 이중층 2D 결정에 필요하지 않습니다. 막 단백질 2D 결정의 양면을 리간드 또는 억제제에 노출시키는 데 잠재적으로 도움이 될 수 있지만, 필 블로팅 전에 용액에 한 번, 최종 필 블로팅 단계 후에 한 번. 또한, 크고 잘 정돈 된 이중층 2D 결정을 줄이면 전자 회절(6,7)이 가능할 수있다. 멤브레인 및 가용성 단백질의 2D 결정의 유도 또는 생물학적 발생 다층은 다양한 표본에 적용할 수 있고 Cryo-EM을 위한 다양한 샘플을 농축하는 역할을 할 수 있음에도 불구하고 필 블롯의 가장 가능성 있는 표적이 될 것입니다(그림 4).
염색 음성으로 초기 테스트를 수행하면 동결, Cryo-EM 시료 홀더 준비, Cryo-EM으로의 전송 및 Cryo-EM 사용이 필요하지 않으므로 시료를 최적화하는 데 드는 시간과 비용이 크게 줄어듭니다. 동결 단계 전의 건조 시간만 별도로 최적화하면 됩니다. 건조 시간은 동일한 샘플1의 표준 역주입 그리드를 건조하기 위해 사용된 시간과 동일하거나 매우 유사할 것이다.
600 메쉬 그리드는 일반적으로 탄소 필름의 우수한 보존을 가져 오지만 필 블롯 반복 횟수가 증가하고 탄소 필름 층이 얇아지면 탄소 필름 파손이 증가 할 수 있습니다 (그림 5). 용해성 단백질의 적층된 2D 결정, 리포좀 및 대규모 어레이의 층상 샘플을 성공적으로 분리할 수 있습니다(그림 2-4).
시료는 Cryo-EM에 의해 신중하게 평가되어 시료 품질에 대한 악영향을 방지합니다. 이것은 적층된 결정과 적층되지 않은 결정의 이미지를 비교하기 위한 이미지 처리에 의해 달성될 수 있다. 평가 목적과 3D 모델의 목표 달성 모두에서, 이미지 처리는 Focus 8,9에서 사용할 수 있는 2dx 프로그램을 통해 수행되며, 이 프로그램은 또한 격자 결함 및 단백질 이질성을 해결하기 위한 단일 입자 접근 방식을 구현하여 원래 2D 결정(10)의 고유한 품질을 극적으로 증가시킬 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁하는 재정적 이해 관계나 기타 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업의 일부는 NIH 보조금 HL090630(ISK)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 600-mesh grids | SPI | 2060-C-XA | |
| Anti-capillary forceps | Ted Pella | 510-5 | |
| Carbon to coat mica | |||
| Cryo-EM | Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV. High-resolution data is collected at 300 kV. | ||
| Dumpont #5 forceps | Ted Pella | 5622 | |
| Grid box for cryo-EM storage | Ted Pella | 160-40 | |
| Kim Wipes | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mica | Ted Pella | 56 | The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid. The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots. |
| Negative stain | 1-2% uranyl acetate is suitable for many samples. Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted. | ||
| Parafilm | |||
| Polystyrene container | Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil. | ||
| Submicron filter paper | MilliporeSigma | DAWP04700 | |
| Transmission electron microscope | JEOL | JEM-1400 | Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids. |
| Trehalose | Prepare 4% trehalose solution. | ||
| Whatman #4 filter paper | MilliporeSigma | WHA1004150 | This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol. |
References
- Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).
- Kühlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 Å resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207 (4), 823-828 (1989).
- Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 1-8 (2018).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27 (3), 545-548 (2019).
- Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438 (7068), 633-638(2005).
- Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).
- Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).
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- Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).
