Summary

필 블롯 기법: 다층 또는 농축된 생물학적 시료에서 단층을 분리하는 Cryo-EM 시료 전처리 방법

Published: June 29, 2022
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Summary

필 블롯 기술은 다층 및 농축된 생물학적 샘플을 단일 레이어로 분리하여 두께를 줄이고 샘플 농도를 높이며 이미지 처리를 용이하게 하는 Cryo-EM 그리드 준비 방법입니다.

Abstract

필 블롯 Cryo-EM 그리드 준비 기술은 다층 시료의 층을 줄이기 위해 크게 수정된 역주입 방법입니다. 플런지 동결 전에 층을 제거하면 시료 두께를 Cryo-EM 데이터 수집에 적합한 수준으로 줄이고 시료 평탄도를 개선하며 이미지 처리를 용이하게 하는 데 도움이 될 수 있습니다. 필 블롯 기술은 다층 멤브레인을 단일 층으로 분리하고, 층상 2D 결정을 개별 결정으로, 용해성 단백질의 적층 된 시트 모양의 구조를 단일 층으로 분리 할 수 있습니다. 이러한 유형의 시료의 높은 시료 두께는 특히 데이터 수집을 위해 현미경 스테이지를 기울여야 하는 경우 Cryo-EM 데이터 수집 및 Cryo-EM 이미지 처리에 극복할 수 없는 문제를 자주 제기합니다. 또한, 그리드 준비 이전의 샘플 농도를 증가시킬 수 있고 필 블롯 기술을 조정하여 단층 표본의 조밀 한 분포를 초래할 수 있기 때문에 이러한 샘플 중 임의의 고농도의 그리드를 효율적으로 데이터 수집을 위해 준비 할 수 있습니다.

Introduction

필 블롯 기술은 적층된 막 단백질의 2차원 결정을 단층으로 분리하여 Cryo-EM 2D 및 3D 데이터 수집에 적합한 얇은 샘플을 얻고이미지 처리를 용이하게 하기 위해 개발되었습니다1. 이 프로토콜은 다른 유형의 다층 샘플뿐만 아니라 Z 단위의 두께를 늘리지 않고 그리드에서 두 샘플 유형의 높은 샘플 농도를 달성하는 데에도 적합합니다.

샘플 층을 하나의 층으로 감소시키는 것은 역주입 방법(2) 상에서 실질적으로 연장되고 변형되는 프로토콜에서 모세관 압력과 전단력의 조합을 적용함으로써 달성된다. 첫 번째 블로팅 단계는 백 주입 방법에서 20-25μm 여과지 기공 크기가 아닌 서브 마이크론에서 블로팅하는 동안 다층 샘플의 양쪽에 탄소 필름과 그리드 바를 단단히 샌드위치하고 부착시킵니다. 개별 층의 분리 또는 박리는 그리드가 트레할로스 드롭에 수직으로 눌려지면 샌드위치 된 층을 강제로 분리 할 때 발생하여 탄소 필름이 그리드 막대에서 멀어집니다 (그림 1). 그리드 바와의 원래 접촉점에서 멀리 떨어진 탄소 필름의 위치 변경은 그리드가 서브 마이크론 여과지에서 다시 한번 블롯 될 때 다음 단계에서 발생합니다. 이러한 단계의 반복 횟수는 특정 샘플에 대해 최적화할 수 있습니다. 또한 이 프로토콜을 사용하여 Z의 응집을 피하면서 샘플 농도를 높일 수 있습니다. 그리드 바 및 탄소 필름에 대한 부착과 강제 분리에 의존하기 때문에 이 접근법은 특정 섬세하거나 불안정한 단백질 및 단백질 복합체와 같은 매우 깨지기 쉬운 분자에는 적합하지 않을 수 있습니다.

필 블롯 기술은 특수 장비나 값비싼 소모품이 필요하지 않습니다. 그러나 특정 샘플에 대한 적용 가능성은 생물학적 매개 변수에 대한 신중한 고려가 필요합니다. 평탄도를 보장하기 위해 탄소 필름이 필요하기 때문에 2D 결정의 경우 결정이 더 쉽지만 필 블롯 기술을 통한 조작은 샘플의 생물학적 무결성 또는 결정 순서에 영향을 미칠 수 있습니다. 단일 입자에 대한 필 블롯 기술의 적합성은 탄소 필름이 필요하고 조작에 안정적인 것으로 제한되며 테스트 될 수 있습니다. 층 사이에 중요한 생물학적 상호 작용이있는 표본은 이러한 상호 작용의 중단으로 인해 필 블롯 기술의 도움으로 특성화에 적합하지 않을 수 있습니다.

필 블롯 기술(“필 블롯”)은 실온에서 TEM에 의한 음성 염색 또는 염색되지 않은 샘플로 테스트 및 스크리닝함으로써 가장 빠르게 최적화됩니다. 최적의 필 블롯 반복 횟수가 확인되면 유리화 전에 두께를 제어하는 시간을 결정할 수 있습니다.

Protocol

1. 필 블롯 기술의 준비 단계 알림: 준비하려면 다음 항목을 서로 인접하게 배치해야 합니다. 20-25 μm 기공 크기 여과지 두 장을 쌓습니다( 재료 표 참조). ~8cm x 10cm 길이의 파라핀 필름을 여과지 옆에 놓고 용지가 위를 향하도록 합니다. 두 개의 추가 #4 여과지 위에 서브미크론 여과지를 놓습니다(그림 …

Representative Results

성공적인 필 블롯 실험은 종종 고농도의 단일 샘플 층을 생성합니다. 대부분의 그리드 사각형의 일부 영역에는 여전히 여러 레이어가 포함될 것으로 예상되며, 특히 필 블롯 단계의 반복 횟수가 적습니다. 그러나 대부분의 그리드 사각형에는 인간 류코트리엔 C4 합성 효소 (그림 2) 및 리포좀 (3.2 단계, 그림 3에 추가됨)의 2D 결정에서 관찰 된 바?…

Discussion

필 블롯은 Cryo-EM 데이터 수집 및 이미지 처리를 위해 다층 2D 결정 및 유사한 샘플의 적층 및 두께를 극복하는 강력한 방법입니다. 필 블롯 사용에 대한 결정은 샘플의 생물학적 파라미터를 기반으로 하며 3D Cryo-EM 모델을 사용할 수 있게 되면 평가도 필요합니다. 접촉의 생물학적 중요성과 접촉 영역의 잠재적 유연성은이 평가에서 특히 중요합니다.

필 블롯의 수는 처음에는 표…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작업의 일부는 NIH 보조금 HL090630(ISK)의 지원을 받았습니다.

Materials

600-mesh grids SPI 2060-C-XA
Anti-capillary forceps Ted Pella 510-5
Carbon to coat mica
Cryo-EM Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV.  High-resolution data is collected at 300 kV.
Dumpont #5 forceps Ted Pella 5622
Grid box for cryo-EM storage Ted Pella 160-40
Kim Wipes
Liquid nitrogen
Mica Ted Pella 56 The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid.  The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots.
Negative stain 1-2% uranyl acetate is suitable for many samples.  Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted.
Parafilm
Polystyrene container Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil.
Submicron filter paper MilliporeSigma DAWP04700
Transmission electron microscope JEOL JEM-1400 Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids.
Trehalose Prepare 4% trehalose solution.
Whatman #4 filter paper MilliporeSigma WHA1004150 This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol.

References

  1. Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).
  2. Kühlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 Å resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207 (4), 823-828 (1989).
  3. Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 1-8 (2018).
  4. Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27 (3), 545-548 (2019).
  5. Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438 (7068), 633-638(2005).
  6. Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).
  7. Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).
  8. Gipson B., Zeng X., Zhang Z. Y., Stahlberg, H. 2dx-user-friendly image processing for 2D crystals. Journal of Structural Biology. 157 (1), 64-72 (2007).
  9. Biyani, N. et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
  10. Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).

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Cite This Article
Johnson, M. C., Grant, A. J., Schmidt-Krey, I. The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples. J. Vis. Exp. (184), e64099, doi:10.3791/64099 (2022).

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