Summary
剥离-印迹技术是一种冷冻电镜网格制备方法，可将多层和浓缩的生物样品分离成单层，以减小厚度、提高样品浓度并促进图像处理。
Abstract
剥离印迹冷冻电镜网格制备技术是一种经过显著修改的背进样方法，目的是减少多层样品的层数。在冷冻之前去除层有助于将样品厚度降低到适合冷冻电镜数据收集的水平，提高样品平坦度并促进图像处理。剥离-印迹技术允许将多层膜分离成单层，将分层的2D晶体分离成单个晶体，并将可溶性蛋白质的堆叠片状结构分离成单层。这些类型样品的高样品厚度经常给冷冻电镜数据收集和冷冻电镜图像处理带来无法克服的问题，特别是当显微镜载物台必须倾斜以进行数据收集时。此外，可以制备高浓度的这些样品的网格以进行有效的数据收集，因为可以增加网格制备之前的样品浓度，并且可以调整剥离印迹技术以产生单层样品的密集分布。
Introduction
开发剥离印迹技术是为了将堆叠的膜蛋白二维晶体分离成单层，以获得用于冷冻电镜 2D 和 3D 数据收集的适当薄样品，并促进图像处理1.该方案同样适用于其他类型的多层样品，以及在不增加Z厚度的情况下在网格上实现任一样品类型的高样品浓度。
通过在协议中施加毛细管压力和剪切力的组合，将样品层减少到一层，该方案大大扩展并修改了背注方法2。第一个印迹步骤导致紧密夹层，并在亚微米（而不是背面进样方法中的20-25μm滤纸孔径）上粘附在多层样品两侧的碳膜和网格条上。一旦将网格垂直压在海藻糖液滴上，迫使碳膜远离网格条，就会发生单个层的分离或剥离，从而迫使夹层分离（图 1）。在下一步中，当网格再次印迹在亚微米滤纸上时，碳膜将远离与网格条的原始接触点重新定位。这些步骤的迭代次数可以针对特定样本进行优化。此外，该方案可用于增加样品浓度，同时避免聚集在Z中。 由于依赖于对网格条和碳膜的粘附以及强制分离，这种方法可能不适用于高度脆弱的分子，例如某些脆弱和/或不稳定的蛋白质和蛋白质复合物。
剥离印迹技术既不需要专门的设备，也不需要昂贵的耗材。然而，对特定样品的适用性需要仔细考虑生物参数。对于2D晶体来说，这个决定更容易，因为需要碳膜来确保平整度，但通过剥离印迹技术 进行操作 可能会影响样品或晶体顺序的生物完整性。剥离印迹技术对单个颗粒的适用性仅限于需要碳膜且对操作稳定的颗粒，并且可以对其进行测试。层间具有关键生物相互作用的标本可能不适合借助剥离-印迹技术进行表征，因为这种相互作用会中断。
剥离-印迹技术（“剥离-印迹”）通过在室温下通过 TEM 对阴性染色或未染色样品进行测试和筛选来最快速地优化。一旦确定了最佳的剥离-印迹迭代次数，就可以确定玻璃化前控制厚度的时间。
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Protocol
1. 剥离印迹技术的制备步骤
注意：准备工作需要将以下物品彼此相邻放置。
- 堆叠两张20-25μm孔径的滤纸（见 材料表）。
- 将~8 cm x 10 cm长的石蜡薄膜放在滤纸旁边，纸张朝上。
- 将一张亚微米滤纸放在另外两张#4滤纸的顶部（图1-1）。
- 将反毛细管镊子放在弯曲的腿朝上，直腿朝下。然后，选择一个 600 目网格，光滑/有光泽的一面朝上。将镊子放在培养皿或其他凸起的表面上，以避免干净的网格与其他物品接触。
- 从石蜡膜上取下纸张，拉动侧面（~5 毫米）以形成一个小边缘。从石蜡膜的一个短边移取两滴 150 μL 的 4% 海藻糖溶液 ~1-2 cm，在石蜡膜上相距 ~1 cm。
- 在单独的工作台上或地板上，将液氮倒入小型聚苯乙烯泡沫容器中（见 材料表）。
注意：接受使用手套和面罩正确操作的培训，以避免冻伤。 - 将一个小的冷冻电镜网格容器放入液氮中，并用无绒湿巾覆盖聚苯乙烯泡沫容器。
2. 将碳膜放置在网格上
- 使用Dumont #5镊子（见 材料表）将碳膜从云母中漂浮，方法是在其中一滴海藻糖溶液上以轻微的角度向下（~20°-40°）接触云母的一侧，并通过向下移动云母来缓慢地让水张力从碳膜上抬起。一旦碳膜漂浮在液滴表面，就释放云母。
- 目视检查碳膜，以避免使用以裂缝形式损坏的碳。
- 将反毛细管镊子以一定角度（~20°-30°）固定的网格插入与碳膜相邻的位置的海藻糖滴中，然后在碳膜下居中。拿起碳膜（图1-2）。
- 保持网格处于相同的方向，并缓慢地将其降低到第二滴海藻糖的表面上，而不会破坏滴的表面张力，以去除可能缠绕在网格边缘到粗糙面的不必要的碳膜。
3. 将多层二维晶体分离成单层
- 旋转反毛细管镊子（见 材料表）并将它们放在培养皿上，网格的碳面朝下（图1-3）。
- 将 1.3 μL 样品移液到网格顶部的轻微海藻糖弯月面中。将溶液移液~8-10次，以混合并将海藻糖和样品分布在网格的两侧。
- 在孵育溶液 1 分钟时，将一滴或多滴 1.7 μL 海藻糖溶液移液到石蜡膜上。
- 将网格旋转回其原始位置，碳膜朝上。
- 使用反毛细管镊子将网格压在亚微米滤纸上（图1-4）。一旦溶液被滤纸吸收并且碳膜平放，等待 3 秒，然后提起网格并将其垂直移动到 1.7 μL 海藻糖溶液滴上（图 1-5）。
注意：对高度堆叠的样品多次重复此步骤，或者在后续步骤中准备网格进行玻璃化。 - 在两张滤纸上吸干网格，然后从滤纸上提起网格（图1-6）。大约 13 秒后，根据湿度和样品缓冲液，将网格放入小型聚苯乙烯泡沫塑料容器中的液氮中，然后将网格放入冷冻电镜网格容器中或直接转移以进行冷冻电镜筛选或数据收集。
注意：为了快速优化方案，请在此步骤中对剥离印迹网格进行负染色，而不是将其投入液氮中。通过将 3 μL 1% 乙酸铀酰施加到网格上对样品进行负染色，将网格孵育 30 秒，并用撕裂的 20-25 μm 孔径滤纸吸干。在海藻糖、单宁或葡萄糖中玻璃化的 2D 晶体网格通常用手浸入玻璃化，因为海藻糖、单宁和葡萄糖可防止以用于手动浸入的速率形成结晶冰2。
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Representative Results
成功的剥离印迹实验将产生通常高浓度的单层样品。预计大多数网格方块中的某些区域仍将包含多个层，尤其是在剥离印迹步骤迭代次数较少的情况下。然而，大多数网格正方形将包含广泛的单层区域，如人白三烯C4合酶（图2）和脂质体（在步骤3.2， 图3中添加）的2D晶体所观察到的那样。可能需要对未显示所需层数减少的样品测试额外的剥离印迹步骤。
剥离印迹实验成功的最重要标志是在高分辨率冷冻电镜数据收集和图像处理后观察到的数据质量和生物完整性。数据解释需要仔细考虑层间接触区域的潜在损坏或失真。
发生剥离印迹的EM网格区域通常比未发生剥离印迹的区域显示更高的样品浓度。这种明显的集中效应是由于多层样品粘附在碳膜和网格棒表面上，然后在剥离印迹制备过程中对两个表面的额外粘附，因为它们反复分离、稍微重新定位并再次接触。结果是原始多层样品的不同层分布在更大的横向区域（图3和图4）。这些区域甚至可以包含更大的2D晶体或膜。在“剥离区”与不受剥离印迹步骤影响的区域相邻的区域，这两种现象都很容易观察到和比较（图3）。图2-4中的图像是在低剂量条件下用透射电子显微镜在120kV的加速电压下收集的（见材料表）。
图 1：剥离印迹技术的示意图。 剥离印迹技术的前两个步骤（1-2和1-3）和最后一步（1-6）基于回样方法2，中间步骤遵循剥离印迹方案（修改自Johnson等人1）。在步骤1中，（A）将两张孔径为20-25μm的滤纸堆叠，（B）与带有两滴海藻糖溶液的石蜡膜相邻，（C）在另外两张滤纸上堆叠一张亚微米滤纸。在步骤2中，（A）碳膜漂浮在第一个海藻糖液滴上，（B）用反毛细管镊子拾取，之后将其接触到第二个液滴（未显示）的表面而不破坏表面张力以去除外围多余的碳膜。在步骤3中，（A）将固定网格的镊子旋转180°（网格的碳膜侧现在朝下），并且（B）将样品移液到海藻糖的弯月面中。在步骤4中，网格旋转回原始方向，碳膜朝上，样品缓慢降低到亚微米滤纸上。将网格抬起，并在步骤5中垂直降低到1.7μL海藻糖溶液液滴上。步骤 4 和 5 称为“剥离印迹”，可以根据堆叠量迭代三次或更多次。可能需要针对不同的样本优化迭代次数。在步骤6中，将样品印迹在两层孔径为20-25μm的滤纸上，然后（B）将其手动投入液氮中。请点击此处查看此图的大图。
图 2：采用剥离-印迹法的 2 D 晶体样品。箭头左侧的区域在碳膜和网格条之间的接触区域中在很大程度上减少为单层2D晶体，该区域被剥离印迹然后移动，而箭头右侧的区域不在受剥离印迹影响的区域。剥离印迹区域可以很容易地选择并在大多数网格上观察到。所示的 2D 晶体是人白三烯 C4 合酶的堆叠和单层 2D 晶体。比例尺对应于 10 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图3：进行剥离印迹的脂质体。 剥离印迹可以成功地用于中断塌陷的脂质体和囊泡的边缘，以产生具有大的，主要是单层磷脂双层的区域，如图像的下半部分所观察到的那样。上半部分不在网格棒和碳膜之间的接触区，因此包含具有两个磷脂双层的完整脂质体。比例尺对应于 1 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图4：剥离印迹足迹。 400目网格的网格方块显示了网格条的足迹（标记为“B”）和产生的剥离印迹区域以及未与网格条接触或经受较少剥离印迹迭代的区域（标记为“C”）。比例尺对应于 10 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：使用太薄的碳膜在亚微米滤纸上反向注射制备的 EM 网格。图像是在（A）与膜的初始接触，（B）接触后1000毫秒和（C）接触后2000毫秒拍摄的视频（见视频1）中的单帧。箭头表示毛细管压力使碳膜破裂的网格正方形。请点击此处查看此图的大图。
视频1：将网格放置在亚微米滤纸上以进行剥离印迹步骤。 碳膜沿左下角到右上角的方向缓慢而紧密地吸到网格上，将样品紧密夹在网格条和碳膜之间。碳膜和单个样品层在每个后续剥离印迹步骤中被置换，允许通过额外的迭代来优化更高层次的样品。 请点击此处下载此视频。
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Discussion
剥离印迹是一种强大的方法，可以克服多层二维晶体和类似样品的堆叠和厚度，以进行冷冻电镜数据收集和图像处理。关于使用剥离印迹的决定将基于样品的生物学参数，一旦3D冷冻电镜模型可用，也需要进行评估。接触的生物学重要性和接触区域的潜在灵活性在这项评估中尤为重要。
剥离印迹的数量最初将在标准阴性染色网格制备后通过观察 确定 ，其中过多的层或厚度将需要标准冷冻电镜网格制备的替代策略。堆叠在寄存器中的薄多层晶体可以直接用于microED3，或者在较厚的晶体4的情况下进行FIB研磨。双层 2D 晶体通常不需要剥离印迹，因为当层位于寄存器5 中时，可以单独或一起处理层。不过，将膜蛋白2D晶体的两侧暴露于配体或抑制剂可能是有益的，一次是在剥离印迹之前进入溶液，一次是在最后的剥离印迹步骤之后。此外，减少大的、有序的双层2D晶体可以允许电子衍射6，7。膜和可溶性蛋白质的2D晶体的多层（诱导或生物发生）将是剥离印迹的最可能靶标，即使该方案可以应用于一系列标本并用于浓缩各种样品以进行冷冻电镜（图4）。
阴性染色的初始测试将大大减少优化样品的时间和成本，因为不需要冷冻、制备冷冻电镜样品架、转移到冷冻电镜和使用冷冻电镜。只有冷冻步骤前的干燥时间需要单独优化。干燥时间将与用于干燥同一样品的标准回样网格1的时间相同或非常相似。
虽然 600 目网格通常可以很好地保存碳膜，但增加的剥离-印迹迭代次数和更薄的碳膜层可能会导致碳膜破裂增加（图 5）。可以成功分离堆叠的2D晶体，脂质体和大阵列可溶性蛋白质的分层样品（图2-4）。
通过冷冻电镜对样品进行仔细评估，以确保避免对样品质量产生不利影响。这可以通过图像处理来比较堆叠和未堆叠晶体的图像来实现。为了评估目的和实现3D模型的目标，图像处理都是 通过 Focus8，9中提供的2dx程序进行的，该程序还实现了单颗粒方法来解决晶格缺陷和蛋白质异质性，并有可能显着提高原始2D晶体的固有质量10。
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Disclosures
作者没有相互竞争的经济利益或其他利益冲突。
Acknowledgments
这项工作的一部分得到了NIH资助HL090630（ISK）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 600-mesh grids | SPI | 2060-C-XA | |
| Anti-capillary forceps | Ted Pella | 510-5 | |
| Carbon to coat mica | |||
| Cryo-EM | Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV. High-resolution data is collected at 300 kV. | ||
| Dumpont #5 forceps | Ted Pella | 5622 | |
| Grid box for cryo-EM storage | Ted Pella | 160-40 | |
| Kim Wipes | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mica | Ted Pella | 56 | The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid. The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots. |
| Negative stain | 1-2% uranyl acetate is suitable for many samples. Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted. | ||
| Parafilm | |||
| Polystyrene container | Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil. | ||
| Submicron filter paper | MilliporeSigma | DAWP04700 | |
| Transmission electron microscope | JEOL | JEM-1400 | Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids. |
| Trehalose | Prepare 4% trehalose solution. | ||
| Whatman #4 filter paper | MilliporeSigma | WHA1004150 | This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol. |
References
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