पील-ब्लोट तकनीक: बहु-स्तरित या केंद्रित जैविक नमूनों से एकल परतों को अलग करने के लिए एक क्रायो-ईएम नमूना तैयारी विधि
Summary
पील-ब्लॉट तकनीक एक क्रायो-ईएम ग्रिड तैयारी विधि है जो मोटाई को कम करने, नमूना एकाग्रता बढ़ाने और छवि प्रसंस्करण की सुविधा के लिए एकल परतों में बहुस्तरीय और केंद्रित जैविक नमूनों को अलग करने की अनुमति देती है।
Abstract
पील-ब्लॉट क्रायो-ईएम ग्रिड तैयार करने की तकनीक बहु-स्तरीय नमूनों की परतों में कमी प्राप्त करने के उद्देश्य से एक महत्वपूर्ण रूप से संशोधित बैक-इंजेक्शन विधि है। ठंड से पहले परतों को हटाने से नमूना मोटाई को क्रायो-ईएम डेटा संग्रह के लिए उपयुक्त स्तर तक कम करने, नमूना फ्लैटनेस में सुधार करने और छवि प्रसंस्करण की सुविधा में सहायता मिल सकती है। पील-ब्लॉट तकनीक मल्टीलैमेलर झिल्ली को एकल परतों में, स्तरित 2 डी क्रिस्टल को अलग-अलग क्रिस्टल में विभाजित करने की अनुमति देती है, और घुलनशील प्रोटीन की स्टैक्ड, शीट जैसी संरचनाओं को एकल परतों में भी अलग किया जा सकता है। इस प्रकार के नमूनों की उच्च नमूना मोटाई अक्सर क्रायो-ईएम डेटा संग्रह और क्रायो-ईएम छवि प्रसंस्करण के लिए दुर्गम समस्याएं पैदा करती है, खासकर जब माइक्रोस्कोप चरण को डेटा संग्रह के लिए झुका होना चाहिए। इसके अलावा, इनमें से किसी भी नमूने की उच्च सांद्रता के ग्रिड को कुशल डेटा संग्रह के लिए तैयार किया जा सकता है क्योंकि ग्रिड तैयारी से पहले नमूना एकाग्रता बढ़ाई जा सकती है और पील-ब्लॉट तकनीक को एकल-स्तरित नमूने के घने वितरण के परिणामस्वरूप समायोजित किया जा सकता है।
Introduction
पील-ब्लॉट तकनीक को क्रायो-ईएम 2 डी और 3 डी डेटा संग्रह के लिए उपयुक्त रूप से पतले नमूने प्राप्त करने और छवि प्रसंस्करण 1 की सुविधा के लिए झिल्ली प्रोटीन के स्टैक्ड दो-आयामी क्रिस्टल को एकल परतों में अलग करने के लिए विकसितकिया गया था। प्रोटोकॉल अन्य प्रकार के मल्टीलैमेलर नमूनों के साथ-साथ जेड में मोटाई बढ़ाए बिना ग्रिड पर नमूना प्रकार की उच्च नमूना सांद्रता प्राप्त करने के लिए समान रूप से उपयुक्त है।
नमूना परतों को एक परत तक कम करना एक प्रोटोकॉल में केशिका दबाव और कतरन बलों के संयोजन को लागू करके प्राप्त किया जाता है जो बैक-इंजेक्शन विधि2 पर काफी हद तक फैला हुआ है और संशोधित करता है। पहले ब्लोटिंग चरण के परिणामस्वरूप बैक-इंजेक्शन विधि में 20-25 μm फिल्टर पेपर पोर आकार के बजाय सबमाइक्रोन पर ब्लोटिंग के दौरान कार्बन फिल्म और बहु-स्तरीय नमूने के दोनों ओर एक ग्रिड बार होता है। एक अलग परत का पृथक्करण, या छीलना, सैंडविच परतों के पृथक्करण को मजबूर करने पर होता है जब ग्रिड को ट्रेहलोस ड्रॉप पर लंबवत रूप से दबाया जाता है, जिससे कार्बन फिल्म को ग्रिड बार से दूर कर दिया जाता है (चित्रा 1)। ग्रिड बार के साथ मूल संपर्क बिंदु से दूर कार्बन फिल्म की पुनर्स्थापना अगले चरण में होती है, जब ग्रिड को एक बार फिर सबमाइक्रोन फिल्टर पेपर पर धब्बा लगाया जाता है। इन चरणों के पुनरावृत्तियों की संख्या को विशिष्ट नमूनों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल का उपयोग जेड में एकत्रीकरण से बचने के दौरान नमूना सांद्रता को बढ़ाने के लिए किया जा सकता है। ग्रिड बार और कार्बन फिल्म के पालन के साथ-साथ बलपूर्वक पृथक्करण पर निर्भरता के कारण, यह दृष्टिकोण अत्यधिक नाजुक अणुओं जैसे कि कुछ नाजुक और / या अस्थिर प्रोटीन और प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है।
पील-ब्लॉट तकनीक को न तो विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है और न ही महंगी आपूर्ति की। हालांकि, विशिष्ट नमूनों के लिए प्रयोज्यता को जैविक मापदंडों के सावधानीपूर्वक विचार की आवश्यकता होगी। 2 डी क्रिस्टल के लिए निर्णय आसान है क्योंकि फ्लैटनेस सुनिश्चित करने के लिए कार्बन फिल्म की आवश्यकता होती है, फिर भी पील-ब्लॉट तकनीक के माध्यम से हेरफेर नमूने या क्रिस्टलीय क्रम की जैविक अखंडता को प्रभावित कर सकता है। एकल कणों के लिए पील-ब्लॉट तकनीक की उपयुक्तता उन लोगों तक सीमित है और परीक्षण किया जा सकता है जिन्हें कार्बन फिल्म की आवश्यकता होती है और हेरफेर के लिए स्थिर होते हैं। परतों के बीच महत्वपूर्ण जैविक बातचीत वाले नमूने इस तरह के इंटरैक्शन के व्यवधान के कारण पील-ब्लॉट तकनीक की मदद से लक्षण वर्णन के लिए उपयुक्त नहीं हो सकते हैं।
पील-ब्लॉट तकनीक (“पील-ब्लोट”) को कमरे के तापमान पर टीईएम द्वारा नकारात्मक दाग या बिना दाग वाले नमूनों के साथ परीक्षण और स्क्रीनिंग द्वारा सबसे जल्दी अनुकूलित किया जाता है। एक बार जब पील-ब्लॉट पुनरावृत्तियों की इष्टतम संख्या की पहचान हो जाती है, तो विट्रीफिकेशन से पहले मोटाई को नियंत्रित करने का समय निर्धारित किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
पील-ब्लॉट क्रायो-ईएम डेटा संग्रह और छवि प्रसंस्करण के लिए बहु-स्तरित 2 डी क्रिस्टल और इसी तरह के नमूनों के स्टैकिंग और मोटाई को दूर करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है। पील-ब्लॉट के उपयोग पर निर्णय नमूने क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम का एक हिस्सा एनआईएच अनुदान एचएल090630 (आईएसके) द्वारा समर्थित था।
Materials
| 600-mesh grids | SPI | 2060-C-XA | |
| Anti-capillary forceps | Ted Pella | 510-5 | |
| Carbon to coat mica | |||
| Cryo-EM | Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV. High-resolution data is collected at 300 kV. | ||
| Dumpont #5 forceps | Ted Pella | 5622 | |
| Grid box for cryo-EM storage | Ted Pella | 160-40 | |
| Kim Wipes | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mica | Ted Pella | 56 | The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid. The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots. |
| Negative stain | 1-2% uranyl acetate is suitable for many samples. Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted. | ||
| Parafilm | |||
| Polystyrene container | Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil. | ||
| Submicron filter paper | MilliporeSigma | DAWP04700 | |
| Transmission electron microscope | JEOL | JEM-1400 | Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids. |
| Trehalose | Prepare 4% trehalose solution. | ||
| Whatman #4 filter paper | MilliporeSigma | WHA1004150 | This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol. |
References
- Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).
- Kühlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 Å resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207 (4), 823-828 (1989).
- Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 1-8 (2018).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27 (3), 545-548 (2019).
- Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438 (7068), 633-638(2005).
- Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).
- Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).
- Gipson B., Zeng X., Zhang Z. Y., Stahlberg, H. 2dx-user-friendly image processing for 2D crystals. Journal of Structural Biology. 157 (1), 64-72 (2007).
- Biyani, N. et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
- Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).
