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Genetics

लेंटिवायरस-मध्यस्थता सीआरआईएसपीआर / कैस 9 जीन संपादन का उपयोग करके नॉक-आउट मांसपेशी सेल लाइनों का विकास

Published: June 16, 2022 doi: 10.3791/64114
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1, 1
1University Grenoble Alpes, INSERM, U1216, CHU Grenoble Alpes, Grenoble Institut Neurosciences, 2Genome Center, University of California, Davis

Summary

प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 का उपयोग करके नॉक-आउट मायोब्लास्ट कैसे उत्पन्न करें, गाइड-आरएनए के डिजाइन से सेलुलर क्लोनिंग और नॉक-आउट क्लोन के लक्षण वर्णन तक शुरू करें।

Abstract

कैस 9 का एक महत्वपूर्ण अनुप्रयोग नॉक-आउट सेल लाइनों का विकास है, विशेष रूप से आनुवंशिक निदान के दौरान पहचाने जाने वाले रोग से जुड़े नए जीन / प्रोटीन के कार्य का अध्ययन करने के लिए। ऐसी सेल लाइनों के विकास के लिए, दो प्रमुख मुद्दों को उलझाना होगा: चुने हुए कोशिकाओं में उच्च दक्षता के साथ सीआरआईएसपीआर टूल (कैस 9 और गाइड आरएनए) का सम्मिलन, और चुने हुए जीन के विशिष्ट विलोपन के लिए कैस 9 गतिविधि का प्रतिबंध। यहां वर्णित प्रोटोकॉल मांसपेशियों की कोशिकाओं जैसे कोशिकाओं को ट्रांसफेक्ट करने के लिए मुश्किल में सीआरआईएसपीआर उपकरण के सम्मिलन के लिए समर्पित है। यह प्रोटोकॉल लेंटिवायरस के उपयोग पर आधारित है, जो सार्वजनिक रूप से उपलब्ध प्लास्मिड के साथ उत्पादित होता है, जिसके लिए सभी क्लोनिंग चरणों को ब्याज के जीन को लक्षित करने के लिए वर्णित किया जाता है। कैस 9 गतिविधि का नियंत्रण कैमिकस 9 नामक पहले वर्णित प्रणाली के अनुकूलन का उपयोग करके किया गया है, जिसमें कैस 9 को लक्षित करने वाले गाइड आरएनए को एन्कोडिंग करने वाले लेंटीवायरस के साथ कोशिकाओं का पारगमन कैस 9 अभिव्यक्ति के प्रगतिशील उन्मूलन की अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल को आरवाईआर 1-नॉक आउट मानव मांसपेशी सेल लाइन के विकास के लिए लागू किया गया है, जिसे प्रोटीन और कार्यात्मक स्तर पर आगे की विशेषता दी गई है, मांसपेशियों के इंट्रासेल्युलर कैल्शियम रिलीज और उत्तेजना-संकुचन युग्मन में शामिल इस महत्वपूर्ण कैल्शियम चैनल के नॉकआउट की पुष्टि करने के लिए। यहां वर्णित प्रक्रिया को आसानी से मांसपेशियों की कोशिकाओं में अन्य जीनों पर या कोशिकाओं को ट्रांसफेक्ट करने के लिए अन्य कठिन में लागू किया जा सकता है और मानव कोशिकाओं में इन जीनों का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान उपकरण ों का उत्पादन किया जा सकता है।

Introduction

जीन अनुक्रमण की प्रगति और एक विशिष्ट ऊतक में अज्ञात कार्यों के जीन में उत्परिवर्तन की पहचान के साथ, एक नए लक्ष्य जीन के कार्य को समझने और संबंधित पैथोफिजियोलॉजिकल तंत्र में इसकी भागीदारी की पुष्टि करने के लिए प्रासंगिक सेलुलर मॉडल का विकास एक आवश्यक उपकरण का गठन करता है। इसके अलावा, ये मॉडल भविष्य के चिकित्सीय विकास 1,2 के लिए प्रमुख महत्व के हैं, और प्रयोग में जानवरों के उपयोग में कमी के लिए अंतरराष्ट्रीय सिफारिशों के साथ सीधी रेखा में नॉक-आउट पशु मॉडल के विकास के लिए एक दिलचस्प विकल्प का गठन करते हैं। सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 का उपयोग करके जीन संपादन वर्तमान में उपलब्ध सबसे शक्तिशाली उपकरणों में से एक है, जिसने कई नॉक-आउट / नॉक-इन मॉडल के विकास की अनुमति दी है, और सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 का उपयोग करके लक्षित जीन सत्यापन सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 3 के सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वालेअनुप्रयोगों में से एक है। जीन संपादन की सफलता लक्ष्य सेल मॉडल में सीआरआईएसपीआर टूल (गाइड आरएनए और न्यूक्लियस कैस 9) को पेश करने की क्षमता पर निर्भर करती है, जो मांसपेशियों की कोशिकाओं जैसे कई कठिन-से-ट्रांसफेक्ट कोशिकाओं में एक चुनौती हो सकती है4. इस चुनौती को वायरस के उपयोग से दूर किया जा सकता है, आमतौर पर लेंटिवायरस, जिसमें कुशलतापूर्वक कई सेल प्रकारों को ट्रांसड्यूस करने और इसके ट्रांसजीन को वितरित करने का बहुत फायदा होता है। लेकिन इसकी प्रमुख कमी मेजबान सेल जीनोम में ट्रांसजीन का एकीकरण है, जिससे एकीकरण स्थल पर स्थानीयकृत जीन के संभावित परिवर्तन और ट्रांसजीन की स्थायी अभिव्यक्ति होती है, जिसके परिणामस्वरूप न्यूक्लियस कैस 9 के मामले में हानिकारक परिणाम होंगे5. मेरिएन और सहकर्मियों6 द्वारा एक स्मार्ट समाधान प्रस्तावित किया गया है, जिसमें कैस 9 जीन को लक्षित करने वाले गाइड-आरएनए की कोशिकाओं में परिचय शामिल है, जिससे कैस 9 निष्क्रियता होती है। इस रणनीति का एक अनुकूलन यहां एक उपयोगकर्ता के अनुकूल और बहुमुखी प्रोटोकॉल के रूप में प्रस्तुत किया गया है जो मुश्किल-से-ट्रांसफेक्ट कोशिकाओं में लगभग किसी भी जीन को नॉक-आउट करने की अनुमति देता है।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल का लक्ष्य अमर मांसपेशियों की कोशिकाओं में रुचि के जीन की निष्क्रियता को प्रेरित करना है। इसका उपयोग विभिन्न प्रकार की अमर कोशिकाओं में ब्याज के किसी भी जीन को खटखटाने के लिए किया जा सकता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल में गाइड आरएनए और उनके क्लोनिंग को लेंटिवायरल प्लास्मिड में डिजाइन करने, लेंटिवायरल वैक्टर में सीआरआईएसपीआर टूल का उत्पादन करने, विभिन्न लेंटीवायरस के साथ कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करने और एक समरूप संपादित सेल लाइन का उत्पादन करने के लिए कोशिकाओं को क्लोन करने के लिए कदम शामिल हैं।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, अमर मानव कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं को टाइप 1 रयानोडीन रिसेप्टर (आरवाईआर 1) के विलोपन के साथ विकसित किया गया है, इंट्रासेल्युलर कैल्शियम रिलीज और मांसपेशियों के संकुचन में शामिल एक आवश्यक कैल्शियम चैनल7. जीन के नॉक-आउट (केओ) की पुष्टि पश्चिमी धब्बा का उपयोग करके प्रोटीन स्तर पर और कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग करके कार्यात्मक स्तर पर की गई है।

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Protocol

यूरोपीय सिफारिशों और फ्रांसीसी कानून के अनुसार बैंक ऑफ टिशूज फॉर रिसर्च (मायोबैंक, यूरोपीय संघ के नेटवर्क यूरोबायोबैंक, पेरिस, फ्रांस में एक भागीदार) से मांसपेशियों की बायोप्सी प्राप्त की गई थी। सभी व्यक्तियों से लिखित सूचित सहमति प्राप्त की गई थी। मौली (मायोलॉजी इंस्टीट्यूट, पेरिस, फ्रांस) द्वारा निर्मित किए गए थे, और प्रोटोकॉल को मायोलॉजी इंस्टीट्यूट नैतिक समिति (एमईएसआरआई, एन एसी -2019-3502) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. सीआरआईएसपीआर गाइड डिजाइन

  1. हटाए जाने वाले जीन के क्षेत्र की पहचान करें। ensembl.org या genome.ucsc.edu जैसे जीनोम ब्राउज़र टूल का उपयोग करके इसके जीनोमिक अनुक्रम की खोज करें और हटाए जाने वाले क्षेत्र के दोनों किनारों पर गाइड आरएनए (जीआरएनए) की तलाश करने के लिए दो क्षेत्रों के क्रोमोसोमिक निर्देशांक निर्धारित करें।
    1. यहां उपयोग किए जाने वाले जीन के लिए, आरवाईआर 1 जीन के फास्टा अनुक्रम और एक्सॉन 101 के अनुक्रम को निम्नानुसार प्राप्त करें। एनसेम्बल में, मानव जीनोम के सबसे हालिया संस्करण में आरवाईआर 1 खोजें, पहली प्रविष्टि का चयन करें, और प्रोटीन कोडिंग अनुक्रम की प्रतिलिपि पर क्लिक करें। फिर, जीन के एक्सॉन की सूची में रीडायरेक्ट करने के लिए एक्सॉन पर क्लिक करें।
    2. डाउनलोड अनुक्रम पर क्लिक करें और पूरे जीन के पूर्ण सर्वसम्मति अनुक्रम को डाउनलोड करने के लिए केवल जीनोमिक अनुक्रम का चयन करें। जीन के एक्सॉन और इंट्रॉन की सूची को नीचे स्क्रॉल करें और लक्षित एक (ओं) का चयन करें।
    3. जीन में संबंधित न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम ज्ञात कीजिए। हटाए जाने वाले एक्सॉन के तुरंत अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम इंट्रॉन के न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमों का चयन करें, जिसका उपयोग जीआरएनए की खोज के लिए किया जाएगा।
  2. Crispor.tefor.net8 जैसे ऑनलाइन टूल का उपयोग करके चरण 1.1 (हटाए जाने वाले क्षेत्र को अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम) में पहचाने गए क्षेत्रों में यहां गाइड 1 और गाइड 2 नामक दो जीआरएनए डिज़ाइन करें। कुछ सौ बेस-जोड़े (बीपी) द्वारा अलग किए गए दो जीआरएनए चुनें, प्रत्येक जीआरएनए का अनुक्रम प्रोटोस्पेसर आसन्न आकृति (पीएएम) के बिना बिल्कुल 20 न्यूक्लियोटाइड लंबा है। ऑफ-टारगेट को सीमित करने के लिए उपलब्ध सर्वोत्तम मार्गदर्शिकाएँ चुनें. गाइड डिजाइन के उदाहरण के लिए चित्रा 1 देखें।
    1. दो गाइडों के बीच अनुक्रम को हटाए जाने की उम्मीद है, और इसके परिणामस्वरूप ब्याज के जीन का नॉक-आउट होता है, इस प्रकार दो गाइडों की स्थिति चुनें जैसे कि यह ब्याज के जीन में एक आवश्यक अनुक्रम या एक आवश्यक एक्सॉन को हटा देता है। सुनिश्चित करें कि हटाए गए अनुक्रम / एक्सॉन विशेष रूप से जीन के वैकल्पिक प्रतिलेख में मौजूद नहीं है और / या यह प्रोटीन के एक महत्वपूर्ण हिस्से को एन्कोड करता है, इस प्रकार इसके विलोपन के परिणामस्वरूप एक कार्यात्मक नॉक-आउट होगा।
      नोट: यद्यपि कैस 9 दरार साइट प्रोटोस्पेसर आसन्न आकृति (पीएएम) के 3 बीपी अपस्ट्रीम होने की भविष्यवाणी की जाती है, लेकिन बड़ी दूरी पर दरार भी हो सकती है, इस प्रकार एक अच्छा समाधान दरार साइट के सटीक स्थानीयकरण पर निर्भर नहीं है, जैसे कि इंट्रॉन में दरार।
  3. निम्नलिखित अनुक्रमों के लिए पीएएम के बिना प्रत्येक जीआरएनए के लिए रिवर्स पूरक (आरसी) अनुक्रम निर्धारित करें: गाइड 1 और गाइड 1-आरसी, गाइड 2, और गाइड 2-आरसी।
  4. प्लास्मिड की क्लोनिंग करने के लिए तालिका 1 में प्रस्तुत प्राइमरों को ऑर्डर करें। प्रोटोकॉल के दौरान, बाँझ एच 2 ओ में 10 एनएम की एकाग्रता परप्राइमरोंका उपयोग करें।
    नोट: इन प्राइमरों (बोल्ड और रेखांकित) में जीआरएनए में जोड़े गए अनुक्रम क्रमशः गाइड, प्रमोटर और ट्रांस-एक्टिवेटिंग-क्रिस्पर आरएनए (ट्रैकआरएनए) से पहले और बाद में प्लास्मिड के अनुक्रम के अनुरूप होते हैं और प्राइमरों और प्लास्मिड के बीच एक अच्छा ओवरलैप सुनिश्चित करने के लिए संशोधित नहीं किया जाना चाहिए।

2. प्लास्मिड क्लोनिंग

नोट: इस चरण में, जीआरएनए को लेंटीवायरस उत्पादन के लिए प्लास्मिड रीढ़ की हड्डी में डाला जाएगा। दो जीआरएनए को एन्कोडिंग करने वाला एक कैसेट पहले ओवरलैपिंग प्राइमरों का उपयोग करके लगातार पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) द्वारा उत्पादित किया जाता है। नए कैसेट को तब लेंटिवायरल बैकबोन प्लास्मिड # 87919 में डाला जाता है।

  1. निम्नलिखित प्लास्मिड प्राप्त करें: प्लास्मिड # 87919, एक लेंटिवायरल वेक्टर में सीआरआईएसपीआर गाइड आरएनए के लिए कोडिंग और लेंटिवायरल वेक्टर में एसपीसीएएस 9 अनुक्रम के लिए प्लास्मिड # 87904 कोडिंग।
  2. कैसेट निर्माण
    नोट: क्लोनिंग प्रोटोकॉल में संक्षेप में है चित्र 2.
    1. प्लास्मिड # 87919 के 2 μL, primer_XmaIF के 2 μL, primer_Guide1R के 2 μL, पोलीमरेज़ मिश्रण के25μL, और H 2 O के 19 μL के साथ एक पीसीआर (ए) प्रतिक्रिया चलाएं निम्नलिखित पीसीआर प्रोग्राम (प्रोग्राम 1): प्रारंभिक विकृतीकरण 98 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट, इसके बाद 98 डिग्री सेल्सियस पर 30 चक्र, 60 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस, 72 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट 45 एस, और 72 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट का अंतिम बढ़ाव। चरण 1.4 पर वर्णित प्राइमरों का टीएम 60 डिग्री सेल्सियस है।
      नोट: यद्यपि कार्यक्रम 1 में बढ़ाव का समय काफी लंबा दिखाई देता है, इस बढ़ाव समय को सही आकार की पर्याप्त सामग्री के उत्पादन को सुनिश्चित करने के लिए चुना गया है। दरअसल, प्लास्मिड में दोहराए गए अनुक्रमों के कारण (आरएनए गाइड के बाद ट्रैकआरएनए का अनुक्रम प्लास्मिड # 87919 में तीन बार दोहराया जाता है) अपेक्षित डीएनए का पीसीआर प्रवर्धन मुश्किल है, और लगातार पीसीआर में अतिरिक्त छोटे बैंड का उत्पादन किया जाता है। इस प्रकार, विभिन्न पीसीआर उत्पादों के बीच प्रतिस्पर्धा के कारण, या तो बढ़ाव का समय बढ़ाया गया है (सबसे लंबे समय तक एक के पक्ष में और अंत में पर्याप्त शुद्ध सामग्री रखने के लिए), या लंबे टुकड़े के लिए एक टच डाउन पीसीआर (प्रोग्राम 2) का उपयोग किया गया है (जैसे कि चरण 2.2.6 में पीसीआर (अंतिम) के लिए वर्णित)।
    2. ट्रिस-बोरेट-ईडीटीए बफर (टीबीई) में 1% एगरोज जेल पर पीसीआर उत्पादों को अलग करें, उत्पाद शुल्क और 300 बीपी टुकड़े को शुद्ध करें। निर्माता के निर्देश के बाद एक समर्पित किट का उपयोग करके शुद्धिकरण करें, 20 μL की अंतिम मात्रा में क्षालन के साथ या तो शुद्ध टुकड़े का सीधे उपयोग करें या चरण 2.2.5 के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. पीसीआर प्रोग्राम 1 का उपयोग करके प्लास्मिड # 87919 के 2 μL, primer_Guide1F के 2 μL, primer_Guide2R के 2 μL, पोलीमरेज़ मिश्रण के 25 μL और H2O के 19 μL के साथ एक पीसीआर (B) प्रतिक्रिया चलाएँ। टीबीई में 1% अगरोज जेल पर पीसीआर उत्पादों को अलग करें, उत्पाद शुल्क और क्षालन बफर के 20 μL में 400 बीपी टुकड़ा शुद्ध करें। या तो शुद्ध टुकड़े का सीधे उपयोग करें या चरण 2.2.5 के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    4. पीसीआर प्रोग्राम 1 का उपयोग करके प्लास्मिड # 87919 के 2 μL, primer_Guide2F के 2 μL, primer_BlpIR के 2 μL, पोलीमरेज़ मिश्रण के 25 μL और H2O के 19 μL के साथ एक पीसीआर (C) प्रतिक्रिया चलाएँ। टीबीई बफर में 1% एगरोज़ जेल पर पीसीआर उत्पादों को अलग करें। उत्पाद शुल्क और क्षालन बफर के 20 μL में 600 बीपी टुकड़ा शुद्ध। या तो सीधे शुद्ध टुकड़े का उपयोग करें या चरण 2.2.6 के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: 900 बीपी पर एक और टुकड़ा दिखाई दे सकता है, प्लास्मिड में दोहराए गए क्षेत्रों पर प्राइमर के संकरण के कारण, जैसा कि चरण 2.2.1 के नोट में वर्णित है। यदि मौजूद है, तो इस बैंड को त्याग दिया जाना चाहिए।
    5. क्षालन पीसीआर ए (चरण 2.2.2 से), क्षालन पीसीआर बी के 2 μL (चरण 2.2.3 से), primer_XmaIF के 2 μL, primer_Guide2R के 2 μL, पोलीमरेज़ मिश्रण के 25 μL, और H2O के 19 μL के साथ, पीसीआर प्रोग्राम 1 के साथ एक पीसीआर (डी) प्रतिक्रिया चलाएं। टीबीई बफर में 1% एगरोज जेल पर पीसीआर उत्पादों को अलग करें; उत्पाद शुल्क और क्षालन बफर के 20 μL में 700 बीपी टुकड़ा शुद्ध। या तो सीधे शुद्ध टुकड़े का उपयोग करें या चरण 2.2.6 के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: दोहराए गए क्षेत्रों पर प्राइमरों के संकरण के कारण अन्य बैंड >1,000 बीपी, 400 बीपी और 300 बीपी पर दिखाई दे सकते हैं और उन्हें त्याग दिया जाना चाहिए।
    6. क्षालन पीसीआर सी (चरण 2.2.4 से), क्षालन पीसीआर डी के 4 μL (चरण 2.2.5 से), primer_XmaIF के 4 μL, primer_BlpIR के 4 μL, पोलीमरेज़ मिश्रण के 50 μL, और H2O के 34 μL के साथ एक पीसीआर (अंतिम) प्रतिक्रिया चलाएँ। उपयोग किया जाने वाला कार्यक्रम निम्नलिखित है (पीसीआर कार्यक्रम 2): 98 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए प्रारंभिक विकृतीकरण; के छह चक्र: 98 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस, 66 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस (प्रति चक्र 1 डिग्री सेल्सियस के संकरण तापमान में कमी), 72 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट 45; के 35 चक्र: 98 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस, 60 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस, 72 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट 45, और 72 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट का अंतिम बढ़ाव।
      नोट: इस अंतिम प्रवर्धन के लिए पीसीआर कार्यक्रम एक टच डाउन पीसीआर है, जो पिछले एक से अलग है, क्योंकि अंतिम प्रवर्धन के बड़े आकार के कारण जिसमें प्रत्येक गाइड के ठीक बाद दो दोहराए गए ट्रैकआरएनए अनुक्रम होते हैं।
    7. टीबीई बफर में 1% एगरोज जेल पर पीसीआर उत्पादों को अलग करें; उत्पाद शुल्क और अंतिम कैसेट को शुद्ध करें, जो क्षालन बफर के 20 μL में लगभग 1,300 बीपी पर पलायन करता है। एल्यूटेड उत्पाद की मात्रा निर्धारित करें। या तो शुद्ध टुकड़े का सीधे उपयोग करें या चरण 2.3.2.1 के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। यह अंतिम उत्पाद है जिसे लेंटिवायरल प्लास्मिड में डाला जाएगा।
      नोट: अन्य टुकड़े >1000 बीपी, 400 बीपी और 300 बीपी पर दिखाई दे सकते हैं, जो अधूरे पीसीआर टुकड़ों के अनुरूप हैं जिन्हें त्याग दिया जाना चाहिए।
  3. लेंटिवायरल प्लास्मिड रीढ़ की हड्डी में जीआरएनए कैसेट का सम्मिलन।
    1. प्रतिबंध एंजाइमों एक्सएमएआई और बीएलपीआई के साथ प्लास्मिड # 87919 के डबल पाचन द्वारा प्लास्मिड को रैखिक करें।
      1. अनुशंसित बफर के 15 μL, प्लास्मिड के 15 μL (1μg/μL), बीएलपीआई एंजाइम के 7.5 μL (10 U/μL पर), XmaI एंजाइम के 7.5 μL (10 U/μL पर), और H 2 O के112.5μL के साथ प्रतिक्रिया तैयार करें। 1% एगरोज़ जेल पर कुल राशि लोड करें, एक उपयुक्त किट के साथ ~ 10 केबी प्लास्मिड को काटें और शुद्ध करें। क्षालन बफर के 20 μL में किया जाता है, और ऑप्टिकल घनत्व माप का उपयोग करके एल्यूटेड उत्पाद की मात्रा निर्धारित की जाती है।
        नोट: सूर्य और कोल9 द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल के रूप में बड़े डीएनए टुकड़े के लिए एक उपयुक्त शुद्धि प्रोटोकॉल का प्रयोग करें।
    2. जीआरएनए कैसेट और प्लास्मिड को लिगेट करें। चरण 2.2.7 से जीआरएनए कैसेट और चरण 2.3.1.1 से रैखिक प्लास्मिड के साथ प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें, 10 μL की अंतिम मात्रा के लिए एंजाइम और H 2 O के2p_guides μL जोड़ें।
      नोट: डीएनए कैसेट राशि 50-100 एनजी और प्लास्मिड राशि 100-200 एनजी के बीच होनी चाहिए, जिसमें 2: 1 दाढ़ अनुपात होना चाहिए।
  4. रासायनिक रूप से सक्षम ई कोलाई जैसे एसटीबीएल 3 (50 μL) या XL10-गोल्ड को बदलने के लिए हौसले से तैयार प्लास्मिड के 2 μL का उपयोग करें और एंटीबायोटिक के बिना 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे की वृद्धि के बाद 100 μg / रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। कुछ कॉलोनियों को चुनें और निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए एक वाणिज्यिक किट का उपयोग करके एक मिनी तैयारी करें।
  5. पीसीआर प्रोग्राम 1 ( चित्रा 2 देखें) का उपयोग करके Primer_XmaI और Primer_BlpR के साथ मिनीप्रेप डीएनए पर पीसीआर प्रवर्धन करें। टीबीई बफर में 1% एगरोज़ जेल पर पीसीआर उत्पादों को अलग करें। लगभग 1300 बीपी के अपेक्षित आकार पर एक बैंड के साथ कुछ कॉलोनियों (~ 5) का चयन करें।
  6. जीआरएनए कैसेट के सही सम्मिलन की पुष्टि करने के लिए Primer_XmaI या Primer_BlpR का उपयोग करके चयनित कॉलोनियों के डीएनए अनुक्रमण करें।
    नोट: अनुक्रम-सत्यापित कॉलोनी में से एक का उपयोग अध्ययन में आगे किया जाता है, और प्लास्मिड को p_guides कहा जाता है।
  7. प्राइमर-किलर एफ और आर के साथ चरण 2.2 (कैसेट निर्माण) से दोहराएं, और प्राइमर-एमचेरी एफ और आर आगे के विश्लेषण के लिए एक अनुक्रम-सत्यापित कॉलोनी का उपयोग करें। प्लास्मिड को p_Killer कहा जाता है।

3. लेंटिवायरस उत्पादन

  1. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए एंडोटॉक्सिन मुक्त मैक्सी-प्रेप किट का उपयोग करके सभी आवश्यक प्लास्मिड की एक बड़ी मात्रा का उत्पादन और शुद्ध करें। μL पर विभाज्य तैयार करें- -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
  2. कोशिकाओं की तैयारी (दिन 1)
    1. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक, दुलबेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) उच्च ग्लूकोज पाइरूवेट से बना माध्यम के 16 मिलीलीटर में प्रति प्लेट 1 एक्स 106 एचईके 293 कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त 145 सेमी की 18 प्लेटें तैयार करें। 3 दिनों के लिए एक 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में, 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को बढ़ाएं।
      नोट: डिस्पोजेबल सुरक्षात्मक सूट, सुरक्षात्मक टोपी और दस्ताने सहित अनुकूलित सुरक्षा गियर का उपयोग करके, लेंटिवायरस का उत्पादन जैव सुरक्षा स्तर 2 प्रयोगशाला में सावधानी के साथ किया जाना चाहिए। सभी प्रयोगों को फिल्टर युक्तियों के साथ एक लामिना प्रवाह हुड (बीएसएलआईआई सुरक्षा कैबिनेट) के तहत किया जाना चाहिए। लेंटीवायरस युक्त सभी समाधान और सभी उपयोग किए गए प्लास्टिक / ग्लास कचरे को इथेनॉल 70% या अन्य वायरस निष्क्रियता के साथ निष्क्रिय किया जाना चाहिए।
  3. कोशिकाओं का अभिकर्मक (दिन 4)
    1. कोशिकाओं के संगम की जाँच करें, यह सुनिश्चित करने के लिए कि वे 60% -65% संगम तक पहुंच गए हैं।
    2. प्रत्येक प्लेट के लिए युक्त अभिकर्मक समाधान तैयार करें: ब्याज के प्लास्मिड का 20.8 μg (पी-गाइड, या पी-किलर, या पीसीएएस 9 # 87904), लिफाफे को एन्कोडिंग प्लास्मिड का 4.8 μg (वीएसवी-जी, # 8454), लेंटिवायरल पैकेजिंग के लिए प्लास्मिड पीएसपीएएक्स 2 (#12260) का 20.8 μg, कैल्शियम फॉस्फेट का 136 μL
      नोट: अभिकर्मकों की इष्टतम तैयारी सुनिश्चित करने के लिए एक ही समय में सभी प्लेटों के लिए मिश्रण तैयार न करें; एक ही समय में छह प्लेटों के लिए मिश्रण तैयार करें, उदाहरण के लिए, 18 प्लेटों के लिए, छह प्लेटों के लिए तीन बार मिश्रण तैयार करें।
    3. कम से कम 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर सेते हैं और कोशिकाओं के लिए ड्रॉपवाइज समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ें। प्लेट के कोमल आंदोलन के साथ अभिकर्मक अभिकर्मक को समरूप करें, आगे, ऊपर और नीचे, 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, कम से कम 5 घंटे के लिए 5% सीओ2 ।
      नोट: इस बिंदु से और लेंटीवायरस के उत्पादन के अंत तक, दस्ताने, सुरक्षा आस्तीन और एक डिस्पोजेबल प्लास्ट्रॉन की दूसरी जोड़ी सहित अतिरिक्त सुरक्षा गियर पहनें।
    4. अभिकर्मक के पांच घंटे बाद, प्लेटों से माध्यम को हटा दें और अभिकर्मक अभिकर्मकों से छुटकारा पाने के लिए पीबीएस के साथ कुल्ला करें। ताजा माध्यम के 12 एमएल जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर 48 घंटे सेते हैं।
  4. वायरल कणों का संग्रह (दिन 6)
    1. इकट्ठा करें और सभी प्लेटों से माध्यम पूल। गोली सेलुलर मलबे के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 800 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र। एक 0.45 μm फिल्टर (एकाधिक फिल्टर आवश्यक) का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला फ़िल्टर करें।
    2. एक झूलते बाल्टी रोटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 68,300 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला निकालें और ट्यूबों को 5-10 मिनट के लिए एक कागज पर सुरक्षा कैबिनेट के नीचे उल्टा करने दें ताकि जितना संभव हो उतना तरल निकाला जा सके, और फिर प्रति गोली एचईके प्रसार माध्यम के 100 μL जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 2 घंटे के बाद, ऊपर और नीचे पाइपिंग करके छर्रों को फिर से निलंबित करें। सभी पुन: निलंबित छर्रों को पूल करें।
      नोट: छर्रों को विभाज्य से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर मध्यम में छोड़ा जा सकता है।
    3. 10 μL या 25 μL नमूना आकार (उपयोग के आधार पर) में विभाज्य लेंटिवायरस और तरल नाइट्रोजन के साथ स्नैप-फ्रीज। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। एक विभाज्य फ्रीज न करें जिसे पिघला दिया गया है।
  5. एलवी-गाइड, एलवी-किलर और एलवी-कैस 9 का उत्पादन करने के लिए ब्याज के अन्य प्लास्मिड के साथ चरण 3.2 से 3.4 दोहराएं।
    नोट: एक विकल्प के रूप में, लेंटीवायरस को किसी कंपनी या वायरस सुविधा से खरीदा जा सकता है।

4. लेंटीवायरस अनुमापन

नोट: वायरस अनुमापन HEK293 कोशिकाओं पर किया जाता है। अनुमापन ब्याज की कोशिकाओं के लिए प्रति सेल (जो भी लेंटीवायरस का बैच) की एक सटीक संख्या को बाद के चरणों में शामिल करना महत्वपूर्ण है। एक कोशिका को कुशलतापूर्वक स्थानांतरित करने वाले वायरल कणों की संख्या को संक्रमण की बहुलता (एमओआई) कहा जाता है: एमओआई 10 इस प्रकार प्रति सेल 10 वायरल कणों की शुरूआत के अनुरूप है। जैसा कि ठंड / विगलन चक्र लेंटीवायरस की व्यवहार्यता को प्रभावित करता है, अनुमापन एक जमे हुए लेंटिवायरस विभाज्य के साथ किया जाता है, और प्रत्येक बाद के प्रयोग को उसी पूल के एक नए विभाज्य के साथ किया जाएगा। एक अनुमापन विधि का वर्णन यहां किया गया है, लेकिन अन्य तरीकों का उपयोग किया जा सकता है।

  1. पहले दिन, नीचे ग्लास कवरलिप्स के साथ पांच35 मिमी प्लेटों में प्रति प्लेट 1 x 10 5 कोशिकाओं और कवरलिप्स के बिना दो 35 मिमी प्लेटें।
  2. दिन 2 पर, कवरलिप्स के बिना दो प्लेटों से, ट्रिप्सिनाइजेशन के बाद कोशिकाओं की संख्या एकत्र करें और गिनें, और प्रति प्लेट (एन) कोशिकाओं की औसत मात्रा निर्धारित करें।
  3. प्रसार माध्यम में 1/10 पर पतला लेंटीवायरस के 100 μL तैयार करें। पतला वायरस के 1 से 50 μL तक पतला वायरस की विभिन्न मात्रा के साथ पांच सुसंस्कृत प्लेटों को ट्रांसड्यूस करें। इस प्रोटोकॉल के लिए, पांच प्लेटों को ट्रांसड्यूस करने के लिए निम्नलिखित संस्करणों का उपयोग करें: 1 μL, 5 μL, 10 μL,20 μL, 50 μL. 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें, 5% सीओ 2 में।
  4. दिन 4 पर, 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में 20 से 30 मिनट के लिए आरटी पर कवरलिप्स के इनक्यूबेशन करके कोशिकाओं को ठीक करें। एलवी-कैस 9 के लिए, आरटी पर 10 मिनट के लिए फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में 0.1% ट्राइटन एक्स 100 के साथ कोशिकाओं को पारगम्य बनाएं, आरटी पर 20 मिनट के लिए पीबीएस -0.1% ट्राइटन एक्स 100-2% बकरी सीरम- 0.5% बोवाइन सीरम एल्बुमिन (बीएसए) में संतृप्त करें, और प्राथमिक एंटीबॉडी एंटी-वी 5 (कमजोर पड़ने 1/400) के साथ आरटी में 45 मिनट इनक्यूबेशन के लिए लेबल करें। आरटी पर 10 मिनट के लिए होश्ट (पीबीएस में 10 μg / एमएल) के साथ नाभिक लेबल करें।
  5. एक स्लाइड पर कवरलिप्स माउंट और एक 20x उद्देश्य के साथ सुसज्जित फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर निरीक्षण करें। एलवी-गाइड और एलवी-किलर के लिए, निर्धारण के बाद सीधे नाभिक लेबलिंग पर जाएं और कवरलिप्स को माउंट करें। प्रत्येक कवरस्लिप के लिए, दृश्य के क्षेत्र में नाभिक की कुल संख्या (कोशिकाओं की कुल संख्या) और लेबल की गई कोशिकाओं की संख्या (या तो वी 5 या एमचेरी के साथ) की गणना करें, और प्रत्येक कवरस्लिप के लिए लेबल की गई कोशिकाओं का अनुपात निर्धारित करें।
  6. एक कवरस्लिप का चयन करें जिसमें ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं का अनुपात कम से कम 10% और 50% से अधिक नहीं है। इस कवरस्लिप के लिए पारगमन दक्षता (एक्स) निर्धारित करें, और इस पारगमन दक्षता को प्राप्त करने के लिए उपयोग किए जाने वाले पतला वायरस (वी, μL में) की मात्रा पर ध्यान दें।
    Equation 1
  7. निम्नलिखित सूत्र के अनुसार वायरस के टिटर (संक्रामक कणों में, आईपी / एमएल के रूप में दर्शाया गया) निर्धारित करें:
    Equation 2
    कमजोर पड़ने का कारक चरण 4.3 में किए गए लेंटीवायरस का कमजोर पड़ना है। हमने नियमित रूप से एलवी-सीएएस 9 के लिए 1 एक्स 109 आईपी / एमएल का अंतिम टिटर और एलवी-गाइड के लिए 1 एक्स10 10 आईपी / एमएल प्राप्त किया, जो एचईके कोशिकाओं में निर्धारित किया गया था।

5. मायोब्लास्ट पारगमन

नोट: अमर मायोब्लास्ट्स को पहले उत्पादित तीन लेंटिवायरस के साथ क्रमिक रूप से ट्रांसड्यूस किया जाता है। स्ट्रेप्टोमाइसिन, 2% अल्ट्रोजर जी, और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 के साथ पूरक हैम के एफ 10 से बने प्रसार माध्यम में उन्हें 50% से कम घनत्व पर बनाए रखा जाता है।

  1. निम्नलिखित सूत्र के अनुसार, एलवी-कैस 9 और एलवी-गाइड के लिए एमओआई 10 और एलवी-हत्यारे के लिए एमओआई 20 के साथ कोशिकाओं की चुनी हुई संख्या का इलाज करने के लिए आवश्यक लेंटिवायरस की मात्रा निर्धारित करें:
    Equation 3
    नोट: एक समानांतर प्रयोग में, ट्रांसडक्शन दक्षता की तुलना मायोब्लास्ट्स और एचईके पर की गई है, एक नियंत्रण लेंटीवायरस (लेंटी-जीएफपी) का उपयोग करके, और हमने निर्धारित किया है कि एचईके सेल की तुलना में मायोब्लास्ट को कुशलतापूर्वक ट्रांसड्यूस करने के लिए पांच गुना अधिक लेंटीवायरस की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, एचईके पर मापा गया एमओआई 10 प्रति मायोब्लास्ट दो वायरल कणों से मेल खाता है। यहां उपयोग किए जाने वाले एमओआई की गणना एचईके कोशिकाओं पर की जाती है।
  2. दिन 1 पर, अच्छी तरह से प्रसार माध्यम के 100 μL में 10,000 कोशिकाओं के साथ 96-अच्छी तरह से प्लेटें बीज। दिन 2 पर, चरण 5.1 में गणना की गई एलवी-गाइड और एलवी-कैस 9 की उचित मात्रा को जोड़कर सुरक्षा कैबिनेट के तहत कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करें। दिन 7 तक इनक्यूबेटर के लिए कोशिकाओं को लौटें।
    नोट: 25 से अधिक एमओआई का उपयोग, विशेष रूप से एलवी-कैस 9 के लिए, लेंटिवायरस की उच्च एकाग्रता पर उच्च कोशिका मृत्यु के कारण संपादित कोशिकाओं की संख्या में सुधार नहीं हो सकता है।
  3. 7 वें दिन, ट्रिप्सिनाइजेशन करें और कोशिकाओं की गिनती करें। एक नई प्लेट में 40% से 50% की संगम पर कोशिकाओं को बीज दें और कोशिकाओं को इनक्यूबेटर में वापस करें। पांच घंटे बाद, 20 के एमओआई (चरण 5.1 में गणना की गई मात्रा) पर एलवी-किलर के साथ कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करें। अभिकर्मक के बाद 5 से 10 दिनों के लिए कोशिकाओं को बढ़ाएं, कम से कम दो मार्गों के लिए, और हमेशा उन्हें <50% की कम संगमता पर बनाए रखें। कोशिकाएं अगले चरण, सेलुलर क्लोनिंग के लिए तैयार होती हैं, जब उनकी वृद्धि सामान्य हो जाती है (विभाजन समय द्वारा अनुमानित)।
    नोट: पारगमन के बाद प्रसार थोड़ा धीमा हो सकता है। कोशिकाओं के विभाजन समय के अनुमान से इस प्रयोगात्मक प्रक्रिया से पहले सामान्य कोशिका वृद्धि निर्धारित की जा सकती है।

6. सेलुलर क्लोनिंग

नोट: चूंकि मायोब्लास्ट ट्रांसडक्शन मुश्किल है और कभी भी 100% दक्षता तक नहीं पहुंचता है, यहां तक कि लेंटिवायरस का उपयोग करते समय, पूरी तरह से सही सेल लाइन प्राप्त करने के लिए सेलुलर क्लोनिंग की आवश्यकता होती है। यह केवल अमर कोशिकाओं, या कोशिकाओं के साथ संभव है जिन्हें कुछ हफ्तों / महीनों के दौरान सुसंस्कृत और प्रवर्धित किया जा सकता है।

  1. ट्रिप्सिनाइज करें और कोशिकाओं की गिनती करें। एमएल पर प्रसार माध्यम में कोशिकाओं को पतला करें और 100 μL / अच्छी तरह से मध्यम वाले 96-अच्छी तरह से प्लेटों में 1 सेल /
    नोट: वरीयता प्राप्त प्लेटों की संख्या अपेक्षित जीन संपादन की संभावना पर निर्भर करती है, 2 से 10 प्लेटें नियमित रूप से उपयोग की जाती हैं।
  2. विकास के लिए कोशिकाओं की निगरानी करें और कम से कम 35 मिमी प्लेट तक पहुंचने तक एक बड़ी प्लेट में प्रत्येक अच्छी तरह से बढ़ाएं, जबकि मायोब्लास्ट्स की संगमता को 50% से नीचे बनाए रखें। यह कदम 2-6 सप्ताह तक रह सकता है, उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं और कुएं में अलग होने के बाद बढ़ने की उनकी क्षमता पर निर्भर करता है।

7. क्लोन चयन

नोट: यह चरण यह पहचानने के लिए किया जाता है कि कौन से बढ़ते क्लोन को उचित रूप से संशोधित किया गया है।

  1. पहली गाइड (Primer_BeforeGuide1F) से पहले स्थित प्राइमर से बना प्राइमरों का एक सेट डिज़ाइन करें और दूसरे गाइड (Primer_AfterGuide2R) के बाद स्थित एक अन्य प्राइमर ताकि संशोधित अनुक्रम को घेरने वाले क्षेत्र को बढ़ाया जा सके। यहां उपयोग किए जाने वाले प्राइमरों के लिए तालिका 1 देखें।
  2. प्रत्येक क्लोन से कोशिकाओं को इकट्ठा, भविष्य के प्रवर्धन के लिए कम से कम 300,000 कोशिकाओं को छोड़ दें, और शेष कोशिकाओं पर किसी भी मानक प्रोटोकॉल का उपयोग करके जीनोमिक डीएनए निकालें।
    1. यदि क्लोन की एक बड़ी संख्या बढ़ रही है, तो गैर-संपादित लोगों को त्यागने के लिए, इस पूल से डीएनए निकालने और पीसीआर के साथ परीक्षण करने के लिए एक ही ट्यूब में पांच क्लोन से कोशिकाओं को पूल करके तेजी से परीक्षण करें। आवश्यकतानुसार कई क्लोन के साथ दोहराएं। फिर, व्यक्तिगत विश्लेषण करने के लिए संपादित कोशिकाओं वाले पूल को अलग करें।
  3. पीसीआर द्वारा संपादन को निम्नानुसार नियंत्रित करें। निर्माता के निर्देशों और प्राइमर मापदंडों के अनुसार थर्मोसाइक्लर में Primer_BeforeGuide1F के 1 μL, Primer_AfterGuide2R के 1 μL, पोलीमरेज़ मिश्रण के12.5μL, जीनोमिक डीएनए के 3 μL और H 2 O के 7.5 μL के साथ पीसीआर प्रतिक्रिया तैयार करें। संपादित क्लोन की पहचान करने के लिए 1% एगरोज़ जेल पर चलाएं।
  4. निम्नानुसार अनुक्रमण द्वारा संपादन को नियंत्रित करें। विलोपन की पुष्टि करने और प्रत्येक क्लोन में संपादन कैसे किया गया है, इसकी पहचान करने के लिए चयनित क्लोनों की सेंगर अनुक्रमण करें। यह सुनिश्चित करने के लिए एक से अधिक संपादित क्लोन रखें कि केवल लक्षित जीन को संशोधित किया गया है और मनाया गया शारीरिक प्रभाव के लिए जिम्मेदार है और एक गैर-संपादित क्लोन रखें जिसका उपयोग बाद के प्रयोगों में नियंत्रण क्लोन (सीटीआरएल) के रूप में किया जाएगा।
  5. चयनित क्लोन का विस्तार करें। एक बार जब प्रत्येक क्लोन की संगमता लगभग 50% तक पहुंच जाती है, तो कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज करें और कोशिकाओं को एक बड़े पकवान में प्लेट करें, जब तक कि जैव रासायनिक और कार्यात्मक लक्षण वर्णन (आमतौर पर प्रति क्लोन 1 x 106 से अधिक) करने के लिए पर्याप्त कोशिकाओं का उत्पादन नहीं किया जाता है, और भविष्य के उपयोग के लिए प्रत्येक क्लोन के जमे हुए विभाज्य को स्टोर करें।

8. संपादित क्लोन की विशेषता

नोट: एक बार डीएनए अनुक्रमण द्वारा कुछ क्लोन उठाए जाने और पुष्टि करने के बाद, लक्षित जीन के विलोपन की पुष्टि पश्चिमी धब्बा का उपयोग करके प्रोटीन स्तर पर की जा सकती है, और कार्यात्मक स्तर पर यदि इस जीन के लिए एक कार्यात्मक सेलुलर परख उपलब्ध है। आरवाईआर 1-केओ के मामले में, जैसा कि आरवाईआर 1 एक कैल्शियम चैनल है, सुसंस्कृत कोशिकाओं पर कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग करके कार्यात्मक लक्षण वर्णन किया गया है।

  1. संपादित क्लोन में प्रोटीन अभिव्यक्ति
    नोट: आरवाईआर 1 केवल विभेदित मायोट्यूब10 में व्यक्त किया जाता है। इसकी अभिव्यक्ति का मूल्यांकन पश्चिमी धब्बा का उपयोग करके मायोट्यूब में किया गया है, ताकि आरवाईआर 1 के प्रोटीन स्तर पर विलोपन की पुष्टि की जा सके, साथ ही कैस 9 प्रोटीन को हटाया जा सके।
    1. प्रसार माध्यम में प्लेट 200,000 कोशिकाएं (ऊपर वर्णित, चरण 5) लैमिनिन के साथ लेपित 35 मिमीप्लेट में लगभग 1.76 सेमी 2 की सतह पर (कैल्शियम के साथ पीबीएस में 10 मिलीग्राम / एक बार जब कोशिकाएं 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर 2-3 घंटे के लिए ऊष्मायन के बाद प्लेट में फंस जाती हैं, तो संस्कृति माध्यम को डीएमईएम कम ग्लूकोज + 10% हॉर्स सीरम + 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन से बने भेदभाव माध्यम में स्थानांतरित करें, और कोशिकाओं को 6 दिनों के लिए इनक्यूबेटर में वापस कर दें।
    2. भेदभाव के 6 दिनों के बाद, प्रोटीज अवरोधकों के साथ पूरक आरआईपीए के 200 μL के साथ कोशिकाओं को इकट्ठा और लाइज़ करें। फोलिन लोरी विधि का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करें11.
    3. 5% -15% ढाल एक्रिलामाइड जेल पर, लेमली विकृतीकरण बफर में आरटी में 30 मिनट के लिए विकृतीकरण के बाद प्रोटीन के 15 μg लोड करें। वैद्युतकणसंचलन पृथक्करण के बाद, 4 घंटे11 के लिए 0.8 वी पर इम्मोबिलॉन पी पर प्रोटीन स्थानांतरित करें।
    4. पीबीएस में आरटी में 30 मिनट के लिए झिल्ली की संतृप्ति के बाद 0.1% ट्वीन 20 और 5% गैर वसा वाले सूखे दूध, आरटी पर 2 घंटे के लिए एक ही बफर में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली सेते हैं या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर, पीबीएस -0.1% ट्वीन 20 के साथ 5 मिनट के लिए झिल्ली 5 एक्स धो लें और आरटी पर 1 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली सेते हैं। उपयोग किए जाने वाले प्राथमिक एंटीबॉडी हैं: कैस 9 का पता लगाने के लिए वी 5-टैग (कमजोर पड़ने: 1/5000) के खिलाफ एंटीबॉडी, लोडिंग नियंत्रण के रूप में एंटी-जीएपीडीएच (कमजोर पड़ने: 1/1000), एंटी-आरवाईआर 1 एंटीबॉडी12,13 (कमजोर पड़ने: 1/10.000), डीएचपीआर के अल्फा 1 सबयूनिट के खिलाफ एंटीबॉडी (कमजोर पड़ने: 1/1000) और मायोसिन भारी श्रृंखला एमएफ 20 के खिलाफ एंटीबॉडी
    5. पीबीएस -0.1% ट्वीन 20 के साथ 5 मिनट के लिए झिल्ली 5x धो लें, तरल की अधिकता को सूखा और केमिलुमिनेसेंट सब्सट्रेट जोड़ें। केमिल्युमिनेसेंट सिग्नल का पता लगाने के लिए सब्सट्रेट प्रदाता द्वारा अनुशंसित के रूप में आगे बढ़ें।
  2. संपादित क्लोन के कार्यात्मक लक्षण वर्णन
    नोट: आरवाईआर 1 के कार्य का मूल्यांकन विभेदित मायोट्यूब में कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग करके किया गया था, जो सीटीआरएल या केओ क्लोन14 से उत्पादित होता है।
    1. लैमिनिन के साथ लेपित 35 मिमी व्यंजनों के केंद्र में0.2 सेमी 2 सतह पर प्लेट 50,000 कोशिकाएं (कैल्शियम के साथ पीबीएस में 10 मिलीग्राम / एमएल पर 50 μL लैमिनिन ड्रॉप द्वारा कवर की गई सतह) और चरण 8.1.1 में वर्णित 6 दिनों के लिए भेदभाव को प्रेरित करती हैं। प्रत्येक उत्तेजना के लिए तीन प्लेटें तैयार करें, एक जैविक ट्रिप्लिकेट होने के लिए।
    2. फ़्लू 4-प्रत्यक्ष के 50 μL के साथ मायोट्यूब लोड करें, भेदभाव माध्यम में 1: 1 पतला और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए ऊष्मायन किया गया। एमएल पर ग्लूकोज के साथ पूरक केआरईबीएस बफर के साथ कोशिकाओं को दो बार कुल्ला।
    3. एक उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप या एक 10x उद्देश्य का उपयोग कर एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ प्रतिदीप्ति विविधताओं को मापें। माइक्रोस्कोप के मंच पर प्लेट स्थापित करें और 90 एस के लिए प्रति सेकंड 1 फ्रेम पर अधिग्रहण शुरू करें।
    4. शेष केआरईबीएस को हटा दें और आरवाईआर 1 प्रत्यक्ष उत्तेजना के लिए झिल्ली विध्रुवण (140 एमएम अंतिम एकाग्रता) या 4 सीएमसी (500 μM अंतिम एकाग्रता) के 2 एमएल के लिए केसीएल के 2 एमएल के अलावा फ्रेम 25 पर कोशिकाओं को उत्तेजित करें। सुनिश्चित करें कि रिकॉर्ड किए गए क्षेत्र में कम से कम 10 मायोट्यूब मौजूद हैं।
    5. एक समर्पित सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्रत्येक मायोट्यूब में प्रतिदीप्ति भिन्नता की मात्रा निर्धारित करें। विश्लेषण के लिए प्रति डिश कम से कम 10 मायोट्यूब (आदर्श रूप से प्रति डिश 20-30 मायोट्यूब) का चयन करें, प्रत्येक मायोट्यूब की लंबी धुरी पर एक रेखा (या ब्याज का क्षेत्र (आरओआई)) खींचें और सभी फ्रेम के लिए इस लाइन के साथ प्रतिदीप्ति एफ एकत्र करें।
    6. फ्रेम 1 से 24 के अनुरूप प्रारंभिक फ्लोरोसेंट मान, एफ 0 निर्धारित करें। फ्लोरोसेंट भिन्नता (एफ-एफ 0) / एफ 0 को 0 से 90 एस तक समय के एक समारोह के रूप में प्लॉट करें। तीन अलग-अलग संस्कृतियों से कम से कम 90 मायोट्यूब से प्रतिदीप्ति भिन्नता प्राप्त करने के लिए प्रयोग को तीन बार दोहराएं। 90 मायोट्यूब के लिए सभी परिणामों को पूल करें और प्रत्येक समय सीमा पर (एफ-एफ 0) / एफ 0 के औसत ± एसईएम की गणना करें। प्रत्येक उत्तेजना और प्रत्येक क्लोन के लिए कैल्शियम रिलीज के शिखर आयाम की मात्रा निर्धारित करें।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल को एक स्वस्थ विषय15 (तथाकथित एचएम कोशिकाओं, मानव मायोब्लास्ट्स के लिए) से अमर मायोब्लास्ट्स पर लागू किया गया था, जिसमें आरवाईआर 1 को पहले16 की विशेषता दी गई है, ताकि आरवाईआर 1 जीन एन्कोडिंग आरवाईआर 1 प्रोटीन को खटखटाया जा सके। गाइड आरएनए का डिजाइन जीन के एक्सॉन 101 और इंट्रॉन 101 के हिस्से को शामिल करने वाले अनुक्रम को हटाने के लिए किया गया था। एक्सॉन 101 के हिस्से को हटाने से रीडिंग फ्रेम में व्यवधान उत्पन्न होने की भविष्यवाणी की जाती है। इसके अलावा, एक्सॉन 101 प्रोटीन के छिद्र को एन्कोड करता है और इस प्रकार एक कार्यात्मक कैल्शियम चैनल का उत्पादन करने की आवश्यकता होती है। गंभीर आरवाईआर 1 से संबंधित मायोपैथी से प्रभावित कई रोगियों में जीन7 के इस क्षेत्र में उत्परिवर्तन होता है। क्रिस्पर सॉफ़्टवेयर के साथ भविष्यवाणी की गई सर्वोत्तम मार्गदर्शिकाओं को सर्वोत्तम दक्षता रखते हुए जितना संभव हो उतना कम ऑफ-टारगेट रखने के लिए चुना गया था। हमने एक ही वायरल वेक्टर में एक ही समय में दो गाइड का उपयोग करना चुना, यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाओं का एक बड़ा हिस्सा नॉक-आउट होगा, और पीसीआर का उपयोग करके संपादित क्लोन में विलोपन का पता लगाने को आसान बनाने के लिए। दो चयनित गाइड ( तालिका 2 और चित्रा 1 देखें) क्रमशः एक्सॉन 101 के अंत में और इंट्रॉन 101 की शुरुआत में स्थानीयकृत हैं, जिसके परिणामस्वरूप 326 बीपी का विलोपन और बाद में फ्रेमशिफ्ट होता है। यह सुनिश्चित करता है कि संपादित कोशिकाएं आरवाईआर 1-केओ होंगी।

एसपीसीएएस 9 को लक्षित करने वाला जीआरएनए पहले से ही मेरिएन और सहकर्मियों6 द्वारा डिजाइन किया गया था और कमजोर प्रमोटर 7 एसके के तहत प्लास्मिड # 87919 में मौजूद था। चूंकि एसपीसीएएस 9 अनुक्रम को लक्षित करने की इसकी दक्षता पहले से ही उनके अध्ययन6 में प्रदर्शित की गई है, इसका उपयोग प्लास्मिड p_Killer बनाने के लिए किया गया है, लेकिन मजबूत प्रमोटर एच 1 के नियंत्रण में। प्लास्मिड p_Killer में दूसरा गाइड प्रमोटर यू 6 के तहत एमचेरी अनुक्रम को लक्षित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। यह एमचेरी को हटाने की अनुमति देगा, जो नव निर्मित सेल लाइन के साथ कुछ बाद के प्रयोगों में परेशान हो सकता है।

प्लास्मिड p_guides और p_killer बनाए गए थे और समर्पित बीएसएल 2 संस्कृति कक्ष में सभी आवश्यक लेंटिवायरस का उत्पादन किया गया था। मायोब्लास्टट्रांसडक्शन के बाद, कोशिकाओं को विकास वसूली तक 2 सप्ताह के लिए सुसंस्कृत किया गया था और संपादित कोशिकाओं की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए पीसीआर का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था। सेलुलर क्लोनिंग के लिए, दो 96-अच्छी तरह से प्लेटों को प्रति अच्छी तरह से 1 सेल पर इलाज कोशिकाओं के साथ वरीयता दी गई थी। सुसंस्कृत कुओं के 32% में कोशिका वृद्धि देखी गई। जीनोमिक डीएनए तब क्लोन से निकाला गया था और पीसीआर विश्लेषण तब तक किया गया था जब तक कि दो सही क्लोन की पहचान नहीं की गई थी (तथाकथित सीएल-कोर -1 और सीएल-कोर -2), चित्रा 3 देखें। आरवाईआर 1 के लक्षित हिस्से को हटाने की पुष्टि सेंगर अनुक्रमण द्वारा की गई थी। अतिरिक्त नियंत्रण कोशिकाओं का उपयोग किया गया है, जैसे कि प्रारंभिक एचएम कोशिकाएं, या एचएम कोशिकाओं को एक ही प्रक्रिया के साथ इलाज किया जाता है, लेकिन पीसीआर और अनुक्रमण (सीएल-सीटीआरएल) द्वारा पुष्टि के रूप में गैर-संपादित किया जाता है। चयनित क्लोन को तब प्रवर्धित किया गया था और प्रोटीन स्तर और कार्यात्मक स्तर पर आगे की विशेषता थी।

प्रोटीन स्तर पर आरवाईआर 1 और कैस 9 के पूर्ण विलुप्त होने को मान्य करने के लिए, पश्चिमी धब्बा विश्लेषण किया गया था। परिणाम चित्रा 4 पर प्रस्तुत कर रहे हैं. एचएम कोशिकाओं में अनुपस्थित कैस 9 प्रोटीन, एलवी-कैस 9 (एचएम + एलवी-कैस 9) के साथ कोशिकाओं के पारगमन के 5 दिन बाद पता चला था, और जैसा कि अपेक्षित था, इसकी अभिव्यक्ति सीएल-सीटीआरएल में और संपादित सीएल-कोर -1 और सीएल-कोर -2 में समाप्त कर दी गई थी, हालांकि कैस 9 की एक छोटी मात्रा अभी भी सीएल-कोर -2 (चित्रा 3 ए) में पाई गई थी। जैसा कि कैस 9 को लक्षित करने वाला जीआरएनए अभी भी व्यक्त किया गया है, शेष कैस 9 की मात्रा उत्तरोत्तर गायब होने की उम्मीद है। अन्य महत्वपूर्ण प्रोटीनों की अभिव्यक्ति का भी पश्चिमी धब्बा का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया था: आरवाईआर 1, प्रोटीन के पूर्ण विलोपन की पुष्टि करने के लिए, डीएचपीआर का अल्फा 1 सबयूनिट, जो उत्तेजना-संकुचन युग्मन में शामिल आरवाईआर 1 का कार्यात्मक भागीदार है, और भेदभाव के मार्कर के रूप में मायोसिन भारी श्रृंखला, क्योंकि आरवाईआर 1 और डीएचपीआर केवल विभेदित मायोट्यूब (चित्रा 3 बी) में व्यक्त किए जाते हैं ). डीएचपीआर और एमवाईएचसी को संशोधित नहीं किया जाना चाहिए। यद्यपि पश्चिमी धब्बा ने दो आरवाईआर 1-केओ क्लोन (सीएल-कोर -1 और सीएल-कोर -2) में आरवाईआर 1 के पूर्ण विलोपन की पुष्टि की, अतिरिक्त संशोधन-कैस 9 या क्लोनिंग प्रक्रिया के परिणामस्वरूप-सीएल-कोर -2 में हो सकता है, जो डीएचपीआर की अनुपस्थिति और मायोसिन भारी श्रृंखला (एमएचसी) में कमी के अलावा प्रस्तुत किया गया था। चूंकि दोनों प्रोटीन केवल विभेदित मायोट्यूब में व्यक्त किए जाते हैं, इसलिए उनकी अनुपस्थिति संभवतः भेदभाव में परिवर्तन को दर्शाती है, जो संभवतः कोशिकाओं के स्थानीय अतिवृद्धि से जुड़ी लंबी एकल कोशिका क्लोनिंग प्रक्रिया से स्टेम कर सकती है जिससे उनकी मायोजेनिक क्षमता में खो जाता है। इस प्रकार, कार्यात्मक स्तर पर केवल सीएल-कोर -1 की विशेषता है। यह दर्शाता है कि सर्वश्रेष्ठ (ओं) के साथ काम करने में सक्षम होने के लिए कई संपादित क्लोन का चयन महत्वपूर्ण है।

कार्यात्मक लक्षण वर्णन कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग करके किया गया था। समय के एक समारोह के रूप में मतलब प्रतिदीप्ति भिन्नता चित्रा 5 पर प्रतिनिधित्व किया है, प्रत्येक जीनोटाइप के कम से कम 180 मायोट्यूब पर, या तो 4-सीएमसी द्वारा प्रत्यक्ष आरवाईआर 1 उत्तेजना या कैल्शियम रिलीज कॉम्प्लेक्स (आरवाईआर 1 से जुड़े डीएचपीआर) की उत्तेजना का उपयोग करके केसीएल झिल्ली विध्रुवण द्वारा।

इन प्रयोगों से पता चला है कि गैर-संशोधित सीएल-सीटीआरएल में प्रारंभिक कोशिका आबादी (एचएम कोशिकाओं) की तुलना में एक व्यवहार था और इसके उत्प्रेरक 4-सीएमसी द्वारा प्रत्यक्ष आरवाईआर 1 उत्तेजना और झिल्ली विध्रुवण द्वारा कैल्शियम रिलीज कॉम्प्लेक्स की उत्तेजना का जवाब दिया। इसके विपरीत, संपादित सीएल-कोर -1 या तो उत्तेजना (4-सीएमसी और केसीएल विध्रुवण) का जवाब देने में असमर्थ था, जैसा कि आरवाईआर 1-केओ के लिए अपेक्षित था।

कुल मिलाकर, पश्चिमी धब्बा और कार्यात्मक लक्षण वर्णन ने पुष्टि की कि सीएल-कोर -1 सेल लाइन एक आरवाईआर 1-केओ मांसपेशी सेल लाइन है। इस प्रोटोकॉल को कंकाल की मांसपेशियों, या अन्य सेल प्रकार (जैसे प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल - आईपीएससी) में व्यक्त किसी भी अन्य जीन पर लागू किया जा सकता है। पूरा प्रोटोकॉल चित्रा 6 में सचित्र है।

Figure 1
चित्रा 1: गाइड आरएनए का स्थानीयकरण और डिजाइन। (ए) आरवाईआर 1-केओ सेल लाइन के निर्माण के लिए डिज़ाइन किए गए गाइड का योजनाबद्ध स्थानीयकरण। गाइड 1 आरवाईआर 1 जीन में एक्सॉन 101 के अंत को लक्षित करता है, गाइड 2 इंट्रॉन 101 को लक्षित करता है, जिससे 326 बीपी का विलोपन और एक फ्रेमशिफ्ट बनता है। गाइड किलर एसपीसीएएस 9 के अनुक्रम में दीक्षा कोडन को लक्षित करता है, गाइड एमचेरी एमचेरी अनुक्रम के अंत को लक्षित करता है। (बी) पहले वर्णित गाइड 1, गाइड 2, गाइड किलर और गाइड एमचेरी के लिए जीनोमिक अनुक्रमों में गाइड का स्थानीयकरण। प्रत्येक गाइड (लंबाई में 20 बीपी) का अनुक्रम रंग में प्रस्तुत किया जाता है और प्रत्येक गाइड के लिए पीएएम को बोल्ड और रेखांकित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: कैसेट के उत्पादन के लिए क्लोनिंग प्रक्रिया। लेंटिवायरस रीढ़ की हड्डी प्लास्मिड में डालने के लिए गाइड के साथ कैसेट का उत्पादन करने के लिए किए गए विभिन्न पीसीआर की योजनाबद्ध प्रस्तुति। पीसीआर ए, पीसीआर बी, पीसीआर सी, और पीसीआर डी को सही शीर्ष पर सचित्र कार्यक्रम 1 के साथ महसूस किया जाता है, और पीसीआर कार्यक्रम 2 के साथ पीसीआर फाइनल, दाईं ओर सचित्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: पीसीआर का उपयोग कर क्लोन का चयन( ए) ग्रे तीर द्वारा दर्शाए गए आगे और रिवर्स प्राइमरों के साथ गाइड को शामिल करते हुए 1,200 बीपी क्षेत्र के पीसीआर प्रवर्धन की योजनाबद्ध प्रस्तुति। दोनों गाइडों पर डीएनए दरार के परिणामस्वरूप पीसीआर टुकड़े के आकार में 326 बीपी की कमी होने की उम्मीद है, जैसा कि कैंची के नीचे बिंदीदार हरी ऊर्ध्वाधर रेखाओं द्वारा दर्शाया गया है। (बी) एचएम कोशिकाओं, सीएल-सीटीआरएल, सीएल-कोर -1 और सीएल-कोर -2 से उत्पादित पीसीआर उत्पादों को 1% एगरोज़ जेल पर लोड किया गया था। एचएम और सीएल-सीटीआरएल का डीएनए गैर संशोधित (पूर्ण लंबाई) दिखाई देता है, जबकि सीएल-कोर -1 और सीएल-कोर -2 का डीएनए नियंत्रण से छोटा है, जैसा कि अपेक्षित (क्लीव) है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: प्रोटीन स्तर पर कोशिकाओं की विशेषता ( ए ) एचएम कोशिकाओं में वी 5-टैग का उपयोग करके कैस 9 प्रोटीन की उपस्थिति के लिए पश्चिमी धब्बा विश्लेषण, एलवी-कैस 9, सीएल-सीटीआरएल, सीएल-कोर -1 और सीएल-कोर -2 के साथ ट्रांसड्यूस्ड एचएम कोशिकाएं। एलवी-सीएएस 9 के साथ ट्रांसड्यूस किए गए एचएम कोशिकाओं में कैस 9 स्पष्ट रूप से पाया जाता है, जबकि इसकी अभिव्यक्ति को एलवी-किलर द्वारा पूरी तरह से (सीएल-सीटीआरएल और सीएल-कोर -1 में) या लगभग पूरी तरह से (सीएल-कोर -2 में) समाप्त कर दिया गया है। (बी) सीएल-सीटीआरएल, सीएल-कोर -1 और सीएल-कोर -2 में लोडिंग नियंत्रण के रूप में आरवाईआर 1, मायोसिन भारी श्रृंखला (एमवाईएचसी), डीएचपीआर और जीएपीडीएच के अल्फा 1 सबयूनिट की अभिव्यक्ति। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: कोशिकाओं के कार्यात्मक लक्षण वर्णन। एचएम कोशिकाओं, सीएल-सीटीआरएल और सीएल-कोर -1 से उत्पादित मायोट्यूब पर फ्लू -4 कैल्शियम इमेजिंग का प्रदर्शन किया गया। घटता एचएम मायोट्यूब (काले घटता), सीएल-सीटीआरएल मायोट्यूब (ग्रे घटता), या सीएल-केओआर -1 (हरे घटता) में प्रतिदीप्ति भिन्नता का प्रतिनिधित्व करते हैं। सभी मूल्यों को माध्य ± एन मायोट्यूब के माध्य (एसईएम) की मानक त्रुटि के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। प्रत्येक स्थिति में, एन = 180 से 256 मायोट्यूब का विश्लेषण किया गया है, कम से कम तीन अलग-अलग प्रयोगों (प्रत्येक वक्र के लिए इंगित सटीक संख्या) से। 4 सीएमसी (500 μM) का उपयोग 2 एमएम बाहरी कैल्शियम की उपस्थिति में सीधे आरवाईआर 1 को उत्तेजित करने के लिए किया गया था। केसीएल विध्रुवण (140 एमएम) 2 एमएम बाहरी कैल्शियम की उपस्थिति में प्रेरित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: पूरे प्रोटोकॉल की योजनाबद्ध प्रस्तुति। प्रोटोकॉल के विभिन्न चरणों में सिलिको डिजाइन में कृत्रिम परिवेशीय आणविक क्लोनिंग और अंतिम सेल चयन के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

नाम अनुक्रम 5'-3' उद्देश्य / उपयोग
Primer_Guide1F मार्गदर्शिका 1 + जीटीएसटीएजीटीएजीटी प्लास्मिड क्लोनिंग
Primer_Guide1R गाइड 1-आरसी + एजीएटीसीटीजीटीजीसीटीसीएटीएकेएजी
Primer_Guide 2 एफ गाइड 2 + जीटीएसटीएटीएजीटीएजीटीजीटीजी
Primer_Guide 2R गाइड 2-आरसी + जीटीटीसीजीटीटीसीसीएजीएजी
Primer_XmaI एफ टैगगगाटसीसीसीसीसीसीजीजीएटीएटीएएटीटी प्लास्मिड क्लोनिंग और कॉलोनियों नियंत्रण
Primer_BlpI आर सीजीसीटीटीसीटीजीसीटीजीसीजीजीसीसी
Primer_KillerF एएटीजीजीएजीटीएसीटीटीसीटीटीसीएजीटीसीसीएटीसीटीएजीटीजीटीजीसीएटीसीटीएजीटीएजीटीजीसीएजीटीजीसी क्लोनिंग प्लास्मिड p_Killer
Primer_KillerR टीजीजीएसीएटीएसीटीसीएजीटीसीएसीटीसीएजीटीटीएसीटीएसीसीटीएजी
Primer_mCherryF जीएएजीटीएसीजीजीसीजीसीसीजी
Primer_mCherryR टीसीजीसीजीसीजीटीटीसीजीटीटीसीटीसीटीएजीटीटीटीसीसीएजी
Primer_RYR1exonF जीसीटीसीजीटीटीसीटीजीटीसीएसीसीसीजीसीजीटीटीएजीटीटीएजीटी क्लोनिंग प्लास्मिड p_guides_RyR1
Primer_RYR1exonR सीजीसीजीजीजीजीजीएटीजीसीएटीएजीजीटीजीसीटीसीएटीएसीएजी
Primer_RYR1intronF टीएएजीटीसीएजीटीसीएजीसीजीसीटीजीटीटीजीटीटीजीटीजीटीजीटी
Primer_RYR1intronR ए.जी.सी.टी.टी.सी.ए.सी.ए.सी.टी.सी.टी
Primer_BeforeRYR1cut एजीटीसीटीटीसीटीटीसीसीसीटी आरवाईआर 1 केओ के लिए क्लोन चयन
Primer_AfterRYR1cut सीटीजीसीसीजीटीसीसीएसीएजीएजीसीएजीसीएसी

तालिका 1: प्राइमरों की सूची। प्लास्मिड क्लोनिंग और कॉलोनी नियंत्रण के साथ-साथ क्लोन चयन के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमर।

नाम गाइड अनुक्रम पाम पीएएम के बिना रिवर्स पूरक
गाइड 1: आरवाईआर 1 एक्सॉन जीसीटीसीजीटीएटीटीसीजीटीसीएसीसीसीजीसीजी जीजीजी सीजीसीजीजीजीजी
गाइड 2: आरवाईआर 1 इंट्रॉन टीएएजीटीसीएटीटीएजीजीसीजीसीटी सीजीजी ए.जी.सी.टी.टी.ए.टी.टी.
गाइड हत्यारा कैस 9 टीजीजीएसीएजीएजीएसीटीसीटीसीटीटी जीजीजी एएटीजीएजीटीएसीटीटीटीजीटीसीसीए
गाइड एमचेरी हत्यारा जीएएजीटीएसीजीजीजीसीजीसीजीए जीजीजी टीसीजीजीसीजीसीटीटीसीजीटीएसीटीजीटीटीसी

तालिका 2: प्लास्मिड p_guides और p_Killer बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले गाइड। आरवाईआर 1-केओ क्लोन के विकास के लिए उपयोग किए जाने वाले अनुक्रम इस तालिका में प्रस्तुत किए गए हैं।

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Discussion

विकृतियों में शामिल अज्ञात कार्य के जीन के लक्षण वर्णन के रास्ते पर एक बड़ा कदम इन जीनों के कार्य का अध्ययन करने के लिए प्रासंगिक सेलुलर मॉडल का विकास है। कैस 9 का उपयोग करके जीन संपादन का उपयोग अनुसंधान का एक तेजी से बढ़ता हुआ क्षेत्र है, और यहां प्रस्तुत नॉक-आउट मॉडल का विकास इसके सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले अनुप्रयोगों में से एक है। इस संदर्भ में, हम यहां ब्याज के किसी भी जीन में मानव कोशिका रेखा नॉक-आउट विकसित करने के लिए एक बहुमुखी प्रोटोकॉल का प्रस्ताव करते हैं, जिससे प्रासंगिक मानव कोशिका मॉडल में इस जीन के लक्षण वर्णन की अनुमति मिलती है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग अमर मायोब्लास्ट के साथ-साथ आईपीएससी में भी किया जा सकता है, और इस प्रकार वस्तुतः ब्याज के जीन में किसी भी मानव कोशिका मॉडल केओ का उत्पादन हो सकता है।

सीमा यह है कि इस प्रोटोकॉल को अमर कोशिकाओं पर लागू किया जाना चाहिए, क्योंकि संवर्धन के कई हफ्तों के साथ-साथ एक सेलुलर क्लोनिंग कई क्रमिक प्रवर्धन के साथ आवश्यक है। वैकल्पिक रूप से कोशिकाओं, जिन्हें कुछ हफ्तों या महीनों के लिए प्रवर्धित और बनाए रखा जा सकता है, का उपयोग किया जाना चाहिए। इस प्रक्रिया का उपयोग करते हुए, ब्याज के जीन के लिए मानव अमर मांसपेशी सेल लाइन केओ (यहां आरवाईआर 1 जीन) लगभग 3-4 महीनों (कोशिकाओं के कार्यात्मक लक्षण वर्णन को छोड़कर) में उत्पादित किया गया है।

यह रणनीति मांसपेशियों की कोशिकाओं जैसे कोशिकाओं को ट्रांसफेक्ट करने में मुश्किल के लिए अनुकूल है, क्योंकि यह लक्ष्य कोशिकाओं में सभी उपकरणों को पेश करने के लिए लेंटिवायरस के उपयोग पर निर्भर करती है, और इस प्रकार यह अभिकर्मक या इलेक्ट्रोपोरेशन जैसे अन्य तरीकों की तुलना में अधिक शक्तिशाली है। इसकी प्रमुख कमी मेजबान जीनोम में एकीकरण है, और मेजबान जीनोम में लेंटीवायरस के हानिकारक एकीकरण से बचने के लिए एक संभावित विकल्प गैर-एकीकृत लेंटीवायरस17 पर उपयोग है, लेकिन इन गैर-एकीकृत लेंटिवायरल कणों की दक्षता कम से कम नियमित लेंटीवायरस के बराबर होनी चाहिए।

एकीकरण साइट शायद कैस 9 के अभिव्यक्ति स्तर को प्रभावित कर सकती है, लेकिन यह संभवतः सीएल-कोर 2 में कैस 9 की छोटी मात्रा के लिए जिम्मेदार नहीं है। कैस 9 की छोटी मात्रा संभवतः एलवी-किलर के साथ इस विशिष्ट क्लोन के पारगमन से संबंधित है, जो अन्य क्लोन की तुलना में कम हो सकती है, या वैकल्पिक रूप से एलवी-कैस 9 की संख्या अधिक हो सकती है।

लंबे समय तक जीआरएनए के बिना अकेले कैस 9 को व्यक्त करने की सिफारिश नहीं की जाती है (जैसे कैस 9 क्लोन के विकास के लिए), क्योंकि यह ऑफ-टारगेट को बढ़ाने के लिए वर्णित किया गया है, और यह कोशिकाओं की मृत्यु दर को भी बढ़ा सकता है।

हमने एसपीसीएस 9 को न्यूक्लियस के रूप में उपयोग करने के लिए चुना है, क्योंकि इसका व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, इसमें एक छोटा पीएएम है, और इसलिए गाइड आरएनए की पसंद के लिए कई विकल्प प्रदान करता है। इसके अलावा, इसका आकार लेंटिवायरल वैक्टर के उत्पादन के साथ संगत है। अन्य न्यूक्लियस का उपयोग किया जा सकता है यदि किसी विशिष्ट पीएएम को लक्षित किया जाना है (जैसे कि सैकस 9 या सीपीएफ 1)18।

विभिन्न लेंटीवायरस को एक नियमित बीएसएल 2 संस्कृति कक्ष19 में उत्पादित किया जा सकता है या वायरस उत्पादन सुविधा या कंपनी से खरीदा जा सकता है। इस प्रोटोकॉल को लागू करने की आवश्यकता आणविक जीव विज्ञान और आणविक क्लोनिंग में विशेषज्ञता है, और चुने हुए सेल मॉडल की संवर्धन में है।

विभिन्न गाइडों को एन्कोड करने वाले लेंटिवायरस फ्लोरोसेंट प्रोटीन, एमचेरी को भी एन्कोड करते हैं। यह फ्लोरोसेंट प्रोटीन उपयोगी हो सकता है, एकल कोशिका क्लोनिंग के बजाय एफएसीएस द्वारा कोशिकाओं की स्वचालित छंटाई और क्लोनिंग की अनुमति देता है, और इस मामले में, एमचेरी की अभिव्यक्ति को एलवी-हत्यारे के साथ दबाया नहीं जाना चाहिए। यदि एमचेरी को बनाए रखना है, तो एमचेरी के खिलाफ दूसरी मार्गदर्शिका को पी-हत्यारे (चरण 2.7) में क्लोन नहीं किया जाना चाहिए। आरवाईआर 1 जीन के लिए, जैसा कि कार्यात्मक लक्षण वर्णन फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग करता है, और इस सेल लाइन के भविष्य के उपयोग के लिए फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोलेबलिंग की भी आवश्यकता हो सकती है, हमने एमचेरी अभिव्यक्ति को दबाने के लिए चुना है। एलवी-किलर में, जीआरएनए लक्ष्यीकरण कैस 9 को मूल प्लास्मिड में शुरू में मौजूद कमजोर प्रमोटर 7 एसके के बजाय एक मजबूत प्रमोटर एच 1 के तहत रखा गया है, ताकि सभी चयनित जीआरएनए पर न्यूक्लियस की समान दक्षता सुनिश्चित की जा सके, और एलवी-किलर को कोशिकाओं में जोड़े जाने के बाद कैस 9 दरार को बढ़ाया जा सके।

सबसे लंबा और सबसे ज़ोरदार कदम सिंगल सेल क्लोनिंग है। हमारी प्रक्रिया में, मांसपेशियों की कोशिकाओं ने कैस 9 के साथ लेंटिवायरल पारगमन के बाद कम वृद्धि प्रदर्शित की और कुछ हफ्तों के बाद ठीक हो गए। यदि वायरल ट्रांसडक्शन के बाद सिंगल सेल क्लोनिंग बहुत जल्दी की जाती है, तो शायद बड़े पैमाने पर कोशिका मृत्यु के कारण, 96-अच्छी तरह से प्लेट के केवल कुछ कुओं में बढ़ती कोशिकाएं होंगी। इस प्रकार, क्लोनिंग से पहले कोशिकाओं को बढ़ाना बेहतर होता है, और कम से कम 2-3 विभाजन की प्रतीक्षा करें। अच्छी तरह से कोशिकाओं को क्लोन करना भी संभव है यदि वे एकल कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से नहीं बढ़ते हैं। इसके अलावा, मायोब्लास्ट को हमेशा एक अच्छी भेदभाव क्षमता बनाए रखने के लिए 50% से नीचे संगम पर सुसंस्कृत किया जाना चाहिए।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था एसोसिएशन फ्रांसेस कॉन्ट्रालेस मायोपैथी (एएफएम-टेलेथॉन) और से औवेर्गने-रोन आल्प्स रेगियन (ऑरा)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-CACNA1S antibody Sigma-Aldrich HPA048892 Primary antibody
Blp I NE BioLabs R0585S Restriction enzyme
CalPhos Mammalian Transfection Kit Takara 631312  Transfection kit
Easy blot anti Mouse IgG GeneTex GTX221667-01 HRP secondary antibody
Easy blot anti Rabbit IgG GeneTex GTX221666 HRP secondary antibody
Fluo-4 direct Molecular Probes F10472 Calcium imaging
GAPDH(14C10) Rabbit mAb  Cell Signaling Technology #2118 Primary antibody
HindIII Fermentas ER0501 Restriction enzyme
InFusion HD Precision Plus Takara 638920 Ligation kit
MasterMix Phusion High Fidelity with GC ThermoFisher Scientific F532L Mix for PCR reaction with High fidelity Taq polymerase and dNTPs
Myosin Heavy Chain antibody DHSB MF20 Primary antibody
NucleoBond Xtra Maxi EF Macherey-Nagel REF 740424 Maxipreparation kit for purification of plasmids
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Macherey-Nagel 740609 DNA purification
NucleoSpin Tissue Macherey-Nagel 740952 Kit for DNA extraction from cell
One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli ThermoFisher Scientific C737303 Chemically competent cells
Plasmid #87904 Addgene 87904 Lentiviral plasmid encoding the SpCas9 (for LV-Cas9)
Plasmid #87919 Addgene 87919 Lentiviral backbone for insertion of cassette with guides (for LV-guide-target)
Plasmid #12260 Addgene 12260 Lentiviral plasmid encoding lentiviral packaging GAG POL
Plasmid #8454 Addgene 8454 Lentiviral plasmid encoding envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles
V5 Tag Monoclonal Antibody Invitrogene R96025  Primary antibody
XL10-Gold Ultracompetent Cells Agilent 200317 Chemically competent cells
Xma I NE BioLabs R0180S Restriction enzyme

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References

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आनुवंशिकी अंक 184
लेंटिवायरस-मध्यस्थता सीआरआईएसपीआर / कैस 9 जीन संपादन का उपयोग करके नॉक-आउट मांसपेशी सेल लाइनों का विकास
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Beaufils, M., Tourel, A., Petiot,… More

Beaufils, M., Tourel, A., Petiot, A., Halmai, N. B., Segal, D. J., Rendu, J., Marty, I. Development of Knock-Out Muscle Cell Lines using Lentivirus-Mediated CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (184), e64114, doi:10.3791/64114 (2022).

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