Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Udvikling af knock-out muskelcellelinjer ved hjælp af Lentivirus-medieret CRISPR / Cas9 genredigering

Published: June 16, 2022 doi: 10.3791/64114
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1, 1
1University Grenoble Alpes, INSERM, U1216, CHU Grenoble Alpes, Grenoble Institut Neurosciences, 2Genome Center, University of California, Davis

Summary

Protokollen beskriver, hvordan man genererer knock-out myoblaster ved hjælp af CRISPR/Cas9, startende fra design af guide-RNA'er til den cellulære kloning og karakterisering af knock-out klonerne.

Abstract

En vigtig anvendelse af clustered regulatory interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas 9 er udviklingen af knock-out cellelinjer, specifikt for at studere funktionen af nye gener/proteiner forbundet med en sygdom, identificeret under den genetiske diagnose. For udviklingen af sådanne cellelinjer skal to hovedspørgsmål løses: indsættelse af CRISPR-værktøjerne (Cas9 og guide RNA) med høj effektivitet i de valgte celler og begrænsning af Cas9-aktiviteten til den specifikke deletion af det valgte gen. Protokollen beskrevet her er dedikeret til indsættelse af CRISPR-værktøjerne i vanskelige at transfektere celler, såsom muskelceller. Denne protokol er baseret på brugen af lentivirus, produceret med plasmider offentligt tilgængelige, for hvilke alle kloningstrin er beskrevet for at målrette mod et gen af interesse. Kontrollen af Cas9-aktivitet er blevet udført ved hjælp af en tilpasning af et tidligere beskrevet system kaldet KamiCas9, hvor transduktionen af cellerne med et lentivirus, der koder for et guide-RNA rettet mod Cas9, muliggør progressiv afskaffelse af Cas9-ekspression. Denne protokol er blevet anvendt til udviklingen af en RYR1-knock out human muskelcellelinje, som er blevet yderligere karakteriseret på protein- og funktionsniveau, for at bekræfte knockout af denne vigtige calciumkanal involveret i muskel intracellulær calciumfrigivelse og i excitations-sammentrækningskobling. Den procedure, der er beskrevet her, kan let anvendes på andre gener i muskelceller eller i andre vanskelige at transfekte celler og producere værdifulde værktøjer til at studere disse gener i humane celler.

Introduction

Med udviklingen af gensekventering og identifikation af mutationer i gener af ukendte funktioner i et specifikt væv udgør udviklingen af relevante cellulære modeller til at forstå funktionen af et nyt målgen og bekræfte dets involvering i de relaterede patofysiologiske mekanismer et vigtigt redskab. Desuden er disse modeller af stor betydning for den fremtidige terapeutiske udvikling 1,2 og udgør et interessant alternativ til udviklingen af knock-out dyremodeller i lige linje med de internationale anbefalinger om reduktion af brugen af dyr til forsøg. Genredigering ved hjælp af CRISPR/Cas9 er blandt de mest kraftfulde værktøjer, der i øjeblikket er tilgængelige, hvilket har muliggjort udviklingen af mange knock-out/knock-in-modeller, og målrettet genvalidering ved hjælp af CRISPR/Cas9 er blandt de mest anvendte anvendelser af CRISPR/Cas93. Succesen med genredigering afhænger af evnen til at introducere CRISPR-værktøjerne (guide RNA'erne og nukleasen Cas9) i målcellemodellen, hvilket kan være en udfordring i mange vanskelige at transfekte celler, såsom muskelceller4. Denne udfordring kan overvindes ved brug af virus, normalt lentivirus, som har den store fordel at transducere effektivt mange celletyper og levere dets transgen. Men dens største ulempe er integrationen af transgenet i værtscellegenomet, hvilket fører til potentiel ændring af gener lokaliseret på integrationsstedet og til permanent ekspression af transgenet, hvilket i tilfælde af nukleasen Cas9 ville resultere i skadelige konsekvenser5. En smart løsning er blevet foreslået af Merienne og kolleger6, som består i introduktion i cellerne af et guide-RNA rettet mod selve Cas9-genet, hvilket fører til Cas9-inaktivering. En tilpasning af denne strategi præsenteres her som en brugervenlig og alsidig protokol, der gør det muligt at knock-out stort set ethvert gen i vanskelige at transfekte celler.

Målet med protokollen, der præsenteres her, er at inducere inaktivering af et gen af interesse i udødeliggjorte muskelceller. Det kan bruges til at knock-out ethvert gen af interesse, i forskellige typer udødeliggjorte celler. Protokollen beskrevet her indeholder trin til at designe guide RNA'erne og deres kloning til lentivirale plasmider, til at producere CRISPR-værktøjerne i lentivirale vektorer, til at transducere cellerne med de forskellige lentivirus og til at klone cellerne for at producere en homogen redigeret cellelinje.

Ved hjælp af denne protokol er udødeliggjorte humane skeletmuskelceller blevet udviklet med deletion af type 1 ryanodinreceptoren (RyR1), en essentiel calciumkanal involveret i intracellulær calciumfrigivelse og muskelkontraktion7. Knock-out (KO) af genet er blevet bekræftet på proteinniveau ved hjælp af Western blot og på det funktionelle niveau ved hjælp af calciumbilleddannelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Muskelbiopsier blev opnået fra Bank of Tissues for Research (Myobank, en partner i EU-netværket EuroBioBank, Paris, Frankrig) i overensstemmelse med europæiske anbefalinger og fransk lovgivning. Der blev indhentet skriftligt informeret samtykke fra alle personer. Udødeliggjorte myoblaster blev venligt produceret af Dr. V. Mouly (Myology Institute, Paris, Frankrig), og protokollerne blev godkendt af Myology Institute ethic Committee (MESRI, n AC-2019-3502).

1. CRISPR guide design

  1. Identificer det område af genet, der skal slettes. Søg efter dens genomiske sekvens ved hjælp af genombrowserværktøjer som ensembl.org eller genome.ucsc.edu og bestem de kromosomiske koordinater for de to regioner for at se efter guide-RNA (gRNA) på begge sider af regionen, der skal slettes.
    1. For det gen, der anvendes her, opnås FASTA-sekvensen af RYR1-genet og sekvensen af exon 101 som følger. I ensembl skal du søge RYR1 i den seneste version af det menneskelige genom, vælge den første post og klikke på transkriptet af proteinkodningssekvensen. Klik derefter på Exons for at omdirigere til listen over exoner af genet.
    2. Klik på Download sekvens , og vælg Kun genomisk sekvens for at downloade den fulde konsensussekvens for hele genet. Rul ned på listen over genets exoner og introner, og vælg den eller de målrettede.
    3. Find den tilsvarende nukleotidsekvens i genet. Vælg nukleotidsekvenserne for intronerne umiddelbart opstrøms og nedstrøms for den exon, der skal slettes, som vil blive brugt til at søge efter gRNA'erne.
  2. Design de to gRNA' er, kaldet guide 1 og guide 2 her, i de regioner, der er identificeret i trin 1.1 (introns opstrøms og nedstrøms den region, der skal slettes) ved hjælp af onlineværktøjer som Crispor.tefor.net8. Vælg de to gRNA'er adskilt af et par hundrede basepar (bp), idet sekvensen af hvert gRNA er nøjagtigt 20 nukleotider lange uden protospacer tilstødende motiv (PAM). Vælg de bedste guider, der er tilgængelige for at begrænse off-target. Se figur 1 for et eksempel på vejledningsdesign.
    1. Sekvensen mellem de to guider forventes at blive slettet, og at resultere i knock-out af genet af interesse, således vælge placeringen af de to guider, så den sletter en væsentlig sekvens eller en væsentlig exon i genet af interesse. Sørg for, at den slettede sekvens /exon ikke udelukkende er til stede i en alternativ transkription af genet, og / eller at den koder for en vigtig del af proteinet, så dets sletning vil resultere i en funktionel knock-out.
      BEMÆRK: Selvom Cas9-spaltningsstedet forudsiges at forekomme 3 bp opstrøms for protospacer tilstødende motiv (PAM), kan spaltning i større afstand også forekomme, så en god løsning er ikke at afhænge af den præcise lokalisering af spaltningsstedet, såsom spaltning i intron.
  3. Bestem den omvendte komplementsekvens (RC) for hvert gRNA uden PAM for at have følgende sekvenser: Guide 1 og Guide 1-RC, Guide 2 og Guide 2-RC.
  4. Bestil primerne præsenteret i tabel 1 for at udføre kloning af plasmiderne. I hele protokollen skal du bruge primere i en koncentration på 10 nM i sterilH2O.
    BEMÆRK: De sekvenser, der tilsættes gRNA'erne i disse primere (fed og understreget), svarer til sekvensen af plasmidet før og efter henholdsvis guide-, promotor- og transaktiverende Crispr RNA (tracrRNA) og bør ikke modificeres for at sikre en god overlapning mellem primerne og plasmidet.

2. Kloning af plasmider

BEMÆRK: I dette trin indsættes gRNA'erne i plasmidets rygrad til lentivirusproduktion. En kassette, der koder for de to gRNA'er, fremstilles først ved successive polymerasekædereaktioner (PCR) ved anvendelse af de overlappende primere. Den nye kassette indsættes derefter i lentiviral backbone plasmid #87919.

  1. Få følgende plasmider: plasmid #87919, kodning for CRISPR guide RNA'er i en lentiviral vektor og plasmid #87904 kodning for SpCas9-sekvensen i en lentiviral vektor.
  2. Kassette konstruktion
    BEMÆRK: Kloningsprotokollen er opsummeret i Figur 2.
    1. Kør en PCR (A) reaktion med 2 μL plasmid #87919, 2 μL primer_XmaIF, 2 μL primer_Guide1R, 25 μL polymeraseblanding og 19 μL H2O. Kør følgende PCR-program (program 1): indledende denaturering 5 min ved 98 °C, efterfulgt af 30 cyklusser på: 30 s ved 98 °C, 30 s ved 60 °C, 1 min. 45 s ved 72 °C og en endelig forlængelse på 7 min ved 72 °C. Tm for primerne beskrevet i trin 1.4 er 60 °C.
      BEMÆRK: Selvom forlængelsestiden i program 1 ser ret lang ud, er denne forlængelsestid valgt for at sikre produktion af nok materiale i den rigtige størrelse. På grund af de gentagne sekvenser i plasmidet (sekvensen af tracrRNA efter RNA-guider gentages tre gange i plasmid #87919) er PCR-amplifikationen af det forventede DNA vanskelig, og yderligere mindre bånd produceres i de successive PCR'er. På grund af konkurrencen mellem de forskellige PCR-produkter er enten forlængelsestiden således blevet øget (for at favorisere den længste og for at have nok renset materiale i slutningen), eller der er brugt en touch down PCR (program 2) til det lange fragment (som beskrevet for PCR (endelig) i trin 2.2.6).
    2. Adskil PCR-produkterne på en 1% agarosegel i Tris-Borate-EDTA-buffer (TBE), punktafgift og rens 300 bp-fragmentet. Rensningen udføres ved hjælp af et særligt sæt, der følger fabrikantens anvisninger, med eluering i et slutvolumen på 20 μL. Brug enten det rensede fragment direkte eller opbevar ved -20 °C i trin 2.2.5.
    3. Kør en PCR (B) reaktion med 2 μL plasmid #87919, 2 μL primer_Guide1F, 2 μL primer_Guide2R, 25 μL polymeraseblanding og 19 μLH2O ved hjælp af PCR-programmet 1. PCR-produkterne adskilles på en 1% agarosegel i TBE, punktafgifter og renser 400 bp-fragmentet i 20 μL elueringsbuffer. Det rensede fragment anvendes enten direkte, eller det opbevares ved -20 °C i trin 2.2.5.
    4. Kør en PCR (C) reaktion med 2 μL plasmid #87919, 2 μL primer_Guide2F, 2 μL primer_BlpIR, 25 μL polymeraseblanding og 19 μLH2O ved hjælp af PCR-program 1. Adskil PCR-produkterne på en 1% agarosegel i TBE-buffer. Punktafgift og rensning af 600 bp fragmentet i 20 μL elueringsbuffer. Det rensede fragment anvendes enten direkte, eller det opbevares ved -20 °C i trin 2.2.6.
      BEMÆRK: Et andet fragment ved 900 bp kan være synligt på grund af hybridisering af primeren på de gentagne områder i plasmidet som beskrevet i NOTE i trin 2.2.1. Hvis det er til stede, skal dette bånd kasseres.
    5. Der køres en PCR(D)-reaktion med 2 μL eluering PCR A (fra trin 2.2.2), 2 μL eluering PCR B (fra trin 2.2.3), 2 μL primer_XmaIF, 2 μL primer_Guide2R, 25 μL polymeraseblanding og 19 μLH2O med PCR-program 1. Adskil PCR-produkterne på en 1% agarosegel i TBE-buffer; punktafgift og rense 700 bp fragmentet i 20 μL elueringsbuffer. Det rensede fragment anvendes enten direkte, eller det opbevares ved -20 °C i trin 2.2.6.
      BEMÆRK: Andre bånd kan være synlige ved >1.000 bp, 400 bp og 300 bp på grund af hybridisering af primerne på de gentagne regioner og bør kasseres.
    6. Der gennemføres en PCR-reaktion (endelig) med 4 μL eluerings-PCR C (fra trin 2.2.4), 4 μL eluerings-PCR D (fra trin 2.2.5), 4 μL primer_XmaIF, 4 μL primer_BlpIR, 50 μL polymeraseblanding og 34 μLH2O. Det anvendte program er følgende (PCR-program 2): indledende denaturering i 5 minutter ved 98 °C; seks cyklusser på: 30 s ved 98 °C, 30 s ved 66 °C (reduktion i hybridiseringstemperaturen på 1 °C pr. cyklus), 1 min. 45 ved 72 °C 35 cyklusser på: 30 s ved 98 °C, 30 s ved 60 °C, 1 min. 45 ved 72 °C og en endelig forlængelse på 5 minutter ved 72 °C.
      BEMÆRK: PCR-programmet til denne endelige forstærkning er en touch down PCR, forskellig fra den foregående, på grund af den store størrelse af den endelige forstærkning, der indeholder to gentagne tracrRNA-sekvenser lige efter hver guide.
    7. Adskil PCR-produkterne på en 1% agarosegel i TBE-buffer; punktafgift og rense den endelige kassette, som migrerer ved ca. 1.300 bp i 20 μL elueringsbuffer. Kvantificer det eluterede produkt. Det rensede fragment anvendes enten direkte, eller det opbevares ved -20 °C i trin 2.3.2.1. Dette er det endelige produkt, der vil blive indsat i det lentivirale plasmid.
      BEMÆRK: Andre fragmenter kan være synlige ved >1000 bp, 400 bp og 300 bp, svarende til ufuldstændige PCR-fragmenter, som bør kasseres.
  3. Indsættelse af gRNA-kassetten i lentiviral plasmid-rygraden.
    1. Lineariser plasmidet ved dobbelt fordøjelse af plasmid #87919 med restriktionsenzymerne XmaI og BlpI.
      1. Reaktionen forberedes med 15 μL anbefalet buffer, 15 μL plasmid (1μg/μL), 7,5 μL BlpI-enzym (ved 10 U/μL), 7,5 μL XmaI-enzym (ved 10 U/μL) og 112,5 μLH2O. Inkuberes i 1 time ved 37 °C og derefter i 20 minutter ved 65 °C. Læg den samlede mængde på en 1% agarosegel, skær ud og rens ~ 10 kb plasmidet med et passende sæt. Eluering udføres i 20 μL buffer, og det eluterede produkt kvantificeres ved hjælp af optisk densitetsmåling.
        BEMÆRK: Brug en passende oprensningsprotokol til stort DNA-fragment, såsom protokollen beskrevet af Sun og coll9.
    2. Ligat gRNA-kassetten og plasmidet. Reaktionsblandingen med gRNA-kassette fra trin 2.2.7 og det lineariserede plasmid fra trin 2.3.1.1 tilsættes 2 μL enzym ogH2Ofor at have et endeligt volumen på 10 μL. Inkuberes i 15 minutter ved 50 °C for at fremstille det endelige plasmid kaldet p_guides.
      BEMÆRK: DNA-kassettemængden skal være mellem 50-100 ng og plasmidmængden mellem 100-200 ng med et 2: 1 molforhold.
  4. Der anvendes 2 μL af det frisklavede plasmid til omdannelse af kemisk kompetente E.Coli såsom Stbl3 (50 μL) eller XL10-Guld og spredes på LB-agarpladen med 100 μg/ml ampicillin efter 1 times vækst ved 37 °C uden antibiotika. Inkuberes ved 37 °C natten over. Vælg et par kolonier og udfør en mini prep ved hjælp af et kommercielt sæt efter producentens anvisninger.
  5. Udfør en PCR-forstærkning på miniprep-DNA'et med Primer_XmaI og Primer_BlpR ved hjælp af PCR-program 1 (se figur 2). Adskil PCR-produkterne på en 1% agarosegel i TBE-buffer. Vælg et par kolonier (~ 5) med et bånd i den forventede størrelse på ca. 1300 bp.
  6. Udfør DNA-sekventering af de valgte kolonier ved hjælp af Primer_XmaI eller Primer_BlpR for at bekræfte den korrekte indsættelse af gRNA-kassetten.
    BEMÆRK: En af de sekvensverificerede kolonier anvendes yderligere i undersøgelsen, og plasmidet kaldes p_guides.
  7. Gentag fra trin 2.2 (kassettekonstruktion) med Primers-Killer F og R, og Primers-mCherry F og R. Brug en sekvensverificeret koloni til yderligere analyse. Plasmidet kaldes p_Killer.

3. Lentivirus produktion

  1. Fremstil og rens en stor mængde af alle de nødvendige plasmider ved hjælp af et endotoksinfrit maxi-prep-kit efter producentens anvisninger. Aliquoter fremstilles ved 2 μg/μL. Opbevares ved -20 °C
  2. Forberedelse af celler (dag 1)
    1. Forbered 18 plader på 145 cm podet med 1 x 106 HEK293 celler pr. plade i 16 ml medium sammensat af Dulbeccos modificerede eagle medium (DMEM) højt glucosepyruvat, suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin. Cellerne forstærkes ved 37 °C i en 5% CO2-inkubator i 3 dage.
      BEMÆRK: Produktion af lentivirus skal udføres med forsigtighed i et biosikkerhedsniveau 2-laboratorium ved hjælp af tilpassede beskyttelsesudstyr, herunder engangsbeskyttelsesdragt, beskyttelseshætte og handsker. Alle eksperimenter skal udføres under en laminær flowhætte (BSLII sikkerhedsskab) med filterspidser. Al opløsning indeholdende lentivirus og alt brugt plast/glasaffald skal inaktiveres med ethanol 70 % eller anden virusinaktivator.
  3. Transfektion af celler (dag 4)
    1. Kontroller sammenløbet af cellerne for at være sikker på, at de har nået 60% -65% sammenløb.
    2. Transfektionsopløsningen indeholdende for hver plade: 20,8 μg af plasmidet af interesse (p-guider eller p-Killer eller pCas9 #87904), 4,8 μg af plasmidet, der koder for konvolutten (VSV-G, # 8454), 20,8 μg af plasmidet psPAX2 (# 12260) til lentiviral emballage, 136 μL calciumphosphat og juster medH2O til et endeligt volumen på 1.000 μL. Tilsæt denne opløsning dråbevis og under omrøring til 1 ml 2x HEPES-bufferet saltvand (HBS).
      BEMÆRK: Forbered ikke en blanding til alle pladerne på samme tid for at sikre en optimal forberedelse af reagenser; forbered en blanding til seks plader på samme tid, f.eks. til 18 plader, forbered tre gange en blanding til seks plader.
    3. Inkuberes ved stuetemperatur (RT) i mindst 10 minutter, og der tilsættes 2 ml opløsning dråbevis til cellerne. Transfektionsreagensen homogeniseres med skånsom omrøring af pladen bagud, fremad, op og ned, inkuberes ved 37 °C, 5 % CO2 i mindst 5 timer.
      BEMÆRK: Fra dette tidspunkt og indtil slutningen af produktionen af lentivirus skal du bære ekstra beskyttelsesudstyr, herunder et andet par handsker, beskyttelsesærmer og en engangsplastron.
    4. Fem timer efter transfektionen fjernes mediet fra pladerne og skylles med PBS for at slippe af med transfektionsreagenser. Der tilsættes 12 ml frisk medium, og der inkuberes 48 timer ved 37 °C, 5 % CO2.
  4. Indsamling af viruspartiklerne (dag 6)
    1. Saml og pool mediet fra alle pladerne. Centrifuger ved 800 x g i 5 minutter ved 4 °C for at pelletere celleaffald. Supernatanten filtreres ved hjælp af et filter på 0,45 μm (der kræves flere filtre).
    2. Centrifuger ved 68.300 x g i 2 timer ved 4 °C i en svingende skovlrotor. Fjern supernatanten, og lad rørene vende på hovedet under sikkerhedsskabet på et papir i 5-10 minutter for at fjerne så meget væske som muligt, og tilsæt derefter 100 μL HEK-spredningsmedium pr. Pellet. Efter mindst 2 timer ved 4 °C genoplives pellets ved at pipettere op og ned. Pool alle de resuspended pellets.
      BEMÆRK: Pellets kan efterlades i mediet natten over ved 4 ° C inden aliquoting.
    3. Aliquot lentivirus i 10 μL eller 25 μL prøvestørrelse (afhængigt af brugen) og snap-freeze med flydende nitrogen. Opbevares ved -80 °C. Frys ikke en aliquot, der er optøet.
  5. Trin 3.2 til 3.4 gentages med andre plasmider af interesse for at fremstille LV-guider, LV-Killer og LV-Cas9.
    BEMÆRK: Som et alternativ kan lentivirus købes fra et firma eller et virusanlæg.

4. Lentivirus titrering

BEMÆRK: Virustitreringen udføres på HEK293-celler. Titreringen er vigtig for i de efterfølgende trin at inkorporere et præcist antal lentivirus pr. celle (uanset batch af lentivirus) for cellerne af interesse. Antallet af virale partikler, der effektivt transducerer en celle, kaldes multiplikationen af infektion (MOI): MOI 10 svarer således til indførelsen af 10 virale partikler pr. Celle. Da fryse-/optøningscyklussen påvirker lentivirusets levedygtighed, udføres titreringen med en frossen lentivirus-aliquot, og hvert efterfølgende forsøg udføres med en ny aliquot af samme pool. En titreringsmetode er beskrevet her, men andre metoder kan anvendes.

  1. På dag 1 frøs 1 x 105 celler pr. plade i fem 35 mm plader med glasdæksler i bunden og to 35 mm plader uden dæksler.
  2. På dag 2, fra de to plader uden dækslips, indsamle og tælle antallet af celler efter trypsinisering, og bestemme den gennemsnitlige mængde celler pr. Plade (N).
  3. 100 μL lentivirus fortyndet ved 1/10 i proliferationsmedium fremstilles. De fem dyrkede plader transduceres med forskellige mængder fortyndet virus, fra 1 til 50 μL fortyndet virus. Til denne protokol skal du bruge følgende volumener til at transducere de fem plader: 1 μL, 5 μL, 10 μL, 20 μL, 50 μL. Inkuberes i 48 timer ved 37 ° C i en 5% CO2.
  4. På dag 4 fikseres cellerne ved inkubation af dækslerne ved RT i 20 til 30 minutter i 4% paraformaldehyd. For LV-Cas9 permeabiliseres cellerne med 0,1% Triton X100 i fosfatbuffersalin (PBS) i 10 minutter ved RT, mættes i PBS-0,1% Triton X100-2% Gedeserum- 0,5% Bovint Serumalbumin (BSA) i 20 minutter ved RT og mærkes i 45 minutter ved RT med primært antistof anti-V5 (fortynding 1/400) efterfulgt af 30 minutters inkubation ved RT med fluorescerende sekundært antistof. Mærk kernerne med Hoescht (10 μg/ml i PBS) i 10 min ved RT.
  5. Monter dækslerne på et dias og observer ved hjælp af et fluorescerende mikroskop udstyret med et 20x mål. For LV-guider og LV-Killer fortsætter efter fiksering direkte til kernemærkningen og monterer dækslerne. For hver dækslip skal du tælle det samlede antal kerner (det samlede antal celler) i synsfeltet og antallet af celler mærket (enten med V5 eller mCherry) og bestemme forholdet mellem celler mærket for hver coverslip.
  6. Vælg en coverslip, hvor forholdet mellem transducerede celler er mindst 10% og ikke overstiger 50%. Bestem transduktionseffektiviteten (X) for denne dækslip, og bemærk mængden af fortyndet virus (V, i μL), der anvendes til at opnå denne transduktionseffektivitet.
    Equation 1
  7. Bestem titeren (i infektiøse partikler, repræsenteret som ip / ml) af virussen i henhold til følgende formel:
    Equation 2
    Fortyndingsfaktoren er fortyndingen af lentivirus udført i trin 4.3. Vi opnåede rutinemæssigt en endelig titer på 1 x 109 ip / ml for LV-Cas9 og 1 x 1010 ip / ml for LV-guide, bestemt i HEK-celler.

5. Myoblast transduktion

BEMÆRK: De udødeliggjorte myoblaster transduceres successivt med de tre lentivirus, der tidligere er produceret. De opretholdes ved en densitet under 50% i et proliferationsmedium sammensat af skinkes F10 suppleret med 20% FBS, 2% penicillin / streptomycin, 2% Ultroser G og dyrket ved 37 ° C, 5% CO2.

  1. Bestem mængden af lentivirus, der er nødvendig for at behandle det valgte antal celler med MOI 10 for LV-Cas9 og LV-guider og MOI 20 for LV-killer, ifølge følgende formel:
    Equation 3
    BEMÆRK: I et parallelt eksperiment er transduktionseffektiviteten blevet sammenlignet på myoblaster og HEK ved hjælp af et kontrol lentivirus (lenti-GFP), og vi har fastslået, at der er behov for fem gange flere lentivirus for at transducere en myoblast effektivt sammenlignet med en HEK-celle. SÅLEDES svarer MOI 10 målt på HEK til to virale partikler pr. Myoblast. Den MOI, der bruges her, beregnes på HEK-celler.
  2. På dag 1 frø 96-brønd plader med 10.000 celler i 100 μL proliferationsmedium pr. Brønd. På dag 2 transduceres cellerne under sikkerhedsskabet ved at tilsætte det passende volumen af LV-guider og LV-Cas9 beregnet i trin 5.1. Returner cellerne til inkubatoren indtil dag 7.
    BEMÆRK: Brugen af MOI højere end 25, især for LV-Cas9, kan ikke forbedre antallet af redigerede celler på grund af højere celledød ved en høj koncentration af lentivirus.
  3. På dag 7 skal du udføre trypsinisering og tælle cellerne. Frø cellerne ved en sammenløb på 40% til 50% i en ny plade og returner cellerne til inkubatoren. Fem timer senere transducer cellerne med LV-Killer ved en MOI på 20 (volumen beregnet i trin 5.1). Forstærk cellerne i 5 til 10 dage efter transfektion i mindst to passager, og hold dem altid ved en lav sammenløb på <50%. Cellerne er klar til næste trin, cellulær kloning, når deres vækst vender tilbage til normal (estimeret af delingstiden).
    BEMÆRK: Spredningen kan være lidt langsommere efter transduktionen. Den normale cellevækst kan bestemmes før denne eksperimentelle procedure ved estimering af cellernes delingstid.

6. Cellulær kloning

BEMÆRK: Da myoblasttransduktion er vanskelig og aldrig når 100% effektivitet, selv når du bruger lentivirus, kræves cellulær kloning for at få en fuldt korrigeret cellelinje. Dette er kun muligt med udødeliggjorte celler eller celler, der kan dyrkes og forstærkes i løbet af få uger / måneder.

  1. Trypsinize og tæl cellerne. Fortynd cellerne i proliferationsmedium ved 10 celler / ml og frø cellerne ved 1 celle / brønd i 96-brøndplader indeholdende 100 μL / brønd medium.
    BEMÆRK: Antallet af plader, der skal sås, afhænger af sandsynligheden for den forventede genredigering, 2 til 10 plader anvendes rutinemæssigt.
  2. Overvåg cellerne for vækst og gradvist forstærke hver brønd i en større plade, indtil de når mindst en 35 mm plade, samtidig med at myoblasternes sammenløb holdes under 50%. Dette trin kan vare 2-6 uger, afhængigt af de anvendte celler og deres evne til at vokse, når de er isoleret i en brønd.

7. Valg af klon

BEMÆRK: Dette trin udføres for at identificere, hvilke af de voksende kloner der er blevet ændret korrekt.

  1. Design et sæt primere sammensat af en primer placeret før den første guide (Primer_BeforeGuide1F) og en anden primer placeret efter den anden guide (Primer_AfterGuide2R) for at forstærke regionen, der omslutter den formodede modificerede sekvens. Se tabel 1 for de anvendte primere her.
  2. Saml celler fra hver klon, spar mindst 300.000 celler til fremtidig forstærkning, og ekstraher genomisk DNA ved hjælp af en hvilken som helst standardprotokol på de resterende celler.
    1. Hvis et stort antal kloner vokser, for at kassere de ikke-redigerede, skal du udføre en hurtig test ved at samle celler fra fem kloner i det samme rør for at udtrække DNA'et fra denne pool og teste med PCR. Gentag med så mange kloner som nødvendigt. Derefter adskilles yderligere de puljer, der indeholdt redigerede celler for at udføre individuel analyse.
  3. Kontroller redigeringen af PCR som følger. Forbered PCR-reaktionen med 1 μL Primer_BeforeGuide1F, 1 μL Primer_AfterGuide2R, 12,5 μL polymeraseblanding, 3 μL genomisk DNA og 7,5 μLH2O. Amplify i en termocycler i henhold til producentens instruktioner og primerparametre. Kør på en 1% agarosegel for at identificere de redigerede kloner.
  4. Kontroller redigeringen ved at sekventere som følger. Udfør Sanger-sekventering af de valgte kloner for at bekræfte sletningen og for at identificere, hvordan redigeringen er udført i hver klon. Opbevar mere end én redigeret klon for at sikre, at kun det målrettede gen er blevet modificeret og er ansvarlig for den observerede fysiologiske effekt, og opbevar en ikke-redigeret klon, der vil blive brugt som en kontrolklon (CTRL) i de efterfølgende eksperimenter.
  5. Udvid de valgte kloner. Når sammenløbet af hver klon har nået ca. 50%, skal du prøve cellerne og plade cellerne i en større skål, indtil der er produceret nok celler til at udføre de biokemiske og funktionelle karakteriseringer (normalt mere end 1 x 106 pr. Klon) og opbevare frosne aliquoter af hver klon til fremtidig brug.

8. Karakterisering af redigerede kloner

BEMÆRK: Når nogle få kloner er blevet plukket og bekræftet ved DNA-sekventering, kan sletningen af det målrettede gen bekræftes på proteinniveau ved hjælp af Western blot og på funktionsniveau, hvis der er et funktionelt cellulært assay tilgængeligt for dette gen. I tilfælde af RYR1-KO, da RyR1 er en calciumkanal, er den funktionelle karakterisering blevet udført ved anvendelse af calciumbilleddannelse på dyrkede celler.

  1. Proteinekspression i redigerede kloner
    BEMÆRK: RyR1 udtrykkes kun i differentierede myotubes10. Dens udtryk er blevet evalueret i myotubes ved hjælp af Western blot for at bekræfte deletionen på proteinniveauet af RyR1 samt sletningen af Cas9-proteinet.
    1. Plade 200.000 celler i proliferationsmedium (beskrevet ovenfor, trin 5) på en overflade på ca. 1,76 cm2 i en 35 mm plade belagt med laminin (overflade svarende til en 200 μL dråbe laminin ved 10 mg/ml i PBS med calcium). Når cellerne sidder fast på pladen efter at være blevet inkuberet i 2-3 timer ved 37 °C, 5% CO2, skal dyrkningsmediet skiftes til et differentieringsmedium sammensat af DMEM lav glucose + 10% hesteserum + 1% penicillin / streptomycin og returnere cellerne til inkubatoren i 6 dage.
    2. Efter 6 dages differentiering opsamles og lyser cellerne med 200 μL RIPA suppleret med proteasehæmmere. Bestem proteinkoncentrationen ved hjælp af Folin Lowry-metoden11.
    3. Der hældes 15 μg protein efter denaturering i 30 min ved RT i Laemmli denatureringsbuffer på en 5%-15% gradientacrylamidgel. Efter elektroforetisk adskillelse overføres proteinerne på Immobilon P ved 0,8 V til 4 h11.
    4. Efter mætning af membranen i 30 minutter ved RT i PBS indeholdende 0,1% Tween 20 og 5% Fedtfri tørmælk inkuberes membranen med de primære antistoffer fortyndet i samme buffer i 2 timer ved RT eller natten over ved 4 °C, membranen vaskes 5x i 5 min med PBS-0,1% Tween 20 og membranen inkuberes med de sekundære antistoffer i 1 time ved RT. De primære antistoffer, der anvendes, er: antistoffer mod V5-tag (fortynding: 1/5000) til påvisning af Cas9, anti-GAPDH (fortynding: 1/1000) som belastningskontrol, anti-RyR1-antistof12,13 (fortynding: 1/10.000), antistof mod alfa 1-underenheden af DHPR (fortynding: 1/1000) og antistof mod myosintungkæde MF20 (fortynding: 1/1000).
    5. Membranen vaskes 5x i 5 minutter med PBS-0,1% Tween 20, tør væskeoverskuddet og tilsæt det kemiluminescerende substrat. Fortsæt som anbefalet af substratudbyderen for at detektere det kemiluminescerende signal.
  2. Funktionel karakterisering af redigerede kloner
    BEMÆRK: Funktionen af RyR1 blev vurderet ved hjælp af calciumbilleddannelse i differentierede myotubes, fremstillet af CTRL- eller KO-kloner14.
    1. Plade 50.000 celler på en 0,2 cm2 overflade i midten af 35 mm fade belagt med laminin (overflade dækket af en 50 μL laminin dråbe, ved 10 mg / ml i PBS med calcium) og inducere differentiering i 6 dage som beskrevet i trin 8.1.1. Forbered tre plader til hver stimulering for at få et biologisk tredobling.
    2. Myorørene fyldes med 50 μL fluo 4-direkte, fortyndet 1:1 i differentieringsmedium og inkuberes i 30 minutter ved 37 °C. Skyl cellerne to gange med KREBS buffer suppleret med glucose ved 1 mg/ml.
    3. Mål fluorescensvariationerne med et omvendt fluorescerende mikroskop eller et konfokalt mikroskop ved hjælp af et 10x mål. Installer pladen på mikroskopets scene og start erhvervelsen med 1 ramme pr. Sekund i 90 s.
    4. Fjern de resterende KREBS og stimuler cellerne ved ramme 25 ved tilsætning af 2 ml KCl til membrandepolarisering (140 mM slutkoncentration) eller 2 ml 4 CmC (500 μM slutkoncentration) til RyR1 direkte stimulering. Sørg for, at mindst 10 myotubes er til stede i det registrerede felt.
    5. Kvantificer fluorescensvariationen i hver myotube ved hjælp af en dedikeret software. Vælg til analyse mindst 10 myotubes pr. skål (ideelt 20-30 myotubes pr. Skål), tegn en linje (eller en interesseregion (ROI)) på den lange akse af hver myotube og saml fluorescensen F langs denne linje for alle rammerne.
    6. Bestem den oprindelige fluorescerende værdi, F0, svarende til rammer 1 til 24. Den fluorescerende variation (F-F0)/F0 afbildes som funktion af tiden fra 0 til 90 s. Gentag eksperimentet tre gange for at opnå fluorescensvariationen fra mindst 90 myotubes fra tre forskellige kulturer. Saml alle resultaterne for de 90 myotubes, og beregn den gennemsnitlige ± SEM på (F-F0)/F0 ved hver tidsramme. Kvantificer den maksimale amplitude af calciumfrigivelse for hver stimulering og hver klon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokol blev anvendt på udødeliggjorte myoblaster fra et sundt emne15 (såkaldte HM-celler til humane myoblaster), hvor RyR1 tidligere er blevet karakteriseret16, for at slå RYR1-genet ud, der koder for RyR1-proteinet. Designet af guiderne RNA blev lavet til at slette sekvensen, der omfatter en del af exon 101 og intron 101 af genet. Sletning af en del af exon 101 forventes at resultere i forstyrrelse af læserammen. Derudover koder exon 101 for proteinets pore og er således forpligtet til at producere en funktionel calciumkanal. Mange patienter, der er ramt af en alvorlig RyR1-relateret myopati, har en mutation i denne region af genet7. De bedste guider forudsagt med Crispor-software blev valgt for at have så få off-targets som muligt, samtidig med at den bedste effektivitet blev bevaret. Vi valgte at bruge to guider på samme tid i den samme virale vektor for at sikre, at en stor del af cellerne vil blive knock-out, og for at lette detektionen af sletningen i redigerede kloner ved hjælp af PCR. De to udvalgte hjælpelinjer (se tabel 2 og figur 1) er lokaliseret henholdsvis i slutningen af exon 101 og i begyndelsen af intron 101, hvilket resulterer i en sletning på 326 bp og en efterfølgende frameshift. Dette sikrer, at de redigerede celler vil være RYR1-KO.

GRNA'et rettet mod SpCas9 var det, der allerede var designet af Merienne og kolleger6 og til stede i plasmid #87919 under den svage promotor 7SK. Da dens effektivitet til at målrette SpCas9-sekvensen allerede er blevet demonstreret i deres undersøgelse6, er den blevet brugt til at skabe plasmidet p_Killer, men under kontrol af den stærke promotor H1. Den anden guide i p_Killer plasmid er designet til at målrette mCherry-sekvensen under promotoren U6. Dette vil tillade sletning af mCherry, hvilket kan være forstyrrende i nogle efterfølgende eksperimenter med den nyoprettede cellelinje.

Plasmider p_guides og p_killer blev oprettet, og alle de nødvendige lentivirus blev produceret i det dedikerede BSL2 kulturrum. Efter myoblaststransduktion blev cellerne dyrket i 2 uger indtil vækstgendannelse og analyseret ved hjælp af PCR for at bekræfte tilstedeværelsen af redigerede celler. Til cellulær kloning blev to 96-brøndplader podet med behandlede celler ved 1 celle pr. Brønd. Cellevækst blev observeret i 32% af dyrkede brønde. Genomisk DNA blev derefter ekstraheret fra klonerne, og PCR-analyse blev udført, indtil to korrigerede kloner blev identificeret (såkaldte Cl-KOR-1 og Cl-KOR-2), se figur 3. Sletningen af den målrettede del af RYR1 blev bekræftet af Sanger-sekventering. Yderligere kontrolceller er blevet brugt, såsom de oprindelige HM-celler eller HM-celler behandlet med den samme procedure, men ikke-redigeret som bekræftet af PCR og sekventering (Cl-CTRL). Udvalgte kloner blev derefter forstærket og yderligere karakteriseret på proteinniveau og funktionsniveau.

For at validere den fuldstændige udryddelse af RyR1 og Cas9 på proteinniveau blev Western blot-analyse udført. Resultaterne fremgår af figur 4. Cas9-proteinet, der var fraværende i HM-cellerne, blev detekteret 5 dage efter transduktionen af cellerne med LV-Cas9 (HM + LV-Cas9), og som forventet blev dets ekspression afskaffet i Cl-CTRL og i den redigerede Cl-KOR-1 og Cl-KOR-2, selvom en lille mængde Cas9 stadig blev påvist i Cl-KOR-2 (figur 3A). Da gRNA-målretningen mod Cas9 stadig udtrykkes, forventes mængden af resterende Cas9 gradvist at forsvinde. Ekspressionen af andre vigtige proteiner blev også vurderet ved hjælp af Western blot: RyR1, for at bekræfte den fulde sletning af proteinet, alfa1-underenheden af DHPR, som er den funktionelle partner for RyR1 involveret i excitations-sammentrækningskobling, og myosin-tungkæden som en differentieringsmarkør, fordi RyR1 og DHPR kun udtrykkes i differentierede myorør (figur 3B ). DHPR og MYHC skal ikke ændres. Selvom Western blot bekræftede fuldstændig sletning af RyR1 i de to RyR1-KO-kloner (Cl-KOR-1 og Cl-KOR-2), kan yderligere ændringer - som følge af Cas9 eller fra kloningsproceduren - have fundet sted i Cl-KOR-2, som desuden præsenterede et fravær af DHPR og en reduktion i myosin tung kæde (MHC). Da begge proteiner kun udtrykkes i differentierede myorør, afspejler deres fravær sandsynligvis ændring i differentiering, som muligvis kan stamme fra den lange enkeltcellekloningsprocedure forbundet med en lokal overvækst af cellerne, der fører til det tabte i deres myogene potentiale. Således er kun Cl-KOR-1 blevet yderligere karakteriseret på funktionsniveauet. Dette viser, at udvælgelse af adskillige redigerede kloner er vigtig for at kunne arbejde med den eller de bedste.

Den funktionelle karakterisering blev udført ved hjælp af calciumbilleddannelse. Den gennemsnitlige fluorescensvariation som funktion af tiden er repræsenteret på figur 5 på mindst 180 myorør af hver genotype ved anvendelse af enten en direkte RyR1-stimulering ved 4-CMC eller stimulering af calciumfrigivelseskomplekset (DHPR forbundet med RyR1) ved KCl-membrandepolarisering.

Disse eksperimenter viste, at den ikke-modificerede Cl-CTRL havde en adfærd, der kunne sammenlignes med den oprindelige cellepopulation (HM-celler) og reagerede på direkte RyR1-stimulering ved sin aktivator 4-CmC og ved stimulering af calciumfrigivelseskomplekset ved membrandepolarisering. I modsætning hertil var den redigerede Cl-KOR-1 ikke i stand til at reagere på nogen af stimuleringerne (4-CmC og KCl depolarisering), som forventet for en RyR1-KO.

Alt i alt bekræftede Western blot og den funktionelle karakterisering, at Cl-KOR-1-cellelinjen er en RyR1-KO muskelcellelinje. Denne protokol kan anvendes på ethvert andet gen udtrykt i skeletmuskulatur eller anden celletype (såsom inducerede pluripotente stamceller - iPSC). Den komplette protokol er illustreret i figur 6.

Figure 1
Figur 1: Lokalisering og design af guiderne RNA. (A) Skematisk lokalisering af hjælpelinjerne designet til oprettelse af RYR1-KO-cellelinjen. Guide 1 er rettet mod slutningen af exon 101 i RYR1-genet , Guide 2 er rettet mod intron 101, hvilket skaber en sletning på 326 bp og en frameshift. Guide Killer retter sig mod initieringskorddonet i sekvensen af SpCas9, Guide mCherry retter sig mod slutningen af mCherry-sekvensen. (B) Lokalisering af guiderne i de genomiske sekvenser for den tidligere beskrevne Guide 1, Guide 2, Guide killer og Guide mCherry. Sekvensen af hver guide (20 bp i længden) er præsenteret i farve, og PAM for hver guide er fed og understreget. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Kloningsprocedure til fremstilling af kassetten. Skematisk præsentation af de forskellige PCR udført for at producere kassetterne med styrene, der skal indsættes i lentivirus backbone plasmid. PCR A, PCR B, PCR C og PCR D realiseres med program 1 illustreret øverst til højre og PCR-finale med PCR-program 2, illustreret nederst til højre. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Udvælgelse af klonerne ved hjælp af PCR. (A) Skematisk præsentation af PCR-forstærkningen af et 1.200 bp-område, der omfatter styrene, med fremadgående og omvendte primere repræsenteret af de grå pile. DNA-spaltning ved begge guider forventes at resultere i en reduktion på 326 bp i størrelsen af PCR-fragmentet, som afbildet af de stiplede grønne lodrette linjer under saksen. (B) PCR-produkter fremstillet af HM-celler, Cl-CTRL, Cl-KOR-1 og Cl-KOR-2 blev indlæst på en 1% agarosegel. DNA'et fra HM og Cl-CTRL ser ud til at være ikke modificeret (fuld længde), mens DNA'et fra Cl-KOR-1 og Cl-KOR-2 er kortere end kontrollen, som forventet (spaltet). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Karakterisering af cellerne på proteinniveau. (A) Western blot-analyse for tilstedeværelsen af Cas 9-protein ved hjælp af V5-mærket i HM-celler, HM-celler transduceret med LV-Cas9, Cl-CTRL, Cl-KOR-1 og Cl-KOR-2. Cas9 detekteres tydeligt i HM-cellerne transduceret med LV-Cas9, mens dets udtryk er blevet afskaffet fuldstændigt (i Cl-CTRL og Cl-KOR-1) eller næsten fuldstændigt (i Cl-KOR-2) af LV-Killer. (B) Ekspression af RyR1, Myosin heavy chain (MYHC), alpha1-underenhed af DHPR og GAPDH som belastningskontrol i Cl-CTRL, Cl-KOR-1 og Cl-KOR-2. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Funktionel karakterisering af cellerne. Fluo-4 calciumbilleddannelse udført på myotubes fremstillet af HM-celler, Cl-CTRL og Cl-KOR-1. Kurverne repræsenterer fluorescensvariationen i HM myotubes (sorte kurver), Cl-CTRL myotubes (grå kurver) eller Cl-KOR-1 (grønne kurver). Alle værdier præsenteres som middelværdi ± standardfejl af middelværdi (SEM) af n myotubes. I hver tilstand er n = 180 til 256 myotubes blevet analyseret fra mindst tre forskellige eksperimenter (nøjagtigt antal angivet for hver kurve). 4 CmC (500 μM) blev brugt til direkte at stimulere RyR1 i nærværelse af 2 mM eksternt calcium. KCl depolarisering (140 mM) blev induceret i nærværelse af 2 mM eksternt calcium. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Skematisk præsentation af hele protokollen. De forskellige trin i protokollen præsenteres, fra in silico-designet til in vitro molekylær kloning og den endelige cellevalg. Klik her for at se en større version af denne figur.

Navn Sekvens 5'-3' Formål/anvendelse
Primer_Guide1F Guide1 + gttttagagctagaaatagc Kloning af plasmider
Primer_Guide1R Vejledning 1-RC +AGATCTGTGGTCTCATACAG
Primer_Guide 2F Vejledning 2 + gttttagagctagaaatagc
Primer_Guide 2R Vejledning 2-RC + GTTTCGTCCTTTCCACAAG
Primer_XmaI F TAGTGGATCCCCCGGGAAAATTCAAAATTTT Plasmider kloning og kolonier kontrol
Primer_BlpI R CGCTTCCATTGCTCAGCTGGCCGCTGCCCC
Primer_KillerF AATGGAGTACTTCTTGTCCAgttttagagctagaaatagc Kloning af plasmid p_Killer
Primer_KillerR TGGACAAGAAGTACTCCATTAGATCTGTGGTCTCATACAG
Primer_mCherryF GAACAGTACGAACGCGCCGAgttttagagctagaaatagc
Primer_mCherryR TCGGCGCGTTCGTACTGTTCGTTTCGTCCTTTCCACAAG
Primer_RYR1exonF GCTCGTATTCGTCACCCGCGgttttagagctagaaatagc Kloning af plasmid p_guides_RyR1
Primer_RYR1exonR CGCGGGTGACGAATACGAGCAGATCTGTGGTCTCATACAG
Primer_RYR1intronF TAAGTCAGTTCATAGGCGCTgttttagagctagaaatagc
Primer_RYR1intronR AGCGCCTATGAACTGACTTAGTTTCGTCCTTTCCACAAG
Primer_BeforeRYR1cut AGTCGTTACCATGTCTTCAGCCCT Klonvalg for RYR1 KO
Primer_AfterRYR1cut CTGCCGATTCCACAGATGAAGCAC

Tabel 1: Liste over primere. Primere, der bruges til plasmidkloning og kolonikontrol, samt dem til klonvalg.

Navn Guide sekvens Pam Omvendt komplement uden PAM
Guide 1: RYR1exon GCTCGTATTCGTCACCCGCG GGG CGCGGGTGACGAATACGAGC
Guide 2: RYR1intron TAAGTCAGTTCATAGGCGCT CGG AGCGCCTATGAACTGACTTA
Guide Killer Cas9 TGGACAAGAAGTACTCCATT GGG AATGGAGTACTTCTTGTCCA
Guide mCherry morder GAACAGTACGAACGCGCCGA GGG TCGGCGCGTTCGTACTGTTC

Tabel 2: Guider, der bruges til at oprette plasmidet p_guides og p_Killer. De sekvenser, der anvendes til udvikling af RyR1-KO-klonerne, er præsenteret i denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Et stort skridt på vejen til karakterisering af gener med ukendt funktion involveret i patologier er udviklingen af relevante cellulære modeller til at studere funktionen af disse gener. Brugen af genredigering ved hjælp af CRISPR/Cas9 er et eksponentielt voksende forskningsfelt, og udviklingen af knock-out-modeller som præsenteret her er blandt de mest anvendte anvendelser. I denne sammenhæng foreslår vi her en alsidig protokol til at udvikle en human cellelinje knock-out i ethvert gen af interesse, hvilket muliggør karakterisering af dette gen i en relevant human cellemodel. Protokollen, der præsenteres her, kan bruges i udødeliggjorte myoblaster såvel som i iPSC og kan således praktisk talt resultere i produktion af enhver human cellemodel KO i genet af interesse.

Begrænsningen er, at denne protokol skal anvendes på udødeliggjorte celler, da mange ugers dyrkning samt en cellulær kloning er påkrævet sammen med adskillige successive forstærkninger. Alternativt bør celler, som kan forstærkes og vedligeholdes i få uger eller måneder, anvendes. Ved hjælp af denne procedure er human udødeliggjort muskelcellelinje KO for genet af interesse (her RYR1-genet ) blevet produceret på ca. 3-4 måneder (eksklusive den funktionelle karakterisering af cellerne).

Denne strategi er velegnet til vanskelige at transfektere celler, såsom muskelceller, da den er afhængig af brugen af lentivirus til at introducere alle værktøjerne i målcellerne, og den er således mere kraftfuld end andre metoder såsom transfektion eller elektroporation. Dens største ulempe er integration i værtsgenomet, og et muligt alternativ til at undgå skadelig integration af lentivirus i værtsgenomet er brugen på ikke-integrativ lentivirus17, men effektiviteten af disse ikke-integrerende lentivirale partikler bør mindst svare til det almindelige lentivirus.

Integrationsstedet kunne sandsynligvis påvirke udtryksniveauet for Cas9, men dette er sandsynligvis ikke ansvarlig for den lille mængde Cas9 i Cl-KOR 2. Den lille mængde Cas9 er sandsynligvis relateret til transduktionen af denne specifikke klon med LV-Killer, som kunne have været lavere end i den anden klon, eller alternativt kunne antallet af LV-Cas9 have været højere.

Det anbefales ikke at udtrykke Cas9 alene uden gRNA i lang tid (såsom til udvikling af en Cas9-klon), da dette er beskrevet for at øge off-targets, og det kan også øge cellernes dødelighed.

Vi har valgt at bruge SpCas9 som nuklease, fordi den er meget udbredt, den har en kort PAM, og tilbyder derfor flere muligheder for valg af guide RNA'er. Derudover er dens størrelse kompatibel med produktionen af lentivirale vektorer. Andre nukleaser kan anvendes, hvis en specifik PAM skal målrettes (såsom SaCas9 eller Cpf1)18.

De forskellige lentivirus kan produceres i et almindeligt BSL2-kulturrum19 eller købes fra et virusproduktionsanlæg eller en virksomhed. Kravet for at implementere denne protokol er ekspertise inden for molekylærbiologi og molekylær kloning og i dyrkning af den valgte cellemodel.

De lentivirus, der koder for de forskellige guider, koder også for det fluorescerende protein, mCherry. Dette fluorescerende protein kan være nyttigt, hvilket muliggør automatiseret sortering af cellerne og kloning af FACS i stedet for enkeltcellekloning, og i dette tilfælde bør ekspressionen af mCherry ikke undertrykkes med LV-morderen. Hvis mCherry skal opretholdes, bør den anden guide mod mCherry ikke klones ind i p-morderen (trin 2.7). For RYR1-genet , da den funktionelle karakterisering gør brug af fluorescerende sonder, og den fremtidige anvendelse af denne cellelinje også kan kræve immunmærkning med fluorescerende antistoffer, har vi valgt at undertrykke mCherry-ekspression. I LV-morderen er gRNA-målet Cas9 placeret under en stærk promotor H1 i stedet for den svage promotor 7SK, der oprindeligt var til stede i det originale plasmid, for at sikre en lignende effektivitet af nukleasen på alle de valgte gRNA'er og for at øge Cas9-spaltningen, når LV-morderen er tilsat cellerne.

Det længste og mest anstrengende trin er kloning af encelle. I vores procedure viste muskelcellerne en reduceret vækst efter lentiviral transduktion med Cas9 og kom sig efter et par uger. Hvis enkeltcellekloningen udføres for tidligt efter de virale transduktioner, sandsynligvis på grund af massiv celledød, vil kun få brønde i en 96-brøndplade indeholde voksende celler. Det er således bedre at forstærke cellerne før kloning og vente på mindst 2-3 opdeling. Det er også muligt at klone cellerne ved 10 celler/ brønd, hvis de ikke vokser godt som enkeltceller. Derudover bør myoblasterne altid dyrkes ved en sammenløb under 50% for at opretholde en god differentieringsevne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af tilskud fra Association Française contre les myopathies (AFM-Téléthon) og fra Auvergne-Rhône Alpes Région (AURA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-CACNA1S antibody Sigma-Aldrich HPA048892 Primary antibody
Blp I NE BioLabs R0585S Restriction enzyme
CalPhos Mammalian Transfection Kit Takara 631312  Transfection kit
Easy blot anti Mouse IgG GeneTex GTX221667-01 HRP secondary antibody
Easy blot anti Rabbit IgG GeneTex GTX221666 HRP secondary antibody
Fluo-4 direct Molecular Probes F10472 Calcium imaging
GAPDH(14C10) Rabbit mAb  Cell Signaling Technology #2118 Primary antibody
HindIII Fermentas ER0501 Restriction enzyme
InFusion HD Precision Plus Takara 638920 Ligation kit
MasterMix Phusion High Fidelity with GC ThermoFisher Scientific F532L Mix for PCR reaction with High fidelity Taq polymerase and dNTPs
Myosin Heavy Chain antibody DHSB MF20 Primary antibody
NucleoBond Xtra Maxi EF Macherey-Nagel REF 740424 Maxipreparation kit for purification of plasmids
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Macherey-Nagel 740609 DNA purification
NucleoSpin Tissue Macherey-Nagel 740952 Kit for DNA extraction from cell
One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli ThermoFisher Scientific C737303 Chemically competent cells
Plasmid #87904 Addgene 87904 Lentiviral plasmid encoding the SpCas9 (for LV-Cas9)
Plasmid #87919 Addgene 87919 Lentiviral backbone for insertion of cassette with guides (for LV-guide-target)
Plasmid #12260 Addgene 12260 Lentiviral plasmid encoding lentiviral packaging GAG POL
Plasmid #8454 Addgene 8454 Lentiviral plasmid encoding envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles
V5 Tag Monoclonal Antibody Invitrogene R96025  Primary antibody
XL10-Gold Ultracompetent Cells Agilent 200317 Chemically competent cells
Xma I NE BioLabs R0180S Restriction enzyme

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Claussnitzer, M., Susztak, K. Gaining insight into metabolic diseases from human genetic discoveries. Trends in Genetics. 37 (12), 1081-1094 (2021).
  2. Fuster-García, C., García-Bohórquez, B., Rodríguez-Muñoz, A., Millán, J. M., García-García, G. Application of CRISPR tools for variant interpretation and disease modeling in inherited retinal dystrophies. Genes. 11 (5), 473 (2020).
  3. Modell, A. E., Lim, D., Nguyen, T. M., Sreekanth, V., Choudhary, A. CRISPR-based therapeutics: current challenges and future applications. Trends in Pharmacological Sciences. 43 (2), 151-161 (2022).
  4. Olson, E. N. Toward the correction of muscular dystrophy by gene editing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), (2021).
  5. Wu, X., Kriz, A. J., Sharp, P. A. Target specificity of the CRISPR-Cas9 system. Quantitative Biology. 2 (2), 59-70 (2014).
  6. Merienne, N., et al. The self-inactivating KamiCas9 system for the editing of CNS disease genes. Cell Reports. 20 (12), 2980-2991 (2017).
  7. Marty, I., Fauré, J. Excitation-contraction coupling alterations in myopathies. Journal of Neuromuscular Diseases. 3 (4), 443-453 (2016).
  8. Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
  9. Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A quick, cost-free method of purification of DNA fragments from agarose gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
  10. Flucher, B. E., Conti, A., Takeshima, H., Sorrentino, V. Type 3 and type 1 ryanodine receptors are localized in triads of the same mammalian skeletal muscle fibers. The Journal of Cell Biology. 146 (3), 621-630 (1999).
  11. Hess, H. H., Lees, M. B., Derr, J. E. A linear Lowry--Folin assay for both water-soluble and sodium dodecyl sulfate-solubilized proteins. Analytical Biochemistry. 85 (1), 295-300 (1978).
  12. Garibaldi, M., et al. Dusty core disease' (DuCD): expanding morphological spectrum of RYR1 recessive myopathies. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 3 (2019).
  13. Marty, I., et al. Biochemical evidence for a complex involving Dihydropyridine receptor and Ryanodine receptor in triad junctions of skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2270-2274 (1994).
  14. Oddoux, S., et al. Triadin deletion induces impaired skeletal muscle function. Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 34918-34929 (2009).
  15. Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1, 34 (2011).
  16. Cacheux, M., et al. Functional characterization of a central core disease RyR1 mutation (p.Y4864H) associated with quantitative defect in RyR1 protein. Journal of Neuromuscular Diseases. 2 (4), 421-432 (2015).
  17. Luis, A. The old and the new: Prospects for non-integrating lentiviral vector technology. Viruses. 12 (10), 1103 (2020).
  18. Leenay, R. T., Beisel, C. L. Deciphering, communicating, and engineering the CRISPR PAM. Journal of Molecular Biology. 429 (2), 177-191 (2017).
  19. Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Neurosciences. , Chapter 4, Unit 4.21 (2006).

Tags

Genetik udgave 184
Udvikling af knock-out muskelcellelinjer ved hjælp af Lentivirus-medieret CRISPR / Cas9 genredigering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beaufils, M., Tourel, A., Petiot,… More

Beaufils, M., Tourel, A., Petiot, A., Halmai, N. B., Segal, D. J., Rendu, J., Marty, I. Development of Knock-Out Muscle Cell Lines using Lentivirus-Mediated CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (184), e64114, doi:10.3791/64114 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter