Summary
在这里，我们开发了一种人主动脉平滑肌细胞器官芯片模型，以复制人主动脉壁中平滑肌细胞的 体内 生物力学应变。
Abstract
传统的二维细胞培养技术和动物模型已用于人胸主动脉瘤和夹层（TAAD）的研究。然而，人类TAAD有时不能用动物模型来表征。临床人体研究和动物实验之间存在明显的物种差距，这可能会阻碍治疗药物的发现。相比之下，传统的细胞培养模型无法模拟 体内 生物力学刺激。为此，微细加工和微流体技术近年来有了长足的发展，为建立复制生物力学微环境的芯片类器官模型提供了新技术。在这项研究中，开发了人主动脉平滑肌细胞器官芯片（HASMC-OOC）模型来模拟主动脉生物力学的病理生理参数，包括人主动脉平滑肌细胞（HASMC）经历的周期性应变的幅度和频率在TAAD中起至关重要的作用。在该模型中，HASMC的形态在形状上变得细长，垂直于应变方向对齐，并且在应变条件下呈现比静态常规条件下更具收缩性的表型。这与天然人主动脉壁中的细胞取向和表型一致。此外，使用二叶式主动脉瓣相关TAAD（BAV-TAAD）和三尖瓣主动脉瓣相关TAAD（TAV-TAAD）患者来源的原发性HASMC，我们建立了BAV-TAAD和TAV-TAAD疾病模型，这些模型复制了TAAD中的HASMC特征。HASMC-OOC模型提供了一个与动物模型互补的新型 体外 平台，用于进一步探索TAAD的发病机制和发现治疗靶点。
Introduction
胸主动脉瘤和夹层 （TAAD） 是主动脉壁的局部扩张或分层，与高发病率和死亡率有关1。人主动脉平滑肌细胞（HASMC）在TAAD的发病机制中起着至关重要的作用。HASMC不是终末分化的细胞，HASMC保持高可塑性，允许它们响应不同的刺激切换表型2。HASMCs在 体内主要受到节律性拉伸应变，这是调节平滑肌形态变化、分化和生理功能的关键因素之一3，4。因此，循环应变在HASMCs研究中的作用不容忽视。然而，传统的2D细胞培养物无法复制HASMC在 体内经历的循环菌株的生物力学刺激。此外，动物TAAD模型的构建不适用于某些类型的TAAD，例如二叶式主动脉瓣（BAV）相关的TAAD。此外，临床人体研究与动物实验之间的物种差距也不容忽视。它阻碍了临床实践中的药物翻译。因此，在主动脉疾病的研究中迫切需要更复杂的生理系统来模拟 体内 生物力学环境。
用于生物医学研究和药物开发的动物实验成本高昂，耗时且在道德上存在问题。此外，动物研究的结果经常无法预测在人体临床试验中获得的结果5，6。缺乏人类临床前模型和临床试验中的高失败率导致临床有效药物很少，这增加了医疗保健成本7。因此，迫切需要寻找其他实验模型来补充动物模型。近年来，微细加工和微流控技术得到了长足的发展，为建立类器官芯片模型提供了新技术，弥补了传统2D细胞培养技术的缺点，并为生理研究和药物开发建立了更现实、低成本和高效的体外模型。使用微流体装置，建立器官芯片，在具有不同刺激的微米大小的腔室中培养活细胞，以复制组织或器官的关键功能。该系统由单个或多个微流体微通道组成，其中一种细胞在灌注室中培养，复制一种组织类型的功能，或者在多孔膜上培养不同的细胞类型以重建不同组织之间的界面。基于微流控的类器官与患者来源的细胞相结合，具有弥合小鼠和人类疾病模型之间巨大物种差异的独特优势，并克服了传统2D细胞培养在疾病机制研究和药物发现方面的缺点。随着过去几年微流控技术的快速发展，研究人员已经意识到体外器官芯片（OOC）模型复制复合体内生物学参数的有用性8。这些微流体类器官模拟体外生物力学环境，如循环应变、剪切应力和液体压力，提供三维 （3D） 细胞培养环境。迄今为止，已经建立了几个OOC模型来模拟肺9，肾脏10，肝脏11，肠12和心脏13等器官的生物力学刺激，但这些模型尚未广泛应用于人类主动脉疾病的研究。
在这项研究中，我们提出了一种人主动脉平滑肌细胞器官芯片（HASMC-OOC）模型，该模型可以控制应用于TAAD患者来源的原发性HASMC的仿生机械力和节律。该芯片由蚀刻有通道的三层聚二甲基硅氧烷（PDMS）厚板和两个商业化的高柔性PDMS膜组成。HASMC在PDMS膜上培养。芯片中间的通道充满了用于细胞培养的培养基。芯片的顶部和底部通道连接到真空压力供应系统，该系统可以控制PDMS膜机械拉伸应变的节奏和频率。HASMC所经历的节律应变可以在HASMC-OOC中模拟，复制传统2D培养系统无法实现的组织或器官的生物力学微环境。利用高分辨率、实时成像和生物力学微环境的优势，可以研究活细胞的生化、遗传和代谢活性，用于组织发育、器官生理学、疾病病因、分子机制和生物标志物鉴定、心血管疾病和主动脉疾病。结合组织特异性和患者细胞，该系统可用于药物筛选、个性化医疗和毒性测试。该HASMC-OOC模型为研究主动脉疾病的发病机制提供了一个新颖的 体外 平台。
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Protocol
经复旦大学伦理委员会中山医院批准，采用人主动脉标本进行原发性HASMC分离。B2020-158）。从复旦大学附属中山医院行升主动脉手术的患者中采集主动脉标本。参与前获得所有患者的书面知情同意。
1.原发性人主动脉平滑肌细胞分离
- 用无菌PBS清洗升主动脉的右侧区域，1x-2x。
- 用两个眼科镊子去除组织的内膜和外膜层，并保留培养基层以收获细胞。
- 将培养基层放在10厘米的培养皿上，用剪刀将其切成小块（2-3毫米）。加入含有 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素的 5 mL 平滑肌细胞培养基 （SMCM）。
- 用无菌滴管将小组织移动到培养瓶中，均匀地铺开组织。尽可能丢弃培养基，然后将瓶子倒置。
- 将2mL SMCM加入倒置培养瓶中，并将其置于37°C的培养箱（5%CO 2）中1-2小时，然后缓慢将其右侧朝上并加入另外2mL SMCM。
- 孵育 5-7 天后，将 SMCM 与 4 mL 新鲜 SMCM 交换。一般来说，散发的平滑肌细胞在大约 2 周内爬出来。
- 慢慢丢弃SMCM，并在更换介质时缓慢添加。移动到显微镜站时缓慢运输培养瓶;否则，组织会漂浮，细胞会缓慢生长。
- 当细胞达到约80%汇合时，用2mL PBS洗涤，用2 mL 0.25%胰蛋白酶消化，并将它们分成两个装有4 mL新鲜SMCM的新培养瓶中。
- 通过对平滑肌细胞（CNN1，SM22）的四种不同特异性标记物进行免疫荧光分析来鉴定细胞14。
2. PDMS芯片的制备
- 为了聚合PDMS，以A：B = 10：1w / w的重量比将固化剂（B组分）添加到碱（A组分）中，并将络合物完全混合5分钟;数量取决于研究的需要。
- 将制备好的PDMS凝胶置于真空提取罐中30-60分钟，并将压力保持在-0.8mPa以下。
注意：高压将导致PDMS凝胶内部的小气泡提取不足，这将影响芯片制造的下一步。 - 使用计算机辅助设计 （CAD） 软件，使用 100 mm × 40 mm × 8 mm 外部框架结构和 70 mm × 6 mm × 4 mm 通道设计模具。
- 使用高精度计算机数控雕刻机定制制作三层模具。使用聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）板雕刻出模具的框架和微通道，然后将它们粘在另一个PMMA板上。
- 将制备好的PDMS凝胶倒入具有100毫米×40毫米×6毫米外框和70毫米×6毫米×4毫米通道的模具上，然后在70°C下交联1-2小时。
- 从模具上剥离交联的PDMS板，并将商业化的PDMS膜切割成100毫米×40毫米的部分。
- 用氧等离子体处理三个制备的PDMS板和两个PDMS膜5分钟以进行PDMS表面活化。应用以下特定设置：室内空气作为工艺气体;压力设置为 -100 kPa;电流设置为 180--200 mA;电压设置为 200 V;处理时间达 5 分钟。
- 使用1毫米的打孔机在三个PDMS板上打孔，以在PDMS芯片上制作空气和介质微通道的入口和出口。
- 按顺序将三个PDMS板和两个PDMS膜粘合在一起：空气通道PDMS板（顶层）-PDMS膜-中通道PDMS板（中间层）-PDMS膜-空气通道PDMS板（底层）。在4倍的立体显微镜下执行此步骤，以使空气微通道与介质微通道完全重叠。
- 将组装好的PDMS芯片置于70°C培养箱中1小时。
- 准备几根内径为1毫米，长度为3厘米的乳胶软管。将外径为1毫米，长1厘米的不锈钢针插入准备好的软管的一端，然后将鲁尔插入软管的另一端，以形成连接到PDMS芯片的空气和介质微通道的管子。
- 将准备好的管插入PDMS芯片上的空气和介质微通道的出口和入口。
3. PDMS芯片表面处理和灭菌
- 使用 2 mL 注射器将 2 mL 的 80 mg/mL 小鼠胶原蛋白注入 PDMS 芯片的培养基微通道中，并在室温下孵育 30 分钟。
- 孵育后，从通道中取出胶原蛋白，并用2mL注射器回忆。将涂有胶原蛋白的PDMS芯片放入60°C培养箱中过夜。
- 将PDMS芯片放入紫外线灭菌器中超过1小时。将灭菌的PDMS芯片放在超洁净工作台上，为细胞实验做准备。
4. PDMS芯片上的细胞接种和细胞拉伸过程
- 使用含有2%胎牛血清（FBS）和1%青霉素 - 链霉素的平滑肌细胞培养基（SMCM）在37°C的5%CO2培养箱中培养4 x 105原代人平滑肌细胞（HASMC）。
- 当HASMC密度达到80%时，丢弃SMCM并用2mL PBS洗涤细胞。
- 使用 1 mL 的 0.25% 胰蛋白酶消化细胞 2 分钟，并以 100 x g 离心 5 分钟。除去上清液并将细胞沉淀重悬于1mL新鲜SMCM中。使用 8 mL SMCM 在 10 cm 培养皿上培养细胞。
- 使用细胞仪计算细胞数，并以2 x 105 个细胞/ mL的终浓度使用细胞。
- 将 2 mL PBS 缓慢倒入涂有胶原蛋白包衣和灭菌的 PDMS 芯片培养基微通道中，然后使用 2 mL 注射器丢弃。
- 使用 2 mL 注射器将总共 2 mL 的 2 x 105 细胞/mL HASMC 悬浮液缓慢倒入 PDMS 芯片的培养基微通道中。然后，关闭 PDMS 芯片入口和出口处的鲁尔。将PDMS芯片置于37°C的培养箱（5%CO2）中1天。
- 将细胞附着在PDMS芯片中的PDMS膜上后，近24小时后，将PDMS芯片上的空气微通道出口连接到真空控制器系统。当细胞附着时，在显微镜下可以看到细长的正常细胞形式，与悬浮的圆形细胞形成鲜明对比。
- 打开电磁阀和真空泵。打开真空调节器，将压力水平调节为 10 kPa（对于 7.18 ± 0.44% 应变）和 15 kPa（对于 17.28 ± 0.91% 应变）。
- 设置控制系统的参数后，将PDMS芯片置于37°C的培养箱（5%CO2）中并拉伸24小时。
5. 机械控制系统的准备
- 准备几个电磁阀、真空过滤器、真空调节器、真空泵、蠕动泵和一个控制电磁阀的可编程逻辑控制器 （PLC）。
- 对 PLC 控制器进行编程，并将开/关时间间隔设置为 1 Hz。 将电磁阀连接到编程控制器。
- 将真空泵的入口连接到真空过滤器，然后将真空过滤器的出口连接到真空调节器。将真空调节器的出口连接到电磁阀，最后将电磁阀的出口连接到PDMS芯片的空气微通道的出口。
- 将蠕动泵的出口连接到PDMS芯片的培养基微通道的入口，蠕动泵的入口连接到培养基微通道PDMS芯片的出口，用于培养基更换和药物处理。
- 通过调节器调整应变幅度，通过微控制器调整应变频率。
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Representative Results
HASMC-OOC模型由真空控制系统、循环系统和PDMS芯片以及HASMC-OOC模型的原理图设计组成（图1）。真空控制系统由真空泵、电磁阀和 PLC 控制器组成。为了充当循环系统，使用蠕动泵来更新细胞培养基并添加药物。PDMS芯片由两个真空室和一个充满SMCM的中间室组成，用于细胞生长。根据芯片结构设计，制备PMMA模具，将3块PDMS板坯倒入模具中，在70 °C交联2 h。用血浆处理后，将三个PDMS板和两个PDMS膜粘合在一起（图2）。制备PDMS芯片时，将HASMC培养在芯片中的PDMS膜上，并将PDMS芯片连接到真空控制系统和循环系统。整个系统的原理图如图1所示。PDMS芯片参数如图3A所示，PDMS膜的机械性能如图3B所示。为了量化PDMS膜的拉伸应变，我们从微流体模型的横截面图中捕获了PDMS膜的实时变形，真空压力为0 kPa，10 kPa，15 kPa，20 kPa，25 kPa和30 kPa。我们还测量了长度的变化，以评估PDMS膜在2 mm，4 mm和6 mm不同培养通道宽度中的应变大小（图3C-E）。PDMS芯片中使用了6毫米宽的微通道。结果表明，10 kPa 的真空压力诱导了 7.18 ± 0.44% 应变，15 kPa 诱导了 17.28 ± 0.91% 应变（图 3E）。
为了验证PDMS芯片中HASMC细胞系（CRL1999）的细胞活力，在细胞培养后的第3天和第5天进行了LIVE / DEAD测定。结果显示，细胞活力在第3天和第5天高于90%（图4A）。PDMS芯片中CRL1999的细胞骨架（F-肌动蛋白）染色显示正常的细胞形态，并且在拉伸24小时后细胞垂直于菌株排列（图4B-C）。在节律应变24小时后，使用HASMC-OOC对收缩标记SM22和CNN1进行免疫荧光染色（图4D-E）。首先，将2mL的PBS缓慢倒入通道中，并用2 mL注射器丢弃。随后，将2mL的4%（v / v）多聚甲醛倒入通道中并在室温下孵育30分钟。之后，通过2mL注射器将2mL的0.2%（v / v）Triton X-100倒入通道中，并在室温下孵育15分钟。随后将2 mL PBS缓慢倒入通道中，并在洗涤细胞后由2 mL注射器丢弃。接下来，将2mL的5%（w / v）牛血清白蛋白缓慢倒入通道中并在室温下孵育30分钟。之后，将1mL的SM22或CNN1抗体缓慢倒入通道中，并在4°C下孵育过夜。 孵育后，将1mL山羊抗兔二抗缓慢倒入通道中，并在室温下孵育1h。最后，将1mL的DAPI溶液缓慢倒入通道中，并在室温下孵育10分钟。结果表明，应变条件下SM22和CNN1的荧光强度高于静态条件下（图4F）。与静态条件相比，HASMC中的SM22和CNN1基因在应变条件下上调（图4G）。这些数据表明，CRL1999垂直于菌株方向对齐，并且在菌株条件下的收缩表型比在静态条件下的传统细胞培养更明显。
使用二叶式主动脉瓣相关TAAD（BAV-TAAD）和三尖瓣主动脉瓣相关TAAD（TAV-TAAD）患者来源的原发性HASMC，我们建立了BAV-TAAD和TAV-TAAD疾病模型。BAV-TAAD和TAV-TAAD患者来源的原发性HASMC的F-肌动蛋白染色结果显示正常的细胞形态，拉伸24小时后细胞垂直于应变方向排列（图5A-B）。免疫荧光染色显示，在应变条件下，BAV-TAAD和TAV-TAAD患者来源的原发性HASMC中的SM22和CNN1表达高于静态条件（图5C-G，I）。与静态条件相比，BAV-TAAD和TAV-TAAD患者来源的原发性HASMC中SM22和CNN1的基因表达水平在应变条件下上调（图5H，J）。PDMS芯片中BAV-TAAD和TAV-TAAD患者来源的原发性HASMC结果与HASMC细胞系CRL1999的结果一致，表明患者来源的原发性HASMC和HASMC-OOC模型的组合在TAAD中复制了HASMC特征，为进一步研究疾病的分子机制和药物筛选提供了BAV-TAAD和TAV-TAAD体外疾病模型。
图 1：HASMC-OOC 系统的示意图设计。 该系统由真空控制系统、循环系统和PDMS芯片组成。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：PDMS 芯片制备程序。 将PDMS凝胶倒入PMMA模具中，并在70°C下交联1-2小时。然后，将3块PDMS板和2块PDMS膜用等离子体处理5 min并粘合在一起。最后，对制备好的PDMS芯片进行灭菌，将浓度为2 x 105 cells/mL的HASMC悬浮液缓慢倒入PDMS芯片的培养基微通道中。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：PDMS 芯片的详细参数和机械性能。 （A） PDMS 芯片的详细参数。PDMS板尺寸为100 mm×40 mm×6 mm，微通道尺寸为70 mm×6 mm×4 mm。 （B）商用PDMS膜的参数。PDMS膜在不同真空压力下计算的拉伸幅度，微通道宽度为2 mm （C）、4 mm （D）和6 mm （E）。数据显示平均±标准差 （SD）。请点击此处查看此图的大图。
图 4：循环菌株条件下 HASMC 的细胞形态、方向和表型改变。 （A）在PDMS芯片上培养HASMC细胞系（CRL1999）后第3天和第5天的LIVE / DEAD测定的代表性图像。（B）CRL1999在静态和应变条件下的F-肌动蛋白染色。（C）CRL1999在静态和应变条件下的电池取向。在静态和应变条件下CRL1999中SM22（D）和CNN1（E）的免疫荧光染色的代表性图像。（F）SM22和CNN1免疫荧光染色的相对强度。（G）静态和应变条件下CRL1999中 SM22 和 CNN1 mRNA的表达。n = 3， *p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001， ****p < 0.0001， 双尾学生t 检验 用于比较两组。数据显示SD±平均值。 请点击此处查看此图的大图。
图5：BAV-TAAD和TAV-TAAD患者来源的HASMC-OOC的细胞形态和表型改变。在静态和应变条件下，BAV-TAAD（A）衍生的原发性HASMC和TAV-TAAD（B）衍生的原发性HASMC的F-肌动蛋白染色的代表性图像。在静态和应变条件下，BAV-TAAD （C） 衍生的原代 HASMC 和 TAV-TAAD （D） 衍生的原代 HASMC 中的 SM22 免疫荧光染色。在静态和应变条件下，BAV-TAAD（E）衍生的原发性HASMC和TAV-TAAD（F）衍生的原发性HASMC中CNN1免疫荧光染色的代表性图像。（G）BAV-TAAD衍生的原发性HASMC中SM22和CNN1免疫荧光染色的相对强度。（H）静态和应变条件下BAV-TAAD衍生的初级HASMC中的SM22和CNN1 mRNA表达。（I）TAV-TAAD衍生的原发性HASMC中SM22和CNN1免疫荧光染色的相对强度。（J）静态和应变条件下TAV-TAAD衍生的初级HASMC中的SM22和CNN1 mRNA表达。n = 3， *p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001， ****p < 0.0001， 双尾学生t检验用于比较两组。数据显示SD±平均值。 请点击此处查看此图的大图。
附图1：设备准备示意图。请点击此处下载此文件。
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Discussion
随着微流控技术的快速发展，近年来出现了可以在体外复制一个或多个器官的生物学功能和结构的OOC模型，用于生物学，医学和药理学15。OOC可以模拟人体生理微环境的关键功能，对于探索疾病机制和促进临床前药物翻译至关重要8，16。虽然OOC仍处于早期阶段，需要更多的投入来优化OOC的设计，但近年来已经取得了很大进展17，18。与其他三维细胞培养模型不同，OOC可以模拟人体的生物力学参数，这些参数对于组织发育和器官功能的维持至关重要。心血管系统的器官和组织在体内不断受到流体流动引起的剪切和循环张力。因此，心血管系统的体外细胞实验需要在提供此类生物力学参数的实验平台上进行，以获得与体内研究获得的实验结果相当的真实实验结果。
在这项研究中，我们建立了一个HASMC-OOC可以精确控制HASMC所承受的生物力学应变的参数。可以控制细胞所承受的流体速度和流体剪切，以及精确控制不同循环应变模式的振幅、频率和节律。在OOC领域使用的众多材料中，PDMS是采用最广泛的19，20，21之一。PDMS透明、柔韧、生物相容、透气，这些特性有助于其在微流控芯片领域的广泛使用19。施加的压力变化可以使PDMS变形，以实现收缩和松弛的机械力，PDMS的渗透性确保芯片上的细胞培养环境可以与培养箱中5%CO2在37°C下的孵育条件保持一致。因此，PDMS不仅为细胞提供受控的机械力，而且还提供适合正常细胞生长的培养环境。我们的实验结果表明，PDMS芯片中培养的细胞的形态和活性与2D培养条件一致，表明PDMS具有生物相容性。
在 仿生体内 生理条件下，主动脉壁中的HASMC经受约9%22的循环应变。在高血压、主动脉扩张和主动脉瘤等病理条件下，HASMC 承受的周期性应变大于 16%23。表征了PDMS芯片的拉伸性能，实验结果表明，10 kPa的真空压力诱导了7.18 ±0.44%的应变，15 kPa的真空压力诱导了17.28 ±0.91%的应变。此外，应变和流体剪切应力的频率可以通过该PDMS芯片系统进行控制。利用BAV-TAAD和TAV-TAAD患者来源的原发性HASMC，可以使用该HASMC-OOC体 外 模型对这些主动脉疾病的分子机制和药物筛选进行，可以复制不同主动脉疾病的发病机制。利用该系统，我们建立了一个疾病模型来研究BAV-TAAD的发病机制，并揭示了线粒体融合激活剂可以部分挽救患病细胞中的线粒体功能障碍24。
HASMC-OOC是根据Ingber的工作9中肺芯片的灵感和参考而设计的。他们的装置复制了肺泡的生理呼吸运动，芯片由三层组成：上层和下层中通道，多孔PDMS膜和两个侧真空室。侧真空室只能在具有先进微流体设备的专业实验室中制造。为了能够在更一般的实验室条件下进行组装，我们将真空室放置在芯片的顶部和底部。两种拉伸方法具有相似的功能，因此可以根据实验室条件和研究需要选择芯片结构，从而进行选择。此外，为了在结构上建立人主动脉的管状结构并从细胞中获得更多的生物样品以进行进一步复杂的生物分析和实验测定，我们建立了一个具有更大通道的五层PDMS芯片，该芯片由一个中间介质通道，两个PDMS膜以及顶部和底部真空室组成。两个PDMS膜和PDMS芯片的大通道将细胞培养面积增加到8.4 cm2，为蛋白质分析提供了足够的样品。此前报道的平台主要侧重于调查轻微动脉疾病，如脑动脉、外周血管或其他动脉疾病25，26。主动脉是直径为25-35毫米的大血管，主动脉的被膜介质主要由承受高强度应变的平滑肌细胞组成。主动脉病的病理学与主动脉壁重塑、平滑肌细胞凋亡和表型转换有关，所有这些都可以通过机械应力进行调节。因此，患者来源的HASMC和拉伸应变是HASMC-OOC成功的重要组成部分。但是，这项研究存在一些局限性。HASMC-OOC没有利用共培养的血管细胞，包括HASMC、主动脉内皮细胞和成纤维细胞，这可能更好地模拟人主动脉的 体内 微环境，可用于研究这些细胞之间的相互作用。尽管HASMC经历了节律性应变，但细胞仍然在无法模拟细胞外基质的扁平PDMS膜上培养。在未来的研究中，我们将通过将微流控芯片与3D生物打印技术相结合来克服这些限制。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者承认，这项工作得到了上海市科学技术委员会（20ZR1411700）、国家自然科学基金（81771971）和上海帆船计划（22YF1406600）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0099-100ml | Used for cell immobilization |
| Alexa Fluor 350-labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0408 | Antibodies used for immunostaining |
| Bovine serum albumin | Beyotime | ST025-20g | |
| Calcium AM/PI | Invitrogen | L3224 | |
| Cell culture flask | Corning | 430639 | |
| CNN1 | Abcam | Ab46794 | |
| Commercial flexible PDMS membrane |
Hangzhou Bald Advanced Materials | KYQ-200 | |
| F-actin | Invitrogen | R415 | |
| FBS | Sigma | M8318 | |
| Hoses | Runze Fluid | 96410 | 1 mm inner diameter; 3 mm outer diameter; 1 mm wall thickness; Official website address: https://www.runzefluidsystem.com |
| Human aortic smooth muscle cell line CRL1999 |
ATCC | Lot Number:70019189 | |
| Image J | Imagej.net/fiji/downloads | Free Download: https://fiji.sc | Imaging platform that is used to identify fluorescence intensity |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment. |
|
| Luer | Runze Fluid | RH-M016 | Official website address: https://www.runzefluidsystem.com. |
| Microscope | Olympus | ||
| mouse collagen | Sigma | C7661 | |
| Oxygen plasma | Changzhou Hongming Instrument | HM-Plasma5L | |
| Pasteur pipette | Biologix | 30-0138A1 | |
| PBS | Beyotime | C0221A | |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture. |
| peristaltic pump | Kamoer | F01A-STP-B046 | |
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| PLC controller | Zhejiang Jun Teng (BenT) CNC factory | BR010-11T8X2M | The detailed program setting can be found in supplementary. Official website address: files.http://www.btcnc.net |
| polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| SM22 | Abcam | ab14106 | |
| SMCM | ScienCell | Cat 1101 | |
| solenoid valve | SMC (China) | VQZ300 | |
| Syringe | Becton,Dickinson and Company | 300841 | |
| Triton-X 100 | Beyotime | ST795 | To penetrate cell membranes |
| Trizol | Invitrogen | 10296010 | Used for RNA extraction |
| trypsin | Sigma | 15400054 | |
| vacuum filter | SMC (China) | ZFC5-6 | Official website address: https://www.smc.com.cn |
| vacuum pump | Kamoer | KVP15-KL-S | |
| vacuum regulator | AirTAC | GVR-200-06 | |
| Primers | |||
| Primer Name | Forward (5’ to 3’) | Reverse (5’ to 3’) | |
| SM22 | CCGTGGAGATCCCAACTGG | CCATCTGAAGGCCAATGACAT | |
| CNN1 | CTCCATTGACTCGAACGACTC | CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA |
References
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