Summary
ここでは、ヒト大動脈壁の平滑筋細胞の in vivo 生体力学的ひずみを再現するためのヒト大動脈平滑筋細胞臓器オンチップモデルを開発しました。
Abstract
従来の二次元細胞培養技術および動物モデルは、ヒト胸部大動脈瘤および解離(TAAD)の研究に使用されてきた。しかし、ヒトTAADは動物モデルによって特徴付けられないことがある。臨床ヒト試験と動物実験の間には、治療薬の発見を妨げる可能性のある明らかな種のギャップがあります。対照的に、従来の細胞培養モデルは、 in vivo の生体力学的刺激をシミュレートすることができません。この目的のために、微細加工およびマイクロ流体技術は近年大きく発展しており、生体力学的微小環境を再現するオルガノイドオンチップモデルを確立するための新しい技術を提供しています。本研究では、ヒト大動脈平滑筋細胞オルガンオンチップ(HASMC-OOC)モデルを開発し、TAADで重要な役割を果たすヒト大動脈平滑筋細胞(HASMC)が経験する周期的ひずみの振幅と頻度を含む、大動脈バイオメカニクスの病態生理学的パラメータをシミュレートしました。このモデルでは、HASMCの形態は形状が細長く、ひずみ方向に対して垂直に整列し、静的な従来の条件下よりもひずみ条件下でより収縮的な表現型を示しました。これは、天然のヒト大動脈壁における細胞の配向および表現型と一致していた。さらに、二尖弁大動脈弁関連TAAD(BAV-TAAD)および三尖弁大動脈弁関連TAAD(TAV-TAAD)患者由来の原発性HASMCを用いて、TAADのHASMC特性を再現するBAV-TAADおよびTAV-TAAD疾患モデルを確立しました。HASMC-OOCモデルは、TAADの病因をさらに探索し、治療標的を発見するための動物モデルを補完する新しい in vitro プラットフォームを提供します。
Introduction
胸部大動脈瘤および解離(TAAD)は、高い罹患率および死亡率に関連する大動脈壁の局所的な拡張または層間剥離です1。ヒト大動脈平滑筋細胞(HASMC)は、TAADの病因において重要な役割を果たしています。HASMCは終末分化細胞ではなく、HASMCは高い可塑性を保持しているため、異なる刺激に応答して表現型を切り替えることができます2。HASMCは主に生体内でリズミカルな引張ひずみを受けており、これは平滑筋の形態学的変化、分化および生理学的機能を調節する重要な因子の1つです3,4。したがって、HASMCの研究における周期的ひずみの役割は無視できません。しかし、従来の2D細胞培養では、HASMCが経験する環状株の生体力学的刺激をin vivoで再現することはできません。さらに、動物TAADモデルの構築は、二尖大動脈弁(BAV)関連のTAADなど、一部のタイプのTAADには適していません。さらに、臨床ヒト研究と動物実験の間の種のギャップは無視できません。それは臨床現場での医薬品翻訳を妨げます。したがって、大動脈疾患の研究において、in vivo生体力学的環境をシミュレートするためのより複雑で生理学的なシステムが緊急に必要とされています。
生物医学研究や医薬品開発に使用される動物実験は、費用と時間がかかり、倫理的に疑わしいものです。さらに、動物実験の結果は、ヒト臨床試験で得られた結果を予測できないことがよくあります5,6。ヒトの前臨床モデルの欠如と臨床試験における高い失敗率により、診療所に有効な薬剤がほとんどなく、医療費が増加しています7。したがって、動物モデルを補完する他の実験モデルを見つけることが急務です。微細加工およびマイクロ流体技術は近年大きく発展しており、従来の2D細胞培養技術の欠点を改善し、生理学的研究および医薬品開発のためのより現実的で低コストかつ効率的なin vitroモデルを確立するためのオルガノイドオンチップモデルを確立するための新しい技術を提供しています。マイクロ流体デバイスを使用して、組織または臓器の主要な機能を再現するために、異なる刺激を持つマイクロメートルサイズのチャンバーで生細胞を培養するための臓器オンチップが確立されます。このシステムは、単一または複数のマイクロ流体マイクロチャネルで構成されており、灌流チャンバーで培養された1種類の細胞が1つの組織タイプの機能を複製するか、異なる細胞タイプを多孔質膜上で培養して異なる組織間の界面を再現します。マイクロ流体ベースのオルガノイドと患者由来の細胞を組み合わせると、マウスとヒトの疾患モデル間の大きな種の違いを橋渡しし、疾患メカニズムの研究や創薬のための従来の2D細胞培養の欠点を克服するという独自の利点があります。過去数年間のマイクロフルイディクスの急速な発展に伴い、研究者は複雑なin vivo生物学的パラメータを複製するin vitro臓器オンチップ(OOC)モデルの有用性を認識しました8。これらのマイクロ流体オルガノイドは、周期的なひずみ、せん断応力、液圧などのin vitro生体力学的環境をシミュレートし、3次元(3D)細胞培養環境を提供します。現在までに、肺9、腎臓10、肝臓11、腸12、心臓13などの臓器の生体力学的刺激をシミュレートするためのOOCモデルがいくつか確立されていますが、これらはヒト大動脈疾患の研究に広く適用されていません。
本研究では、TAAD患者由来の初代HASMCに適用される生体模倣的な機械的力とリズムを制御できるヒト大動脈平滑筋細胞オルガンオンチップ(HASMC-OOC)モデルを紹介します。このチップは、チャネルでエッチングされたポリジメチルシロキサン(PDMS)の3層の厚板と、2つの商品化された柔軟性の高いPDMS膜で構成されています。HASMCはPDMSメンブレン上で培養されます。チップの中央にあるチャネルは、細胞培養用の培養液で満たされています。チップの上部と下部のチャネルは、PDMS膜の機械的引張ひずみのリズムと周波数を制御できる真空圧力供給システムに接続されています。HASMCが経験するリズムのひずみをHASMC-OOCでシミュレートすることができ、従来の2D培養システムでは機能的に達成できなかった組織または臓器の生体力学的微小環境を再現します。高解像度、リアルタイムイメージング、および生体力学的微小環境の利点により、生細胞の生化学的、遺伝的、代謝的活動を組織発生、臓器生理学、疾患病因、分子メカニズムおよびバイオマーカー同定、心血管疾患および大動脈疾患について研究することができる。組織特異的および患者細胞と組み合わせることで、このシステムは薬物スクリーニング、個別化医療、および毒性試験に使用できます。このHASMC-OOCモデルは、大動脈疾患の病因を研究するための新しい in vitro プラットフォームを提供します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ヒト大動脈標本は、復旦大学倫理委員会中山病院(NO.B2020-158)。大動脈標本は、復旦大学中山病院で上行大動脈手術を受けた患者から収集されました。参加前にすべての患者から書面によるインフォームドコンセントが得られました。
1.一次ヒト大動脈平滑筋細胞の分離
- 上行大動脈の右側領域を滅菌PBS、1x-2xで洗浄する。
- 2つの眼科用鉗子で組織の内膜層と外膜層を取り除き、培地層を保持して細胞を採取します。
- 培地層を10 cmの培養皿に置き、ハサミで小片(2〜3 mm)に切ります。10%FBSおよび1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含む平滑筋細胞培養培地(SMCM)を5 mL加えます。
- 滅菌スポイトで小さな組織を培養ボトルに移動し、組織を均等に広げます。培地はできるだけ捨ててから、ボトルを逆さまにします。
- 2 mLのSMCMを倒立培養ボトルに加え、37°Cのインキュベーター(5%CO2)に1〜2時間置き、ゆっくりと裏返してさらに2 mLのSMCMを加えます。
- 5〜7日間のインキュベーション後、SMCMを4 mLの新鮮なSMCMと交換します。一般的に、散発的な平滑筋細胞は約2週間で登ります。
- SMCMをゆっくりと破棄し、培地を交換するときにゆっくりと追加します。顕微鏡ステーションに移動するときは、培養ボトルをゆっくりと輸送します。さもなければ、組織は浮遊し、細胞はゆっくり成長するでしょう。
- 細胞が約80%のコンフルエントに達したら、2 mLのPBSで洗浄し、2 mLの0.25%トリプシンで消化し、4 mLの新鮮なSMCMを含む2つの新しい培養ボトルに分割します。
- 平滑筋細胞の4つの異なる特異的マーカー(CNN1、SM22)の免疫蛍光分析を通じて細胞を同定します14。
2. PDMSチップの作製
- PDMSを重合するには、硬化剤(B成分)をベース(A成分)にA:B = 10:1 w / wの重量比で添加し、複合体を5分間完全に混合します。量は研究の必要性によって異なります。
- 調製したPDMSゲルを真空抽出タンクに30〜60分間入れ、圧力を-0.8mPa未満に維持します。
注:高圧は、チップ製造の次のステップに影響を与えるPDMSゲル内の小さな気泡の抽出が不十分になります。 - コンピューター支援設計(CAD)ソフトウェアを使用して、100 mm×40 mm× 8 mmの外枠構造と70 mm×6 mm×4 mmチャネルで金型を設計します。
- 高精度のコンピューター数値制御彫刻機を使用して、3層の金型をカスタム作成します。ポリメチルメタクリレート(PMMA)プレートを使用して金型のフレームとマイクロチャネルを切り開き、それらを別のPMMAプレートに接着します。
- 調製したPDMSゲルを、外枠100 mm×40 mm×6 mm、70 mm×6 mm×4 mmチャンネルの型に注ぎ、70°Cで1〜2時間架橋します。
- 架橋PDMSスラブを金型から剥がし、製品化したPDMSメンブレンを100mm×40mmの切片に切断します。
- 準備した3枚のPDMSスラブと2枚のPDMSメンブレンを酸素プラズマで5分間処理し、PDMS表面活性化を行います。次の特定の設定を適用します:プロセスガスとしての室内空気。圧力は-100 kPaに設定されています。電流は180〜200 Maに設定されています。電圧は200Vに設定されています。処理時間は5分です。
- 1 mmの穴あけ機を使用して3つのPDMSスラブに穴を開け、PDMSチップ上の空気と媒体マイクロチャネルの入口と出口を作ります。
- 3つのPDMSスラブと2つのPDMSメンブレンを、エアチャネルPDMSスラブ(最上層)-PDMSメンブレン-ミディアムチャネルPDMSスラブ(中間層)-PDMSメンブレン-エアチャネルPDMSスラブ(最下層)の順に接着します。このステップを実体顕微鏡で4倍に実行して、空気マイクロチャネルと中程度のマイクロチャネルを完全に重ね合わせます。
- 組み立てたPDMSチップを70°Cのインキュベーターに1時間入れます。
- 内径1mm、長さ3cmのラテックスホースを数本用意します。用意したホースの一方の端に外径1mm、長さ1cmのステンレス針を挿入し、ホースのもう一方の端にルアーを挿入して、PDMSチップの空気および中マイクロチャネルに接続されたチューブを作成します。
- 準備したチューブをPDMSチップ上の空気および中程度のマイクロチャネルの出口と入口に挿入します。
3. PDMSチップの表面処理と滅菌
- 2 mLシリンジを使用して、2 mLの80 mg/mLマウスコラーゲンをPDMSチップの培地マイクロチャネルに注入し、室温で30分間インキュベートします。
- インキュベーション後、チャネルからコラーゲンを取り除き、2 mLシリンジで回収します。コラーゲンコーティングされたPDMSチップを60°Cのインキュベーターに一晩入れます。
- PDMSチップをUV滅菌器に1時間以上入れます。滅菌したPDMSチップを超クリーンベンチに置き、細胞実験の準備をします。
4. PDMSチップへの細胞播種と細胞延伸プロセス
- 2%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含む平滑筋細胞培地(SMCM)を用いて、患者由来の4 x 10 5初代ヒト平滑筋細胞(HASMC)を37°Cの5 %CO2 インキュベーター内で培養する。
- HASMC密度が80%に達したら、SMCMを廃棄し、2 mLのPBSで細胞を洗浄します。
- 1 mLの0.25%トリプシンを使用して細胞を2分間消化し、100 x g で5分間遠心分離します。上清を除去し、細胞ペレットを1 mLの新鮮なSMCMに再懸濁します。8 mLのSMCMを使用して、10 cmの培養皿で細胞を培養します。
- サイトメーターを使用して細胞数を計算し、2 x 105 細胞/mLの最終濃度で細胞を使用します。
- コラーゲンコーティングおよび滅菌されたPDMSチップ培地マイクロチャネルに2 mLのPBSをゆっくりと注ぎ、後で2 mLシリンジを使用して廃棄します。
- 2 mLシリンジを使用して、合計2 mLの2 x 105 セル/mL HASMC懸濁液をPDMSチップの培地マイクロチャネルにゆっくりと注ぎます。次に、PDMSチップの入口と出口にあるルアーを閉じます。PDMSチップをインキュベーター(5%CO2)に入れ、37°Cで1日間入れます。
- セルがPDMSチップのPDMSメンブレンに取り付けられた後、ほぼ24時間後に、PDMSチップ上の空気マイクロチャネルの出口を真空コントローラシステムに接続します。細胞が付着すると、懸濁した丸い細胞とは対照的に、細長い正常な細胞形態が顕微鏡下で観察され得る。
- 電磁弁と真空ポンプをオンにします。真空レギュレーターを開き、圧力レベルを10 kPaに調整します 7.18 ± 0.44%ひずみの場合、15 kPa 17.28 ± 0.91%ひずみの場合。
- 制御システムのパラメータを設定した後、PDMSチップを37°Cのインキュベーター(5%CO2)に入れ、24時間ストレッチします。
5.機械制御システムの準備
- いくつかのソレノイドバルブ、真空フィルター、真空レギュレーター、真空ポンプ、蠕動ポンプ、およびソレノイドバルブを制御するプログラマブルロジックコントローラー(PLC)を準備します。
- PLCコントローラーをプログラムし、オン/オフ時間間隔を1Hzに設定します。 電磁弁をプログラムされたコントローラーに接続します。
- 真空ポンプの入口を真空フィルターに接続し、次に真空フィルターの出口を真空レギュレーターに接続します。真空レギュレーターの出口をソレノイドバルブに接続し、最後にソレノイドバルブの出口をPDMSチップのエアマイクロチャネルの出口に接続します。
- 蠕動ポンプの出口をPDMSチップの培地マイクロチャネルの入口に接続し、蠕動ポンプの入口を培地マイクロチャネルPDMSチップの出口に接続して、培地の交換と薬物処理を行います。
- レギュレータによるひずみの振幅とマイクロコントローラによるひずみ周波数を調整します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HASMC-OOCモデルは、真空制御システム、循環システム、PDMSチップで構成され、HASMC-OOCモデルの概略設計です(図1)。真空制御システムは、真空ポンプ、電磁弁、およびPLCコントローラで構成されています。循環システムとして機能するために、蠕動ポンプを使用して細胞培養培地をリフレッシュし、薬物を添加しました。PDMSチップは、2つの真空チャンバーと、細胞増殖用のSMCMで満たされた中央チャンバーで構成されていました。チップ構造の設計に従って、PMMAモールドを準備し、3つのPDMSスラブをモールドに流し込み、70°Cで2時間架橋することによって準備しました。血漿処理後、3つのPDMSスラブと2つのPDMS膜を結合しました(図2)。PDMSチップを調製すると、HASMCをチップ内のPDMSメンブレン上で培養し、PDMSチップを真空制御システムと循環システムに接続しました。システム全体の概略図を補足図1に示します。PDMSチップのパラメータを図3Aに、PDMSメンブレンの機械的特性を図3Bに示します。PDMS膜の引張ひずみを定量化するために、0 kPa、10 kPa、15 kPa、20 kPa、25 kPa、および30 kPaの真空圧力で、マイクロ流体モデルの断面図からPDMS膜のリアルタイム変形をキャプチャしました。また、長さの変化を測定して、2 mm、4 mm、および6 mmの異なる培養チャネル幅でのPDMS膜のひずみの大きさを評価しました(図3C-E)。PDMSチップには幅6mmのマイクロチャネルを使用しました。その結果、真空圧10 kPaでは7.18 ± 0.44%ひずみ、15 kPaでは17.28 ± 0.91%ひずみが誘導されました(図3E)。
PDMSチップ内のHASMC細胞株(CRL1999)の細胞生存率を検証するために、細胞培養後3日目および5日目にLIVE/DEADアッセイを実施しました。結果は、細胞生存率が3日目および5日目に90%より高いことを示した(図4A)。PDMSチップにおけるCRL1999の細胞骨格(F-アクチン)染色は、正常な細胞形態および24時間延伸後に株に対して垂直に整列した細胞を示した(図4B−C)。収縮マーカーSM22およびCNN1の免疫蛍光染色は、24時間のリズムひずみ後にHASMC-OOCを用いて行った(図4D-E)。開始するために、2mLのPBSをチャネルにゆっくりと注ぎ、2mLシリンジで廃棄した。続いて、2 mLの4%(v / v)パラホルムアルデヒドをチャネルに注ぎ、室温で30分間インキュベートしました。この後、2 mLの0.2%(v / v)Triton X-100を2 mLシリンジでチャネルに注ぎ、室温で15分間インキュベートしました。これに続いて、2 mLのPBSをチャネルにゆっくりと注ぎ、細胞を洗浄した後に2 mLシリンジで廃棄しました。次に、2 mLの5%(w / v)ウシ血清アルブミンをチャネルにゆっくりと注ぎ、室温で30分間インキュベートしました。その後、1 mLのSM22またはCNN1抗体をチャネルにゆっくりと注ぎ、4°Cで一晩インキュベートしました。 インキュベーション後、1 mLのヤギ抗ウサギ二次抗体をチャネルにゆっくりと注ぎ、室温で1時間インキュベートしました。最後に、1 mLのDAPI溶液をチャネルにゆっくりと注ぎ、室温で10分間インキュベートしました。その結果、SM22とCNN1の蛍光強度は、ひずみ条件下での蛍光強度が静的条件下での蛍光強度よりも高いことが示されました(図4F)。静的条件と比較して、HASMCのSM22およびCNN1遺伝子は、株条件下でアップレギュレーションされました(図4G)。これらのデータは、CRL1999がひずみ方向に対して垂直に整列し、収縮表現型が従来の静的条件下での細胞培養よりもひずみ条件下でより顕著であることを示唆しました。
二尖弁大動脈弁関連TAAD(BAV-TAAD)および三尖弁大動脈弁関連TAAD(TAV-TAAD)患者由来の原発性HASMCを用いて、BAV-TAADおよびTAV-TAAD疾患モデルを確立した。BAV-TAADおよびTAV-TAAD患者由来初代HASMCのF-アクチン染色の結果は、正常な細胞形態および24時間延伸後の細胞が株方向に垂直に整列したことを示した(図5A-B)。免疫蛍光染色は、BAV-TAADおよびTAV-TAAD患者由来の一次HASMCにおけるSM22およびCNN1発現が、静的条件下でよりもひずみ条件下で高いことを示しました(図5C-G、I)。BAV-TAADおよびTAV-TAAD患者由来の初代HASMCにおけるSM22およびCNN1の遺伝子発現レベルは、静的条件とは対照的に、株条件下でアップレギュレーションされました(図5H、J)。PDMSチップ内のBAV-TAADおよびTAV-TAAD患者由来初代HASMCにおけるこれらの結果は、HASMC細胞株CRL1999の結果と一致しており、患者由来の初代HASMCとHASMC-OOCモデルの組み合わせがTAADのHASMC特性を再現していることを示しており、疾患の分子メカニズムと薬物スクリーニングのさらなる調査のためのBAV-TAADおよびTAV-TAADインビトロ疾患モデルを提供します。
図1:HASMC-OOCシステムの概略設計。 このシステムは、真空制御システム、循環システム、およびPDMSチップで構成されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:PDMSチップの準備手順。 PDMSゲルをPMMAモールドに流し込み、70°Cで1〜2時間架橋した。次に、3つのPDMSスラブおよび2つのPDMS膜をプラズマで5分間処理し、互いに接着した。最後に、調製したPDMSチップを滅菌し、濃度2 x 105 細胞/mLのHASMC懸濁液をPDMSチップの培地マイクロチャネルにゆっくりと注いだ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:PDMSチップの詳細なパラメータと機械的特性。 (A)PDMSチップの詳細なパラメータ。PDMSスラブサイズは100mm×40mm×6mmであり、マイクロチャネルサイズは70mm×6mm×4mmであった。2 mm(C)、4 mm(D)、および6 mm(E)のマイクロチャネル幅の異なる真空圧力でのPDMS膜の計算された伸張振幅。データは平均±標準偏差(SD)を示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:周期的ひずみ条件下でのHASMCの細胞形態、配向、および表現型の変化。 (A)HASMC細胞株(CRL1999)をPDMSチップ上で培養した後の3日目と5日目のLIVE/DEADアッセイの代表的な画像。(B)静圧およびひずみ条件下でのCRL1999のF-アクチン染色。(C)静的およびひずみ条件下でのCRL1999の細胞配向。静的およびひずみ条件下でのCRL1999におけるSM22(D)およびCNN1(E)の免疫蛍光染色の代表像。(F)SM22およびCNN1の免疫蛍光染色の相対強度。(g)静的およびひずみ条件下でのCRL1999における SM22 および CNN1 mRNA発現。n = 3, *p < 0.05, **p < 0.01, ****p < 0.001, ****p < 0.0001, 両側スチューデント のt検定 を用いて2群を比較した。データは平均±SDを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:BAV-TAADおよびTAV-TAAD患者由来のHASMC-OOCにおける細胞形態および表現型の変化。静的およびひずみ条件下でのBAV-TAAD(A)由来初代HASMCおよびTAV-TAAD(B)由来初代HASMCのF-アクチン染色の代表的な画像。静的およびひずみ条件下でのBAV-TAAD(C)由来の一次HASMCおよびTAV-TAAD(D)由来の一次HASMCにおけるSM22免疫蛍光染色。静的およびひずみ条件下でのBAV-TAAD(E)由来一次HASMCおよびTAV-TAAD(F)由来一次HASMCにおけるCNN1の免疫蛍光染色の代表的な画像。(G)BAV-TAAD由来の一次HASMCにおけるSM22およびCNN1免疫蛍光染色の相対強度。(h)静的およびひずみ条件下でのBAV-TAAD由来の初代HASMCにおけるSM22およびCNN1 mRNA発現。(I)TAV-TAAD由来の初代HASMCにおけるSM22およびCNN1免疫蛍光染色の相対強度。(J)静的およびひずみ条件下でのTAV-TAAD由来の初代HASMCにおけるSM22およびCNN1 mRNA発現。n = 3, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, 両側スチューデントのt検定を用いて2群を比較した。データは平均±SDを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:機器準備の概略説明。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
マイクロ流体技術の急速な発展に伴い、生物学、医学、薬理学への応用のために、1つまたは複数の臓器の生物学的機能と構造をin vitroで再現できるOOCモデルが近年登場しています15。OOCは、疾患メカニズムの探索と前臨床薬物翻訳の促進に不可欠な、ヒトの生理学的微小環境の主要な機能をシミュレートすることができます8,16。OOCはまだ初期段階にあり、OOCの設計を最適化するにはより多くのインプットが必要ですが、近年多くの進歩が見られました17,18。他の3次元細胞培養モデルとは異なり、OOCは、組織の発達と臓器機能の維持に不可欠な人体の生体力学的パラメータを模倣することができます。心血管系の器官および組織は、in vivoで流体流誘発せん断および周期的張力に絶えずさらされている。したがって、心血管系のin vitro細胞実験は、in vivo研究から得られたものに匹敵する現実的な実験結果を得るために、そのような生体力学的パラメータを提供する実験プラットフォームで実施する必要がある。
本研究では、HASMCが受ける生体力学的ひずみのパラメータを精密に制御できるHASMC-OOCを確立しました。細胞が受ける流体速度と流体せん断を制御し、周期ひずみのさまざまなパターンの振幅、周波数、およびリズムを正確に制御することが可能です。OOCの分野で使用されてきた多くの材料の中で、PDMSは最も広く採用されている19,20,21の1つです。PDMSは、透明で、柔軟性があり、生体適合性があり、通気性があり、これらの特性は、マイクロ流体チップの分野での幅広い使用に貢献しています19。加えられた圧力変化はPDMSを変形させて収縮と弛緩の機械的な力を達成する可能性があり、PDMSの透過性により、チップ上の細胞培養環境はインキュベーター内の37°Cで5%CO2のインキュベーション条件と一致することができます。したがって、PDMSは細胞に制御された機械的力を提供するだけでなく、正常な細胞増殖に適した培養環境も提供します。実験結果は、PDMSチップで培養された細胞の形態と活性が2D培養条件と一致していることを示しており、PDMSが生体適合性であることを示しています。
生体模倣の in vivo 生理学的条件下では、大動脈壁のHASMCは約9%22の周期的ひずみにさらされます。高血圧、大動脈拡張、大動脈瘤などの病理学的状態では、HASMCは16%23を超える周期的な緊張にさらされます。PDMSチップの引張特性を特徴づけ、実験結果は、10 kPaの真空圧が0.44%ひずみ±7.18、15 kPaが17.28 ± 0.91%ひずみを誘発することを示しています。さらに、ひずみおよび流体せん断応力の周波数は、このPDMSチップシステムによって制御することができる。BAV-TAADおよびTAV-TAAD患者由来の原発性HASMCを使用して、これらの大動脈疾患の分子メカニズムと薬物スクリーニングを、異なる大動脈疾患の疾患病因を再現できるこのHASMC-OOC インビトロ モデルを使用して行うことができます。このシステムを用いて、BAV-TAADの病態解明のための疾患モデルを確立し、ミトコンドリア融合活性化剤が罹患細胞のミトコンドリア機能障害を部分的に救済できることを明らかにしました24。
HASMC-OOCは、Ingberの作品9からのラングオンチップのインスピレーションと参照に基づいて設計されました。彼らのデバイスは肺の肺胞の生理学的呼吸運動を再現し、チップは3つの層で構成されていました:上部と下部の中流路、多孔質PDMS膜、および2つの側面真空チャンバー。サイド真空チャンバーは、高度なマイクロ流体装置を備えた専門の実験室でのみ製造できます。より一般的な実験室条件での組み立てを可能にするために、真空チャンバーをチップの上部と下部に配置しました。どちらのストレッチアプローチも同様の機能を備えているため、実験室の条件や研究ニーズに応じてチップ構造を選択できます。さらに、ヒト大動脈の管状構造を構造的に確立し、細胞からより多くの生物学的サンプルを取得して、さらに複雑な生物学的分析と実験アッセイを行うために、中流路、2つのPDMS膜、および上部と下部の真空チャンバーで構成される、より大きなチャネルを備えた5層のPDMSチップを確立しました。2つのPDMSメンブレンとPDMSチップの大きなチャンネルにより、細胞培養面積が最大8.4 cm2に増加し、タンパク質分析に十分なサンプルが提供されました。以前に報告されたプラットフォームは、主に脳動脈、末梢血管、または他の動脈疾患などのマイナー動脈疾患の調査に焦点を当てていました25,26。大動脈は直径25〜35mmの大きな血管であり、大動脈の中膜は主に高張力ひずみを受ける平滑筋細胞で構成されています。大動脈症の病理は、大動脈壁のリモデリング、平滑筋細胞のアポトーシス、および表現型の切り替えに関連しており、これらはすべて機械的ストレスによって調節することができます。したがって、患者由来のHASMCと引張ひずみは、HASMC-OOCの成功に不可欠な要素です。ただし、この研究にはいくつかの制限があります。HASMC-OOCは、HASMC、大動脈内皮細胞、線維芽細胞などの共培養血管細胞を利用しておらず、ヒト大動脈のin vivo微小環境をよりよくシミュレートし、これらの細胞間の相互作用を研究するために使用できます。HASMCはリズミカルな緊張を経験しますが、細胞は細胞外マトリックスを模倣できない平らなPDMS膜上で培養されています。今後の研究では、マイクロ流体チップと3Dバイオプリンティング技術を組み合わせることで、これらの限界を克服します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
著者らは、この研究が上海市科学技術委員会(20ZR1411700)、中国国家自然科学財団(81771971)、上海セーリングプログラム(22YF1406600)からの助成金によって支援されたことを認めている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0099-100ml | Used for cell immobilization |
| Alexa Fluor 350-labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0408 | Antibodies used for immunostaining |
| Bovine serum albumin | Beyotime | ST025-20g | |
| Calcium AM/PI | Invitrogen | L3224 | |
| Cell culture flask | Corning | 430639 | |
| CNN1 | Abcam | Ab46794 | |
| Commercial flexible PDMS membrane |
Hangzhou Bald Advanced Materials | KYQ-200 | |
| F-actin | Invitrogen | R415 | |
| FBS | Sigma | M8318 | |
| Hoses | Runze Fluid | 96410 | 1 mm inner diameter; 3 mm outer diameter; 1 mm wall thickness; Official website address: https://www.runzefluidsystem.com |
| Human aortic smooth muscle cell line CRL1999 |
ATCC | Lot Number:70019189 | |
| Image J | Imagej.net/fiji/downloads | Free Download: https://fiji.sc | Imaging platform that is used to identify fluorescence intensity |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment. |
|
| Luer | Runze Fluid | RH-M016 | Official website address: https://www.runzefluidsystem.com. |
| Microscope | Olympus | ||
| mouse collagen | Sigma | C7661 | |
| Oxygen plasma | Changzhou Hongming Instrument | HM-Plasma5L | |
| Pasteur pipette | Biologix | 30-0138A1 | |
| PBS | Beyotime | C0221A | |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture. |
| peristaltic pump | Kamoer | F01A-STP-B046 | |
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| PLC controller | Zhejiang Jun Teng (BenT) CNC factory | BR010-11T8X2M | The detailed program setting can be found in supplementary. Official website address: files.http://www.btcnc.net |
| polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| SM22 | Abcam | ab14106 | |
| SMCM | ScienCell | Cat 1101 | |
| solenoid valve | SMC (China) | VQZ300 | |
| Syringe | Becton,Dickinson and Company | 300841 | |
| Triton-X 100 | Beyotime | ST795 | To penetrate cell membranes |
| Trizol | Invitrogen | 10296010 | Used for RNA extraction |
| trypsin | Sigma | 15400054 | |
| vacuum filter | SMC (China) | ZFC5-6 | Official website address: https://www.smc.com.cn |
| vacuum pump | Kamoer | KVP15-KL-S | |
| vacuum regulator | AirTAC | GVR-200-06 | |
| Primers | |||
| Primer Name | Forward (5’ to 3’) | Reverse (5’ to 3’) | |
| SM22 | CCGTGGAGATCCCAACTGG | CCATCTGAAGGCCAATGACAT | |
| CNN1 | CTCCATTGACTCGAACGACTC | CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA |
References
- Olsson, C., Thelin, S., Ståhle, E., Ekbom, A., Granath, F. Thoracic aortic aneurysm and dissection: increasing prevalence and improved outcomes reported in a nationwide population-based study of more than 14,000 cases from 1987 to 2002. Circulation. 114 (24), 2611-2618 (2006).
- van Varik, B. J., et al. Mechanisms of arterial remodeling: lessons from genetic diseases. Frontiers in Genetics. 3 (290), 1-10 (2012).
- Halka, A. T., et al. The effects of stretch on vascular smooth muscle cell phenotype in vitro. Cardiovascular Pathology. 17 (2), 98-102 (2008).
- Wang, Y., et al. Arterial wall stress induces phenotypic switching of arterial smooth muscle cells in vascular remodeling by activating the YAP/TAZ signaling pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (2), 842-853 (2018).
- Fabre, K., et al. Introduction to a manuscript series on the characterization and use of microphysiological systems (MPS) in pharmaceutical safety and ADME applications. Lab on a Chip. 20, 1049-1057 (2020).
- Golding, H., Khurana, S., Zaitseva, M. What is the predictive value of animal models for vaccine efficacy in humans? The importance of bridging studies and species-independent correlates of protection. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (4), 028902 (2018).
- Ingber, D. E. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nature Reviews. Genetics. 25, 1-25 (2022).
- Niu, L., et al. Microfluidic chip for odontoblasts in vitro. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (9), 4844-4851 (2019).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (69), 1-25 (2017).
- Yoon No, D., Lee, K. H., Lee, J., Lee, S. H. 3D liver models on a microplatform: well-defined culture, engineering of liver tissue and liver-on-a-chip. Lab on a Chip. 15 (19), 3822-3837 (2015).
- Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
- Jastrzebska, E., Tomecka, E., Jesion, I. Heart-on-a-chip based on stem cell biology. Biosensors & Bioelectronics. 75 (1), 67-81 (2016).
- Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Netherlands Heart Journal. 15 (3), 100-108 (2007).
- Perestrelo, A. R., Águas, A. C., Rainer, A., Forte, G. Microfluidic organ/body-on-a-chip devices at the convergence of biology and microengineering. Sensors. 15 (12), 31142-31170 (2015).
- Liu, Y., et al. Construction of cancer-on-a-chip for drug screening. Drug Discovery Today. 26 (8), 1875-1890 (2021).
- Yang, Q., et al. Design of organ-on-a-chip to improve cell capture efficiency. International Journal of Mechanical Sciences. 209, 106705 (2021).
- Yang, Q., Lian, Q., Xu, F. Perspective: Fabrication of integrated organ-on-a-chip via bioprinting. Biomicrofluidics. 11 (3), 031301 (2017).
- Mohammed, M. I., et al. Fabrication of microfluidic devices: improvement of surface quality of CO2 laser machined poly (methylmethacrylate) polymer. Journal of Micromechanics and Microengineering. 27 (1), 015021 (2017).
- Tsao, C. W. Polymer microfluidics: Simple, low-cost fabrication process bridging academic lab research to commercialized production. Micromachines. 7 (12), 225-236 (2016).
- Kirschbaum, S. E., Baeumner, A. J. A review of electrochemiluminescence (ECL) in and for microfluidic analytical devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (14), 3911-3926 (2015).
- Stefanadis, C., et al. Pressure-diameter relation of the human aorta. A new method of determination by the application of a special ultrasonic dimension catheter. Circulation. 92 (8), 2210-2219 (1995).
- Williams, B. Mechanical influences on vascular smooth muscle cell function. Journal of Hypertension. 16 (12), 1921-1929 (1998).
- Abudupataer, M., et al. Aorta smooth muscle-on-a-chip reveals impaired mitochondrial dynamics as a therapeutic target for aortic aneurysm in bicuspid aortic valve disease. eLife. 10, 69310 (2021).
- Poussin, C., et al. 3d human microvessel-on-a-chip model for studying monocyte-to-endothelium adhesion under flow - application in systems toxicology. Altex. 1, 47-63 (2020).
- Yasotharan, S., Pinto, S., Sled, J. G., Bolz, S., Gunther, A. Artery-on-a-chip platform for automated, multimodal assessment of cerebral blood vessel structure and function. Lab on a Chip. 15, 2660-2669 (2015).
