体外 通过模拟胃肠液的多亚相交换 在 单个液滴中消化乳液
Summary
通过多亚相交换（绰号OCTOPUS）实现的悬滴表面薄膜平衡允许通过将原始散装溶液与模拟的胃肠道液体进行顺序亚相交换来模拟消化条件。通过原位记录消化界面层的界面张力来监测模拟的体外消化。
Abstract
乳液目前正被用于封装和输送营养物质和药物，以解决不同的胃肠道疾病，如肥胖、营养强化、食物过敏和消化系统疾病。乳液提供所需功能的能力，即到达胃肠道内的特定部位，抑制/延缓脂解或促进消化率，最终取决于其在胃肠道中对酶降解的敏感性。在水包油乳液中，脂滴被界面层包围，乳化剂在其中稳定乳液并保护包封的化合物。实现乳液的定制消化率取决于其初始成分，但还需要监测这些界面层的演变，因为它们经历了胃肠道消化的不同阶段。通过多亚相交换实现的悬滴表面膜平衡允许通过应用定制的静态消解模型来模拟浸入油中的单个水滴中乳液的 体外 消解。通过原始液滴散装溶液与人工培养基的亚相交换来模拟通过胃肠道的运输，模拟胃肠道每个隔室/步骤的生理条件。界面张力的动态演变在整个模拟胃肠道消化过程中原 位 记录。在每个消化阶段（口腔、胃、小肠）后测量消化界面的机械性能，例如界面扩张弹性和粘度。可以调整每种消化介质的组成，以解释消化条件的特殊性，包括胃肠道病理和婴儿消化介质。确定了影响蛋白水解和脂肪分解的特定界面机制，为通过乳液的界面工程调节消化提供了工具。获得的结果可用于设计具有定制功能的新型食品基质，例如低过敏性、受控的能量摄入和降低消化率。
Introduction
了解脂肪的消化方式（涉及乳液消化）对于合理设计具有定制功能的产品非常重要1.脂肪消化的基质是乳液，因为脂肪在食用时通过机械作用并与口腔和胃中的生物表面活性剂混合而乳化。此外，人类消耗的大部分脂肪已经乳化（例如奶制品），对于婴儿或一些老年人来说，这是唯一的消费形式。因此，具有特定消化特性的乳液基产品的设计在营养学中非常重要1。此外，乳液可以封装和输送营养素、药物或亲脂性生物活性物质2 ，以解决不同的胃肠道疾病，如肥胖3、营养强化、食物过敏和消化系统疾病。在水包油乳液中，脂滴被蛋白质、表面活性剂、聚合物、颗粒和混合物等乳化剂的界面层包围4.乳化剂的作用是双重的：稳定乳液5 和保护/运输包封的化合物到特定部位。实现乳液的定制消化率取决于其初始组成，但还需要监测该界面在通过胃肠道的过程中的持续演变（图1）。
图 1：应用乳液的界面工程来解决一些主要的胃肠道疾病。 请点击此处查看此图的大图。
脂质消化最终是一个界面过程，因为它需要脂肪酶（胃或胰腺）通过界面层吸附到乳化脂滴的油水界面上，以到达并水解油中所含的甘油三酯成游离脂肪酸和单酰基甘油酯6。 图 2 对此进行了示意图。胃脂肪酶与胃中的胃蛋白酶和磷脂竞争油水界面（图2，胃消化）。然后，胰脂肪酶/大肠脂肪酶与胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶、磷脂、胆盐和小肠消化产物竞争。蛋白酶可以改变界面覆盖，防止或有利于脂肪酶吸附，而胆盐具有高度表面活性，并取代大部分剩余的乳化剂以促进脂肪酶吸附（图2，肠道消化）。最终，脂肪分解的速率和程度取决于初始/胃消化乳液的界面特性，例如厚度、分子间/分子内连接以及静电和空间位阻相互作用。因此，监测界面层在消化过程中的演变提供了一个实验平台，以确定影响脂肪酶吸附和脂质消化的界面机制和事件。
图 2：说明界面在胃肠道脂质消化中的作用的示意图。 胃蛋白酶水解改变胃期的界面组成，而胃脂肪酶水解甘油三酯。在小肠中，胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶进一步水解界面膜，而脂肪分解通过BS/脂肪酶的吸附，甘油三酯的水解以及脂解产物的解吸在BS胶束/复合物中溶解来进行。 请点击此处查看此图的大图。
格拉纳达大学（UGR）的悬垂滴落设备采用专利技术，即同轴双毛细管，可实现散装溶液7的亚相交换。保持垂滴的毛细管由两个同轴毛细管组成，这两个毛细管独立连接到双显微注射器的每个通道。每个微量注射器可以独立运行，允许通过通流7交换掉落的内容物。因此，亚相交换包括用内毛细管同时注入新溶液，以及使用相同的流速用外毛细管提取本体溶液。该过程允许更换本体溶液，而不会干扰界面区域或液滴的体积。该程序后来升级为多亚相交换，允许液滴本体溶液8的多达8次顺序亚相交换。这可以通过依次将散装溶液与模拟不同隔室（口腔、胃、小肠）的人工培养基交换，模拟悬浮在脂质介质中的单个水滴中的消化过程。整个设置如图 3所示，包括组件的详细信息。微量注射器中的注射器连接到八个通孔阀，每个通孔阀连接到装有人工消化液的微量离心管，其组件如图 2所示。
图 3：章鱼及其所有组件的一般视图。 CCD相机、显微镜、微定位器、热稳定细胞和双毛细管独立连接到双显微注射器，两个注射器连接到八个通孔阀。每个注射器与毛细管连接，四个带样品的微量离心管和一个放电。 请点击此处查看此图的大图。
图4A 显示了如何将每种人工消化液通过双毛细管的亚相交换注入垂液滴中。 图2 中详述的每种消化复合物可以同时/顺序应用，模拟通过胃肠道的通道。人工消化液含有不同的酶和生物表面活性剂，它们改变了初始乳化剂的界面张力，如图 4B所示。同样在UGR开发的DINATEN软件（见 材料表）实时记录了初始界面层在 体外消化时界面张力的演变。此外，在每个消化阶段之后，通过将体积/界面面积的周期性振荡施加到稳定的界面层上并记录界面张力的响应来计算界面层的膨胀弹性。振荡的周期/频率和幅度可以改变，使用软件CONTACTO进行图像处理可提供膨胀流变参数8。
图 4：消解曲线示例 。 （A）初始乳化剂层经受人工消化介质置于微量离心机中，通过将不同的溶液依次亚相交换到悬滴中。（B）初始乳化剂的界面张力（y轴）作为时间（x轴）的一般演变，因为它在 体外 被人工培养基中的各种酶/生物表面活性剂消化。与普通肠液的最终亚相交换通过溶解在混合胶束中测量消化脂质的解吸。 请点击此处查看此图的大图。
本研究介绍了旨在使用侧滴设备测量界面层体外消化的一般方案9.初始界面层依次暴露于模拟通过胃肠道的条件，如图2所示。通过微量离心管中包含的不同溶液的亚相交换将这些不同的消化介质注入悬滴中（图4A）。这些培养基的组成可以根据将要评估的胃肠道状况进行定制，即胃/肠蛋白水解/脂肪分解，从而可以测量累积效应和益处10。用于模拟每个隔室中消化过程的实验条件遵循INFOGEST发布的国际共识协议，详细说明了电解质和酶的pH和量11。基于悬滴的实验装置允许在整个模拟消解过程中原位记录界面张力。在每个消化步骤结束时计算界面层的膨胀流变性。通过这种方式，每种乳化剂都提供了一个消解曲线，说明消解界面的特性，如图4B所示。这允许提取有关其对消化过程不同阶段的敏感性或抵抗力的结论。一般来说，人工消化介质含有酸/碱性pH值，电解质，蛋白酶（胃和肠），脂肪酶（胃和肠），胆盐和磷脂，它们溶解在各自的消化液（胃或肠）中。图4B显示了乳化剂界面张力演变的一般特征，首先受到蛋白酶作用，然后是脂肪酶。通常，由于水解肽9，12的解吸，界面层的蛋白水解促进了界面张力的增加，而脂解由于胆盐和脂肪酶的吸附而导致界面张力的急剧降低13。与肠液的最终亚相交换耗尽未吸附/消化物质的本体溶液，并促进可溶性化合物的解吸和消化脂质在混合胶束中的溶解。这是通过记录的界面张力增加来量化的（图4B）。
总之，在悬滴中实施的实验设计以模拟单个液滴中的体外消化，允许测量当消化过程依次应用于初始界面层10时累积效应和协同作用。每种消化介质的组成可以很容易地调整，以解释消化条件的特殊性，包括胃肠道病理或婴儿消化介质14。然后，鉴定影响蛋白水解和脂肪分解的界面机制可用于通过乳液的界面工程调节消化。获得的结果可用于设计具有定制功能的新型食品基质，例如低过敏性、控制能量摄入和降低消化率15，16，17，18，19。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文介绍了使用悬垂滴剂设备测量界面层体外消化的通用方案。该方案可以通过调整消化缓冲液的组成来调整实验的具体要求，消化缓冲液基于INFOGEST11，20协调方案，以便于与文献进行比较。消化酶和生物表面活性剂可以单独、顺序或一起添加。后一种选择需要小心进行，因为界面层的饱和度会通过提供非常低的界面张力来阻碍不同的现象，并?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究由项目RTI2018-101309-B-C21和PID2020-631-116615RAI00资助，由MCIN/AEI/10.13039/501100011033和“ERDF创造欧洲的方式”资助。这项工作（部分）得到了格拉纳达大学（西班牙）生物胶体和流体物理小组（参考PAI-FQM115）的支持。
Materials
| Alpha-chymotrypsin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | C4129 | Enzyme |
| Beta-lactoglobulin | Sigma-Aldrich | L0130 | Emulsfier |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | Emulsfier |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | Electrolyte |
| Centrifuge | Kronton instruments | Centrikon T-124 | For separating oil and resins |
| Citrus pectin | Sigma-Aldrich | P9135 | Emulsfier |
| co-lipase FROM PORCINE PANCREAS | Sigma | C3028 | Enzyme |
| CONTACTO | University of Granada (UGR) | https://core.ugr.es/dinaten/, last access: 07/18/2022 | |
| DINATEN | University of Granada (UGR) | https://core.ugr.es/dinaten/, last access: 07/18/2022 | |
| Gastric lipase | Lipolytech | RGE15-1G | Enzyme |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | 70024-90-7 | Emulsifier |
| INFOGEST | http://www.proteomics.ch/IVD/ | ||
| Lipase from porcine pancreas, type II | Sigma-Aldrich | L33126 | Enzyme |
| Magnesium metasilicate resins | Fluka | 1343-88-0 | Resins to purify oil |
| Micro 90 | International products | M-9051-04 | Cleaner |
| NaCl | Sigma | 7647-14-5 | Electrolyte |
| NaH2PO4 | Scharlau | 10049-21-5 | To prepare buffer |
| OCTOPUS | Producciones Científicas y Técnicas S.L. (Gójar, Spain) | Pendandt Drop Equipment implemented with multi subphase exchange | |
| Olive oil | Sigma-Aldrich | 1514 | oil |
| Pancreatic from porcine pancreas | Sigma | P7545-25 g | Enzyme |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P6887 | Enzyme |
| Pluronic F127 | Sigma | P2443 | Emulsifier |
| Pluronic F68 | Sigma | P1300 | Emulsfier |
| Sodium deoxycholate | Sigma | Bile salts | |
| Sodium glycodeoxycholate | Sigma | C9910 | Bile salts |
| Sodium taurocholate | Sigma | 86339 | Bile salts |
| Syringe Filter | Millex-DP | SLGP033R | Syringe Filter 0.22 µm pore size polyethersulfone |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | Enzyme |
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