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Biochemistry

In vitro Digestion d’émulsions dans une seule gouttelette par échange multi-sous-phase de fluides gastro-intestinaux simulés

Published: November 18, 2022 doi: 10.3791/64158
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Department of Applied Physics, Faculty of Sciences, Campus de Fuentenueva, University of Granada, 2Department of Physical Chemistry, Faculty of Pharmacy, Campus de Cartuja, University of Granada, 3Department of Software Engineering, School of Computer and Telecommunication Engineering, Campus de Aynadamar, University of Granada

Summary

Une balance de film de surface de goutte pendante mise en œuvre avec un échange multi-sous-phase, surnommé OCTOPUS, permet d’imiter les conditions digestives par l’échange séquentiel en sous-phase de la solution en vrac originale avec des fluides gastro-intestinaux simulés. La digestion in vitro simulée est surveillée en enregistrant in situ la tension interfaciale de la couche interfaciale digérée.

Abstract

Les émulsions sont actuellement utilisées pour encapsuler et fournir des nutriments et des médicaments pour lutter contre différentes affections gastro-intestinales telles que l’obésité, l’enrichissement en nutriments, les allergies alimentaires et les maladies digestives. La capacité d’une émulsion à fournir la fonctionnalité souhaitée, à savoir atteindre un site spécifique dans le tractus gastro-intestinal, inhiber / retarder la lipolyse ou faciliter la digestibilité, dépend finalement de sa susceptibilité à la dégradation enzymatique dans le tractus gastro-intestinal. Dans les émulsions huile-dans-eau, les gouttelettes lipidiques sont entourées de couches interfaciales, où les émulsifiants stabilisent l’émulsion et protègent le composé encapsulé. La réalisation d’une digestibilité sur mesure des émulsions dépend de leur composition initiale, mais nécessite également de surveiller l’évolution de ces couches interfaciales lorsqu’elles sont soumises à différentes phases de digestion gastro-intestinale. Une balance de film de surface de goutte pendante mise en œuvre avec un échange multi-sous-phase permet de simuler la digestion in vitro d’émulsions dans une seule gouttelette aqueuse immergée dans l’huile en appliquant un modèle de digestion statique personnalisé. Le transit dans le tractus gastro-intestinal est imité par l’échange en sous-phase de la solution originale en vrac de gouttelettes avec des milieux artificiels, imitant les conditions physiologiques de chaque compartiment / étape du tractus gastro-intestinal. L’évolution dynamique de la tension interfaciale est enregistrée in situ tout au long de la digestion gastro-intestinale simulée. Les propriétés mécaniques des interfaces digérées, telles que l’élasticité dilatationnelle interfaciale et la viscosité, sont mesurées après chaque phase de digestion (orale, gastrique, intestin grêle). La composition de chaque milieu digestif peut être ajustée pour tenir compte des particularités des affections digestives, y compris les pathologies gastro-intestinales et les milieux digestifs infantiles. Les mécanismes interfaciaux spécifiques affectant la protéolyse et la lipolyse sont identifiés, fournissant des outils pour moduler la digestion par l’ingénierie interfaciale des émulsions. Les résultats obtenus peuvent être manipulés pour concevoir de nouvelles matrices alimentaires avec des fonctionnalités adaptées telles qu’une faible allergénicité, un apport énergétique contrôlé et une digestibilité réduite.

Introduction

Comprendre comment les graisses sont digérées, ce qui implique la digestion des émulsions, est important pour concevoir rationnellement des produits avec des fonctionnalités sur mesure1. Le substrat pour la digestion des graisses est une émulsion puisque la graisse est émulsionnée lors de la consommation par action mécanique et mélange avec des biosurfactants dans la bouche et l’estomac. En outre, la plupart des graisses consommées par les humains sont déjà émulsionnées (comme les produits laitiers), et dans le cas des nourrissons ou de certaines personnes âgées, c’est la seule forme de consommation. Par conséquent, la conception de produits à base d’émulsion avec des profils de digestion spécifiques est très importante dans la nutrition1. De plus, les émulsions peuvent encapsuler et fournir des nutriments, des médicaments ou des bioactifs lipophiles2 pour lutter contre différentes affections gastro-intestinales telles que l’obésité3, l’enrichissement en nutriments, les allergies alimentaires et les maladies digestives. Dans les émulsions huile-dans-eau, les gouttelettes lipidiques sont entourées de couches interfaciales d’émulsifiants tels que des protéines, des tensioactifs, des polymères, des particules et des mélanges4. Le rôle des émulsifiants est double : stabiliser l’émulsion5 et protéger/transporter le composé encapsulé vers un site spécifique. La réalisation d’une digestibilité adaptée des émulsions dépend de leur composition initiale mais nécessite également de suivre l’évolution continue de cette interface lors du transit dans le tractus gastro-intestinal (Figure 1).

Figure 1
Figure 1: Application de l’ingénierie interfaciale des émulsions pour s’attaquer à certaines des principales affections gastro-intestinales. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La digestion lipidique est finalement un processus interfacial car elle nécessite l’adsorption de lipases (gastriques ou pancréatiques) sur l’interface huile-eau de gouttelettes lipidiques émulsionnées à travers la couche interfaciale pour atteindre et hydrolyser les triglycérides contenus dans l’huile en acides gras libres et monoacylglycérides6. Ceci est schématisé à la figure 2. La lipase gastrique entre en compétition avec la pepsine et les phospholipides dans l’estomac pour l’interface huile-eau (Figure 2, digestion gastrique). Ensuite, la lipase / colipase pancréatique est en concurrence avec la trypsine / chymotrypsine, les phospholipides, les sels biliaires et les produits digestifs dans l’intestin grêle. Les protéases peuvent altérer la couverture interfaciale, empêchant ou favorisant l’adsorption de la lipase, tandis que les sels biliaires sont très actifs en surface et déplacent la majeure partie de l’émulsifiant restant pour favoriser l’adsorption de la lipase (Figure 2, digestion intestinale). Finalement, le taux et l’étendue de la lipolyse dépendent des propriétés interfaciales de l’émulsion digérée initiale / gastrique, telles que l’épaisseur, les connexions inter/ intramoléculaires et les interactions électrostatiques et stériques. En conséquence, le suivi de l’évolution de la couche interfaciale au fur et à mesure de sa digestion offre une plate-forme expérimentale pour identifier les mécanismes et événements interfaciaux affectant l’adsorption de la lipase et, par conséquent, la digestion des lipides.

Figure 2
Figure 2 : Schéma illustrant le rôle des interfaces dans la digestion des lipides gastro-intestinaux. L’hydrolyse de la pepsine modifie la composition interfaciale au niveau de la phase gastrique, tandis que la lipase gastrique hydrolyse les triglycérides. Dans l’intestin grêle, la trypsine/chymotrypsine hydrolyse davantage le film interfacial, tandis que la lipolyse procède par l’adsorption des BS/lipases, l’hydrolyse des triglycérides et la désorption des produits lipolytiques par solubilisation dans les micelles/complexes BS. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

L’équipement de chute suspendue de l’Université de Grenade (UGR) est mis en œuvre avec une technologie brevetée, le double capillaire coaxial, qui permet l’échange en sous-phase de la solution en vrac7. Le capillaire, qui retient la goutte pendante, consiste en un arrangement de deux capillaires coaxiaux qui sont connectés indépendamment à chaque canal d’un double microinjecteur. Chaque micro-injecteur peut fonctionner indépendamment, ce qui permet l’échange du contenu perdu par fluxtraversant 7. En conséquence, l’échange en sous-phase consiste en l’injection simultanée de la nouvelle solution avec le capillaire interne et l’extraction de la solution globale avec le capillaire externe en utilisant le même débit. Ce processus permet le remplacement de la solution en vrac sans perturbation de la zone interfaciale ou du volume de la gouttelette. Cette procédure a ensuite été mise à niveau vers un échange multi-sous-phase, qui permet jusqu’à huit échanges séquentiels en sous-phase de la solution de masse de gouttelettes8. Cela permet de simuler le processus digestif dans une seule gouttelette aqueuse en suspension dans un milieu lipidique en échangeant séquentiellement la solution en vrac avec des milieux artificiels imitant les différents compartiments (bouche, estomac, intestin grêle). L’ensemble de la configuration est représenté à la figure 3, y compris les détails des composants. Les seringues du micro-injecteur sont reliées aux huit valves vias, chacune étant reliée à un tube microcentrifuge contenant le liquide digestif artificiel avec les composants décrits à la figure 2.

Figure 3
Figure 3 : Vue générale de l’OCTOPUS avec tous les composants. La caméra CCD, le microscope, le micropositionneur, la cellule thermostabilisée et le double capillaire sont connectés indépendamment à un double micro-injecteur avec deux seringues reliées à huit valves vias. Chaque seringue se connecte avec un capillaire, quatre tubes microcentrifugés avec échantillon et une décharge. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La figure 4A montre comment chacun des fluides digestifs artificiels est injecté dans le pendentif goutte à goutte par échange de sous-phase à travers le double capillaire. Chaque composé digestif détaillé à la figure 2 peut être appliqué simultanément/séquentiellement, simulant le passage dans le tractus gastro-intestinal. Les fluides digestifs artificiels contiennent différentes enzymes et biosurfactants, qui modifient la tension interfaciale de l’émulsifiant initial, comme le montre la figure 4B. Le logiciel DINATEN (voir Tableau des matériaux), également développé à l’UGR, enregistre l’évolution de la tension interfaciale en temps réel au fur et à mesure que la couche interfaciale initiale est digérée in vitro. De plus, après chaque phase digestive, l’élasticité dilatationnelle de la couche interfaciale est calculée en imposant des oscillations périodiques de volume / zone interfaciale sur la couche interfaciale stabilisée et en enregistrant la réponse de la tension interfaciale. La période/fréquence et l’amplitude de l’oscillation peuvent être variées, et le traitement d’image avec le logiciel CONTACTO fournit les paramètres rhéologiques dilatationnels8.

Figure 4
Figure 4 : Exemples de profils de digestion. (A) La couche émulsifiante initiale est soumise à des milieux digestifs artificiels placés dans la microcentrifugeuse par échange séquentiel en sous-phase des différentes solutions dans la goutte pendante. (B) L’évolution générale de la tension interfaciale (axe y) de l’émulsifiant initial en fonction du temps (axe des abscisses) tel qu’il est digéré in vitro par les différentes enzymes/biosurfactants dans les milieux artificiels. Un échange final en sous-phase avec le liquide intestinal ordinaire mesure la désorption des lipides digérés par solubilisation en micelles mixtes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Cette étude présente le protocole général conçu pour mesurer la digestion in vitro des couches interfaciales avec un équipement de goutte pendentif9. La couche interfaciale initiale est soumise séquentiellement à des conditions imitant le passage dans le tractus gastro-intestinal, comme illustré à la figure 2. Ces différents milieux digestifs sont injectés dans le pendentif goutte à goutte par échange sous-phase des différentes solutions contenues dans les tubes microcentrifugeuses (Figure 4A). La composition de ces milieux peut être personnalisée en fonction des conditions gastro-intestinales qui seront évaluées, à savoir, protéolyse gastrique/intestinale/lipolyse, permettant de mesurer les effets cumulatifs et les sinergies10. Les conditions expérimentales utilisées pour imiter le processus de digestion dans chaque compartiment suivent le protocole de consensus international publié par INFOGEST détaillant le pH et les quantités d’électrolytes et d’enzymes11. Le dispositif expérimental basé sur la goutte pendante permet d’enregistrer la tension interfaciale in situ tout au long du processus de digestion simulé. La rhéologie dilatationnelle de la couche interfaciale est calculée à la fin de chaque étape digestive. De cette façon, chaque émulsifiant offre un profil de digestion illustrant les propriétés des interfaces digérées, comme illustré à la figure 4B. Cela permet d’extraire des conclusions concernant sa susceptibilité ou sa résistance aux différentes étapes du processus digestif. En général, les milieux digestifs artificiels contiennent du pH acide/basique, des électrolytes, des protéases (gastriques et intestinales), des lipases (gastriques et intestinales), des sels biliaires et des phospholipides, qui sont dissous dans leurs liquides digestifs respectifs (gastrique ou intestinal). La figure 4B montre un profil générique de l’évolution de la tension interfaciale d’un émulsifiant, d’abord soumise à une action protéase, puis à des lipases. En général, la protéolyse de la couche interfaciale favorise une augmentation de la tension interfaciale due à la désorption des peptides hydrolysés9,12, tandis que la lipolyse entraîne une réduction très forte de la tension interfaciale due à l’adsorption des sels biliaires et des lipases 13. Un échange final en sous-phase avec le liquide intestinal épuise la solution en vrac de matière non adsorbée/digérée et favorise la désorption des composés solubles et la solubilisation des lipides digérés dans des micelles mixtes. Ceci est quantifié par l’augmentation de la tension interfaciale enregistrée (Figure 4B).

En résumé, la conception expérimentale mise en œuvre dans la goutte pendante pour simuler la digestion in vitro dans une seule gouttelette permet de mesurer les effets cumulatifs et les synergies lorsque le processus de digestion est appliqué séquentiellement à la couche interfaciale initiale10. La composition de chaque milieu digestif peut être facilement ajustée pour tenir compte des particularités des affections digestives, y compris les pathologies gastro-intestinales ou les milieux digestifs infantiles14. Ensuite, l’identification des mécanismes interfaciaux affectant la protéolyse et la lipolyse peut être utilisée pour moduler la digestion par l’ingénierie interfaciale des émulsions. Les résultats obtenus peuvent être appliqués à la conception de nouvelles matrices alimentaires avec des fonctionnalités adaptées telles qu’une faible allergénicité, un apport énergétique contrôlé et une digestibilité réduite 15,16,17,18,19.

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Protocol

1. Séquence de nettoyage de toute la verrerie utilisée dans l’expérimentation scientifique des surfaces

  1. Frottez la verrerie avec une solution de nettoyage concentrée (voir le tableau des matériaux) diluée dans de l’eau (10%).
  2. Rincer abondamment avec une séquence d’eau du robinet, de propanol, d’eau distillée et d’eau ultrapure. Sécher dans une cabine et conserver dans une armoire fermée jusqu’à utilisation.

2. Préparation des échantillons

  1. Préparer les milieux digestifs artificiels selon les protocoles normalisés INFOGEST11,20 (voir le tableau des matériaux). Pour plus de détails, voir le tableau 1 et inclure de petites adaptations aux exigences du travail interfacial pour prévenir la contamination tensio-active et la dilution des échantillons (1:10)10.
  2. Préparez la solution émulsifiante en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Préparer 0,01 L d’une solution concentrée de (1 kg) L−1) émulsifiant ou mélange d’émulsifiants (voir le tableau des matières) dans un tampon initial (tableau 1) et conserver sous agitation légère pendant la nuit.
    2. Diluer à 0,1 kg· L−1 (ou selon les besoins) pour saturer l’interface; atteindre un pseudo plateau dans la tension interfaciale après 1 h d’adsorption à une zone interfaciale constante suivant le rapport publié précédemment21.
    3. Conserver sous agitation légère pendant 15 minutes avant utilisation.
  3. Purifier la phase huileuse.
    1. Préparez un mélange d’huile végétale (tournesol, olive, trioléine, etc.) et les résines métasilicates de magnésium (voir le tableau des matériaux) dans une proportion de 2:1 p/p dans un grand bécher. Conserver sous agitation mécanique légère pendant au moins 3 h.
    2. Centrifuger le mélange à 8 000 x g pendant 30 minutes à température ambiante dans une centrifugeuse commerciale (voir le tableau des matières).
    3. Filtrer le mélange d’huile sous vide à l’aide d’un filtre à seringue (taille des pores de 0,2 μm) (voir le tableau des matières). Conserver dans des bouteilles d’ambre propres scellées et barbotées d’azote jusqu’à utilisation.

3. Calibrage et nettoyage de l’OCTOPUS

  1. Rincer tous les tubes à l’eau ultrapure en réglant une séquence de nettoyage des seringues et de toutes les valves à travers un capillaire (valves 6/4) et à la sortie externe (valve 8-couleur bleue). Pour ce faire, appuyez sur le bouton Nettoyer dans la boîte de dialogue de gauche (Figure supplémentaire 1A).
  2. Vérifier la tension superficielle7 de l’eau à température ambiante en formant une gouttelette d’eau et en mesurant en temps réel pendant 5 min (Figure supplémentaire 1B, C).
    1. Régler la densité différentielle air-eau (0,9982 kg· L−1) dans la boîte de dialogue de gauche, Figure supplémentaire 1B.
  3. Remplissez la cuvette propre (verre optique) avec 0,002 L d’huile végétale propre et placez-la dans le porte-cuvette de la cellule thermostatique (Figure 3).
  4. Réglez le thermostat et laissez l’équilibre de la température à 37 °C.
  5. Vérifiez la tension interfaciale de l’eau-huile à température ambiante7.
    1. Régler la densité différentielle par rapport à l’huile végétale-eau (huile d’olive: 0,800 kg· L−1) (figure supplémentaire 1C).
    2. Injecter 40 μL à un débit de 0,5 μL·s−1 et mesurer en temps réel toutes les secondes jusqu’à la fin de l’injection. Il s’agit d’un processus dynamique simple (Figure supplémentaire 1B, D).
    3. Tracer la tension interfaciale en fonction du volume des gouttelettes dans une fiche technique.
    4. Vérifiez que la plage de volume des gouttelettes fournit une valeur pour la tension interfaciale indépendante du volume des gouttelettes. Tracer la zone interfaciale en fonction du volume des gouttelettes.
    5. Programmez un processus comportant deux étapes (figure supplémentaire 1B et figure supplémentaire 2A) en suivant les étapes ci-dessous.
      1. Avec une seringue interne, injectez un volume contenu dans cette plage de tension interfaciale constante.
      2. Maintenir la surface interfaciale constante à la valeur sélectionnée à l’étape 3.5.4 et enregistrer la tension interfaciale pendant 5 min7.

4. Programmation d’un processus expérimental dans DINATEN pour chaque étape digestive

REMARQUE : Pour les paramètres de processus, voir la figure supplémentaire 1B.

  1. Effectuez le contrôle initial.
    1. Pour la formation de gouttes, injecter 10 μL (±5 μL) de solution émulsifiante dans le capillaire (valve 6) (Figure supplémentaire 2A).
    2. Enregistrer l’adsorption à une surface interfaciale constante 21 de 20 mm 2 (±10 mm2) pendant 1 h (figure supplémentaire 2B).
    3. Enregistrer la rhéologie dilatationnelle8 (figure supplémentaire 2C).
      1. Régler l’amplitude d’oscillation à 1,25 μL, période 10 s.
      2. Enregistrer l’adsorption à la zone interfaciale sélectionnée (étape 4.1.2) pendant 10 s.
      3. Répétez l’étape 4.1.3 à différentes périodes : 5 s, 20 s, 50 s et 100 s.
  2. Enregistrer la digestion gastrique.
    1. Enregistrer l’adsorption21 à la zone interfaciale sélectionnée pendant 10 s.
    2. Échange de sous-phase7 avec le liquide dans la valve 2 (sSGF) et les enzymes gastriques (tableau 1) (figure supplémentaire 2D).
      1. Remplissez la seringue gauche de la valve 2. Injecter 125 μL dans la valve 6-capillaire avec la seringue gauche à 5 μL·s−1.
      2. Extraire 125 μL du capillaire avec la seringue droite à 5 μL·s−1. Déchargez la seringue droite pour sortir de la valve 8. Répétez les étapes 4.2.2.1-4.2.2.2 10 fois pour assurer un échange complet.
    3. Enregistrer l’adsorption21 à la zone interfaciale sélectionnée à l’étape 4.1.2 pendant 1 h (figure supplémentaire 2B).
    4. Enregistrer la rhéologie dilatationnelle8 (figure supplémentaire 2C).
      1. Régler l’amplitude d’oscillation à 1,25 μL, période 10 s.
      2. Enregistrer l’adsorption de la zone interfaciale sélectionnée à l’étape 4.1.2 pendant 10 s. Répétez à différentes périodes: 5 s, 20 s, 50 s, 100 s.
  3. Enregistrer la digestion intestinale.
    1. Enregistrer l’adsorption21 à la zone interfaciale sélectionnée à l’étape 4.1.2 pendant 10 s (figure supplémentaire 2B).
    2. Échange de sous-phase7 avec du liquide dans la valve 3 (SIF) et des enzymes intestinales/sels biliaires/phospholipides (tableau 1) (figure supplémentaire 2D).
      1. Remplissez la seringue gauche de la valve 2. Injecter 125 μL dans la valve 6-capillaire avec la seringue gauche à 5 μL·s−1. Extraire 125 μL du capillaire avec la seringue droite à 5 μL·s−1.
      2. Déchargez la seringue droite pour sortir de la valve 8. Répétez les étapes 4.3.2.1-4.3.2.2 10 fois pour assurer un échange complet.
    3. Enregistrer l’adsorption21 à la zone interfaciale sélectionnée à l’étape 4.1.2 pendant 1 h.
    4. Enregistrer la rhéologie dilatationnelle8 (figure supplémentaire 2C).
      1. Régler l’amplitude d’oscillation à 1,25 μL, période 10 s.
      2. Enregistrer l’adsorption à la zone interfaciale sélectionnée à l’étape 4.1.2 pendant 10 s.
      3. Répétez à différentes périodes: 5 s, 20 s, 50 s, 100 s.
  4. Notez la désorption en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Enregistrer l’adsorption21 à la zone interfaciale sélectionnée à l’étape 4.1.2 pendant 10 s (figure supplémentaire 2B).
    2. Échange de sous-phase7 avec liquide dans la vanne 5 (sSIF) (tableau 1, figure supplémentaire 2D).
      1. Remplissez la seringue gauche de la valve 5. Injecter 125 μL dans la valve 5-capillaire avec la seringue gauche à 5 μL·s−1.
      2. Extraire 125 μL du capillaire avec la seringue droite à 5 μL·s−1. Déchargez la seringue droite pour sortir de la valve 8. Répétez les étapes 4.4.2.1-4.4.2.2 10 fois pour assurer un échange complet.
    3. Enregistrer l’adsorption21 à la zone interfaciale sélectionnée à l’étape 4.1.2 pendant 1 h (figure supplémentaire 2B).
    4. Enregistrer la rhéologie dilatationnelle8 (figure supplémentaire 2C).
      1. Maintenir l’amplitude de 1,25 μL, période 10 s.
      2. Enregistrer l’adsorption à la zone interfaciale sélectionnée à l’étape 4.1.2 pendant 10 s.
      3. Répétez l’étape 4.4.4 à différentes périodes : 5 s, 20 s, 50 s, 100 s.

5. Mise en place de l’expérience

  1. Remplissez les tubes de microcentrifugation avec le milieu de digestion artificiel et connectez chacun d’eux à la vanne respective par le tube correspondant.
  2. Remplir le tube dans les vannes 2 à 5 en nettoyant de la vanne 2, de la vanne 3, de la vanne 4 et de la vanne 5 jusqu’à la sortie externe (vanne 8) (figure supplémentaire 1A).
  3. Remplissez le tuyau dans la vanne 1 en nettoyant de la vanne 1 à la valve 6-capillaire 5 fois.
  4. Placez le capillaire dans la phase huileuse. Charger la seringue gauche avec la valve 1 (solution initiale, tableau 1).
  5. Commencez le traitement séquentiel de l’étape 4.1-initiale, de l’étape 4.2-gastrique, de l’étape 4.3-intestins et de l’étape 4.4-désorption, en enregistrant les données à la fin de chaque processus.

6. Calcul des paramètres rhéologiques dilatationnels avec le logiciel de traitement d’image CONTACTO8

REMARQUE : Pour plus de détails, voir Maldonado-Valderrama et coll.8.

  1. Charger les images correspondant à l’oscillation de surface à une fréquence et une amplitude données (Figure supplémentaire 3A).
  2. Appuyez sur Rhéologie (Figure supplémentaire 3B) et obtenez les paramètres de dilatation (Figure supplémentaire 3C).
  3. Copiez-collez les résultats dans la feuille de calcul des données.

7. Tracer les résultats expérimentaux

  1. Recalculez la colonne de temps dans chacune des étapes du processus de digestion en ajoutant les dernières données de l’heure de l’étape précédente.
  2. Tracez la tension interfaciale en fonction du temps additif pour chacune des étapes du processus de digestion utilisé.
  3. Tracer l’élasticité et la viscosité finales de tension interfaciale/dilatation obtenues à la fin de chaque étape par rapport à la phase de digestion : digestion initiale, digestion gastrique, digestion duodénale et désorption.

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Representative Results

Cette section présente différents exemples de profils de digestion mesurés avec l’OCTOPUS. L’aspect général des correspondances de profils de digestion simulées est illustré à la figure 4B. La tension interfaciale est généralement représentée contre le temps dans le profil de digestion. Les différentes phases/étapes de digestion considérées sont représentées en différentes couleurs. La première phase forme la couche initiale et correspond à la phase d’adsorption de l’émulsifiant ou de la protéine/tensioactif/polymère, selon les cas. Ensuite, les différents fluides digestifs sont injectés par échange de sous-phase dans une solution en vrac contenant le nouveau milieu. La nouvelle sous-phase produit des changements dans la tension interfaciale de la couche émulsifiante initiale et dans la rhéologie dilatationnelle mesurée à la fin de chaque étape digestive. Le processus de digestion peut comprendre un maximum de huit étapes digestives.

Figure 5
Figure 5 : Exemple de profils de digestion gastrique. (A) Protéolyse gastrique de l’albumine sérique humaine. Les milieux digestifs sont appliqués par échange de sous-phase avec des solutions détaillées dans la section expérimentale à T = 37 °C. Bleu : tampon initial avec protéine, rouge : sSGF avec pepsine. Reproduit avec la permission de del Castillo-Santaella et al.12. (B) Lipolyse gastrique de la pectine d’agrumes. Les milieux digestifs sont appliqués par échange de sous-phase avec des solutions détaillées dans la section expérimentale à T = 37 °C. Bleu : tampon initial avec pectine d’agrumes, jaune : sSGF avec lipase gastrique, gris : sSGF. Reproduit avec la permission de Infantes-Garcia et al.17. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La figure 5 montre quelques résultats expérimentaux obtenus pour la digestion gastrique des émulsifiants. Sur la figure 5A, l’albumine sérique humaine (HSA)12 est d’abord adsorbée sur l’interface huile d’olive-eau, diminuant la tension interfaciale pour atteindre un plateau après 1 h. A la fin de cette phase, la rhéologie est mesurée à 0,1 Hz (10 s) de fréquence (période). Dans la deuxième étape, le sSGF avec de la pepsine est ajouté par échange de sous-phase. Cela consiste à introduire un volume avec une seringue tout en extrayant le même volume avec l’autre seringue. De cette façon, la zone de la goutte ne change pas, maintenant les composants irréversiblement adsorbés à l’interface huile-eau. L’échange est répété entre 10 et 15 fois. Lors de l’échange en sous-phase avec le sSGF et la pepsine, la tension interfaciale augmente en raison de l’hydrolyse de la protéine, qui dilue la couche protéique initiale (Figure 5A). Sur la figure 5B, la pectine d’agrumes (CP)17 s’adsorbe sur l’huile-eau de triglycérides pendant 40 min, suivie d’une rhéologie dilatationnelle à 0,1 Hz. Dans la deuxième étape, le sSGF avec lipase gastrique est injecté dans la majeure partie de la goutte; Contrairement à la protéolyse, la lipolyse entraîne l’adsorption de la lipase et la formation d’acides gras, qui restent à l’interface, réduisant la tension interfaciale. La phase de désorption est la troisième étape, qui évalue la production d’hydrophilie ou la solubilisation des produits lipophiles de lipolyse. La figure 5B montre que l’échange de sous-phase avec sSGF fournit une réponse nulle de la tension interfaciale. Cela peut être interprété comme la production de produits digestifs lipophiles, qui s’adsorbent de manière irréversible et ne sont pas solubilisés, restant ancrés à l’interface. L’absence de sels biliaires dans la phase gastrique est responsable du manque de solubilisation. Le degré de lipolyse peut être analysé qualitativement par la valeur de la tension interfaciale atteinte.

Figure 6
Figure 6 : Exemple de profils de digestion intestinale. (A) Profils d’adsorption-désorption des sels biliaires (carrés noirs), de la lipase (triangles gris) et de la lipase + sels biliaires (rhomboïdes orange) dans le SIF à 37 °C. Reproduit avec la permission de Macierzanka et al.13. (B) Adsorption des sels biliaires + lipase sur F68 (vert foncé) et F127 (vert clair) préalablement adsorbés, adsorption des sels biliaires (jaune) dans le SIF s. Désorption: échange de sous-phase avec sSIF sur les sels biliaires (orange), F68 (violet foncé) et F127 (violet clair). Reproduit avec la permission de Torcello-Gómez et al.19. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La figure 6 montre les résultats expérimentaux obtenus pour la digestion intestinale des émulsifiants. Contrairement à la digestion gastrique, la présence de sels biliaires dans l’intestin grêle offre différents profils de désorption lors de l’échange en sous-phase avec le sSIF et de l’épuisement de la solution en vrac. La figure 6A montre les profils de désorption obtenus pour les sels biliaires purs, la lipase pure et les mélanges lipase/sels biliaires 8,9,10,13. Les sels biliaires s’adsorbent de manière réversible sur l’interface huile-eau et, par conséquent, ils sont complètement désorbés lors de l’échange de sous-phase avec le sSIF, comme l’indique l’augmentation de la tension interfaciale pour atteindre la valeur de l’interface huile-eau nue 8,13. Inversement, la lipase s’adsorbe de manière irréversible, comme le donne la valeur constante de la tension interfaciale après échange de sous-phase par sSIF. Le mélange lipase et sels biliaires fournit un profil de désorption intermédiaire quantifié par une augmentation limitée de la tension interfaciale lors de l’échange de sous-phase par sSIF à une valeur intermédiaire. La couche interfaciale restante contient de la lipase et des acides gras libres. Les sels biliaires ont peut-être désorbé de l’interface et solubilisé certains des acides gras libres formés dans la lipolyse. La figure 6B montre l’évolution de la tension interfaciale lors de la lipolyse de deux variantes de Pluronic : F127 et F6819. La figure 6B montre une forte diminution de la tension interfaciale due à l’adsorption de lipase et de sels biliaires et à la production d’acides gras libres sur les films interfaciaux précédemment formés de F68 et F127 à l’interface huile-eau. L’étape de désorption montre l’augmentation de la tension interfaciale causée par l’échange de sous-phase avec le sSIF, qui quantifie la solubilisation des produits lipolytiques.

Figure 7
Figure 7 : Exemple de profils complets de digestion gastro-intestinale dynamique. (A) Profil de digestion in vitro du film adsorbé AS-48 à l’interface air-eau. Les milieux digestifs sont appliqués par échange de sous-phase avec des solutions détaillées dans la section expérimentale à T = 37 °C. Contrôle: tampon initial avec AS-48, pepsine: sSGF avec pepsine, trypsine: sSIF avec trypsine + chymotrypsine, désorption: sSIF. Reproduit avec la permission de del Castillo-Santaella et al.18. (B) Profil de digestion in vitro des films adsorbés d’albumine sérique humaine et bovine à l’interface huile d’olive-eau. Les milieux digestifs sont appliqués par échange de sous-phase avec des solutions détaillées dans la section expérimentale à T = 37 °C. Contrôle: tampon initial avec HSA/BSA, pepsine: sSGF avec pepsine, trypsine: sSIF avec trypsine + chymotrypsine, lipolyse: sSIF avec lipase et sels biliaires, désorption: sSIF. Les courbes tracées sont des expériences représentatives avec des écarts <5%. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La figure 7 montre des exemples de profils de digestion simulés complets. La figure 7A montre le profil de digestion du bioconservateur alimentaire AS-48 adsorbé à l’interface air-eau18. Le processus digestif a été conçu pour se concentrer sur la protéolyse de ce peptide, tandis que la lipolyse de l’huile n’était pas nécessaire, étant à l’interface air-eau. Par conséquent, la digestion simulée dans la figure 7A comprend cinq étapes: contrôle/film initial, pepsinolyse, trypsinolyse et désorption. Les résultats expérimentaux ont montré que cette bactériocine est résistante à la fois à l’hydrolyse de la pepsine et de la trypsine, car la tension superficielle est restée inchangée. En conséquence, l’AS-48 a été considéré comme un bon agent de conservation biologique résistant à la digestion in vitro . La figure 7B compare les profils de digestion in vitro des couches adsorbées d’albumines sériques humaines et bovines adsorbées à l’interface huile-eau22. Cette simulation a été conçue pour imiter la digestibilité des émulsions stabilisées par ces deux protéines23 et évaluer l’encapsulation de la curcumine4. Par conséquent, la digestion simulée a été personnalisée comprenant cinq étapes: contrôle / initial, pepsinolyse, trypsinolyse, lipolyse et désorption. Les résultats expérimentaux ont montré une augmentation de la tension interfaciale après la digestion de la pepsine, indiquant une susceptibilité accrue à la pepsinolyse. Cela a été attribué à l’augmentation du déploiement de la variante bovine lors de l’adsorption, exposant les sites sensibles à la pepsine. Ensuite, la trypsinolyse et la lipolyse ont fourni des profils de digestion complètement similaires (Figure 7B).

Figure 8
Figure 8 : Exemple de valeurs finales de digestion gastro-intestinale. (A) tension interfaciale, (B) élasticité dilatationnelle, (C) viscosité dilatationnelle de la digestion in vitro du film adsorbé β-lactoglobuline à l’interface huile d’olive-eau. Les paramètres de dilatation ont été mesurés à 1 Hz, 0,1 Hz et 0,01 Hz après que l’interface digérée ait été équilibrée à chaque étape. Les milieux digestifs sont appliqués par échange de sous-phase avec des solutions détaillées dans la section expérimentale à T = 37 °C. Contrôle: tampon initial avec protéine, pepsine: sSGF avec pepsine, trypsine: sSIF avec trypsine + chymotrypsine, lipolyse: sSIF avec lipase et sels biliaires, désorption: sSIF. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

En général, afin d’évaluer et de comparer la nature des différentes couches interfaciales digérées, la tension interfaciale finale et l’élasticité/viscosité dilatationnelle obtenues pour les interfaces digérées sont tracées pour chacune des étapes considérées dans le processus de digestion conçu. La figure 8 montre la tension interfaciale (figure 8A), l’élasticité dilatationnelle (figure 8B) et la viscosité dilatationnelle (figure 8C), mesurées à des fréquences de 1 Hz, 0,1 Hz et 0,01 Hz. Les valeurs tracées ont été obtenues après chaque étape digestive de β-lactoglobuline adsorbée à l’interface huile-eau16. La figure 8A montre que la protéolyse (pepsine et trypsine) produit de petites augmentations de la tension interfaciale, tandis que la lipolyse réduit cette valeur et que la désorption augmente à nouveau. En ce qui concerne l’élasticité dilatationnelle, la protéine forme des films élastiques et interconnectés à l’interface huile-eau. La présence de sels biliaires produit des films interfaciaux très mobiles et fluides avec une faible élasticité. Enfin, les produits lipolytiques restants ne peuvent pas développer un film élastique cohésif après désorption. L’élasticité dilatationnelle augmente légèrement avec la fréquence d’oscillation (Figure 8B). Enfin, la viscosité dilatationnelle des films interfaciaux illustrés à la figure 8C n’est détectable qu’à la fréquence inférieure et détecte l’existence de multicouches, d’agrégats ou d’autres structures dissipatives à l’interface. La comparaison du profil de digestion de la β-lactoglobuline avec le profil de digestion obtenu pour la β-lactoglobuline traitée par impulsions a montré une meilleure digestibilité des protéines soumises à ce type de traitement physique16.

Tampon initial 0,00113 mol L-1 NaH2PO4, pH 7,0
Liquide gastrique simulé simplifié (sSGF) [NaH2PO4] = 0,00113 mol L-1, [NaCl] = 0,15 mol L-1, pH 3,0
Liquide intestinal simulé simplifié (SIF) [NaH 2 PO4] = 0,00113 mol L-1, [NaCl] = 0,15 mol L-1, [CaCl2] = 0,003 mol L-1, pH 7,0
Enzymes gastriques pepsine (50 ∙ 10 3 U L-1), lipase gastrique (0,5 ∙ 103 U L-1)
Enzymes intestinales trypsine (2,5 ∙ 10 3 U L-1), chymotrypsine (0,625 ∙ 10 3 U L-1), lipase pancréatique (50∙ 10 3 U L-1), co-lipase (150 ∙ 10 3 U L-1)
Mélange de sels biliaires 0,01 mol L-1 M. Mélange de sels biliaires : Taurocholate de sodium et désoxycholate de sodium (50/50) ou Taurocholate de sodium et glycodésoxycholate de sodium (50/50)

Tableau 1 : Composition des milieux digestifs artificiels.

Figure supplémentaire 1: Opérations de base de l’interface informatique DINATEN. A) Aspect général de l’interface informatique DINATEN; La boîte de dialogue de gauche montre les deux seringues connectées à toutes les valves et contrôle l’injection/extraction et le nettoyage. La boîte de dialogue centrale contient la commande, l’image de dépôt et le tableau avec les résultats. (B) Le calcul en temps réel fournit une mesure automatique en fonction du temps. (C) Commande gauche pour inclure la densité différentielle. (D) Un processus dynamique simple contrôle le volume, la vitesse et les temps de capture d’injection/extraction. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : L’interface de programmation de chaque étape digestive (processus). (A) Formation de gouttes avec une seringue gauche de volume fixe et de débit d’injection fixe. (B) Adsorption à surface interfaciale constante: contrôle. (C) Rhéologie avec une amplitude, une période et un nombre de cycles fixes. (D) Échange de sous-phases: injecter et extraire avec les deux seringues au même rythme. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 3 : Calcul des paramètres de dilatation avec le logiciel d’analyse d’images CONTACTO. (A) Analyse des images correspondant à l’oscillation à une période déterminée. (B) Calcul des paramètres de dilatation de la couche interfaciale des images sélectionnées. (C) Boîte de dialogue montrant les résultats de l’analyse dilatationnelle. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Cet article décrit un protocole généralisé pour mesurer la digestion in vitro des couches interfaciales à l’aide d’un équipement de chute pendant. Le protocole peut être adapté aux exigences spécifiques de l’expérience en ajustant la composition des tampons digestifs, qui sont basés sur le protocole harmonisé INFOGEST11,20 pour faciliter la comparaison avec la littérature. Les enzymes digestives et les biosurfactants peuvent être ajoutés individuellement, séquentiellement ou ensemble. Cette dernière option doit être menée avec précaution car la saturation de la couche interfaciale entraverait les différents phénomènes en fournissant simplement une tension interfaciale très faible et pourrait provoquer la chute de la gouttelette. Afin de pouvoir analyser l’effet de chaque composant digestif, les différentes enzymes digestives sont ajoutées séquentiellement et à différentes concentrations. De cette façon, les effets de chaque composant peuvent être analysés et systématisés, et les synergies sont évaluées par addition séquentielle. De plus, pour éviter que les gouttelettes ne tombent, certaines concentrations sont diluées9. Les résultats obtenus ne peuvent pas être directement extrapolés aux systèmes émulsionnés car les conditions sont ajustées pour tenir compte d’un système simplifié. Cependant, l’évolution de la tension interfaciale montre l’évolution de la couverture interfaciale au fur et à mesure que la couche interfaciale est digérée10. De même, l’évolution de la rhéologie dilatationnelle fournit quelques informations sur les propriétés mécaniques de l’interface au fur et à mesure de la digestion9. Ces résultats contiennent des informations utiles qui peuvent être adaptées et soigneusement interprétées pour être appliquées aux systèmes émulsionnés.

L’équipement de chute de pendentif permet d’évaluer les événements in situ se produisant spécifiquement au niveau de la couche interfaciale, comme le montre la figure 2. Tout d’abord, une couche interfaciale initiale est formée, représentant une seule gouttelette d’émulsion. Cette couche initiale est soumise à différentes conditions digestives et change sa composition séquentiellement en raison de la présence des différents composants dans la phase aqueuse. Aussi, les lipases doivent surmonter cette couche interfaciale pour accéder à la phase huileuse et hydrolyser la graisse. Ces événements interfaciaux doivent être évalués à la même couche interfaciale initialement créée. Soumettre une émulsion à une digestion in vitro permettrait d’échantillonner à différents moments et d’évaluer les changements dans l’émulsion au fur et à mesure de sa digestion (taille des gouttelettes, potentiel zêta), mais cela ne permettrait pas d’évaluer in situ la couche interfaciale entourant chaque gouttelette d’émulsion. Ainsi, l’équipement de largage pendentif mis en œuvre avec échange multi-sous-phase comprend une technique complémentaire pour se concentrer sur l’ingénierie interfaciale des émulsions14.

La première limitation de cette méthodologie est précisément liée à la saturation de la couche interfaciale avec des produits assortis, qui doivent être dilués pour éviter la chute de la gouttelette. Un autre problème expérimental est le dégazage de tous les milieux artificiels afin d’éviter la nucléation des bulles, ce qui pourrait également provoquer un détachement des gouttelettes du capillaire. Il est également important de tenir compte du rapport huile-eau plus élevé par rapport aux systèmes d’émulsion lors de l’extrapolation aux systèmes émulsionnés. Enfin, bien que la rhéologie dilatationnelle contienne des informations sur les associations inter- et intramoléculaires au sein de la couche interfaciale, formée et perturbée par les enzymes digestives, elle est difficile à interpréter et à extrapoler à la stabilité de l’émulsion. Au total, la goutte pendante mise en œuvre avec un dispositif d’échange multi-sous-phase est un équipement utile pour compléter les études de digestion in vitro des émulsions12, qui suivent l’évolution de la distribution granulométrique des gouttelettes et le potentiel zêta de la digestion des protéines avec électrophorèse22. Les modifications du tube digestif pour tenir compte de la variation entre les sexes, de la digestion du nourrisson ou des problèmes digestifs constituent les applications futures de la procédure expérimentale.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents connus ou de relations personnelles qui auraient pu influencer le travail rapporté dans cet article.

Acknowledgments

Cette recherche a été financée par les projets RTI2018-101309-B-C21 et PID2020-631-116615RAI00, financés par MCIN/AEI/10.13039/501100011033 et par « FEDER A way of Making Europe ». Ce travail a été (partiellement) soutenu par le Groupe de Physique des Biocolloïdes et des Fluides (réf. PAI-FQM115) de l’Université de Grenade (Espagne).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alpha-chymotrypsin from bovine pancreas Sigma-Aldrich C4129 Enzyme
Beta-lactoglobulin Sigma-Aldrich L0130 Emulsfier
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich 9048-46-8 Emulsfier
CaCl2 Sigma-Aldrich 10043-52-4 Electrolyte
Centrifuge Kronton instruments Centrikon T-124 For separating oil and resins
Citrus pectin Sigma-Aldrich P9135 Emulsfier
co-lipase FROM PORCINE PANCREAS Sigma C3028 Enzyme
CONTACTO University of Granada (UGR) https://core.ugr.es/dinaten/, last access: 07/18/2022
DINATEN University of Granada (UGR) https://core.ugr.es/dinaten/, last access: 07/18/2022
Gastric lipase Lipolytech RGE15-1G Enzyme
Human Serum Albumin Sigma-Aldrich 70024-90-7 Emulsifier
INFOGEST http://www.proteomics.ch/IVD/
Lipase from porcine pancreas, type II Sigma-Aldrich L33126 Enzyme
Magnesium metasilicate resins Fluka 1343-88-0 Resins to purify oil
Micro 90 International products M-9051-04 Cleaner
NaCl Sigma 7647-14-5 Electrolyte
NaH2PO4 Scharlau 10049-21-5 To prepare buffer
OCTOPUS Producciones Científicas y Técnicas S.L. (Gójar, Spain) Pendandt Drop Equipment implemented with multi subphase exchange
Olive oil Sigma-Aldrich 1514 oil
Pancreatic from porcine pancreas Sigma P7545-25 g Enzyme
Pepsin Sigma-Aldrich P6887 Enzyme
Pluronic F127 Sigma P2443 Emulsifier
Pluronic F68 Sigma P1300 Emulsfier
Sodium deoxycholate Sigma Bile salts
Sodium glycodeoxycholate Sigma C9910 Bile salts
Sodium taurocholate Sigma 86339 Bile salts
Syringe Filter Millex-DP SLGP033R  Syringe Filter 0.22 µm pore size polyethersulfone
Trypsin Sigma-Aldrich T1426 Enzyme

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References

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Biochimie numéro 189
<em>In vitro</em> Digestion d’émulsions dans une seule gouttelette <em>par</em> échange multi-sous-phase de fluides gastro-intestinaux simulés
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