시험관 내 시뮬레이션된 위장관액의 다중 하위 단계 교환 을 통한 단일 액적의 에멀젼 소화
Summary
OCTOPUS라는 별명을 가진 다중 하위 단계 교환으로 구현된 펜던트 드롭 표면 필름 균형은 원래 벌크 용액과 시뮬레이션된 위장관액의 순차적 하위 단계 교환을 통해 소화 상태를 모방할 수 있습니다. 시뮬레이션된 체외 소화는 소화된 계면층의 계면 장력을 현장에서 기록하여 모니터링됩니다.
Abstract
에멀젼은 현재 비만, 영양 강화, 음식 알레르기 및 소화기 질환과 같은 다양한 위장 상태를 해결하기 위해 영양소와 약물을 캡슐화하고 전달하는 데 사용되고 있습니다. 에멀젼이 원하는 기능, 즉 위장관 내의 특정 부위에 도달하거나, 지방 분해를 억제 / 지연하거나, 소화율을 촉진하는 능력은 궁극적으로 위장관의 효소 분해에 대한 감수성에 달려 있습니다. 수중유 에멀젼에서 지질 방울은 계면 층으로 둘러싸여 있으며, 여기서 유화제는 에멀젼을 안정화하고 캡슐화된 화합물을 보호합니다. 에멀젼의 맞춤형 소화율을 달성하는 것은 초기 구성에 따라 다르지만 위장 소화의 여러 단계에 따라 계면층의 진화를 모니터링해야 합니다. 다중 하위 상 교환으로 구현된 펜던트 드롭 표면 필름 저울은 맞춤형 정적 분해 모델을 적용하여 오일에 잠긴 단일 수성 액적에서 에멀 젼의 체외 소화를 시뮬레이션할 수 있습니다. 위장관을 통한 통과는 위장관의 각 구획 / 단계의 생리적 조건을 모방하여 원래의 액적 벌크 용액과 인공 배지의 하위 단계 교환에 의해 모방됩니다. 계면 장력의 동적 진화는 시뮬레이션된 전체 위장 소화에 걸쳐 현장에서 기록됩니다. 계면 확장 탄성 및 점도와 같은 소화 된 계면의 기계적 특성은 각 소화 단계 (구강, 위, 소장) 후에 측정됩니다. 각 소화기 매체의 구성은 위장 병리 및 유아 소화기 매체를 포함한 소화 상태의 특수성을 설명하도록 조정할 수 있습니다. 단백질 분해 및 지방 분해에 영향을 미치는 특정 계면 메커니즘이 확인되어 에멀젼의 계면 공학에 의해 소화를 조절하는 도구를 제공합니다. 얻은 결과는 낮은 알레르기 성, 제어 된 에너지 섭취 및 소화율 감소와 같은 맞춤형 기능을 갖춘 새로운 식품 매트릭스를 설계하기 위해 조작 될 수 있습니다.
Introduction
에멀젼 소화와 관련된 지방이 어떻게 소화되는지 이해하는 것은 맞춤형 기능성을 갖춘 제품을 합리적으로 설계하는 데 중요합니다1. 지방 소화를위한 기질은 기계적 작용에 의해 소비되고 입과 위장의 생체 계면 활성제와 혼합되면 지방이 유화되기 때문에 에멀젼입니다. 또한 인간이 소비하는 대부분의 지방은 이미 유화 (예 : 유제품)이며, 유아 또는 일부 노인의 경우 이것이 유일한 소비 형태입니다. 따라서 특정 소화 프로파일을 가진 에멀젼 기반 제품의 설계는 영양에서 매우 중요합니다1. 또한 에멀젼은 영양소, 약물 또는 친유성 생리 활성 물질2 을 캡슐화하고 전달하여 비만3, 영양 강화, 음식 알레르기 및 소화기 질환과 같은 다양한 위장 상태를 해결할 수 있습니다. 수중유 에멀젼에서, 지질 방울은 단백질, 계면활성제, 중합체, 입자 및 혼합물과 같은 유화제의 계면 층으로둘러싸여 있다4. 유화제의 역할은 두 가지입니다: 에멀젼5을안정화시키고 캡슐화 된 화합물을 특정 부위로 보호/운반합니다. 에멀젼의 맞춤형 소화율을 달성하는 것은 초기 구성에 따라 다르지만 위장관을 통과하는 동안 이 인터페이스의 지속적인 진화를 모니터링해야 합니다(그림 1).
그림 1: 주요 위장 상태를 해결하기 위해 에멀젼의 계면 공학을 적용합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
지질 소화는 오일에 포함 된 트리글리 세라이드에 도달하고 가수 분해하기 위해 계면 층을 통해 유화 된 지질 방울의 오일-물 계면에 리파아제 (위 또는 췌장)를 흡착해야하기 때문에 궁극적으로 계면 과정입니다6. 이것은 그림 2에 도식화되어 있습니다. 위 리파아제는 기름-물 계면을 위해 위장의 펩신 및 인지질과 경쟁합니다 (그림 2, 위 소화). 그런 다음 췌장 리파아제/콜리파아제는 트립신/키모트립신, 인지질, 담즙염 및 소장의 소화 산물과 경쟁합니다. 프로테아제는 계면 범위를 변경하여 리파아제 흡착을 방지하거나 선호할 수 있는 반면, 담즙염은 표면 활성이 높고 나머지 유화제의 대부분을 대체하여 리파아제 흡착을 촉진합니다(그림 2, 장 소화). 결국, 지방 분해의 속도와 정도는 두께, 분자 간 / 분자 내 연결, 정전기 및 입체 상호 작용과 같은 초기 / 위 소화 에멀젼의 계면 특성에 따라 달라집니다. 따라서, 소화될 때 계면층의 진화를 모니터링하는 것은 리파아제 흡착 및 따라서 지질 소화에 영향을 미치는 계면 메커니즘 및 이벤트를 식별하는 실험 플랫폼을 제공합니다.
그림 2: 위장관 지질 소화에서 인터페이스의 역할을 보여주는 개략도. 펩신 가수 분해는 위상에서 계면 구성을 변화시키는 반면, 위 리파아제는 트리글리 세라이드를 가수 분해합니다. 소장에서 트립신/키모트립신은 계면 필름을 추가로 가수분해하는 반면, 지방분해는 BS/리파아제의 흡착, 트리글리세리드의 가수분해, BS 미셀/복합체의 가용화에 의한 지방분해 생성물의 탈착에 의해 진행됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그라나다 대학 (UGR)의 펜던트 드롭 장비는 벌크 용액7의 아상 교환을 가능하게하는 특허 기술 인 동축 이중 모세관으로 구현됩니다. 펜던트 방울을 보유하는 모세관은 이중 미세 주입기의 각 채널에 독립적으로 연결된 두 개의 동축 모세관의 배열로 구성됩니다. 각각의 마이크로인젝터는 독립적으로 작동할 수 있어, 쓰루플로우(7)에 의해 적하된 내용물의 교환을 허용한다. 따라서, 하위 단계 교환은 내부 모세관과 함께 새로운 용액의 동시 주입과 동일한 유속을 사용하여 외부 모세관과 벌크 용액의 추출로 이루어진다. 이 공정은 계면 영역이나 액적의 부피를 방해하지 않고 벌크 용액을 대체 할 수있게합니다. 이 절차는 나중에 다중 하위 상 교환으로 업그레이드되어 액적 벌크 용액 8의 최대8 개의 순차적 하위 상 교환이 가능합니다. 이를 통해 벌크 용액을 다른 구획(입, 위, 소장)을 모방한 인공 배지와 순차적으로 교환하여 지질 매체에 현탁된 단일 수성 방울에서 소화 과정을 시뮬레이션할 수 있습니다. 전체 설정은 구성 요소의 세부 정보를 포함하여 그림 3에 나와 있습니다. 마이크로 인젝터의 주사기는 8 개의 비아 밸브에 연결되며, 각각은 그림 2에 설명 된 구성 요소가 포함 된 인공 소화액이 들어있는 마이크로 원심 분리 튜브에 연결됩니다.
그림 3: 모든 구성 요소가 있는 문어의 일반 보기. CCD 카메라, 현미경, 마이크로 포지셔너, 열 안정화 셀 및 이중 모세관은 8 개의 비아 밸브에 연결된 2 개의 주사기가있는 이중 마이크로 인젝터에 독립적으로 연결됩니다. 각 주사기는 모세관, 샘플이있는 4 개의 마이크로 원심 분리기 튜브 및 1 개의 배출물과 연결됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4A는 각각의 인공 소화액이 이중 모세관을 통한 서브상 교환에 의해 펜던트 방울에 주입되는 방법을 보여준다. 그림 2 에 자세히 설명된 각 소화 화합물은 위장관을 통과하는 통로를 시뮬레이션하여 동시에/순차적으로 적용할 수 있습니다. 인공 소화액에는 다양한 효소와 생물 계면 활성제가 포함되어있어 그림 4B에 표시된 것처럼 초기 유화제의 계면 장력을 변경합니다. UGR에서 개발된 소프트웨어 DINATEN( 재료 표 참조)은 초기 계면층이 체외에서 분해될 때 계면 장력의 진화를 실시간으로 기록합니다. 또한, 각 소화 단계 후에, 안정화 된 계면 층에 부피 / 계면 영역의 주기적 진동을 부과하고 계면 장력의 반응을 기록함으로써 계면 층의 팽창 탄성이 계산됩니다. 진동의 주기/주파수 및 진폭은 다양할 수 있으며 소프트웨어 CONTACTO를 사용한 이미지 처리는 확장 유변학적 매개변수8를 제공합니다.
그림 4: 소화 프로파일의 예 . (A) 초기 유화제 층은 펜던트 방울로 상이한 용액의 순차적 인 하위 단계 교환에 의해 미세 원심 분리기에 배치 된 인공 소화 매체를 받는다. (B) 인공 매체의 다양한 효소 / 생물 계면 활성제에 의해 시험관 내에서 소화됨에 따라 시간 (x 축)의 함수로서 초기 유화제의 계면 장력 (y 축)의 일반적인 진화. 일반 장액과의 최종 하위 단계 교환은 혼합 된 미셀에서 가용화에 의한 소화 된 지질의 탈착을 측정합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이 연구는 펜던트 드롭 장비9를 사용하여 계면층의 체외 소화를 측정하도록 설계된 일반적인 프로토콜을 제시합니다. 초기 계면층은 도 2에 도시된 바와 같이, 위장관을 통과하는 것을 모방하는 조건에 순차적으로 적용된다. 이러한 다양한 소화 매체는 미세 원심 분리기 튜브에 포함 된 다양한 용액의 하위 단계 교환에 의해 펜던트 방울에 주입됩니다 (그림 4A). 이러한 배지의 조성은 평가될 위장 상태, 즉 위/장 단백질 분해/지방 분해에 따라 맞춤화될 수 있으며, 누적 효과 및 시너지10을 측정할 수 있습니다. 각 구획에서 소화 과정을 모방하는 데 사용되는 실험 조건은 전해질 및 효소11의 pH와 양을 자세히 설명하는 INFOGEST에서 발표한 국제 합의 프로토콜을 따릅니다. 펜던트 드롭을 기반으로 한 실험 장치를 사용하면 시뮬레이션된 분해 과정 전반에 걸쳐 계면 장력을 현장에서 기록할 수 있습니다. 계면층의 팽창 유변학은 각 소화 단계가 끝날 때 계산됩니다. 이러한 방식으로, 각 유화제는 도 4B에 도시된 바와 같이, 소화된 계면의 특성을 설명하는 분해 프로파일을 제공한다. 이것은 소화 과정의 다른 단계에 대한 감수성 또는 저항에 관한 결론을 추출 할 수있게합니다. 일반적으로 인공 소화기에는 산/염기성 pH, 전해질, 프로테아제(위 및 장), 리파아제(위 및 장), 담즙염 및 인지질이 포함되어 있으며 각각의 소화액(위 또는 장)에 용해됩니다. 도 4B는 유화제의 계면 장력의 진화에 대한 일반적인 프로파일을 보여주며, 먼저 프로테아제 작용을 받은 후 리파아제를 받는다. 일반적으로, 계면층의 단백질 분해는 가수 분해 된 펩티드 9,12의 탈착으로 인해 계면 장력의 증가를 촉진하는 반면, 지방 분해는 담즙 염 및 리파아제(13)의 흡착으로 인한 계면 장력의 매우 가파른 감소를 초래한다. 장액과의 최종 하위 단계 교환은 흡착되지 않은/소화된 물질의 벌크 용액을 고갈시키고 가용성 화합물의 탈착 및 혼합 미셀에서 소화된 지질의 가용화를 촉진합니다. 이것은 기록 된 증가 된 계면 장력에 의해 정량화됩니다 (그림 4B).
요약하면, 단일 액적에서 시험관내 소화를 시뮬레이션하기 위해 펜던트 방울에 구현된 실험 설계는 소화 과정이 초기 계면층(10)에 순차적으로 적용될 때 누적 효과 및 시너지 효과를 측정할 수 있게 한다. 각각의 소화기 배지의 조성은 위장 병리 또는 유아 소화기 매체(14)를 포함하는 소화기 상태의 특수성을 설명하도록 용이하게 조정될 수 있다. 그런 다음 단백질 분해 및 지방 분해에 영향을 미치는 계면 메커니즘의 식별을 사용하여 에멀젼의 계면 공학에 의해 소화를 조절할 수 있습니다. 얻은 결과는 낮은 알레르기 성, 제어 된 에너지 섭취 및 소화율 감소 15,16,17,18,19와 같은 맞춤형 기능을 가진 새로운 식품 매트릭스를 설계하는 데 적용될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 기사에서는 펜던트 드롭 장비를 사용하여 계면층의 체외 분해를 측정하는 일반화 된 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜은 문헌과의 비교를 용이하게 하기 위해 INFOGEST11,20 조화 프로토콜을 기반으로 하는 소화 완충액의 구성을 조정하여 실험의 특정 요구 사항에 맞게 조정할 수 있습니다. 소화 효소 및 바이오 계면 활성제는 개별적으로, 순차?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 MCIN/AEI/10.13039/501100011033 및 “ERDF 유럽을 만드는 방법”이 자금을 지원하는 RTI2018-101309-B-C21 및 PID2020-631-116615RAI00 프로젝트의 자금 지원을 받았습니다. 이 연구는 그라나다 대학 (스페인)의 Biocolloid and Fluid Physics Group (ref. PAI-FQM115)의 지원을 받았다.
Materials
| Alpha-chymotrypsin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | C4129 | Enzyme |
| Beta-lactoglobulin | Sigma-Aldrich | L0130 | Emulsfier |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | Emulsfier |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | Electrolyte |
| Centrifuge | Kronton instruments | Centrikon T-124 | For separating oil and resins |
| Citrus pectin | Sigma-Aldrich | P9135 | Emulsfier |
| co-lipase FROM PORCINE PANCREAS | Sigma | C3028 | Enzyme |
| CONTACTO | University of Granada (UGR) | https://core.ugr.es/dinaten/, last access: 07/18/2022 | |
| DINATEN | University of Granada (UGR) | https://core.ugr.es/dinaten/, last access: 07/18/2022 | |
| Gastric lipase | Lipolytech | RGE15-1G | Enzyme |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | 70024-90-7 | Emulsifier |
| INFOGEST | http://www.proteomics.ch/IVD/ | ||
| Lipase from porcine pancreas, type II | Sigma-Aldrich | L33126 | Enzyme |
| Magnesium metasilicate resins | Fluka | 1343-88-0 | Resins to purify oil |
| Micro 90 | International products | M-9051-04 | Cleaner |
| NaCl | Sigma | 7647-14-5 | Electrolyte |
| NaH2PO4 | Scharlau | 10049-21-5 | To prepare buffer |
| OCTOPUS | Producciones Científicas y Técnicas S.L. (Gójar, Spain) | Pendandt Drop Equipment implemented with multi subphase exchange | |
| Olive oil | Sigma-Aldrich | 1514 | oil |
| Pancreatic from porcine pancreas | Sigma | P7545-25 g | Enzyme |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P6887 | Enzyme |
| Pluronic F127 | Sigma | P2443 | Emulsifier |
| Pluronic F68 | Sigma | P1300 | Emulsfier |
| Sodium deoxycholate | Sigma | Bile salts | |
| Sodium glycodeoxycholate | Sigma | C9910 | Bile salts |
| Sodium taurocholate | Sigma | 86339 | Bile salts |
| Syringe Filter | Millex-DP | SLGP033R | Syringe Filter 0.22 µm pore size polyethersulfone |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | Enzyme |
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