Summary
Een hangende drop surface filmbalans geïmplementeerd met een multi-subfase uitwisseling, bijgenaamd de OCTOPUS, maakt het mogelijk om spijsverteringsproblemen na te bootsen door de sequentiële subfase-uitwisseling van de originele bulkoplossing met gesimuleerde gastro-intestinale vloeistoffen. De gesimuleerde in vitro vertering wordt gemonitord door in situ de interfaciale spanning van de verteerde interfaciale laag te registreren.
Abstract
Emulsies worden momenteel gebruikt om voedingsstoffen en medicijnen in te kapselen en te leveren om verschillende gastro-intestinale aandoeningen aan te pakken, zoals obesitas, verrijking van voedingsstoffen, voedselallergieën en spijsverteringsziekten. Het vermogen van een emulsie om de gewenste functionaliteit te bieden, namelijk het bereiken van een specifieke plaats in het maagdarmkanaal, het remmen / vertragen van lipolyse of het vergemakkelijken van de verteerbaarheid, hangt uiteindelijk af van de gevoeligheid voor enzymatische afbraak in het maagdarmkanaal. In olie-in-water emulsies worden lipidedruppels omgeven door interfaciale lagen, waar de emulgatoren de emulsie stabiliseren en de ingekapselde verbinding beschermen. Het bereiken van een op maat gemaakte verteerbaarheid van emulsies hangt af van hun oorspronkelijke samenstelling, maar vereist ook het monitoren van de evolutie van die interfaciale lagen terwijl ze worden onderworpen aan verschillende fasen van gastro-intestinale spijsvertering. Een hangende drop-oppervlaktefilmbalans geïmplementeerd met een multi-subfase-uitwisseling maakt het mogelijk om de in vitro vertering van emulsies te simuleren in een enkele waterige druppel ondergedompeld in olie door een aangepast statisch verteringsmodel toe te passen. De doorvoer door het maagdarmkanaal wordt nagebootst door de subfase-uitwisseling van de oorspronkelijke druppel bulkoplossing met kunstmatige media, waarbij de fysiologische omstandigheden van elk compartiment / stap van het maagdarmkanaal worden nagebootst. De dynamische evolutie van de interfaciale spanning wordt in situ vastgelegd gedurende de hele gesimuleerde gastro-intestinale spijsvertering. De mechanische eigenschappen van verteerde interfaces, zoals interfaciale dilatatie-elasticiteit en viscositeit, worden gemeten na elke verteringsfase (oraal, maag, dunne darm). De samenstelling van elk spijsverteringsmedium kan worden afgestemd om rekening te houden met de bijzonderheden van de spijsverteringsaandoeningen, waaronder gastro-intestinale pathologieën en spijsverteringsmedia voor zuigelingen. De specifieke interfaciale mechanismen die van invloed zijn op proteolyse en lipolyse worden geïdentificeerd en bieden hulpmiddelen om de spijsvertering te moduleren door de interfaciale engineering van emulsies. De verkregen resultaten kunnen worden gemanipuleerd voor het ontwerpen van nieuwe voedselmatrices met op maat gemaakte functionaliteiten zoals lage allergeniciteit, gecontroleerde energie-inname en verminderde verteerbaarheid.
Introduction
Begrijpen hoe vet wordt verteerd, waarbij emulsievergisting betrokken is, is belangrijk om producten rationeel te ontwerpen met op maat gemaakte functionaliteit1. Het substraat voor vetvertering is een emulsie omdat vet wordt geëmulgeerd bij consumptie door mechanische actie en vermenging met biosurfactanten in de mond en maag. Ook is het grootste deel van het vet dat door mensen wordt geconsumeerd al geëmulgeerd (zoals melkproducten) en in het geval van baby's of sommige ouderen is dit de enige vorm van consumptie. Daarom is het ontwerp van op emulsie gebaseerde producten met specifieke spijsverteringsprofielen erg belangrijk in voeding1. Bovendien kunnen emulsies voedingsstoffen, medicijnen of lipofiele bioactieve stoffen inkapselen en leveren2 om verschillende gastro-intestinale aandoeningen aan te pakken, zoals obesitas3, verrijking van voedingsstoffen, voedselallergieën en spijsverteringsziekten. In olie-in-water emulsies worden lipidedruppels omgeven door interfaciale lagen van emulgatoren zoals eiwitten, oppervlakteactieve stoffen, polymeren, deeltjes en mengsels4. De rol van emulgatoren is tweeledig: stabiliseer de emulsie5 en bescherm/transporteer de ingekapselde verbinding naar een specifieke locatie. Het bereiken van een op maat gemaakte verteerbaarheid van emulsies hangt af van hun oorspronkelijke samenstelling, maar vereist ook het monitoren van de continue evolutie van deze interface tijdens de transit door het maagdarmkanaal (figuur 1).
Figuur 1: Interfaciale engineering van emulsies toepassen om enkele van de belangrijkste gastro-intestinale aandoeningen aan te pakken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Lipidenvertering is uiteindelijk een interfacial proces omdat het de adsorptie van lipasen (maag of pancreas) op het olie-water-grensvlak van geëmulgeerde lipidedruppels door de interfaciale laag vereist om de triglyceriden in de olie te bereiken en te hydrolyseren tot vrije vetzuren en monoacylglyceriden6. Dit is geschematiseerd in figuur 2. Maaglipase concurreert met pepsine en fosfolipiden in de maag voor de olie-water interface (Figuur 2, maagvertering). Vervolgens concurreren pancreaslipase / colipase met trypsine / chymotrypsine, fosfolipiden, galzouten en spijsverteringsproducten in de dunne darm. Proteasen kunnen de interfaciale dekking veranderen, waardoor lipase-adsorptie wordt voorkomen of begunstigd, terwijl galzouten zeer oppervlakteactief zijn en het grootste deel van de resterende emulgator verdringen om lipase-adsorptie te bevorderen (figuur 2, intestinale spijsvertering). Uiteindelijk zijn de snelheid en de omvang van lipolyse afhankelijk van de interfaciale eigenschappen van de initiële / maagverteerde emulsie, zoals de dikte, inter / intramoleculaire verbindingen en elektrostatische en sterische interacties. Dienovereenkomstig biedt het monitoren van de evolutie van de interfaciale laag terwijl deze wordt verteerd een experimenteel platform om interfaciale mechanismen en gebeurtenissen te identificeren die van invloed zijn op lipase-adsorptie en dus lipidenvertering.
Figuur 2: Schematisch diagram dat de rol van interfaces in gastro-intestinale lipidenvertering illustreert. Pepsinehydrolyse verandert de interfaciale samenstelling in de maagfase, terwijl maaglipase triglyceriden hydrolyseert. In de dunne darm hydrolyseren trypsine / chymotrypsine de interfaciale film verder, terwijl lipolyse verloopt door de adsorptie van BS / lipasen, de hydrolyse van triglyceriden en de desorptie van lipolytische producten door oplosbaarheid in de BS-micellen / complex. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De hanger drop apparatuur aan de Universiteit van Granada (UGR) is geïmplementeerd met een gepatenteerde technologie, de coaxiale dubbele capillaire, die subfase uitwisseling van de bulkoplossing mogelijk maakt7. Het capillair, dat de hangerdruppel vasthoudt, bestaat uit een opstelling van twee coaxiale haarvaten die onafhankelijk verbonden zijn met elk kanaal van een dubbele micro-injector. Elke microinjector kan onafhankelijk werken, waardoor de gedropte inhoud kan worden uitgewisseld door through-flow7. Dienovereenkomstig bestaat de subfase-uitwisseling uit de gelijktijdige injectie van de nieuwe oplossing met het binnenste capillair en de extractie van de bulkoplossing met het buitenste capillair met hetzelfde debiet. Dit proces maakt de vervanging van de bulkoplossing mogelijk zonder verstoring van het interfaciale gebied of het volume van de druppel. Deze procedure werd later opgewaardeerd tot een multi-subfase-uitwisseling, die maximaal acht opeenvolgende subfase-uitwisselingen van de druppelbulkoplossing8 mogelijk maakt. Dit maakt de simulatie van het spijsverteringsproces mogelijk in een enkele waterige druppel gesuspendeerd in lipidische media door de bulkoplossing sequentieel uit te wisselen met kunstmatige media die de verschillende compartimenten (mond, maag, dunne darm) nabootsen. De hele opstelling is weergegeven in figuur 3, inclusief de details van de componenten. De spuiten in de microinjector zijn verbonden met de acht vias-kleppen, die elk worden aangesloten op een microcentrifugebuis met de kunstmatige spijsverteringsvloeistof met componenten die zijn beschreven in figuur 2.
Figuur 3: Algemeen beeld van de OCTOPUS met alle componenten. De CCD-camera, microscoop, micropositioner, thermogestabiliseerde cel en dubbel capillair onafhankelijk verbonden met een dubbele micro-injector met twee spuiten verbonden met acht vias-kleppen. Elke spuit wordt aangesloten op capillair, vier microcentrifugebuizen met monster en één ontlading. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4A laat zien hoe elk van de kunstmatige spijsverteringsvloeistoffen druppelsgewijs in de hanger wordt geïnjecteerd door subfase-uitwisseling via het dubbele capillair. Elke spijsverteringsverbinding zoals beschreven in figuur 2 kan gelijktijdig/sequentieel worden aangebracht, waarbij de passage door het maagdarmkanaal wordt gesimuleerd. De kunstmatige spijsverteringsvloeistoffen bevatten verschillende enzymen en biosurfactanten, die de interfaciale spanning van de initiële emulgator veranderen, zoals geschematiseerd in figuur 4B. De software DINATEN (zie Materiaaltabel), ook ontwikkeld aan de UGR, registreert de evolutie van de interfaciale spanning in real time terwijl de initiële interfaciale laag in vitro wordt verteerd. Ook wordt na elke spijsverteringsfase de dilatatie-elasticiteit van de interfaciale laag berekend door periodieke oscillaties van volume / interfacial gebied op de gestabiliseerde interfaciale laag op te leggen en de respons van de interfaciale spanning te registreren. De periode/frequentie en de amplitude van de oscillatie kunnen worden gevarieerd en beeldverwerking met de software CONTACTO levert de dilatatiereologische parameters8.
Figuur 4: Voorbeelden van verteringsprofielen. (A) De initiële emulgatorlaag wordt onderworpen aan kunstmatige spijsverteringsmedia die in de microcentrifuge worden geplaatst door sequentiële subfase-uitwisseling van de verschillende oplossingen in de hangende druppel. (B) De algemene evolutie van de interfaciale spanning (y-as) van de initiële emulgator als functie van de tijd (x-as) zoals deze in vitro wordt verteerd door de verschillende enzymen/biosurfactanten in de kunstmatige media. Een laatste subfase-uitwisseling met gewoon darmvocht meet de desorptie van verteerd lipide door oplosbaarheid in gemengde micellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Deze studie presenteert het algemene protocol dat is ontworpen om de in vitro vertering van interfaciale lagen te meten met hangervalapparatuur9. De initiële interfaciale laag wordt achtereenvolgens onderworpen aan aandoeningen die de passage door het maagdarmkanaal nabootsen, zoals weergegeven in figuur 2. Deze verschillende spijsverteringsmedia worden in de hangende druppel geïnjecteerd door subfase-uitwisseling van de verschillende oplossingen in de microcentrifugebuizen (figuur 4A). De samenstelling van deze media kan worden aangepast afhankelijk van de gastro-intestinale aandoeningen die zullen worden geëvalueerd, namelijk maag / intestinale proteolyse / lipolyse, waardoor cumulatieve effecten en zondaarskunnen worden gemeten 10. De experimentele omstandigheden die worden gebruikt om het verteringsproces in elk compartiment na te bootsen, volgen het internationale consensusprotocol dat door INFOGEST is gepubliceerd en waarin de pH en hoeveelheden elektrolyten en enzymenworden beschreven 11. Het experimentele apparaat op basis van hangerval maakt het mogelijk om de interfaciale spanning in situ te registreren tijdens het gesimuleerde verteringsproces. De dilatationale reologie van de interfaciale laag wordt berekend aan het einde van elke spijsverteringsstap. Op deze manier biedt elke emulgator een verteringsprofiel dat de eigenschappen van de verteerde interfaces illustreert, zoals weergegeven in figuur 4B. Dit maakt het mogelijk om conclusies te trekken met betrekking tot de gevoeligheid of weerstand tegen de verschillende stadia van het spijsverteringsproces. Over het algemeen bevatten de kunstmatige spijsverteringsmedia zure / basische pH, elektrolyten, proteasen (maag en darm), lipasen (maag en darm), galzouten en fosfolipiden, die zijn opgelost in hun respectieve spijsverteringsvloeistoffen (maag of darm). Figuur 4B toont een generiek profiel van de evolutie van de interfaciale spanning van een emulgator, eerst onderworpen aan protease-actie, gevolgd door lipasen. Over het algemeen bevordert proteolyse van de interfaciale laag een toename van de interfaciale spanning als gevolg van de desorptie van gehydrolyseerde peptiden 9,12, terwijl lipolyse resulteert in een zeer steile vermindering van de interfaciale spanning als gevolg van de adsorptie van galzouten en lipasen13. Een laatste subfase-uitwisseling met darmvocht put de bulkoplossing van niet-geabsorbeerd / verteerd materiaal uit en bevordert de desorptie van oplosbare verbindingen en de oplosbaarheid van verteerde lipiden in gemengde micellen. Dit wordt gekwantificeerd door de toegenomen interfaciale spanning die is geregistreerd (figuur 4B).
Samenvattend, het experimentele ontwerp geïmplementeerd in de hangerdruppel om in vitro vertering in een enkele druppel te simuleren, maakt het mogelijk om cumulatieve effecten en synergieën te meten terwijl het spijsverteringsproces sequentieel wordt toegepast op de initiële interfaciale laag10. De samenstelling van elk spijsverteringsmedium kan eenvoudig worden afgestemd om rekening te houden met de bijzonderheden van de spijsverteringsaandoeningen, waaronder gastro-intestinale pathologieën of spijsverteringsmedia voor zuigelingen14. Vervolgens kan de identificatie van de interfaciale mechanismen die proteolyse en lipolyse beïnvloeden, worden gebruikt om de spijsvertering te moduleren door de interfaciale engineering van emulsies. De verkregen resultaten kunnen worden toegepast bij het ontwerpen van nieuwe voedselmatrices met op maat gemaakte functionaliteiten zoals lage allergeniciteit, gecontroleerde energie-inname en verminderde verteerbaarheid 15,16,17,18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Reinigingsvolgorde voor al het glaswerk dat wordt gebruikt in oppervlaktewetenschappelijke experimenten
- Schrob het glaswerk met een geconcentreerde reinigingsoplossing (zie Tabel met materialen) verdund in water (10%).
- Spoel grondig af met een reeks kraanwater, propanol, gedestilleerd water en ultrapuur water. Droog in een cabine en bewaar in een gesloten kast tot gebruik.
2. Monstervoorbereiding
- Bereid kunstmatige spijsverteringsmedia volgens de gestandaardiseerde INFOGEST-protocollen11,20 (zie Materiaaltabel). Zie tabel 1 voor nadere bijzonderheden en bevat kleine aanpassingen aan de eisen van de interfaciale werkzaamheden ter voorkoming van oppervlakteactieve verontreiniging en verdunning van monsters (1:10)10.
- Bereid de emulgatoroplossing volgens de onderstaande stappen.
- Bereid 0,01 l van een geconcentreerde oplossing van (1 kg· L−1) emulgator of een mengsel van emulgatoren (zie Materiaaltabel) in een initiële buffer (Tabel 1) en 's nachts onder lichte roering bewaren.
- Verdun tot 0,1 kg· L−1 (of zoals vereist) om de interface te verzadigen; een pseudoplateau in de interfaciale spanning bereiken na 1 uur adsorptie op een constant interfacial gebied na het eerder gepubliceerde rapport21.
- Houd onder milde agitatie gedurende 15 minuten voor gebruik.
- Zuiver de oliefase.
- Bereid een mengsel van plantaardige olie (zonnebloem, olijf, triolein, enz.) en magnesiummetasilicaatharsen (zie materiaaltabel) in een verhouding van 2:1 w/m in een groot bekerglas. Bewaren onder milde mechanische agitatie gedurende ten minste 3 uur.
- Centrifugeer het mengsel bij 8.000 x g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een commerciële centrifuge (zie Materiaaltabel).
- Filtreer het oliemengsel onder vacuüm met een spuitfilter (poriegrootte van 0,2 μm) (zie materiaaltabel). Bewaren in schone amberkleurige flessen verzegeld en bubbelend met stikstof tot gebruik.
3. Kalibratie en reiniging van de OCTOPUS
- Spoel alle slangen af met ultrapuur water door een volgorde van reiniging van beide spuiten en alle kleppen door een capillair (kleppen 6/4) en naar de externe uitgang (klep 8-blauwe kleur) in te stellen. Voer dit uit door op de knop Opschonen in het linkerdialoogvenster te drukken (aanvullende figuur 1A).
- Controleer de oppervlaktespanning7 van water bij kamertemperatuur door een waterdruppel te vormen en gedurende 5 minuten in realtime te meten (aanvullende figuur 1B, C).
- Stel de differentiële dichtheid in op lucht-water (0,9982 kg· L−1) in het linkerdialoogvenster , Aanvullende figuur 1B.
- Vul de schone cuvette (optisch glas) met 0,002 L schone plantaardige olie en plaats deze in de cuvettehouder in de thermostatische cel (figuur 3).
- Stel de thermostaat in en zorg voor temperatuurevenwichtigheid op 37 °C.
- Controleer de interfaciale spanning van water-olie bij kamertemperatuur7.
- Stel de differentiële dichtheid in op plantaardige olie-water (olijfolie: 0,800 kg· L−1) (aanvullende figuur 1C).
- Injecteer 40 μL met een snelheid van 0,5 μL·s−1 en meet elke seconde in realtime tot het einde van de injectie. Dit is een eenvoudig dynamisch proces (aanvullende figuur 1B, D).
- Plot de interfaciale spanning als functie van het druppelvolume in een gegevensblad.
- Controleer of het druppelvolumebereik een waarde biedt voor de interfaciale spanning die onafhankelijk is van het druppelvolume. Plot het interfaciale gebied als een functie van het druppelvolume.
- Programmeer een proces met twee stappen (aanvullende figuur 1B en aanvullende figuur 2A) volgens de onderstaande stappen.
- Injecteer met een binnenspuit een volume binnen dit bereik van constante interfaciale spanning.
- Houd het interfaciale gebied constant op de in stap 3.5.4 geselecteerde waarde en noteer de interfaciale spanning gedurende 5 min7.
4. Programmeren van één experimenteel proces in DINATEN voor elke spijsverteringsstap
OPMERKING: Voor de procesparameters, zie aanvullende figuur 1B.
- Voer het eerste besturingselement uit.
- Injecteer voor druppelvorming 10 μL (±5 μL) emulgatoroplossing in het capillair (klep 6) (aanvullende figuur 2A).
- Noteer de adsorptie op een constant interfacial gebied21 van 20 mm2 (±10 mm2) gedurende 1 uur (aanvullende figuur 2B).
- Noteer de dilatatiereologie8 (aanvullende figuur 2C).
- Stel de amplitude van de oscillatie in op 1,25 μL, punt 10 s.
- Noteer de adsorptie op het geselecteerde interfaciale gebied (stap 4.1.2) gedurende 10 s.
- Herhaal stap 4.1.3 op verschillende tijdstippen: 5 s, 20 s, 50 s en 100 s.
- Record maagvertering.
- Noteer de adsorptie21 op het geselecteerde interfaciale gebied gedurende 10 s.
- Subfase-uitwisseling7 met vloeistof in klep 2 (sSGF) en maagenzymen (tabel 1) (aanvullende figuur 2D).
- Vul de linkerspuit vanaf klep 2. Injecteer 125 μL in ventiel 6-capillair met de linkerspuit bij 5 μL·s−1.
- Extraheer 125 μL uit het capillair met de rechterspuit bij 5 μL·s−1. Laad de juiste spuit uit om klep 8 te verlaten. Herhaal stap 4.2.2.1-4.2.2.2 10 keer om volledige uitwisseling te garanderen.
- Noteer de adsorptie21 op het geselecteerde interfaciale gebied in stap 4.1.2 gedurende 1 uur (aanvullende figuur 2B).
- Noteer de dilatatiereologie8 (aanvullende figuur 2C).
- Stel de amplitude van de oscillatie in op 1,25 μL, punt 10 s.
- Noteer de adsorptie van het geselecteerde interfaciale gebied in stap 4.1.2 gedurende 10 s. Herhaal op verschillende tijdstippen: 5 s, 20 s, 50 s, 100 s.
- Noteer de darmvertering.
- Noteer de adsorptie21 op het geselecteerde interfaciale gebied in stap 4.1.2 gedurende 10 s (aanvullende figuur 2B).
- Subfase-uitwisseling7 met vloeistof in klep 3 (sSIF) en intestinale enzymen/galzouten/fosfolipiden (tabel 1) (aanvullende figuur 2D).
- Vul de linkerspuit vanaf klep 2. Injecteer 125 μL in ventiel 6-capillair met de linkerspuit bij 5 μL·s−1. Extraheer 125 μL uit het capillair met de rechterspuit bij 5 μL·s−1.
- Laad de juiste spuit uit om klep 8 te verlaten. Herhaal stap 4.3.2.1-4.3.2.2 10 keer om volledige uitwisseling te garanderen.
- Noteer de adsorptie21 op het geselecteerde interfaciale gebied in stap 4.1.2 gedurende 1 uur.
- Noteer de dilatatiereologie8 (aanvullende figuur 2C).
- Stel de amplitude van de oscillatie in op 1,25 μL, punt 10 s.
- Noteer de adsorptie op het geselecteerde interfaciale gebied in stap 4.1.2 gedurende 10 s.
- Herhaal op verschillende tijdstippen: 5 s, 20 s, 50 s, 100 s.
- Noteer de desorptie volgens de onderstaande stappen.
- Noteer de adsorptie21 op het geselecteerde interfaciale gebied in stap 4.1.2 gedurende 10 s (aanvullende figuur 2B).
- Subfase uitwisseling7 met vloeistof in klep 5 (sSIF) (Tabel 1, Aanvullende Figuur 2D).
- Vul de linkerspuit vanaf klep 5. Injecteer 125 μL in ventiel 5-capillair met de linkerspuit bij 5 μL·s−1.
- Extraheer 125 μL uit het capillair met de rechterspuit bij 5 μL·s−1. Laad de juiste spuit uit om klep 8 te verlaten. Herhaal stap 4.4.2.1-4.4.2.2 10 keer om volledige uitwisseling te garanderen.
- Noteer de adsorptie21 op het geselecteerde interfaciale gebied in stap 4.1.2 gedurende 1 uur (aanvullende figuur 2B).
- Noteer de dilatatiereologie8 (aanvullende figuur 2C).
- Handhaaf de amplitude van 1,25 μL, punt 10 s.
- Noteer de adsorptie op het geselecteerde interfaciale gebied in stap 4.1.2 gedurende 10 s.
- Herhaal stap 4.4.4 op verschillende tijdstippen: 5 s, 20 s, 50 s, 100 s.
5. Het experiment opzetten
- Vul de microcentrifugebuizen met de kunstmatige vergistingsmedia en verbind ze elk met de betreffende klep door de bijbehorende slang.
- Vul de slang in kleppen 2-5 door te reinigen van klep 2, klep 3, klep 4 en klep 5 naar de externe uitgang (klep 8) (aanvullende figuur 1A).
- Vul de slang in klep 1 door 5 keer van klep 1 naar klep 6-capillair te reinigen.
- Plaats het capillair in de oliefase. Plaats de linkerspuit met klep 1 (initiële oplossing, tabel 1).
- Begin met het sequentieel verwerken van stap 4.1-initieel, stap 4.2-maag, stap 4.3-darmen en stap 4.4-desorptie, waarbij de gegevens aan het einde van elk proces worden opgeslagen.
6. Berekening van de dilatatiereologische parameters met de beeldverwerkingssoftware CONTACTO8
OPMERKING: Zie Maldonado-Valderrama et al.8 voor meer informatie.
- Laad de beelden die overeenkomen met de gebiedsoscillatie met een bepaalde frequentie en amplitude (aanvullende figuur 3A).
- Druk op Reologie (aanvullende figuur 3B) en verkrijg de dilatatieparameters (aanvullende figuur 3C).
- Kopieer en plak de resultaten in het gegevensspreadblad.
7. Plotten van de experimentele resultaten
- Bereken de tijdkolom in elk van de stappen van het verteringsproces opnieuw door de laatste gegevens van de tijd van de vorige stap toe te voegen.
- Plot de interfaciale spanning versus additieve tijd voor elk van de stappen van het gebruikte verteringsproces.
- Plot de uiteindelijke interfaciale spanning / dilatatie-elasticiteit en viscositeit verkregen aan het einde van elke stap versus de spijsverteringsfase: initiële, maagvertering, duodenale spijsvertering en desorptie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze sectie toont verschillende voorbeelden van verteringsprofielen gemeten met de OCTOPUS. Het algemene uiterlijk van de gesimuleerde verteringsprofielovereenkomsten is weergegeven in figuur 4B. De interfaciale spanning wordt meestal weergegeven tegen de tijd in het spijsverteringsprofiel. De verschillende fasen/verteteringsstappen die worden overwogen, worden weergegeven in verschillende kleuren. De eerste fase vormt de eerste laag en komt overeen met de adsorptiefase van de emulgator of eiwit/oppervlakteactieve stof/polymeer, afhankelijk van elk geval. Vervolgens worden de verschillende spijsverteringsvloeistoffen geïnjecteerd door subfase-uitwisseling in een bulkoplossing die de nieuwe media bevat. De nieuwe subfase veroorzaakt veranderingen in de interfaciale spanning van de initiële emulgatorlaag en in de dilatatiereologie gemeten aan het einde van elke spijsverteringsstap. Het verteringsproces kan bestaan uit maximaal acht spijsverteringsstappen.
Figuur 5: Voorbeeld van maagverteringsprofielen. (A) Maagproteolyse van humaan serumalbumine. Spijsverteringsmedia worden aangebracht door subfase-uitwisseling met oplossingen die in de experimentele sectie zijn beschreven bij T = 37 °C. Blauw: initiële buffer met eiwit, rood: sSGF met pepsine. Overgenomen met toestemming van del Castillo-Santaella et al.12. (B) Maaglipolie van citruspectine. Spijsverteringsmedia worden aangebracht door subfase-uitwisseling met oplossingen die in de experimentele sectie zijn beschreven bij T = 37 °C. Blauw: initiële buffer met citruspectine, geel: sSGF met maaglipase, grijs: sSGF. Overgenomen met toestemming van Infantes-Garcia et al.17. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5 toont enkele experimentele resultaten verkregen voor de maagvertering van emulgatoren. In figuur 5A wordt humaan serumalbumine (HSA)12 eerst geadsorbeerd op de olijfolie-waterinterface, waardoor de interfaciale spanning na 1 uur wordt verlaagd tot een plateau. Aan het einde van deze fase wordt de reologie gemeten met een frequentie van 0,1 Hz (10 s) (periode). In de tweede stap wordt sSGF met pepsine toegevoegd door subfase-uitwisseling. Dit bestaat uit het inbrengen van een volume met de ene spuit en het extraheren van hetzelfde volume met de andere spuit. Op deze manier verandert het gebied van de druppel niet, waardoor de onomkeerbaar geadsorbeerde componenten op de olie-waterinterface behouden blijven. De uitwisseling wordt tussen 10-15 keer herhaald. Tijdens subfase-uitwisseling met sSGF en pepsine neemt de interfaciale spanning toe als gevolg van hydrolyse van het eiwit, dat de initiële eiwitlaag verdunt (figuur 5A). In figuur 5B adsorbeert citruspectine (CP)17 gedurende 40 minuten op het triglyceridenolie-water, gevolgd door dilatatiereologie bij 0,1 Hz. In de tweede stap wordt sSGF met maaglipase geïnjecteerd in het grootste deel van de druppel; omgekeerd bij proteolyse resulteert lipolyse in de adsorptie van lipase en de vorming van vetzuren, die op het grensvlak blijven, waardoor de interfaciale spanning wordt verminderd. De desorptiefase is de derde stap, die de productie van hydrofiele of de oplosbaarheid van lipofiele producten van lipolyse beoordeelt. Figuur 5B laat zien dat subfase-uitwisseling met sSGF een nulrespons van de interfaciale spanning oplevert. Dit kan worden geïnterpreteerd als de productie van lipofiele spijsverteringsproducten, die onomkeerbaar adsorberen en niet worden opgelost, en verankerd blijven aan de interface. De afwezigheid van galzouten in de maagfase is verantwoordelijk voor het gebrek aan oplosbaarheid. De mate van lipolyse kan kwalitatief worden geanalyseerd door de bereikte waarde van interfaciale spanning.
Figuur 6: Voorbeeld van intestinale verteringsprofielen. (A) Adsorptie-desorptieprofielen van galzouten (zwarte vierkanten), lipase (grijze driehoeken) en lipase + galzouten (oranje ruiten) in sSIF bij 37 °C. Overgenomen met toestemming van Macierzanka et al.13. (B) Adsorptie van galzouten + lipase op eerder geadsorbeerde F68 (donkergroen) en F127 (lichtgroen), adsorptie van galzouten (geel) in sSIF. Desorptie: subfase-uitwisseling met sSIF op galzouten (oranje), F68 (donkerpaars) en F127 (lichtpaars). Overgenomen met toestemming van Torcello-Gómez et al.19. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6 toont de experimentele resultaten verkregen voor de intestinale vertering van emulgatoren. In tegenstelling tot maagvertering biedt de aanwezigheid van galzouten in de dunne darm verschillende desorptieprofielen bij subfase-uitwisseling met sSIF en uitputting van de bulkoplossing. Figuur 6A toont de desorptieprofielen verkregen voor zuivere galzouten, zuivere lipase en gemengde lipase/galzouten 8,9,10,13. Galzouten adsorberen reversibel op de olie-waterinterface en worden daarom volledig gedesorbeerd bij subfase-uitwisseling met sSIF, zoals aangegeven door de toename van de interfaciale spanning om de waarde van de kale olie-waterinterface te bereiken 8,13. Omgekeerd adsorbeert lipase onomkeerbaar, zoals gegeven door de constante waarde van interfaciale spanning na subfase-uitwisseling door sSIF. Het mengsel lipase en galzouten biedt een intermediair desorptieprofiel gekwantificeerd door een beperkte toename van de interfaciale spanning bij subfase-uitwisseling door sSIF tot een tussenwaarde. De resterende interfaciale laag bevat lipase en vrije vetzuren. De galzouten zijn mogelijk uit de interface gedesorbeerd en hebben een deel van de vrije vetzuren die in de lipolyse werden gevormd, opgelost. Figuur 6B toont de evolutie van de interfaciale spanning bij lipolyse van twee varianten van Pluronic: F127 en F6819. Figuur 6B toont een sterke afname van de interfaciale spanning als gevolg van de adsorptie van lipase- en galzouten en de productie van vrije vetzuren op eerder gevormde interfaciale films van F68 en F127 op het olie-water-grensvlak. De desorptiestap toont de verhoogde interfaciale spanning veroorzaakt door subfase-uitwisseling met sSIF, die de oplosbaarheid van lipolytische producten kwantificeert.
Figuur 7: Voorbeeld van volledige dynamische gastro-intestinale verteringsprofielen. (A) In vitro verteringsprofiel van AS-48 geadsorbeerde film op het lucht-water raakvlak. Spijsverteringsmedia worden aangebracht door subfase-uitwisseling met oplossingen die in de experimentele sectie zijn beschreven bij T = 37 °C. Controle: initiële buffer met AS-48, pepsine: sSGF met pepsine, trypsine: sSIF met trypsine + chymotrypsine, desorptie: sSIF. Overgenomen met toestemming van del Castillo-Santaella et al.18. B) In vitro verteringsprofiel van humane en runderserumalbumine geadsorbeerde films op het grensvlak tussen olijfolie en water. Spijsverteringsmedia worden aangebracht door subfase-uitwisseling met oplossingen die in de experimentele sectie zijn beschreven bij T = 37 °C. Controle: initiële buffer met HSA/BSA, pepsine: sSGF met pepsine, trypsine: sSIF met trypsine + chymotrypsine, lipolyse: sSIF met lipase en galzouten, desorptie: sSIF. Uitgezette curven zijn representatieve experimenten met afwijkingen <5%. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7 toont voorbeelden van complete gesimuleerde verteringsprofielen. Figuur 7A toont het verteringsprofiel van bioconserveringsmiddel AS-48 dat is geadsorbeerd op het lucht-water-grensvlak18. Het spijsverteringsproces is ontworpen om zich te concentreren op de proteolyse van dit peptide, terwijl de lipolyse van olie niet nodig was, omdat het zich op het lucht-water-raakvlak bevindt. Daarom bestaat de gesimuleerde spijsvertering in figuur 7A uit vijf stappen: controle/initiële film, pepsinolyse, trypsinolyse en desorptie. De experimentele resultaten toonden aan dat deze bacteriocinaat resistent is tegen zowel pepsine als trypsinehydrolyse, omdat de oppervlaktespanning onveranderd bleef. Dienovereenkomstig werd AS-48 beschouwd als een goed bioconserveermiddel voor voedsel dat resistent is tegen in vitro vertering. Figuur 7B vergelijkt de in vitro verteringsprofielen van geadsorbeerde lagen humane en runderserumalbumines geadsorbeerd op het olie-water raakvlak22. Deze simulatie is ontworpen om de verteerbaarheid van emulsies gestabiliseerd door deze twee eiwitten na te bootsen23 en de inkapseling van curcumine4 te evalueren. Daarom werd de gesimuleerde spijsvertering aangepast in vijf stappen: controle / initieel, pepsinolyse, trypsinolyse, lipolyse en desorptie. De experimentele resultaten toonden een verhoogde interfaciale spanning na pepsinevertering, wat wijst op een verhoogde gevoeligheid voor pepsinolyse. Dit werd toegeschreven aan een verhoogde ontplooiing van de rundervariant bij adsorptie, waardoor pepsinegevoelige plaatsen werden blootgesteld. Vervolgens leverden trypsinolyse en lipolyse volledig vergelijkbare spijsverteringsprofielen op (figuur 7B).
Figuur 8: Voorbeeld van eindwaarden van gastro-intestinale spijsvertering. (A) Interfaciale spanning, (B) dilatatie-elasticiteit, (C) dilatatie-viscositeit van in vitro vertering van β-lactoglobuline geadsorbeerde film op het olijfolie-water grensvlak. De dilatatieparameters werden gemeten bij 1 Hz, 0,1 Hz en 0,01 Hz nadat de verteerde interface in elke stap in evenwicht was gebracht. Spijsverteringsmedia worden aangebracht door subfase-uitwisseling met oplossingen die in de experimentele sectie zijn beschreven bij T = 37 °C. Controle: initiële buffer met eiwit, pepsine: sSGF met pepsine, trypsine: sSIF met trypsine + chymotrypsine, lipolyse: sSIF met lipase en galzouten, desorptie: sSIF. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
In het algemeen worden, om de aard van verschillende verteerde interfaciale lagen te evalueren en te vergelijken, de uiteindelijke interfaciale spanning en de dilatatie-elasticiteit / viscositeit verkregen voor verteerde interfaces uitgezet voor elk van de stappen die worden overwogen in het ontwerp van het verteringsproces. Figuur 8 toont de interfaciale spanning (figuur 8A), de dilatatie-elasticiteit (figuur 8B) en de dilatatieviscositeit (figuur 8C), gemeten bij frequenties van 1 Hz, 0,1 Hz en 0,01 Hz. De uitgezette waarden werden verkregen na elke spijsverteringsstap van β-lactoglobuline geadsorbeerd op het olie-water-grensvlak16. Figuur 8A laat zien dat proteolyse (pepsine en trypsine) kleine toenames van de interfaciale spanning veroorzaakt, terwijl lipolyse deze waarde vermindert en desorptie weer toeneemt. Wat de dilatatie-elasticiteit betreft, vormt het eiwit elastische en onderling verbonden films op het olie-water-raakvlak. De aanwezigheid van galzouten produceert zeer mobiele en vloeibare interfaciale films met een lage elasticiteit. Ten slotte kunnen de resterende lipolytische producten na desorptie geen samenhangende elastische film ontwikkelen. De dilatatie-elasticiteit neemt iets toe met de oscillatiefrequentie (figuur 8B). Ten slotte is de dilatatieviscositeit van de interfaciale films in figuur 8C alleen detecteerbaar bij de lagere frequentie en detecteert het het bestaan van meerlagen, aggregaten of andere dissipatieve structuren op het grensvlak. Vergelijking van het verteringsprofiel van β-lactoglobuline met het verteringsprofiel verkregen voor met puls behandelde β-lactoglobuline toonde een verbeterde verteerbaarheid van eiwitten die aan dit type fysische behandeling werden onderworpen16.
| Initiële buffer | 0,00113 mol L-1 NaH2PO4, pH 7,0 | ||
| Vereenvoudigde gesimuleerde maagvloeistof (sSGF) | [NaH2PO4] = 0,00113 mol L-1, [NaCl] = 0,15 mol L-1, pH 3,0 | ||
| Vereenvoudigde gesimuleerde darmvloeistof (sSIF) | [NaH2PO4] =0,00113 mol L-1, [NaCl] = 0,15 mol L-1, [CaCl2] = 0,003 mol L-1, pH 7,0 | ||
| Maag enzymen | pepsine (50 ∙ 103 U L-1), maaglipase (0,5 ∙ 103 U L-1) | ||
| Intestinale enzymen | trypsine (2,5 ∙ 103 U L-1), chymotrypsine (0,625 ∙ 103 U L-1), pancreaslipase (50∙ 103 U L-1), co-lipase (150 ∙ 103 U L-1) | ||
| Galzouten mengsel | 0,01 mol L-1 M. Galzouten mengsel: Natrium taurocholaat en natriumdeoxycholaat (50/50) of natrium taurocholaat en natriumglycodeoxycholaat (50/50) | ||
Tabel 1: Samenstelling van de kunstmatige spijsverteringsmedia.
Aanvullende figuur 1: Basisbewerkingen van de computerinterface DINATEN. A) Algemeen uiterlijk van de computerinterface DINATEN; het linkerdialoogvenster toont de twee spuiten die op alle kleppen zijn aangesloten en regelt de injectie/extractie en reiniging. Het centrale dialoogvenster bevat de opdracht, de drop-afbeelding en de tabel met resultaten. (B) De real-time berekening biedt automatische meting als functie van de tijd. (C) Linker commando om de differentiële dichtheid op te nemen. (D) Een eenvoudig dynamisch proces regelt het injectie-/extractievolume, de snelheid en de opnametijden. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: De interface voor het programmeren van elke spijsverteringsstap (proces). (A) Druppelvorming met een linkerspuit met een vast volume en een vaste injectiesnelheid. (B) Adsorptie op constant interfacial gebied: controle. (C) Reologie met een vaste amplitude, periode en aantal cycli. (D) Subfase-uitwisseling: injecteren en extraheren met beide spuiten in dezelfde snelheid. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 3: Berekening van de dilatatieparameters met de software voor beeldanalyse CONTACTO. (A) Analyse van de beelden die overeenkomen met de oscillatie op een vaste periode. (B) Berekening van de dilatatieparameters van de interfaciale laag van de geselecteerde beelden. (C) Dialoogvenster met de resultaten van de dilatatieanalyse. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel beschrijft een gegeneraliseerd protocol om in vitro vertering van interfaciale lagen te meten met behulp van hangervalapparatuur. Het protocol kan worden aangepast aan de specifieke vereisten van het experiment door de samenstelling van de spijsverteringsbuffers af te stemmen, die zijn gebaseerd op het geharmoniseerde INFOGEST 11,20-protocol om vergelijking met literatuur te vergemakkelijken. De spijsverteringsenzymen en biosurfactanten kunnen afzonderlijk, sequentieel of samen worden toegevoegd. Deze laatste optie moet met zorg worden uitgevoerd, omdat de verzadiging van de interfaciale laag de verschillende verschijnselen zou belemmeren door slechts een zeer lage interfaciale spanning te bieden en de druppel zou kunnen laten vallen. Om het effect van elke spijsverteringscomponent te kunnen analyseren, worden de verschillende spijsverteringsenzymen sequentieel en in verschillende concentraties toegevoegd. Op deze manier kunnen de effecten van elke component worden geanalyseerd en gesystematiseerd en worden de synergieën geëvalueerd door sequentiële optelling. Om te voorkomen dat druppeltjes vallen, worden sommige concentraties verdund9. De verkregen resultaten kunnen niet direct worden geëxtrapoleerd naar geëmulgeerde systemen, omdat de omstandigheden worden aangepast om rekening te houden met een vereenvoudigd systeem. De evolutie van de interfaciale spanning toont echter de evolutie van de interfaciale dekking als de interfaciale laag wordt verteerd10. Evenzo biedt de evolutie van de dilatatiereologie enige informatie over de mechanische eigenschappen van de interface naarmate de spijsvertering vordert9. Deze resultaten bevatten nuttige informatie die kan worden aangepast en zorgvuldig kan worden geïnterpreteerd om te worden toegepast op geëmulgeerde systemen.
De hanger drop-apparatuur maakt de evaluatie mogelijk van in situ gebeurtenissen die zich specifiek voordoen op de interfaciale laag, zoals afgebeeld in figuur 2. Eerst wordt een initiële interfaciale laag gevormd, die één enkele emulsiedruppel vertegenwoordigt. Deze eerste laag wordt onderworpen aan verschillende spijsverteringsaandoeningen en verandert de samenstelling sequentieel als gevolg van de aanwezigheid van de verschillende componenten in de waterige fase. Ook moeten lipasen deze interfaciale laag overwinnen om toegang te krijgen tot de oliefase en het vet te hydrolyseren. Deze interfaciale gebeurtenissen moeten worden geëvalueerd op dezelfde interfaciale laag die aanvankelijk is gecreëerd. Het onderwerpen van een emulsie aan in vitro vergisting zou bemonstering op verschillende tijdstippen en de evaluatie van de veranderingen in de emulsie mogelijk maken terwijl deze wordt verteerd (druppelgrootte, zetapotentiaal), maar het zou geen in situ evaluatie van de interfaciale laag rond elke emulsiedruppel mogelijk maken. Vandaar dat de hangervalapparatuur die is geïmplementeerd met multi-subfase-uitwisseling een complementaire techniek omvat om zich te concentreren op de interfaciale engineering van emulsies14.
De eerste beperking van deze methodologie is precies gerelateerd aan de verzadiging van de interfaciale laag met diverse producten, die moeten worden verdund om het vallen van de druppel te voorkomen. Een ander experimenteel probleem is de ontgassing van alle kunstmatige media om de nucleatie van bellen te voorkomen, wat ook druppelloslating van het capillair zou kunnen veroorzaken. Het is ook belangrijk om rekening te houden met de grotere olie-waterverhouding in vergelijking met emulsiesystemen bij het extrapoleren naar geëmulgeerde systemen. Ten slotte, hoewel de dilatationale reologie informatie bevat over de inter- en intramoleculaire associaties binnen de interfaciale laag, gevormd en verstoord door spijsverteringsenzymen, is het moeilijk te interpreteren en te extrapoleren naar emulsiestabiliteit. Al met al is de hangerdruppel geïmplementeerd met een multi-subfase-uitwisselingsapparaat een nuttig apparaat om in vitro verteringsstudies van emulsies12 aan te vullen, die de evolutie van de distributie van druppelgrootte en het zeta-potentieel van eiwitvertering met elektroforese volgen22. Modificaties van het spijsverteringskanaal om rekening te houden met geslachtsvariatie, spijsvertering bij kinderen of spijsverteringsproblemen omvatten toekomstige toepassingen van de experimentele procedure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen bekende concurrerende financiële belangen of persoonlijke relaties hebben die het werk dat in dit artikel wordt gerapporteerd, kunnen hebben beïnvloed.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door de projecten RTI2018-101309-B-C21 en PID2020-631-116615RAI00, gefinancierd door MCIN/AEI/10.13039/501100011033 en door "ERDF A way of making Europe". Dit werk werd (gedeeltelijk) ondersteund door de Biocolloid and Fluid Physics Group (ref. PAI-FQM115) van de Universiteit van Granada (Spanje).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alpha-chymotrypsin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | C4129 | Enzyme |
| Beta-lactoglobulin | Sigma-Aldrich | L0130 | Emulsfier |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | Emulsfier |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | Electrolyte |
| Centrifuge | Kronton instruments | Centrikon T-124 | For separating oil and resins |
| Citrus pectin | Sigma-Aldrich | P9135 | Emulsfier |
| co-lipase FROM PORCINE PANCREAS | Sigma | C3028 | Enzyme |
| CONTACTO | University of Granada (UGR) | https://core.ugr.es/dinaten/, last access: 07/18/2022 | |
| DINATEN | University of Granada (UGR) | https://core.ugr.es/dinaten/, last access: 07/18/2022 | |
| Gastric lipase | Lipolytech | RGE15-1G | Enzyme |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | 70024-90-7 | Emulsifier |
| INFOGEST | http://www.proteomics.ch/IVD/ | ||
| Lipase from porcine pancreas, type II | Sigma-Aldrich | L33126 | Enzyme |
| Magnesium metasilicate resins | Fluka | 1343-88-0 | Resins to purify oil |
| Micro 90 | International products | M-9051-04 | Cleaner |
| NaCl | Sigma | 7647-14-5 | Electrolyte |
| NaH2PO4 | Scharlau | 10049-21-5 | To prepare buffer |
| OCTOPUS | Producciones Científicas y Técnicas S.L. (Gójar, Spain) | Pendandt Drop Equipment implemented with multi subphase exchange | |
| Olive oil | Sigma-Aldrich | 1514 | oil |
| Pancreatic from porcine pancreas | Sigma | P7545-25 g | Enzyme |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P6887 | Enzyme |
| Pluronic F127 | Sigma | P2443 | Emulsifier |
| Pluronic F68 | Sigma | P1300 | Emulsfier |
| Sodium deoxycholate | Sigma | Bile salts | |
| Sodium glycodeoxycholate | Sigma | C9910 | Bile salts |
| Sodium taurocholate | Sigma | 86339 | Bile salts |
| Syringe Filter | Millex-DP | SLGP033R | Syringe Filter 0.22 µm pore size polyethersulfone |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | Enzyme |
References
- McClements, D. J. The biophysics of digestion: Lipids. Current Opinion in Food Science. 21, 1-6 (2018).
- McClements, D. J., Li, Y. Structured emulsion-based delivery systems: Controlling the digestion and release of lipophilic food components. Advances in Colloid and Interface Science. 159 (2), 213-228 (2010).
- Corstens, M. N., et al. Food-grade micro-encapsulation systems that may induce satiety via delayed lipolysis: A review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 57 (10), 2218-2244 (2017).
- Aguilera-Garrido, A., del Castillo-Santaella, T., Galisteo-González, F., Gálvez-Ruiz, M. J., Maldonado-Valderrama, J. Investigating the role of hyaluronic acid in improving curcumin bioaccessibility from nanoemulsions. Food Chemistry. 351, 129301 (2021).
- Rodríguez Patino, J. M., Carrera Sánchez, C., Rodríguez Niño, M. R. Implications of interfacial characteristics of food foaming agents in foam formulations. Advances in Colloid and Interface Science. 140 (2), 95-113 (2008).
- Wilde, P. J., Chu, B. S. Interfacial & colloidal aspects of lipid digestion. Advances in Colloid and Interface Science. 165 (1), 14-22 (2011).
- Cabrerizo-Vílchez, M. A., Wege, H. A., Holgado-Terriza, J. A., Neumann, A. W. Axisymmetric drop shape analysis as penetration Langmuir balance. Review of Scientific Instruments. 70 (5), 2438-2444 (1999).
- Maldonado-Valderrama, J., Muros-Cobos, J. L., Holgado-Terriza, J. A., Cabrerizo-Vílchez, M. A. Bile salts at the air-water interface: Adsorption and desorption. Colloids and surfaces B: Biointerfaces. 120, 176-183 (2014).
- Maldonado-Valderrama, J., Terriza, J. A. H., Torcello-Gómez, A., Cabrerizo-Vílchez, M. A. In vitro digestion of interfacial protein structures. Soft Matter. 9, 1043-1053 (2013).
- Maldonado-Valderrama, J. Probing in vitro digestion at oil-water interfaces. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 39, 51-60 (2019).
- Brodkorb, A., et al. INFOGEST static in vitro simulation of gastrointestinal food digestion. Nature Protocols. 14 (4), 991-1014 (2019).
- del Castillo-Santaella, T., Maldonado-Valderrama, J., Molina-Bolivar, J. A., Galisteo-Gonzalez, F. Effect of cross-linker glutaraldehyde on gastric digestion of emulsified albumin. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 145, 899-905 (2016).
- Macierzanka, A., Torcello-Gómez, A., Jungnickel, C., Maldonado-Valderrama, J. Bile salts in digestion and transport of lipids. Advances in Colloid and Interface Science. 274, 102045 (2019).
- Maldonado-Valderrama, J., Torcello-Gómez, A., del Castillo-Santaella, T., Holgado-Terriza, J. A., Cabrerizo-Vílchez, M. A. Subphase exchange experiments with the pendant drop technique. Advances in Colloid and Interface Science. 222, 488-501 (2015).
- Bellesi, F. A., Ruiz-Henestrosa, V. M. P., Maldonado-Valderrama, J., Del Castillo Santaella, T., Pilosof, A. M. R. Comparative interfacial in vitro digestion of protein and polysaccharide oil/water films. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 161, 547-554 (2018).
- Del Castillo-Santaella, T., Sanmartín, E., Cabrerizo-Vílchez, M. A., Arboleya, J. C., Maldonado-Valderrama, J. Improved digestibility of β-lactoglobulin by pulsed light processing: A dilatational and shear study. Soft Matter. 10 (48), 9702-9714 (2014).
- Infantes-Garcia, M. R., et al. In vitro gastric lipid digestion of emulsions with mixed emulsifiers: Correlation between lipolysis kinetics and interfacial characteristics. Food Hydrocolloids. 128, 107576 (2022).
- del Castillo-Santaella, T., Cebrián, R., Maqueda, M., Gálvez-Ruiz, M. J., Maldonado-Valderrama, J. Assessing in vitro digestibility of food biopreservative AS-48. Food Chemistry. 246, 249-257 (2018).
- Torcello-Gómez, A., Maldonado-Valderrama, J., Jódar-Reyes, A. B., Cabrerizo-Vílchez, M. A., Martín-Rodríguez, A. Pluronic-covered oil-water interfaces under simulated duodenal conditions. Food Hydrocolloids. 34, 54-61 (2014).
- Minekus, M., et al. A standardised static in vitro digestion method suitable for food - an international consensus. Food & Function. 5 (6), 1113-1124 (2014).
- Wege, H. A., Holgado-Terriza, J. A., Cabrerizo-Vílchez, M. A. Development of a constant surface pressure penetration langmuir balance based on axisymmetric drop shape analysis. Journal of Colloid and Interface Science. 249 (2), 263-273 (2002).
- del Castillo-Santaella, T., et al. Hyaluronic acid and human/bovine serum albumin shelled nanocapsules: Interaction with mucins and in vitro digestibility of interfacial films. Food Chemistry. 383, 132330 (2022).
- Aguilera-Garrido, A., et al. Applications of serum albumins in delivery systems: Differences in interfacial behaviour and interacting abilities with polysaccharides. Advances in Colloid and Interface Science. 290 (5), 102365 (2021).
