Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

במבחנה עיכול תחליבים בטיפה אחת באמצעות החלפה רב-פאזית של נוזלי מערכת העיכול המדומים

Published: November 18, 2022 doi: 10.3791/64158
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Department of Applied Physics, Faculty of Sciences, Campus de Fuentenueva, University of Granada, 2Department of Physical Chemistry, Faculty of Pharmacy, Campus de Cartuja, University of Granada, 3Department of Software Engineering, School of Computer and Telecommunication Engineering, Campus de Aynadamar, University of Granada

Summary

איזון יריעת פני השטח של התליון המיושם עם החלפה מרובת תת-פאזות, המכונה OCTOPUS, מאפשר לחקות את תנאי העיכול על ידי החלפת תת-פאזה רציפה של התמיסה המקורית בתפזורת עם נוזלים מדומים במערכת העיכול. העיכול המדומה במבחנה מנוטר על ידי רישום באתרו של המתח הבין-פאזי של השכבה הבין-מרחבית המעוכלת.

Abstract

תחליבים משמשים כיום כדי לתמצת ולספק חומרים מזינים ותרופות כדי להתמודד עם מצבים שונים במערכת העיכול כגון השמנת יתר, העשרת חומרים מזינים, אלרגיות למזון ומחלות עיכול. היכולת של תחליב לספק את הפונקציונליות הרצויה, כלומר, להגיע לאתר מסוים במערכת העיכול, לעכב / מעכב ליפוליזה, או להקל על העיכול, בסופו של דבר תלוי ברגישות שלו לפירוק אנזימטי במערכת העיכול. בתחליבי שמן במים, טיפות השומנים מוקפות בשכבות בין-אישיות, שבהן המתחלבים מייצבים את התחליב ומגנים על התרכובת העטופה. השגת יכולת עיכול מותאמת אישית של תחליבים תלויה בהרכב הראשוני שלהם, אך דורשת גם מעקב אחר האבולוציה של אותן שכבות בין-פאזיות מכיוון שהן נתונות לשלבים שונים של עיכול במערכת העיכול. איזון סרט שטח של טיפת תליון המיושם עם החלפה מרובת תת-פאזות מאפשר לדמות את העיכול במבחנה של תחליבים בטיפה מימית אחת השקועה בשמן על ידי יישום מודל עיכול סטטי מותאם אישית. המעבר דרך מערכת העיכול מחוקה על ידי החלפת תת-פאזה של תמיסת התפזורת המקורית של הטיפות עם מדיה מלאכותית, המחקה את התנאים הפיזיולוגיים של כל תא/שלב במערכת העיכול. האבולוציה הדינמית של המתח הבין-תאי נרשמת באתרה לאורך כל העיכול המדומה של מערכת העיכול. התכונות המכניות של ממשקים מעוכלים, כגון גמישות מורחבת בין-פאזית וצמיגות, נמדדות לאחר כל שלב עיכול (דרך הפה, הקיבה, המעי הדק). ניתן לכוונן את ההרכב של כל מדיה במערכת העיכול כדי להסביר את המאפיינים של תנאי העיכול, כולל פתולוגיות במערכת העיכול ומדיה העיכול של התינוק. המנגנונים הבין-פאזיים הספציפיים המשפיעים על פרוטאוליזה וליפוליזה מזוהים, ומספקים כלים לווסת את העיכול על ידי הנדסה בין-פאזית של תחליבים. ניתן לתמרן את התוצאות המתקבלות לתכנון מטריצות מזון חדשניות עם פונקציות מותאמות אישית כגון אלרגניות נמוכה, צריכת אנרגיה מבוקרת וירידה בעיכול.

Introduction

הבנת אופן העיכול של שומן, הכוללת עיכול תחליבים, חשובה לתכנון רציונלי של מוצרים עם פונקציונליות מותאמת אישית1. המצע לעיכול שומן הוא תחליב שכן השומן מתחלב עם הצריכה על ידי פעולה מכנית וערבוב עם חומרים פעילי שטח ביולוגיים בפה ובקיבה. כמו כן, רוב השומן הנצרך על ידי בני אדם כבר מתחלב (כגון מוצרי חלב), ובמקרה של תינוקות או כמה קשישים, זוהי צורת הצריכה היחידה. לפיכך, העיצוב של מוצרים מבוססי תחליב עם פרופילי עיכול ספציפיים חשוב מאוד בתזונה1. יתר על כן, תחליבים יכולים לעטוף ולספק חומרים מזינים, תרופות או פעילות ביולוגית ליפופילית2 כדי להתמודד עם מצבים שונים במערכת העיכול כגון השמנת יתר3, חיזוק חומרים מזינים, אלרגיות למזון ומחלות עיכול. בתחליבי שמן במים, טיפות השומנים מוקפות בשכבות בין-פאזיות של מתחלבים כגון חלבונים, חומרים פעילי שטח, פולימרים, חלקיקים ותערובות4. תפקידם של מתחלבים הוא כפול: לייצב את האמולסיה5 ולהגן/להעביר את התרכובת העטופה לאתר מסוים. השגת יכולת עיכול מותאמת אישית של אמולסיות תלויה בהרכב הראשוני שלהם, אך דורשת גם מעקב אחר האבולוציה המתמשכת של ממשק זה במהלך המעבר דרך מערכת העיכול (איור 1).

Figure 1
איור 1: יישום הנדסה בין-פאזית של תחליבים כדי להתמודד עם כמה מהמצבים העיקריים במערכת העיכול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

עיכול שומנים הוא בסופו של דבר תהליך בין-פאזי מכיוון שהוא דורש ספיחה של ליפאזות (קיבה או לבלב) על ממשק מי השמן של טיפות שומנים מתחלבות דרך השכבה הבין-פאזית כדי להגיע ולהידרוליזה של הטריגליצרידים הכלולים בשמן לחומצות שומן חופשיות ומונואצילגליצרידים6. זה מתואר באיור 2. ליפאז קיבה מתחרה עם פפסין ופוספוליפידים בקיבה על ממשק שמן-מים (איור 2, עיכול קיבה). לאחר מכן, ליפאז/קוליפאז בלבלב מתחרים בטריפסין/כימוטריפסין, פוספוליפידים, מלחי מרה ומוצרי עיכול במעי הדק. פרוטאזות יכולות לשנות את הכיסוי הבין-מרחבי, למנוע או להעדיף ספיחת ליפאז, בעוד שמלחי מרה פעילים מאוד על פני השטח ודוחקים את רוב המתחלב שנותר כדי לקדם ספיחת ליפאז (איור 2, עיכול מעיים). בסופו של דבר, הקצב וההיקף של ליפוליזה תלויים בתכונות הבין-פאזיות של התחליב המעוכל הראשוני/קיבה, כגון עובי, קשרים בין-מולקולריים ואינטראקציות אלקטרוסטטיות וסטריות. בהתאם לכך, מעקב אחר האבולוציה של השכבה הבין-פאזית בזמן שהיא מתעכלת מציע פלטפורמה ניסיונית לזיהוי מנגנונים ואירועים בין-פאזיים המשפיעים על ספיחת ליפאז, ומכאן על עיכול השומנים.

Figure 2
איור 2: דיאגרמה סכמטית הממחישה את תפקידם של ממשקים בעיכול שומנים במערכת העיכול. הידרוליזה של פפסין משנה את ההרכב הבין-פאזי בשלב הקיבה, בעוד שליפאז קיבה מבצע הידרוליזה של טריגליצרידים. במעי הדק, טריפסין/כימוטריפסין מבצעים הידרוליזה נוספת של הסרט הבין-מרחבי, בעוד שליפוליזה ממשיכה על ידי ספיחה של BS/ליפאזות, הידרוליזה של טריגליצרידים, וספיגה של מוצרים ליפוליטיים על ידי סולוביזציה במיקלות/קומפלקס BS. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

ציוד הטלת התליון באוניברסיטת גרנדה (UGR) מיושם בטכנולוגיה מוגנת בפטנט, הנימים הכפולים הקואקסיאליים, המאפשרת החלפה תת-פאזית של הפתרון בתפזורת7. הנימי, המחזיק את טיפת התליון, מורכב מסידור של שני נימים קואקסיאליים המחוברים באופן עצמאי לכל ערוץ של מיקרו-אינז'קטור כפול. כל מיקרו-אינז'קטור יכול לפעול באופן עצמאי, מה שמאפשר להחליף את התוכן שנשמט על ידי זרימהדרך 7. לפיכך, חילופי subphase מורכב הזרקה בו זמנית של הפתרון החדש עם נימי הפנימי ואת מיצוי של תמיסה בתפזורת עם נימי החיצוני באמצעות אותו קצב זרימה. תהליך זה מאפשר החלפת התמיסה בתפזורת ללא הפרעה לאזור הבין-תאי או לנפח הטיפות. הליך זה שודרג מאוחר יותר להחלפה מרובת תת-פאזות, המאפשרת עד שמונה החלפות תת-פאזיות רצופות של פתרון תפזורת הטיפות8. זה מאפשר סימולציה של תהליך העיכול בטיפה מימית אחת המרחפת במדיה ליפידית על ידי החלפה רציפה של התמיסה בתפזורת עם מדיה מלאכותית המחקה את התאים השונים (פה, קיבה, מעי דק). המערך כולו מיוצג באיור 3, כולל פרטי הרכיבים. המזרקים במיקרו-אינז'קטור מחוברים לשמונת שסתומי ה-vias, שכל אחד מהם מתחבר לצינור מיקרו-צנטריפוגה המכיל את נוזל העיכול המלאכותי עם רכיבים המתוארים באיור 2.

Figure 3
איור 3: מבט כללי על התמנון עם כל הרכיבים. מצלמת ה-CCD, המיקרוסקופ, המיקרו-מייצב, התא התרמו-יציב והנימים הכפולים מחוברים באופן עצמאי למיקרו-מזרק כפול עם שני מזרקים המחוברים לשמונה שסתומי ויאס. כל מזרק מתחבר עם נימי, ארבעה צינורות microcentrifuge עם דגימה פריקה אחת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4A מראה כיצד כל אחד מנוזלי העיכול המלאכותיים מוזרק לתוך טיפת התליון על ידי חילוף תת-פאזי דרך הנימים הכפולים. כל תרכובת עיכול המפורטת באיור 2 ניתנת ליישום בו-זמנית/ברצף, תוך הדמיה של המעבר דרך מערכת העיכול. נוזלי העיכול המלאכותיים מכילים אנזימים שונים וחומרים פעילי שטח ביולוגיים, שמשנים את המתח הבין-תאי של המתחלב הראשוני, כפי שמתואר באיור 4B. התוכנה DINATEN (ראה טבלת חומרים), שפותחה גם היא ב- UGR, מתעדת את האבולוציה של המתח הבין-פאזי בזמן אמת כאשר השכבה הבין-פאזית הראשונית מתעכלת במבחנה. כמו כן, לאחר כל שלב עיכול, מחושבת האלסטיות הרחיבה של השכבה הבין-פאזית על ידי הטלת תנודות מחזוריות של נפח/אזור בין-פאזי על השכבה הבין-פאזית המיוצבת ורישום התגובה של המתח הבין-מרחבי. התקופה/תדר והמשרעת של התנודה יכולים להיות מגוונים, ועיבוד תמונה עם התוכנה CONTACTO מספק את הפרמטרים הריאולוגיים המרחיבים8.

Figure 4
איור 4: דוגמאות לפרופילי עיכול . (A) שכבת התחליב הראשונית נתונה למדיית עיכול מלאכותית הממוקמת במיקרוצנטריפוגה על ידי החלפת תת-פאזה רציפה של התמיסות השונות לתוך טיפת התליון. (B) האבולוציה הכללית של המתח הבין-פאזי (ציר y) של המתחלב הראשוני כפונקציה של הזמן (ציר x) כפי שהוא מתעכל במבחנה על ידי האנזימים/ביו-חומרים פעילי שטח שונים במדיה המלאכותית. חילוף תת-פאזי סופי עם נוזל מעיים רגיל מודד את הספיגה של שומנים מעוכלים על ידי סולוביזציה במיצלות מעורבות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

מחקר זה מציג את הפרוטוקול הכללי שנועד למדוד עיכול במבחנה של שכבות בין-מרחביות באמצעות ציוד לנפילת תליון9. השכבה הבין-פאזית הראשונית נתונה ברצף לתנאים המחקים את המעבר דרך מערכת העיכול, כפי שמתואר באיור 2. מדיות העיכול השונות האלה מוזרקות לתוך טיפת התליון על ידי החלפה תת-פאזית של התמיסות השונות הכלולות בצינורות המיקרוצנטריפוגה (איור 4A). ההרכב של מדיה זו יכול להיות מותאם אישית בהתאם לתנאי העיכול שיוערכו, כלומר, פרוטאוליזה קיבה / מעיים / ליפוליזה, המאפשר מדידת השפעות מצטברות ו sinergies10. תנאי הניסוי המשמשים לחיקוי תהליך העיכול בכל תא תואמים את פרוטוקול הקונצנזוס הבינלאומי שפורסם על ידי INFOGEST המפרט את ה- pH ואת כמויות האלקטרוליטים והאנזימים11. המכשיר הניסיוני המבוסס על נפילת תליון מאפשר הקלטה של המתח הבין-פאזי באתרו לאורך כל תהליך העיכול המדומה. הריאולוגיה המתרחבת של השכבה הבין-פאזית מחושבת בסוף כל שלב עיכול. בדרך זו, כל מתחלב מציע פרופיל עיכול הממחיש את התכונות של הממשקים המעוכלים, כפי שמתואר באיור 4B. זה מאפשר מיצוי של מסקנות לגבי רגישות או התנגדות לשלבים שונים של תהליך העיכול. באופן כללי, מדיית העיכול המלאכותית מכילה חומצה/pH בסיסית, אלקטרוליטים, פרוטאזות (קיבה ומעי), ליפאזות (קיבה ומעי), מלחי מרה ופוספוליפידים, המומסים בנוזלי העיכול שלהם (קיבה או מעיים). איור 4B מראה פרופיל גנרי של האבולוציה של המתח הבין-פאזי של המתחלב, תחילה נתון לפעולת פרוטאזות, ולאחר מכן ליפאזות. באופן כללי, פרוטאוליזה של השכבה הבין-פאזית מקדמת עלייה במתח הבין-פאזלי עקב ספיגה של פפטידים שעברו הידרוליזה9,12, בעוד שליפוליזה גורמת לירידה תלולה מאוד במתח הבין-פאזי עקב ספיחה של מלחי מרה וליפאזות 13. החלפה תת-פאזית סופית עם נוזל מעיים מדלדלת את התמיסה הגדולה של חומר לא מעוכל/מעוכל ומקדמת ספיגה של תרכובות מסיסות וסילוק שומנים מעוכלים במיקסים של מיצלות. ניתן לכמת זאת על-ידי העלייה במתח הבין-פאזי שנרשמה (איור 4B).

לסיכום, התכנון הניסיוני המיושם בטיפת התליון כדי לדמות עיכול במבחנה בטיפה בודדת מאפשר למדוד השפעות מצטברות וסינרגיות כאשר תהליך העיכול מוחל ברצף על שכבת הבינייםהראשונית 10. הרכב של כל מדיה העיכול ניתן לכוונן בקלות כדי להסביר את המאפיינים של תנאי העיכול, כולל פתולוגיות במערכת העיכול או מדיה העיכול התינוק14. לאחר מכן, ניתן להשתמש בזיהוי המנגנונים הבין-פאזיים המשפיעים על פרוטאוליזה וליפוליזה כדי לווסת את העיכול על ידי הנדסה בין-פאזית של תחליבים. ניתן ליישם את התוצאות המתקבלות בתכנון מטריצות מזון חדשניות עם פונקציות מותאמות אישית כגון אלרגניות נמוכה, צריכת אנרגיה מבוקרת וירידה בעיכול 15,16,17,18,19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. רצף ניקוי לכל כלי הזכוכית המשמשים בניסויים מדעיים על פני השטח

  1. קרצפו את כלי הזכוכית בתמיסת ניקוי מרוכזת (ראו טבלת חומרים) מדוללת במים (10%).
  2. יש לשטוף היטב עם רצף של מי ברז, פרופנול, מים מזוקקים ומים אולטרה-טהורים. יש לייבש בתא ולאחסן בארון סגור עד לשימוש.

2. הכנת דוגמאות

  1. הכינו מדיית עיכול מלאכותית בהתאם לפרוטוקולים המתוקנניםשל INFOGEST 11,20 (ראו טבלת חומרים). לפרטים, ראו טבלה 1 וכללו התאמות קטנות לדרישות העבודה הבין-פאזית למניעת זיהום פעיל של פני השטח ודילול דגימות (1:10)10.
  2. הכן את פתרון האמולסיפייר לפי השלבים הבאים.
    1. יש להכין 0.01 ליטר תמיסה מרוכזת של (1 ק"ג· L−1) מתחלב או תערובת של מתחלבים (ראו טבלת חומרים) במאגר ראשוני (טבלה 1) ולשמור תחת תסיסה קלה למשך הלילה.
    2. מדלל ל-0.1 ק"ג· L−1 (או כנדרש) כדי להרוות את הממשק; להגיע לרמה מדומה במתח הבין-תאי לאחר שעה אחת של ספיחה באזור בין-פאזי קבוע בעקבות דו"ח21 שפורסם קודם לכן.
    3. יש לשמור תחת תסיסה קלה במשך 15 דקות לפני השימוש.
  3. לטהר את שלב השמן.
    1. הכינו תערובת של שמן צמחי (חמניות, זית, טריולאין וכו ') ושרפים מטסיליקט מגנזיום (ראו טבלת חומרים) ביחס של 2:1 w/w בכוס גדולה. יש לשמור תחת תסיסה מכנית קלה למשך 3 שעות לפחות.
    2. צנטריפוגה בטמפרטורה של 8,000 x גרם למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בצנטריפוגה מסחרית (ראו טבלת חומרים).
    3. סנן את תערובת השמן תחת ואקום באמצעות מסנן מזרק (גודל נקבוביות 0.2 מיקרומטר) (ראו טבלת חומרים). יש לאחסן בבקבוקי ענבר נקיים אטומים ומבעבעים בחנקן עד לשימוש.

3. כיול וניקוי התמנון

  1. יש לשטוף את כל הצינורות במים טהורים במיוחד על ידי קביעת רצף של ניקוי שני המזרקים וכל השסתומים דרך נימי (שסתומים 6/4) וליציאה החיצונית (שסתום 8-צבע כחול). בצע זאת על-ידי לחיצה על לחצן הניקוי בתיבת הדו-שיח השמאלית (איור משלים 1A).
  2. בדקו את מתח הפנים7 של המים בטמפרטורת החדר על ידי יצירת טיפת מים ומדידה בזמן אמת במשך 5 דקות (איור משלים 1B, C).
    1. הגדר את הצפיפות הדיפרנציאלית לאוויר-מים (0.9982 ק"ג· L−1) בתיבת הדו-שיח השמאלית, איור משלים 1B.
  3. מלאו את הקובט הנקי (זכוכית אופטית) ב-0.002 ליטר שמן צמחי נקי והניחו אותו במחזיק הקובט בתא התרמוסטטי (איור 3).
  4. מכוונים את התרמוסטט ומאפשרים שיווי משקל טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  5. בדוק את המתח הבין-פאזי של שמן מים בטמפרטורת החדר7.
    1. הגדר את הצפיפות הדיפרנציאלית למי שמן צמחיים (שמן זית: 0.800 ק"ג· L−1) (איור משלים 1C).
    2. להזריק 40 μL בקצב של 0.5 μL·s−1 ולמדוד בזמן אמת כל שנייה עד סוף ההזרקה. זהו תהליך דינמי פשוט (איור משלים 1B, D).
    3. התווה את המתח הבין-מרחבי כפונקציה של נפח טיפות בגיליון נתונים.
    4. בדוק שטווח עוצמת הקול של הטיפות מספק ערך עבור המתח הבין-מרחבי ללא תלות בנפח הטיפות. התווה את האזור הבין-פאזלי כפונקציה של נפח טיפה.
    5. תכנן תהליך המכיל שני שלבים (איור משלים 1B ואיור משלים 2A) בהתאם לשלבים הבאים.
      1. עם מזרק פנימי, להזריק נפח הכלול בטווח זה של מתח הדדי קבוע.
      2. שמור על האזור הבין-מרחבי קבוע בערך שנבחר בשלב 3.5.4 ורשום את המתח הבין-פאזי למשך 5 דקות7.

4. תכנות תהליך ניסיוני אחד ב-DINATEN לכל שלב במערכת העיכול

הערה: לפרמטרים של התהליך, ראה איור משלים 1B.

  1. בצע את הבקרה הראשונית.
    1. לצורך היווצרות טיפות, הזריקו 10 μL (±5 μL) של תמיסת מתחלב לתוך הנימי (שסתום 6) (איור משלים 2A).
    2. רשום את הספיחה באזור בין-פאזי קבוע 21 מתוך 20 מ"מ 2 (±10 מ"מ2) למשך שעה אחת (איור משלים 2B).
    3. רשום את הריאולוגיה המרחיבה8 (איור משלים 2C).
      1. הגדר את המשרעת של תנודה ל 1.25 μL, נקודה 10 שניות.
      2. הקלט את הספיחה באזור הבין-פאזי שנבחר (שלב 4.1.2) במשך 10 שניות.
      3. חזור על שלב 4.1.3 בתקופות שונות: 5 שניות, 20 שניות, 50 שניות ו- 100 שניות.
  2. שיא עיכול קיבה.
    1. הקלט את הספיחה21 באזור הבין-פאזי שנבחר במשך 10 שניות.
    2. חילוף תת-פאזי7 עם נוזל בשסתום 2 (sSGF) ובאנזימי קיבה (טבלה 1) (איור משלים 2D).
      1. מלא את המזרק השמאלי משסתום 2. להזריק 125 μL לתוך שסתום 6-נימי עם מזרק שמאל ב 5 μL·s−1.
      2. חלץ 125 μL מהנימי עם המזרק הימני ב-5 μL·s−1. פרקו את המזרק הימני כדי לצאת משסתום 8. חזור על שלבים 4.2.2.1-4.2.2.2 10 פעמים כדי להבטיח החלפה מלאה.
    3. רשום את ספיחה21 באזור הבין-פאזי שנבחר בשלב 4.1.2 למשך שעה אחת (איור משלים 2B).
    4. רשום את הריאולוגיה המרחיבה8 (איור משלים 2C).
      1. הגדר את המשרעת של תנודה ל 1.25 μL, נקודה 10 שניות.
      2. רשום את ספיחת האזור הבין-פאזי שנבחר בשלב 4.1.2 עבור 10 שניות. חוזרים על הפעולה בתקופות שונות: 5 שניות, 20 שניות, 50 שניות, 100 שניות.
  3. שיא עיכול מעיים.
    1. רשום את ספיחה21 באזור הבין-פאזי שנבחר בשלב 4.1.2 עבור 10 שניות (איור משלים 2B).
    2. חילוף תת-פאזי7 עם נוזל בשסתום 3 (sSIF) ובאנזימי מעיים/מלחי מרה/פוספוליפידים (טבלה 1) (איור משלים 2D).
      1. מלא את המזרק השמאלי משסתום 2. להזריק 125 μL לתוך שסתום 6-נימי עם מזרק שמאל ב 5 μL·s−1. חלץ 125 μL מהנימי עם המזרק הימני ב-5 μL·s−1.
      2. פרקו את המזרק הימני כדי לצאת משסתום 8. חזור על שלבים 4.3.2.1-4.3.2.2 10 פעמים כדי להבטיח החלפה מלאה.
    3. רשום את ספיחה21 באזור הבין-פאזי שנבחר בשלב 4.1.2 למשך שעה אחת.
    4. רשום את הריאולוגיה המרחיבה8 (איור משלים 2C).
      1. הגדר את המשרעת של תנודה ל 1.25 μL, נקודה 10 שניות.
      2. רשום את הספיחה באזור הבין-פאזי שנבחר בשלב 4.1.2 למשך 10 שניות.
      3. חוזרים על הפעולה בתקופות שונות: 5 שניות, 20 שניות, 50 שניות, 100 שניות.
  4. הקלט את הספיגה בעקבות השלבים הבאים.
    1. רשום את ספיחה21 באזור הבין-פאזי שנבחר בשלב 4.1.2 עבור 10 שניות (איור משלים 2B).
    2. חילוף תת-פאזי7 עם נוזל בשסתום 5 (sSIF) (טבלה 1, איור משלים 2D).
      1. מלא את המזרק השמאלי משסתום 5. להזריק 125 μL לתוך שסתום 5-נימי עם מזרק שמאל ב 5 μL·s−1.
      2. חלץ 125 μL מהנימי עם המזרק הימני ב-5 μL·s−1. פרקו את המזרק הימני כדי לצאת משסתום 8. חזור על שלבים 4.4.2.1-4.4.2.2 10 פעמים כדי להבטיח החלפה מלאה.
    3. רשום את ספיחה21 באזור הבין-פאזי שנבחר בשלב 4.1.2 למשך שעה אחת (איור משלים 2B).
    4. רשום את הריאולוגיה המרחיבה8 (איור משלים 2C).
      1. לשמור על משרעת של 1.25 μL, תקופה 10 שניות.
      2. רשום את הספיחה באזור הבין-פאזי שנבחר בשלב 4.1.2 למשך 10 שניות.
      3. חזור על שלב 4.4.4 בתקופות שונות: 5 שניות, 20 שניות, 50 שניות, 100 שניות.

5. הגדרת הניסוי

  1. מלא את צינורות microcentrifuge עם מדיה העיכול המלאכותי ולחבר כל אחד מהם לשסתום המתאים על ידי צינורות המתאים.
  2. מלאו את הצינורות בשסתומים 2-5 על ידי ניקוי משסתום 2, שסתום 3, שסתום 4 ושסתום 5 ליציאה החיצונית (שסתום 8) (איור משלים 1A).
  3. מלאו את הצינורות בשסתום 1 על ידי ניקוי משסתום 1 לשסתום 6-נימי 5 פעמים.
  4. מכניסים את הנימים לשלב השמן. טען את המזרק השמאלי עם שסתום 1 (פתרון ראשוני, טבלה 1).
  5. התחל לעבד ברצף את שלב 4.1 הראשוני, שלב 4.2-קיבה, שלב 4.3-מעיים ושלב 4.4-ספיגה, תוך שמירת הנתונים בסוף כל תהליך.

6. חישוב הפרמטרים הריאולוגיים המרחיבים באמצעות תוכנת עיבוד התמונה CONTACTO8

הערה: לפרטים, ראה מלדונדו-ולדרמה ואח '8.

  1. טען את התמונות המתאימות לתנודת האזור בתדר ואמפליטודה נתונה (איור משלים 3A).
  2. לחץ על ריאולוגיה (איור משלים 3B) וקבל את הפרמטרים המרחיבים (איור משלים 3C).
  3. העתק והדבק את התוצאות לתוך גיליון פריסת הנתונים.

7. התוויית תוצאות הניסוי

  1. חשב מחדש את עמודת הזמן בכל אחד מהשלבים של תהליך העיכול על ידי הוספת הנתונים האחרונים של הזמן של השלב הקודם.
  2. התווה את המתח הבין-תאי לעומת זמן התוסף עבור כל אחד משלבי תהליך העיכול שבו נעשה שימוש.
  3. שרטטו את המתח הבין-מרחבי/גמישות וצמיגות הבין-פאזיים הסופיים המתקבלים בסוף כל שלב לעומת שלב העיכול: ראשוני, עיכול קיבה, עיכול תריסריון וספיגוע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

חלק זה מציג דוגמאות שונות לפרופילי עיכול שנמדדו באמצעות התמנון. המראה הכללי של התאמות פרופיל העיכול המדומה מוצג באיור 4B. המתח הבין-אישי מיוצג בדרך כלל כנגד הזמן בפרופיל העיכול. שלבי הפאזה/עיכול השונים הנחשבים מיוצגים בצבעים שונים. השלב הראשון יוצר את השכבה הראשונית ומתאים לשלב הספיחה של המתחלב או החלבון/פעילי השטח/הפולימר, בהתאם לכל מקרה. לאחר מכן, נוזלי העיכול השונים מוזרקים על ידי חילופי תת-פאזה לתמיסה בתפזורת המכילה את המדיה החדשה. תת-השלב החדש מייצר שינויים במתח הבין-פאזי של שכבת התחליב הראשונית ובריאולוגיה הרחיבה הנמדדת בסוף כל שלב עיכול. תהליך העיכול יכול לכלול לכל היותר שמונה שלבי עיכול.

Figure 5
איור 5: דוגמה לפרופילי עיכול קיבה. (A) פרוטאוליזה קיבה של אלבומין בסרום אנושי. מדיית העיכול מיושמת על ידי חילופי תת-פאזה עם פתרונות המפורטים בסעיף הניסוי ב- T = 37 °C. כחול: חיץ ראשוני עם חלבון, אדום: sSGF עם פפסין. נדפס מחדש באישור דל קסטילו-סנטאלה ואח'. (B) ליפוליזיס קיבה של פקטין הדרים. מדיית העיכול מיושמת על ידי חילופי תת-פאזה עם פתרונות המפורטים בסעיף הניסוי ב- T = 37 °C. כחול: חיץ ראשוני עם פקטין הדרים, צהוב: sSGF עם ליפאז קיבה, אפור: sSGF. נדפס מחדש באישור אינפנטס-גרסיה ואח'. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 5 מראה כמה תוצאות ניסיוניות שהתקבלו עבור עיכול קיבה של חומרים מתחלבים. באיור 5A, אלבומין בסרום אנושי (HSA)12 נספג לראשונה בממשק שמן זית-מים, מה שמקטין את המתח הבין-תאי כדי להגיע לרמה אחרי שעה אחת. בסוף שלב זה, הריאולוגיה נמדדת ב 0.1 הרץ (10 שניות) של תדר (נקודה). בשלב השני, sSGF עם פפסין מתווסף על ידי חילופי subphase. זה מורכב מהצגת נפח עם מזרק אחד תוך חילוץ אותו נפח עם המזרק השני. בדרך זו, שטח הטיפה אינו משתנה, תוך שמירה על הרכיבים הנספגים באופן בלתי הפיך בממשק השמן-מים. חילופי חוזר על עצמו בין 10-15 פעמים. במהלך החלפה תת-פאזית עם sSGF ופפסין, המתח הבין-פאזי עולה כתוצאה מהידרוליזה של החלבון, שמדללת את שכבת החלבון הראשונית (איור 5A). באיור 5B, פקטין הדרים (CP)17 סופח את מי שמן הטריגליצרידים למשך 40 דקות, ולאחר מכן ריאולוגיה מתרחבת ב-0.1 הרץ. בשלב השני, sSGF עם ליפאז קיבה מוזרק לתוך עיקר הירידה; לעומת זאת פרוטאוליזה, ליפוליזה גורמת לספיגת ליפאז ולהיווצרות חומצות שומן, שנשארות בממשק, ומפחיתות את המתח הבין-אישי. שלב הספיגה הוא השלב השלישי, אשר מעריך את הייצור של הידרופילי או solubilization של מוצרים ליפופיליים של ליפוליזה. איור 5B מראה שחילופי תת-פאזות עם sSGF מספקים תגובת אפס של המתח הבין-מרחבי. זה יכול להתפרש כייצור של מוצרי עיכול ליפופיליים, אשר סופחים באופן בלתי הפיך ואינם מסיסים, ונשארים מעוגנים בממשק. היעדר מלחי מרה בשלב הקיבה אחראי לחוסר solubilization. מידת הליפוליזה יכולה להיות מנותחת איכותית על ידי הערך של מתח הדדי שהושג.

Figure 6
איור 6: דוגמה לפרופילי עיכול מעיים . (A) פרופילי ספיחה-ספיגה של מלחי מרה (ריבועים שחורים), ליפאז (משולשים אפורים) וליפאז + מלחי מרה (רומבואידים כתומים) ב-sSIF בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. נדפס מחדש באישור מקירז'נקה ואחרים 13. (B) ספיחה של מלחי מרה + ליפאז על F68 שנספח בעבר (ירוק כהה) ו- F127 (ירוק בהיר), ספיחה של מלחי מרה (צהוב) ב- sSIF. ספיחה: החלפת תת-פאזה עם sSIF על מלחי מרה (כתום), F68 (סגול כהה) ו- F127 (סגול בהיר). נדפס מחדש באישור טורצ'לו-גומז ואחרים 19. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 6 מציג את תוצאות הניסוי שהתקבלו עבור עיכול מעיים של חומרים מתחלבים. בניגוד לעיכול קיבה, נוכחותם של מלחי מרה במעי הדק מציעה פרופילי ספיגה שונים בהחלפת תת-פאזה עם sSIF ודלדול התמיסה בתפזורת. איור 6A מראה את פרופילי הספיגה המתקבלים עבור מלחי מרה טהורים, ליפאז טהור ומלחי ליפאז/מרה מעורבים 8,9,10,13. מלחי המרה נספגים באופן הפיך על ממשק מי השמן, ולכן, הם מתפרקים לחלוטין עם חילופי תת-פאזה עם sSIF, כפי שעולה מהעלייה במתח הבין-פאזי כדי להגיע לערך של ממשק שמן-מים חשופים 8,13. לעומת זאת, ספיחת ליפאז באופן בלתי הפיך, כפי שניתן על ידי הערך הקבוע של מתח בין-פאזי לאחר חילופי תת-פאזות על ידי sSIF. תערובת ליפאז ומלחי מרה מספקת פרופיל ספיגת ביניים הניתן לכימות על ידי עלייה מוגבלת במתח הבין-פאזי עם החלפת תת-פאזה על ידי sSIF לערך ביניים. השכבה הבין-אישית הנותרת מכילה ליפאז וחומצות שומן חופשיות. ייתכן שמלחי המרה יצאו מהממשק ופיזרו חלק מחומצות השומן החופשיות שנוצרו בליפוליזה. איור 6B מראה את האבולוציה של המתח הבין-תאי על ליפוליזה של שתי גרסאות של פלורוני: F127 ו-F6819. איור 6B מראה ירידה תלולה במתח הבין-תאי עקב ספיחה של ליפאז ומלחי מרה וייצור חומצות שומן חופשיות על גבי יריעות בין-פאזיות שנוצרו בעבר של F68 ו-F127 בממשק שמן-מים. שלב הספיגה מראה את המתח הבין-פאזי המוגבר הנגרם על ידי חילופי תת-פאזה עם sSIF, אשר מכמת את הסולוביזציה של מוצרים ליפוליטיים.

Figure 7
איור 7: דוגמה לפרופילי עיכול דינמיים מלאים של מערכת העיכול . (A) פרופיל עיכול במבחנה של סרט ספיחה AS-48 בממשק אוויר-מים. מדיית העיכול מיושמת על ידי חילופי תת-פאזה עם פתרונות המפורטים בסעיף הניסוי ב- T = 37 °C. שליטה: חיץ ראשוני עם AS-48, פפסין: sSGF עם פפסין, טריפסין: sSIF עם טריפסין + כימוטריפסין, ספיגה: sSIF. נדפס מחדש באישור דל קסטילו-סנטאלה ואחרים 18. (B) פרופיל עיכול במבחנה של יריעות ספיחת אלבומין בסרום אנושי ובקר בממשק שמן זית-מים. מדיית העיכול מיושמת על ידי חילופי תת-פאזה עם פתרונות המפורטים בסעיף הניסוי ב- T = 37 °C. בקרה: חיץ ראשוני עם HSA/BSA, פפסין: sSGF עם פפסין, טריפסין: sSIF עם טריפסין + כימוטריפסין, ליפוליזה: sSIF עם ליפאז ומלחי מרה, ספיגה: sSIF. עקומות משורטטות הן ניסויים מייצגים עם סטיות <5%. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 7 מציג דוגמאות לפרופילי עיכול מדומים מלאים. איור 7A מראה את פרופיל העיכול של חומר משמר ביולוגי AS-48 של מזון שנספג בממשק אוויר-מים18. תהליך העיכול נועד להתמקד בפרוטאוליזה של פפטיד זה, בעוד ליפוליזה של שמן לא היה צורך, להיות בממשק אוויר-מים. לפיכך, העיכול המדומה באיור 7A מורכב מחמישה שלבים: בקרה/סרט ראשוני, פפסינוליזה, טריפסינוליזה וספיגה. תוצאות הניסוי הראו כי בקטריוצין זה עמיד הן לפפסין והן להידרוליזה של טריפסין מכיוון שמתח הפנים נותר ללא שינוי. בהתאם לכך, AS-48 נחשב לחומר משמר ביולוגי טוב למזון העמיד בפני עיכול במבחנה . איור 7B משווה את פרופילי העיכול במבחנה של שכבות ספיחה של אלבומינים בסרום אנושי ובקר שנספחו בממשק שמן-מים22. סימולציה זו נועדה לחקות את יכולת העיכול של תחליבים המיוצבים על-ידי שני חלבונים אלה23 ולהעריך את הכמוסות של כורכומין4. לפיכך, העיכול המדומה הותאם אישית וכלל חמישה שלבים: בקרה/ראשוניות, פפסינוליזה, טריפסינוליזה, ליפוליזה וספיגה. תוצאות הניסוי הראו מתח בין-תאי מוגבר לאחר עיכול פפסין, מה שמעיד על רגישות מוגברת לפפסינוליזה. זה יוחס להתפשטות מוגברת של גרסת הבקר עם ספיחה, וחשף אתרים רגישים לפפסין. לאחר מכן, טריפסינוליזה וליפוליזה סיפקו פרופילי עיכול דומים לחלוטין (איור 7B).

Figure 8
איור 8: דוגמה לערכים הסופיים של עיכול במערכת העיכול. (A) מתח בין-מרחבי, (B) גמישות מתרחבת, (C) צמיגות מרחיבה של עיכול במבחנה של סרט ספיחת β-לקטוגלובולין בממשק שמן זית-מים. הפרמטרים המרחיבים נמדדו ב-1 הרץ, 0.1 הרץ ו-0.01 הרץ לאחר שהממשק המעוכל היה מאוזן בכל שלב. מדיית העיכול מיושמת על ידי חילופי תת-פאזה עם פתרונות המפורטים בסעיף הניסוי ב- T = 37 °C. שליטה: חיץ ראשוני עם חלבון, פפסין: sSGF עם פפסין, טריפסין: sSIF עם טריפסין + כימוטריפסין, ליפוליזה: sSIF עם ליפאז ומלחי מרה, ספיגה: sSIF. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

באופן כללי, על מנת להעריך ולהשוות את טבען של שכבות בין-פאזיות מעוכלות שונות, המתח הבין-פאזי הסופי והגמישות/צמיגות ההרחבה המתקבלות עבור ממשקים מעוכלים מתווכים עבור כל אחד מהשלבים הנחשבים בתהליך העיכול המתוכנן. איור 8 מראה את המתח הבין-פאזי (איור 8A), את האלסטיות המתרחבת (איור 8B) ואת הצמיגות המרחיבה (איור 8C), הנמדדים בתדרים של 1 הרץ, 0.1 הרץ ו-0.01 הרץ. הערכים ששורטטו התקבלו לאחר כל שלב עיכול של ספיחת β-לקטוגלובולין בממשק שמן-מים16. איור 8A מראה כי פרוטאוליזה (פפסין וטריפסין) מייצרת עליות קטנות במתח הבין-תאי, בעוד ליפוליזה מפחיתה את הערך הזה, והספיגה עולה שוב. לגבי גמישות ההרחבה, החלבון יוצר שכבות אלסטיות ומחוברות זו לזו בממשק שמן-מים. נוכחותם של מלחי מרה מייצרת סרטים בין-אישיים ניידים וזורמים מאוד עם גמישות נמוכה. לבסוף, המוצרים הליפוליטיים הנותרים אינם יכולים לפתח סרט אלסטי מגובש לאחר ספיגה. האלסטיות הרחיבה גדלה מעט עם תדירות התנודה (איור 8B). לבסוף, הצמיגות הרחיבה של השכבות הבין-שכבתיות המוצגות באיור 8C ניתנת לזיהוי רק בתדר הנמוך יותר ומזהה את קיומם של רב-שכבתיים, אגרגטים או מבנים מתפזרים אחרים בממשק. השוואת פרופיל העיכול של β-לקטוגלובולין עם פרופיל העיכול המתקבל עבור β-לקטוגלובולין שטופלו בדופק הראתה יכולת עיכול משופרת של חלבונים הנתונים לסוג זה של טיפול פיזי16.

מאגר ראשוני 0.00113 מול L-1 NaH2ת.ד.4, pH 7.0
נוזל קיבה מדומה פשוט (sSGF) [NaH2PO4] = 0.00113 מול L-1, [NaCl] = 0.15 מול L-1, pH 3.0
נוזל מעיים מדומה פשוט (sSIF) [NaH 2 PO4] =0.00113 מול L-1, [NaCl] = 0.15 מול L-1, [CaCl2] = 0.003 מול L-1, pH 7.0
אנזימי קיבה פפסין (50 ∙ 10 3 U L-1), ליפאז קיבה (0.5 ∙ 103 U L-1)
אנזימי מעיים טריפסין (2.5 ∙ 10 3 U L-1), כימוטריפסין (0.625 ∙ 10 3 U L-1), ליפאז הלבלב (50∙ 10 3 U L-1), קו-ליפאז (150 ∙ 10 3 U L-1)
תערובת מלחי מרה 0.01 מול L-1 M. תערובת מלחי מרה: נתרן טאורוקולאט ונתרן דאוקסיכולאט (50/50) או נתרן טאורוכולאט ונתרן גליקודוקסיכולאט (50/50)

טבלה 1: הרכב מדיית העיכול המלאכותית.

איור משלים 1: פעולות בסיסיות של ממשק המחשב DINATEN. (א) הופעה כללית של ממשק המחשב DINATEN; תיבת הדו-שיח השמאלית מציגה את שני המזרקים המחוברים לכל השסתומים ושולטת על ההזרקה/מיצוי והניקוי. תיבת הדו-שיח המרכזית כוללת את הפקודה, את תמונת השחרור ואת הטבלה עם התוצאות. (B) החישוב בזמן אמת מספק מדידה אוטומטית כפונקציה של זמן. (C) פקודה שמאלית לכלול את צפיפות הדיפרנציאל. (D) תהליך דינמי פשוט שולט בנפח ההזרקה/מיצוי, בקצב ובזמני הלכידה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: הממשק לתכנות כל שלב עיכול (תהליך). (A) היווצרות טיפה עם מזרק שמאלי בנפח קבוע וקצב הזרקה קבוע. (B) ספיחה באזור בין-פאזי קבוע: שליטה. (C) ריאולוגיה עם משרעת, תקופה ומספר מחזורים קבועים. (D) החלפת תת-פאזה: להזריק ולחלץ עם שני המזרקים באותו קצב. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 3: חישוב הפרמטרים המרחיבים באמצעות התוכנה לניתוח תמונה CONTACTO. (A) ניתוח התמונות המתאימות לתנודה בתקופה קצובה. (B) חישוב הפרמטרים המרחיבים של השכבה הבין-פאזית של התמונות שנבחרו. (C) תיבת דו-שיח המציגה את התוצאות מהניתוח המורחב. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מאמר זה מתאר פרוטוקול כללי למדידת עיכול במבחנה של שכבות בין-מרחביות באמצעות ציוד להטלת תליון. ניתן להתאים את הפרוטוקול לדרישות הספציפיות של הניסוי על ידי כוונון הרכב מאגרי העיכול, המבוססים על פרוטוקול INFOGEST11,20 הרמוני כדי להקל על ההשוואה לספרות. ניתן להוסיף את אנזימי העיכול והחומרים פעילי השטח בנפרד, ברצף או ביחד. אפשרות אחרונה זו צריכה להתבצע בזהירות שכן הרוויה של השכבה הבין-פאזית תעכב את התופעות השונות על ידי מתן מתח בין-תאי נמוך מאוד ועלולה לגרום לטיפות ליפול. על מנת להיות מסוגל לנתח את ההשפעה של כל מרכיב עיכול, אנזימי העיכול השונים מתווספים ברצף ובריכוזים שונים. בדרך זו, את ההשפעות של כל רכיב ניתן לנתח שיטתי, ואת הסינרגיות מוערכים על ידי תוספת רציפה. כמו כן, כדי למנוע טיפות ליפול, כמה ריכוזים מדוללים9. לא ניתן לבצע אקסטרפולציה ישירה של התוצאות המתקבלות למערכות מתחלבות מכיוון שהתנאים מותאמים כדי להסביר מערכת פשוטה. עם זאת, האבולוציה של המתח הבין-פאזי מראה את האבולוציה של הכיסוי הבין-פאזי כאשר השכבה הבין-פאזית מתעכלת10. באופן דומה, האבולוציה של הריאולוגיה הרחיבה מספקת מידע מסוים על התכונות המכניות של הממשק ככל שהעיכול מתקדם9. תוצאות אלה מכילות מידע שימושי שניתן להתאים ולפרש בקפידה כך שיוחל על מערכות מתחלבות.

ציוד הטלת התליון מאפשר הערכה של אירועי in situ המתרחשים במיוחד בשכבה הבין-פאזית, כפי שמתואר באיור 2. ראשית, נוצרת שכבה בין-פאזית ראשונית, המייצגת טיפת תחליב אחת בודדת. שכבה ראשונית זו נתונה לתנאי עיכול שונים ומשנה את הרכבה ברצף בשל נוכחותם של המרכיבים השונים בשלב המיימי. כמו כן, ליפאזות חייבות להתגבר על שכבה בין-פאזית זו כדי לגשת לשלב השמן ולבצע הידרוליזה של השומן. אירועים בין-פאזיים אלה חייבים להיות מוערכים באותה שכבה בין-פאזית שנוצרה בתחילה. הכפפת תחליב לעיכול במבחנה תאפשר דגימה בזמנים שונים והערכת השינויים בתחליב תוך כדי עיכול (גודל טיפה, פוטנציאל זטה), אך היא לא תאפשר הערכה באתרה של השכבה הבין-מרחבית המקיפה כל טיפת תחליב. לפיכך, ציוד הטלת התליון המיושם בהחלפה מרובת פאזות כולל טכניקה משלימה המתמקדת בהנדסה הבין-פאזית של אמולסיות14.

המגבלה הראשונה של מתודולוגיה זו קשורה דווקא לרוויה של השכבה הבין-אישית עם מוצרים שונים, אשר צריך להיות מדולל כדי למנוע את נפילת הטיפות. נושא ניסיוני נוסף הוא דה-גזיפיקציה של כל המדיה המלאכותית על מנת למנוע גרעין של בועות, מה שעלול גם לגרום לניתוק טיפות מהנימי. חשוב גם לקחת בחשבון את יחס השמן-מים הגדול יותר בהשוואה למערכות תחליב בעת אקסטרפולציה למערכות מתחלבות. לבסוף, למרות שהראולוגיה הרחיבה מכילה מידע על האסוציאציות הבין-מולקולריות והתוך-מולקולריות בתוך השכבה הבין-מרחבית, הנוצרות ומשתבשות על-ידי אנזימי עיכול, קשה לפרש ולבצע אקסטרפולציה ליציבות התחליב. בסך הכל, טיפת התליון המיושמת עם מכשיר החלפה רב-פאזי היא ציוד שימושי להשלמת מחקרי עיכול במבחנה של תחליבים12, העוקבים אחר האבולוציה של התפלגות גודל הטיפות ופוטנציאל הזטה של עיכול חלבונים עם אלקטרופורזה22. שינויים במערכת העיכול כדי לקחת בחשבון שונות מגדרית, עיכול תינוקות או בעיות עיכול מהווים יישומים עתידיים של ההליך הניסיוני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי לא ידוע להם על אינטרסים כלכליים מתחרים או על קשרים אישיים שיכלו להשפיע על העבודה המדווחת במאמר זה.

Acknowledgments

מחקר זה מומן על ידי פרויקטים RTI2018-101309-B-C21 ו- PID2020-631-116615RAI00, במימון MCIN/AEI/10.13039/501100011033 ועל ידי "ERDF דרך ליצור את אירופה". עבודה זו נתמכה (חלקית) על ידי הקבוצה לפיזיקה ביוקולואידית וזורמים (ref. PAI-FQM115) של אוניברסיטת גרנדה (ספרד).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alpha-chymotrypsin from bovine pancreas Sigma-Aldrich C4129 Enzyme
Beta-lactoglobulin Sigma-Aldrich L0130 Emulsfier
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich 9048-46-8 Emulsfier
CaCl2 Sigma-Aldrich 10043-52-4 Electrolyte
Centrifuge Kronton instruments Centrikon T-124 For separating oil and resins
Citrus pectin Sigma-Aldrich P9135 Emulsfier
co-lipase FROM PORCINE PANCREAS Sigma C3028 Enzyme
CONTACTO University of Granada (UGR) https://core.ugr.es/dinaten/, last access: 07/18/2022
DINATEN University of Granada (UGR) https://core.ugr.es/dinaten/, last access: 07/18/2022
Gastric lipase Lipolytech RGE15-1G Enzyme
Human Serum Albumin Sigma-Aldrich 70024-90-7 Emulsifier
INFOGEST http://www.proteomics.ch/IVD/
Lipase from porcine pancreas, type II Sigma-Aldrich L33126 Enzyme
Magnesium metasilicate resins Fluka 1343-88-0 Resins to purify oil
Micro 90 International products M-9051-04 Cleaner
NaCl Sigma 7647-14-5 Electrolyte
NaH2PO4 Scharlau 10049-21-5 To prepare buffer
OCTOPUS Producciones Científicas y Técnicas S.L. (Gójar, Spain) Pendandt Drop Equipment implemented with multi subphase exchange
Olive oil Sigma-Aldrich 1514 oil
Pancreatic from porcine pancreas Sigma P7545-25 g Enzyme
Pepsin Sigma-Aldrich P6887 Enzyme
Pluronic F127 Sigma P2443 Emulsifier
Pluronic F68 Sigma P1300 Emulsfier
Sodium deoxycholate Sigma Bile salts
Sodium glycodeoxycholate Sigma C9910 Bile salts
Sodium taurocholate Sigma 86339 Bile salts
Syringe Filter Millex-DP SLGP033R  Syringe Filter 0.22 µm pore size polyethersulfone
Trypsin Sigma-Aldrich T1426 Enzyme

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McClements, D. J. The biophysics of digestion: Lipids. Current Opinion in Food Science. 21, 1-6 (2018).
  2. McClements, D. J., Li, Y. Structured emulsion-based delivery systems: Controlling the digestion and release of lipophilic food components. Advances in Colloid and Interface Science. 159 (2), 213-228 (2010).
  3. Corstens, M. N., et al. Food-grade micro-encapsulation systems that may induce satiety via delayed lipolysis: A review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 57 (10), 2218-2244 (2017).
  4. Aguilera-Garrido, A., del Castillo-Santaella, T., Galisteo-González, F., Gálvez-Ruiz, M. J., Maldonado-Valderrama, J. Investigating the role of hyaluronic acid in improving curcumin bioaccessibility from nanoemulsions. Food Chemistry. 351, 129301 (2021).
  5. Rodríguez Patino, J. M., Carrera Sánchez, C., Rodríguez Niño, M. R. Implications of interfacial characteristics of food foaming agents in foam formulations. Advances in Colloid and Interface Science. 140 (2), 95-113 (2008).
  6. Wilde, P. J., Chu, B. S. Interfacial & colloidal aspects of lipid digestion. Advances in Colloid and Interface Science. 165 (1), 14-22 (2011).
  7. Cabrerizo-Vílchez, M. A., Wege, H. A., Holgado-Terriza, J. A., Neumann, A. W. Axisymmetric drop shape analysis as penetration Langmuir balance. Review of Scientific Instruments. 70 (5), 2438-2444 (1999).
  8. Maldonado-Valderrama, J., Muros-Cobos, J. L., Holgado-Terriza, J. A., Cabrerizo-Vílchez, M. A. Bile salts at the air-water interface: Adsorption and desorption. Colloids and surfaces B: Biointerfaces. 120, 176-183 (2014).
  9. Maldonado-Valderrama, J., Terriza, J. A. H., Torcello-Gómez, A., Cabrerizo-Vílchez, M. A. In vitro digestion of interfacial protein structures. Soft Matter. 9, 1043-1053 (2013).
  10. Maldonado-Valderrama, J. Probing in vitro digestion at oil-water interfaces. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 39, 51-60 (2019).
  11. Brodkorb, A., et al. INFOGEST static in vitro simulation of gastrointestinal food digestion. Nature Protocols. 14 (4), 991-1014 (2019).
  12. del Castillo-Santaella, T., Maldonado-Valderrama, J., Molina-Bolivar, J. A., Galisteo-Gonzalez, F. Effect of cross-linker glutaraldehyde on gastric digestion of emulsified albumin. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 145, 899-905 (2016).
  13. Macierzanka, A., Torcello-Gómez, A., Jungnickel, C., Maldonado-Valderrama, J. Bile salts in digestion and transport of lipids. Advances in Colloid and Interface Science. 274, 102045 (2019).
  14. Maldonado-Valderrama, J., Torcello-Gómez, A., del Castillo-Santaella, T., Holgado-Terriza, J. A., Cabrerizo-Vílchez, M. A. Subphase exchange experiments with the pendant drop technique. Advances in Colloid and Interface Science. 222, 488-501 (2015).
  15. Bellesi, F. A., Ruiz-Henestrosa, V. M. P., Maldonado-Valderrama, J., Del Castillo Santaella, T., Pilosof, A. M. R. Comparative interfacial in vitro digestion of protein and polysaccharide oil/water films. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 161, 547-554 (2018).
  16. Del Castillo-Santaella, T., Sanmartín, E., Cabrerizo-Vílchez, M. A., Arboleya, J. C., Maldonado-Valderrama, J. Improved digestibility of β-lactoglobulin by pulsed light processing: A dilatational and shear study. Soft Matter. 10 (48), 9702-9714 (2014).
  17. Infantes-Garcia, M. R., et al. In vitro gastric lipid digestion of emulsions with mixed emulsifiers: Correlation between lipolysis kinetics and interfacial characteristics. Food Hydrocolloids. 128, 107576 (2022).
  18. del Castillo-Santaella, T., Cebrián, R., Maqueda, M., Gálvez-Ruiz, M. J., Maldonado-Valderrama, J. Assessing in vitro digestibility of food biopreservative AS-48. Food Chemistry. 246, 249-257 (2018).
  19. Torcello-Gómez, A., Maldonado-Valderrama, J., Jódar-Reyes, A. B., Cabrerizo-Vílchez, M. A., Martín-Rodríguez, A. Pluronic-covered oil-water interfaces under simulated duodenal conditions. Food Hydrocolloids. 34, 54-61 (2014).
  20. Minekus, M., et al. A standardised static in vitro digestion method suitable for food - an international consensus. Food & Function. 5 (6), 1113-1124 (2014).
  21. Wege, H. A., Holgado-Terriza, J. A., Cabrerizo-Vílchez, M. A. Development of a constant surface pressure penetration langmuir balance based on axisymmetric drop shape analysis. Journal of Colloid and Interface Science. 249 (2), 263-273 (2002).
  22. del Castillo-Santaella, T., et al. Hyaluronic acid and human/bovine serum albumin shelled nanocapsules: Interaction with mucins and in vitro digestibility of interfacial films. Food Chemistry. 383, 132330 (2022).
  23. Aguilera-Garrido, A., et al. Applications of serum albumins in delivery systems: Differences in interfacial behaviour and interacting abilities with polysaccharides. Advances in Colloid and Interface Science. 290 (5), 102365 (2021).

Tags

ביוכימיה גיליון 189
<em>במבחנה</em> עיכול תחליבים בטיפה אחת <em>באמצעות</em> החלפה רב-פאזית של נוזלי מערכת העיכול המדומים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maldonado-Valderrama, J., del… More

Maldonado-Valderrama, J., del Castillo Santaella, T., Holgado-Terriza, J. A., Cabrerizo-Vílchez, M. Á. In vitro Digestion of Emulsions in a Single Droplet via Multi Subphase Exchange of Simulated Gastrointestinal Fluids. J. Vis. Exp. (189), e64158, doi:10.3791/64158 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter