In vitro Digestion av emulsioner i en enda droppe via multi-subfasutbyte av simulerade gastrointestinala vätskor
Summary
En hängande droppytafilmbalans implementerad med ett flerfasutbyte, smeknamnet OCTOPUS, möjliggör efterliknande matsmältningsförhållanden genom sekventiell subfasutbyte av den ursprungliga bulklösningen med simulerade gastrointestinala vätskor. Den simulerade matsmältningen in vitro övervakas genom att på plats registrera gränssnittsspänningen i det smälta gränsskiktet.
Abstract
Emulsioner används för närvarande för att kapsla in och leverera näringsämnen och läkemedel för att hantera olika gastrointestinala tillstånd som fetma, näringsbefästning, matallergier och matsmältningssjukdomar. Förmågan hos en emulsion att tillhandahålla den önskade funktionaliteten, nämligen att nå en specifik plats i mag-tarmkanalen, hämma / fördröja lipolys eller underlätta smältbarhet, beror i slutändan på dess mottaglighet för enzymatisk nedbrytning i mag-tarmkanalen. I olja-i-vatten-emulsioner omges lipiddroppar av gränssnittsskikt, där emulgeringsmedlen stabiliserar emulsionen och skyddar den inkapslade föreningen. Att uppnå en skräddarsydd smältbarhet av emulsioner beror på deras ursprungliga sammansättning men kräver också övervakning av utvecklingen av dessa gränsskikt eftersom de utsätts för olika faser av gastrointestinal matsmältning. En hängande droppytafilmbalans implementerad med ett utbyte med flera subfaser gör det möjligt att simulera in vitro-uppslutning av emulsioner i en enda vattendroppe nedsänkt i olja genom att tillämpa en anpassad statisk matsmältningsmodell. Transiteringen genom mag-tarmkanalen efterliknas av subfasutbytet av den ursprungliga droppbulklösningen med konstgjorda medier, vilket efterliknar de fysiologiska förhållandena i varje fack / steg i mag-tarmkanalen. Den dynamiska utvecklingen av gränsspänningen registreras in situ genom hela den simulerade gastrointestinala matsmältningen. De mekaniska egenskaperna hos smälta gränssnitt, såsom interfacial dilatationselasticitet och viskositet, mäts efter varje matsmältningsfas (oral, gastrisk, tunntarmen). Sammansättningen av varje matsmältningsmedia kan ställas in för att ta hänsyn till särdragen i matsmältningsförhållandena, inklusive gastrointestinala patologier och spädbarns matsmältningsmedier. De specifika gränssnittsmekanismerna som påverkar proteolys och lipolys identifieras, vilket ger verktyg för att modulera matsmältningen genom gränssnittsteknik av emulsioner. De erhållna resultaten kan manipuleras för att utforma nya livsmedelsmatriser med skräddarsydda funktioner som låg allergenicitet, kontrollerat energiintag och minskad smältbarhet.
Introduction
Att förstå hur fett smälts, vilket innebär emulsionssmältning, är viktigt för att rationellt utforma produkter med skräddarsydd funktionalitet1. Underlaget för fettsmältning är en emulsion eftersom fett emulgeras vid konsumtion genom mekanisk verkan och blandning med biosurfaktanter i munnen och magen. Dessutom är det mesta av det fett som konsumeras av människor redan emulgerat (som mjölkprodukter), och när det gäller spädbarn eller vissa äldre är detta den enda formen av konsumtion. Därför är utformningen av emulsionsbaserade produkter med specifika matsmältningsprofiler mycket viktig i näring1. Dessutom kan emulsioner kapsla in och leverera näringsämnen, läkemedel eller lipofila bioaktiva ämnen2 för att hantera olika gastrointestinala tillstånd som fetma3, näringsbefästning, matallergier och matsmältningssjukdomar. I olja-i-vatten-emulsioner omges lipiddroppar av gränssnittsskikt av emulgeringsmedel såsom proteiner, ytaktiva ämnen, polymerer, partiklar och blandningar4. Emulgeringsmedlens roll är tvåfaldig: stabilisera emulsionen5 och skydda/transportera den inkapslade föreningen till ett specifikt ställe. Att uppnå en skräddarsydd smältbarhet av emulsioner beror på deras ursprungliga sammansättning men kräver också övervakning av den kontinuerliga utvecklingen av detta gränssnitt under transiteringen genom mag-tarmkanalen (figur 1).
Figur 1: Tillämpa gränssnittsteknik av emulsioner för att hantera några av de viktigaste gastrointestinala tillstånden. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Lipidsmältning är i slutändan en gränssnittsprocess eftersom det kräver adsorption av lipaser (magsäck eller bukspottkörtel) på olje-vattengränssnittet för emulgerade lipiddroppar genom gränsskiktet för att nå och hydrolysera triglyceriderna i oljan till fria fettsyror och monoacylglycerider6. Detta schematiseras i figur 2. Maglipas konkurrerar med pepsin och fosfolipider i magsäcken om gränssnittet mellan olja och vatten (figur 2, magsmältningen). Sedan, pankreas lipas / kolipas konkurrera med trypsin / chymotrypsin, fosfolipider, gallsalter, och matsmältningsprodukter i tunntarmen. Proteaser kan förändra gränssnittstäckningen, förhindra eller gynna lipasadsorption, medan gallsalter är mycket ytaktiva och förskjuter det mesta av det återstående emulgeringsmedlet för att främja lipasadsorption (figur 2, intestinal matsmältning). Så småningom beror lipolysens hastighet och omfattning på gränssnittsegenskaperna hos den initiala / gastriska smälta emulsionen, såsom tjockleken, inter / intramolekylära anslutningar och elektrostatiska och steriska interaktioner. Följaktligen erbjuder övervakning av utvecklingen av gränsskiktet när det smälts en experimentell plattform för att identifiera gränssnittsmekanismer och händelser som påverkar lipasadsorption och därmed lipidsmältning.
Figur 2: Schematiskt diagram som illustrerar gränssnittens roll i gastrointestinal lipidsmältning. Pepsinhydrolys förändrar gränssnittskompositionen vid magfasen, medan gastrlipas hydrolyserar triglycerider. I tunntarmen hydrolyserar trypsin/chymotrypsin ytterligare gränssnittsfilmen, medan lipolys fortskrider genom adsorption av BS/lipaser, hydrolys av triglycerider och desorption av lipolytiska produkter genom solubilisering i BS-miceller / komplexet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Pendeldroppsutrustningen vid University of Granada (UGR) implementeras med en patenterad teknik, den koaxiella dubbelkapillären, som möjliggör subfasutbyte av bulklösningen7. Kapillären, som håller hängande droppen, består av ett arrangemang av två koaxialkapillärer som är oberoende anslutna till varje kanal i en dubbel mikroinjektor. Varje mikroinjektor kan fungera oberoende, vilket möjliggör utbyte av det tappade innehållet genom genomflöde7. Följaktligen består subfasutbytet av samtidig injektion av den nya lösningen med den inre kapillären och extraktionen av bulklösningen med den yttre kapillären med användning av samma flödeshastighet. Denna process möjliggör ersättning av bulklösningen utan störning av gränsområdet eller droppens volym. Denna procedur uppgraderades senare till ett flerfasutbyte, vilket möjliggör upp till åtta sekventiella subfasutbyten av droppbulklösningen8. Detta möjliggör simulering av matsmältningsprocessen i en enda vattenhaltig droppe suspenderad i lipidiska medier genom att sekventiellt utbyta bulklösningen med konstgjorda medier som efterliknar de olika facken (mun, mage, tunntarm). Hela installationen representeras i figur 3, inklusive detaljer om komponenterna. Sprutorna i mikroinjektorn är anslutna till de åtta viasventilerna, som var och en ansluter till ett mikrocentrifugrör som innehåller den konstgjorda matsmältningsvätskan med komponenter som beskrivs i figur 2.
Figur 3: Allmän bild av bläckfisken med alla komponenter. CCD-kameran, mikroskopet, mikrolägesställaren, termostabiliserad cell och dubbelkapillär ansluten oberoende till en dubbel mikroinjektor med två sprutor anslutna till åtta viasventiler. Varje spruta ansluts med kapillär, fyra mikrocentrifugrör med prov och en urladdning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4A visar hur var och en av de konstgjorda matsmältningsvätskorna injiceras i hänget droppe genom subfasutbyte genom dubbelkapillären. Varje matsmältningsförening som beskrivs i figur 2 kan appliceras samtidigt/sekventiellt och simulera passagen genom mag-tarmkanalen. De konstgjorda matsmältningsvätskorna innehåller olika enzymer och biosurfaktanter, som förändrar gränssnittsspänningen hos det initiala emulgeringsmedlet, enligt schemat i figur 4B. Programvaran DINATEN (se Materialförteckning), som också utvecklats vid UGR, registrerar utvecklingen av gränssnittsspänningen i realtid när det ursprungliga gränssnittsskiktet smälts in vitro. Efter varje matsmältningsfas beräknas också dilatationselasticiteten hos det interfaciala skiktet genom att införa periodiska svängningar av volym / gränssnittsområde på det stabiliserade gränssnittsskiktet och registrera svaret på gränssnittsspänningen. Perioden/frekvensen och amplituden för oscillationen kan varieras, och bildbehandling med programvaran CONTACTO tillhandahåller de dilatationella reologiska parametrarna8.
Figur 4: Exempel på rötningsprofiler . (A) Det ursprungliga emulgeringsskiktet utsätts för artificiella matsmältningsmedier placerade i mikrocentrifugen genom sekventiellt subfasutbyte av de olika lösningarna i hängdroppen. (B) Den allmänna utvecklingen av gränssnittsspänningen (y-axeln) hos det ursprungliga emulgeringsmedlet som en funktion av tiden (x-axeln) när den smälts in vitro av de olika enzymerna/biosurfaktanterna i det artificiella mediet. Ett slutligt subfasutbyte med vanlig tarmvätska mäter desorptionen av smält lipid genom solubilisering i blandade miceller . Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Denna studie presenterar det allmänna protokollet som är utformat för att mäta in vitro-matsmältning av gränssnittsskikt med hängande dropputrustning9. Det initiala gränssnittsskiktet utsätts sekventiellt för förhållanden som efterliknar passagen genom mag-tarmkanalen, som visas i figur 2. Dessa olika matsmältningsmedier injiceras i hängdroppen genom subfasutbyte av de olika lösningarna i mikrocentrifugrören (figur 4A). Sammansättningen av dessa medier kan anpassas beroende på de gastrointestinala förhållanden som kommer att utvärderas, nämligen mag-/tarmproteolys/lipolys, vilket möjliggör mätning av kumulativa effekter och sinergies10. De experimentella betingelserna som används för att efterlikna matsmältningsprocessen i varje fack följer det internationella konsensusprotokollet som publicerats av INFOGEST som beskriver pH och mängder elektrolyter och enzymer11. Den experimentella anordningen baserad på hängande droppe möjliggör inspelning av gränssnittsspänningen på plats under hela den simulerade matsmältningsprocessen. Mellanskiktets dilatationella reologi beräknas i slutet av varje matsmältningssteg. På detta sätt erbjuder varje emulgeringsmedel en matsmältningsprofil som illustrerar egenskaperna hos de smälta gränssnitten, som visas i figur 4B. Detta möjliggör extraktion av slutsatser om dess mottaglighet eller resistens mot de olika stadierna i matsmältningsprocessen. I allmänhet innehåller det artificiella matsmältningsmediet syra / basiskt pH, elektrolyter, proteaser (mag- och tarm), lipaser (mag- och tarm), gallsalter och fosfolipider, som löses i sina respektive matsmältningsvätskor (mag- eller tarm). Figur 4B visar en generisk profil av utvecklingen av ett emulgeringsmedels gränssnittsspänning, först utsatt för proteasverkan, följt av lipaser. I allmänhet främjar proteolys av gränsskiktet en ökning av gränssnittsspänningen på grund av desorptionen av hydrolyserade peptider9,12, medan lipolys resulterar i en mycket brant minskning av gränssnittsspänningen på grund av adsorptionen av gallsalter och lipaser 13. Ett slutligt subfasutbyte med tarmvätska utarmar bulklösningen av oadsorberat / smält material och främjar desorptionen av lösliga föreningar och solubiliseringen av smälta lipider i blandade miceller. Detta kvantifieras genom den ökade gränssnittsspänningen som registrerats (figur 4B).
Sammanfattningsvis möjliggör den experimentella designen som implementeras i hängande droppe för att simulera in vitro-matsmältning i en enda droppe att mäta kumulativa effekter och synergier när matsmältningsprocessen appliceras sekventiellt på det initiala gränssnittsskiktet10. Sammansättningen av varje matsmältningsmedium kan enkelt ställas in för att ta hänsyn till särdragen i matsmältningsförhållandena, inklusive gastrointestinala patologier eller spädbarns matsmältningsmedier14. Därefter kan identifiering av gränssnittsmekanismerna som påverkar proteolys och lipolys användas för att modulera matsmältningen genom gränssnittsteknik av emulsioner. De erhållna resultaten kan tillämpas vid utformning av nya livsmedelsmatriser med skräddarsydda funktioner såsom låg allergenicitet, kontrollerat energiintag och minskad smältbarhet 15,16,17,18,19.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den här artikeln beskriver ett generaliserat protokoll för att mäta in vitro-matsmältning av gränssnittsskikt med hjälp av hängande dropputrustning. Protokollet kan anpassas till experimentets specifika krav genom att ställa in sammansättningen av matsmältningsbuffertarna, som är baserade på det harmoniserade protokollet INFOGEST11,20 för att underlätta jämförelse med litteratur. Matsmältningsenzymerna och biosurfaktanterna kan tillsät…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning finansierades av projekten RTI2018-101309-B-C21 och PID2020-631-116615RAI00, finansierade av MCIN/AEI/10.13039/501100011033 och av “ERUF Ett sätt att skapa Europa”. Detta arbete stöddes (delvis) av Biocolloid and Fluid Physics Group (ref. PAI-FQM115) vid universitetet i Granada (Spanien).
Materials
| Alpha-chymotrypsin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | C4129 | Enzyme |
| Beta-lactoglobulin | Sigma-Aldrich | L0130 | Emulsfier |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | Emulsfier |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | Electrolyte |
| Centrifuge | Kronton instruments | Centrikon T-124 | For separating oil and resins |
| Citrus pectin | Sigma-Aldrich | P9135 | Emulsfier |
| co-lipase FROM PORCINE PANCREAS | Sigma | C3028 | Enzyme |
| CONTACTO | University of Granada (UGR) | https://core.ugr.es/dinaten/, last access: 07/18/2022 | |
| DINATEN | University of Granada (UGR) | https://core.ugr.es/dinaten/, last access: 07/18/2022 | |
| Gastric lipase | Lipolytech | RGE15-1G | Enzyme |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | 70024-90-7 | Emulsifier |
| INFOGEST | http://www.proteomics.ch/IVD/ | ||
| Lipase from porcine pancreas, type II | Sigma-Aldrich | L33126 | Enzyme |
| Magnesium metasilicate resins | Fluka | 1343-88-0 | Resins to purify oil |
| Micro 90 | International products | M-9051-04 | Cleaner |
| NaCl | Sigma | 7647-14-5 | Electrolyte |
| NaH2PO4 | Scharlau | 10049-21-5 | To prepare buffer |
| OCTOPUS | Producciones Científicas y Técnicas S.L. (Gójar, Spain) | Pendandt Drop Equipment implemented with multi subphase exchange | |
| Olive oil | Sigma-Aldrich | 1514 | oil |
| Pancreatic from porcine pancreas | Sigma | P7545-25 g | Enzyme |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P6887 | Enzyme |
| Pluronic F127 | Sigma | P2443 | Emulsifier |
| Pluronic F68 | Sigma | P1300 | Emulsfier |
| Sodium deoxycholate | Sigma | Bile salts | |
| Sodium glycodeoxycholate | Sigma | C9910 | Bile salts |
| Sodium taurocholate | Sigma | 86339 | Bile salts |
| Syringe Filter | Millex-DP | SLGP033R | Syringe Filter 0.22 µm pore size polyethersulfone |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | Enzyme |
References
- McClements, D. J. The biophysics of digestion: Lipids. Current Opinion in Food Science. 21, 1-6 (2018).
- McClements, D. J., Li, Y. Structured emulsion-based delivery systems: Controlling the digestion and release of lipophilic food components. Advances in Colloid and Interface Science. 159 (2), 213-228 (2010).
- Corstens, M. N., et al. Food-grade micro-encapsulation systems that may induce satiety via delayed lipolysis: A review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 57 (10), 2218-2244 (2017).
- Aguilera-Garrido, A., del Castillo-Santaella, T., Galisteo-González, F., Gálvez-Ruiz, M. J., Maldonado-Valderrama, J. Investigating the role of hyaluronic acid in improving curcumin bioaccessibility from nanoemulsions. Food Chemistry. 351, 129301 (2021).
- Rodríguez Patino, J. M., Carrera Sánchez, C., Rodríguez Niño, M. R. Implications of interfacial characteristics of food foaming agents in foam formulations. Advances in Colloid and Interface Science. 140 (2), 95-113 (2008).
- Wilde, P. J., Chu, B. S. Interfacial & colloidal aspects of lipid digestion. Advances in Colloid and Interface Science. 165 (1), 14-22 (2011).
- Cabrerizo-Vílchez, M. A., Wege, H. A., Holgado-Terriza, J. A., Neumann, A. W. Axisymmetric drop shape analysis as penetration Langmuir balance. Review of Scientific Instruments. 70 (5), 2438-2444 (1999).
- Maldonado-Valderrama, J., Muros-Cobos, J. L., Holgado-Terriza, J. A., Cabrerizo-Vílchez, M. A. Bile salts at the air-water interface: Adsorption and desorption. Colloids and surfaces B: Biointerfaces. 120, 176-183 (2014).
- Maldonado-Valderrama, J., Terriza, J. A. H., Torcello-Gómez, A., Cabrerizo-Vílchez, M. A. In vitro digestion of interfacial protein structures. Soft Matter. 9, 1043-1053 (2013).
- Maldonado-Valderrama, J. Probing in vitro digestion at oil-water interfaces. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 39, 51-60 (2019).
- Brodkorb, A., et al. INFOGEST static in vitro simulation of gastrointestinal food digestion. Nature Protocols. 14 (4), 991-1014 (2019).
- del Castillo-Santaella, T., Maldonado-Valderrama, J., Molina-Bolivar, J. A., Galisteo-Gonzalez, F. Effect of cross-linker glutaraldehyde on gastric digestion of emulsified albumin. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 145, 899-905 (2016).
- Macierzanka, A., Torcello-Gómez, A., Jungnickel, C., Maldonado-Valderrama, J. Bile salts in digestion and transport of lipids. Advances in Colloid and Interface Science. 274, 102045 (2019).
- Maldonado-Valderrama, J., Torcello-Gómez, A., del Castillo-Santaella, T., Holgado-Terriza, J. A., Cabrerizo-Vílchez, M. A. Subphase exchange experiments with the pendant drop technique. Advances in Colloid and Interface Science. 222, 488-501 (2015).
- Bellesi, F. A., Ruiz-Henestrosa, V. M. P., Maldonado-Valderrama, J., Del Castillo Santaella, T., Pilosof, A. M. R. Comparative interfacial in vitro digestion of protein and polysaccharide oil/water films. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 161, 547-554 (2018).
- Del Castillo-Santaella, T., Sanmartín, E., Cabrerizo-Vílchez, M. A., Arboleya, J. C., Maldonado-Valderrama, J. Improved digestibility of β-lactoglobulin by pulsed light processing: A dilatational and shear study. Soft Matter. 10 (48), 9702-9714 (2014).
- Infantes-Garcia, M. R., et al. In vitro gastric lipid digestion of emulsions with mixed emulsifiers: Correlation between lipolysis kinetics and interfacial characteristics. Food Hydrocolloids. 128, 107576 (2022).
- del Castillo-Santaella, T., Cebrián, R., Maqueda, M., Gálvez-Ruiz, M. J., Maldonado-Valderrama, J. Assessing in vitro digestibility of food biopreservative AS-48. Food Chemistry. 246, 249-257 (2018).
- Torcello-Gómez, A., Maldonado-Valderrama, J., Jódar-Reyes, A. B., Cabrerizo-Vílchez, M. A., Martín-Rodríguez, A. Pluronic-covered oil-water interfaces under simulated duodenal conditions. Food Hydrocolloids. 34, 54-61 (2014).
- Minekus, M., et al. A standardised static in vitro digestion method suitable for food – an international consensus. Food & Function. 5 (6), 1113-1124 (2014).
- Wege, H. A., Holgado-Terriza, J. A., Cabrerizo-Vílchez, M. A. Development of a constant surface pressure penetration langmuir balance based on axisymmetric drop shape analysis. Journal of Colloid and Interface Science. 249 (2), 263-273 (2002).
- del Castillo-Santaella, T., et al. Hyaluronic acid and human/bovine serum albumin shelled nanocapsules: Interaction with mucins and in vitro digestibility of interfacial films. Food Chemistry. 383, 132330 (2022).
- Aguilera-Garrido, A., et al. Applications of serum albumins in delivery systems: Differences in interfacial behaviour and interacting abilities with polysaccharides. Advances in Colloid and Interface Science. 290 (5), 102365 (2021).
