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Cancer Research

유세포분석을 통한 노화 종양 세포의 식별 및 농축을 위한 원적색 형광 노화 관련 β-갈락토시다아제 프로브

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64176
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Molecular Genetics and Cell Biology, University of Chicago

Summary

세포 배양 또는 쥐 종양 모델에서 화학 요법 약물에 의해 유도 된 노화 암 세포의 형광, 유세포 측정 정량화를위한 프로토콜이 제시된다. 선택적 절차에는 공동 면역염색, 대규모 배치 또는 시점 분석을 용이하게 하기 위한 샘플 고정, 유세포 분석 분류에 의한 생존 가능한 노화 세포의 농축이 포함됩니다.

Abstract

세포 노화는 노화 세포에서 일반적으로 수년에 걸쳐 발생하는 생물학적 손상에 의해 유발되는 증식 정지 상태이지만 다양한 암 치료에 의해 유발 된 손상에 대한 반응으로 종양 세포에서도 빠르게 나타날 수 있습니다. 종양 세포 노화는 노화 세포가 사멸에 내성을 갖게되고 종양 완화를 차단하면서 종양 악성 종양 및 치료 내성을 악화시키기 때문에 일반적으로 바람직하지 않은 것으로 간주됩니다. 따라서 노화 종양 세포의 식별은 암 연구 커뮤니티의 지속적인 관심사입니다. 다양한 노화 분석이 존재하며, 많은 것이 잘 알려진 노화 마커인 노화 관련 베타-갈락토시다아제(SA-β-Gal)의 활성을 기반으로 합니다.

일반적으로 SA-β-Gal 분석은 고정 된 세포에 발색 기질 (X-Gal)을 사용하여 수행되며 광학 현미경으로 "파란색"노화 세포를 느리고 주관적으로 열거합니다. C12-FDG(녹색) 및 DDAO-갈락토사이드(DDAOG; far-red)를 포함한 세포 투과성 형광 SA-β-Gal 기질을 사용한 개선된 분석은 살아있는 세포의 분석을 가능하게 하고 유세포분석기를 포함한 고처리량 형광 분석 플랫폼의 사용을 가능하게 했습니다. C12-FDG는 SA-β-Gal에 대해 잘 문서화 된 프로브이지만 녹색 형광 방출은 리포 푸신 응집체의 축적으로 인해 노화 중에 발생하는 고유 세포자가 형광 (AF)과 겹칩니다. 원적색 SA-β-Gal 프로브 DDAOG를 활용하여 녹색 세포 자가형광을 노화를 확인하기 위한 보조 파라미터로 사용하여 분석에 신뢰성을 더할 수 있습니다. 나머지 형광 채널은 세포 생존율 염색 또는 선택적인 형광 면역표지에 사용될 수 있다.

유세포 분석을 사용하여 노화 종양 세포의 식별을 위한 이중 매개변수 분석으로 DDAOG 및 리포푸신 자가형광을 사용하는 것을 입증합니다. 생존 가능한 노화 세포의 백분율의 정량이 수행됩니다. 원한다면, 관심있는 세포 표면 항원을 평가하기 위해 선택적인 면역표지 단계가 포함될 수 있다. 확인된 노화 세포는 또한 유세포 분석기로 분류되고 다운스트림 분석을 위해 수집될 수 있습니다. 수집된 노화 세포는 즉시 용해되거나(예를 들어, 면역검정 또는 '오믹스 분석을 위해) 추가로 배양될 수 있다.

Introduction

노화 세포는 정상적인 생물학적 노화 동안 일반적으로 수년에 걸쳐 유기체에 축적되지만 방사선 및 화학 요법을 포함한 다양한 암 치료에 의해 유발 된 손상에 대한 반응으로 종양 세포에서도 빠르게 발전 할 수 있습니다. 더 이상 증식하지는 않지만 치료 유도 노화(TIS) 종양 세포는 치료 내성에 기여하고 재발을 유발할 수 있습니다1,2,3. TIS 세포에 의해 분비되는 인자는 면역 회피 또는 전이를 촉진하여 종양 악성 종양을 악화시킬 수 있습니다 4,5. TIS 세포는 복잡한 상황별 표현형, 변경된 대사 프로필 및 고유한면역 반응을 발달시킵니다6,7,8. 따라서 다양한 암 치료 접근법에 의해 유도 된 TIS 종양 세포의 확인 및 특성화는 암 연구 커뮤니티의 지속적인 관심 주제입니다.

TIS 종양 세포를 검출하기 위해, 종래의 노화 분석은 주로 노화 마커 효소 인 리소좀 베타-갈 락토시다 제 GLB19의 증가 된 활성을 검출하는 것에 기초하여 널리 사용된다. 중성에 가까운(산성이 아닌) 리소좀 pH에서 검출하면 노화 관련 베타-갈락토시다아제(SA-β-Gal)를 특이적으로 검출할 수 있습니다10. 수십 년 동안 사용되어 온 표준 SA-β-Gal 분석은 청색 발색 베타 갈락토시다제 기질인 X-Gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노사이드)을 사용하여 광학 현미경으로 고정 세포에서 SA-β-Gal을 검출합니다11. X-Gal 분석을 통해 일반적으로 사용 가능한 시약 및 실험실 장비를 사용하여 TIS를 정성적으로 시각적으로 확인할 수 있습니다. 기본 투과광 현미경은 청색 발색의 존재를 평가하는 데 필요한 유일한 기기입니다. 그러나 X-Gal 염색 절차는 감도가 부족할 수 있으며 때로는 색상이 발생하는 데 24시간 이상이 필요합니다. 염색 후에는 광학 현미경으로 청색 발색의 강도 수준을 나타내는 세포를 계수하는 것을 기반으로 개별 노화 세포의 낮은 처리량, 주관적인 점수가 이어집니다. X-Gal은 세포 불투과성이므로 이 분석에는 다운스트림 분석을 위해 회수할 수 없는 용매 고정 세포가 필요합니다. 동물이나 환자의 제한된 샘플로 작업 할 때 이는 큰 단점이 될 수 있습니다.

C12-FDG(5-도데카노일아미노플루오레세인 디-β-D-갈락토피라노사이드, 녹색) 및 DDAOG(9H-(1,3-디클로로-9,9-디메틸아크리딘-2-온-7-일)β-D-갈락토피라노사이드, 원적색)를 포함한 세포 투과, 형광 효소 기질을 사용하는 개선된 SA-β-Gal 분석은 이전에 문헌12,13,14,15에 나타났습니다. DDAOG의 화학적 프로브 구조 및 광학적 특성은 보충 그림 S1에 나와 있습니다. 이러한 세포 투과성 프로브를 사용하면 고정되지 않은 살아있는 세포를 분석할 수 있으며, 발색성 프로브가 아닌 형광 프로브는 고함량 스크리닝 기기 및 유세포분석기를 포함한 신속한 고처리량 형광 분석 플랫폼의 사용을 용이하게 합니다. 분류 유세포분석기는 다운스트림 분석(예: 웨스턴 블로팅, ELISA 또는 'omics)을 위해 세포 배양 또는 종양으로부터 살아있는 노화 세포의 농축 개체군을 회수할 수 있습니다. 형광 분석은 또한 정량적 신호를 제공하여 주어진 샘플 내에서 노화 세포의 백분율을 보다 정확하게 결정할 수 있습니다. 생존성 프로브 및 형광단 표지 항체를 포함한 추가 형광 프로브를 쉽게 추가하여 SA-β-Gal 이상의 표적을 다중화 분석할 수 있습니다.

DDAOG와 유사하게 C12-FDG는 SA-β-Gal의 형광 프로브이지만 녹색 형광 방출은 세포16에 리포푸신 응집체가 축적되어 노화 중에 발생하는 고유 세포 AF와 겹칩니다. 원적색 DDAOG 프로브를 활용하여 녹색 셀룰러 AF를 노화를 확인하기 위한 보조 매개변수로 사용할 수 있습니다17. 이는 SA-β-Gal 외에 두 번째 마커를 사용하여 분석 신뢰성을 향상시키는데, 이는 종종 노화18에 대한 단일 마커로서 신뢰할 수 없을 수 있습니다. 노화 세포에서 내인성 AF의 검출은 표지가 없는 접근 방식이므로 DDAOG 기반 분석의 특이성을 확장하는 빠르고 간단한 방법입니다.

이 프로토콜에서 우리는 시험관 내 배양에서 생존 가능한 TIS 종양 세포를 식별하거나 마우스에서 확립된 약물 처리 종양에서 분리하기 위한 신속한 이중 매개변수 유세포분석 분석으로 DDAOG 및 AF를 사용하는 것을 보여줍니다(그림 1). 이 프로토콜은 광범위한 표준 상용 유세포분석 분석기 및 분류기와 호환되는 형광단을 사용합니다(표 1). 표준 유세포분석 분석을 이용한 생존가능한 노화 세포의 백분율의 정량이 가능하다. 원한다면, 선택적인 면역표지 단계를 수행하여 관심있는 세포 표면 항원을 노화와 동시에 평가할 수 있다. 확인된 노화 세포는 표준 형광 활성화 세포 분류(FACS) 방법론을 사용하여 농축할 수도 있습니다.

Figure 1
그림 1: 실험적 워크플로. DDAOG 분석의 요점을 요약한 개략도. (a) TIS 유도 약물을 포유동물 배양 세포에 첨가하거나 종양 보유 마우스에 투여한다. 그런 다음 TIS의 발병에 시간이 허용됩니다 : 세포의 경우, 치료 후 4 일; 마우스의 경우 총 22 일, 5 일마다 3 회 치료와 7 일 회복. 세포가 수확되거나 종양이 현탁액으로 해리됩니다. (B) 샘플을 Baf로 처리하여 30 분 동안 SA-β-Gal 검출을 위해 리소좀 pH를 조정합니다. 그런 다음 DDAOG 프로브를 60 분 동안 추가하여 SA-β-Gal을 검출합니다. 샘플을 PBS에서 2x 세척하고, 생존성 염색을 간단히 첨가한다(15분). 임의로, 샘플은 개방 형광 채널에서 형광 항체로 염색될 수 있고/있거나 추후 분석을 위해 고정될 수 있다. (C) 샘플은 표준 유세포 분석기를 사용하여 분석됩니다. 생존 가능한 세포는 빨간색 DDAOG (SA-β-Gal을 나타냄) 대 녹색자가 형광 (리포 푸신)을 보여주는 점도표로 시각화됩니다. TIS 세포의 백분율을 결정하기 위한 게이트는 처리되지 않은 대조군 샘플에 기초하여 확립된다(도시되지 않음). 분류 세포분석기(FACS)를 사용하는 경우 TIS 세포를 수집하여 추가 시험관 내 분석을 위해 배양에 다시 넣거나 분자 생물학 분석을 위해 용해 및 처리할 수 있습니다. 약어 : DDAO = 9H- (1,3- 디클로로 -9,9- 디메틸 아 크리 딘 -2- 온); DDAOG = DDAO-갈락토사이드; TIS = 치료 유도 노화; FL-Ab = 형광단-접합 항체; Baf = 바필로마이신 A1; SA-β-Gal = 노화-관련 베타-갈락토시다제; PBS = 인산염-완충 식염수; FACS = 형광 활성화 세포 분류. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

형광단 감지 전 / 엠 (nm) 사이토 미터 레이저 (nm) 세포계 검출기/대역통과 필터(nm)
다오그 사β갈 645/6601 640 670 / 30
AF 리포푸신 < 600 488 525 / 50
이력서450 생존 능력 408/450 405 450 / 50
체육 항체/표면 마커 565/578 561 582 / 15

표 1: 형광단 및 세포분석기 광학 사양. 이 프로토콜에 사용되는 세포분석기 사양은 총 4개의 레이저와 15개의 방출 검출기가 있는 기기에 대해 나열됩니다. 645/660 nm에서 검출된 DDAOG는 SA-β-Gal1에 의해 절단된 프로브의 형태이다. 절단되지 않은 DDAOG는 460/610nm에서 낮은 수준의 형광을 나타낼 수 있지만 프로토콜의 세척 단계에 의해 제거됩니다. 약어 : DDAO = 9H- (1,3- 디클로로 -9,9- 디메틸 아 크리 딘 -2- 온); DDAOG = DDAO-갈락토사이드; AF =자가 형광; PE = 피코 에리트 린; SA-β-Gal = 노화 관련 베타-갈락토시다아제.

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Protocol

설명 된 모든 동물 작업은 시카고 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다.

1. 저장 용액의 준비 및 보관

알림: 세포를 흐름 분류할 경우 모든 용액은 멸균 기술을 사용하여 준비하고 0.22μm 필터 장치를 통해 여과해야 합니다.

  1. DMSO에서 5 mg / mL의 DDAO- 갈락토사이드의 저장 용액을 준비하십시오. 튜브당 50 μL(또는 원하는 부피)의 분취량. 어둠 속에서 -20 ° C에서 최대 1 년 동안 보관하십시오.
  2. DMSO 중 1 mM에서 바필로마이신 A1의 저장 용액을 준비한다. 튜브당 50 μL(또는 원하는 부피)의 분취량. -20 ° C에서 최대 6 개월 동안 보관하십시오.
  3. DMSO 중 1 mM에서 칼세인 바이올렛 450 AM의 스톡 용액을 준비한다. 튜브당 50 μL(또는 원하는 부피)의 분취량. 어둠 속에서 -20 ° C에서 최대 1 년 동안 보관하십시오.
  4. 시험관 내에서 배양된 세포의 처리를 위해, 적절한 용매에 노화 유도제의 10mM 농축 스톡 용액을 준비하고 0.2μm 주사기 필터를 사용하여 멸균한다. −20 °C에서 보관하거나 제조업체의 지시에 따라 보관하십시오.
    참고: 생체 내에서 (종양이 확립된 마우스에게) 노화 유도 화학 요법제를 전달하려면 약제가 USP 등급이어야 하며 주사 직전에 농축 재고에서 식염수로 희석되어야 합니다.
  5. 사용 중인 세포주에 대한 완전한 배양 배지를 준비합니다.
    참고: 예를 들어, DMEM 1x + 10% FBS + 1x 글루타민 대체물 + 1x 페니실린/스트렙토마이신을 사용하여 B16-F10 또는 A549 세포용 배지를 준비합니다. 배지는 멸균 상태로 유지해야합니다. 다른 세포주-특이적 배지 제형이 사용될 수 있다. 글루타티온과 같은 특정 성분은 경우에 따라 노화의 시작을 방해 할 수 있습니다. 노화의 시작이 예상보다 낮거나 대조 화학 요법 제에서 관찰되지 않는 경우 다양한 배지 제형의 경험적 테스트를 수행해야합니다.
  6. 염색을 준비하고 완충액을 씻으십시오.
    1. 염색 절차에 사용하기 위해 1x PBS에 1% 소 혈청 알부민(BSA)을 준비합니다. 2 g의 BSA를 200 mL의 PBS에 녹이고 실온에서 10분 동안 또는 완전히 녹을 때까지 저어줍니다.
    2. 세척 완충액으로 1x PBS에서 0.5% BSA를 준비합니다. 단계 1.6.1에서 제조된 1% BSA 100mL를 0.5% BSA용 1x PBS 100mL에 희석한다.
    3. 완충액은 4°C에서 최대 1개월 동안 보관합니다.
  7. 1x PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드를 준비하십시오. 편의성과 안정성을 위해 시중에서 판매되는 밀봉된 파라포름알데히드 앰플(예: 16% v/v)을 사용하십시오: 2.5mL의 16% PFA + 7.5mL의 1x PBS(= 10mL의 4% PFA). 실험 당 필요한 총 부피에 따라 준비된 양을 조정하십시오.
    알림: 셀 고정을 위해서만 필요에 따라 준비하십시오. 매번 신선하게 준비하십시오.
  8. FACS 분류 완충액을 준비합니다 : 1x PBS, 1 mM EDTA, 25 mM hepes, 1 % BSA (pH 7.2). 0.22 μm 여과 장치를 통해 제균 여과하고 4°C에서 최대 1개월 동안 보관한다.
    참고: FACS 정렬에 대해서만 필요에 따라 준비하십시오. 유동 분류 완충액 제형은 FACS 기기에 따라 다를 수 있습니다. 위의 공식은이 연구에 사용 된 기기와 호환됩니다 ( 재료 표 참조). 제조업체의 지침을 참조하십시오.
  9. 종양 해리 용액을 준비하십시오 : RPMI-100 배지에서 1640 μg / mL Liberase TL + 1640 μg / mL DNAse I (FBS 또는 기타 보충제 없음). 스톡 용액은 Liberase TL (제조업체의 지시에 따라 준비 및 보관) 및 DNAse I (이중 증류수 [ddH2O]에서 100mg / mL, -20 ° C에서 보관)을 보관하는 데 유용합니다.
    알림: 종양만 사용하는 경우 필요에 따라 준비하십시오. 매번 신선하게 준비하십시오.

2. 배양된 암세포에서 화학요법 약물에 의한 노화 유도

알림: 이 섹션의 모든 세포 조작 단계는 멸균 관행을 사용하여 생물안전 캐비닛에서 수행해야 합니다. 이 섹션은 부착 세포 유형에 대해 작성되었습니다. 현탁 세포는 언급된 바와 같이 적절한 변형과 함께 사용될 수 있다.

  1. 공급업체 또는 사용된 특정 세포주를 제공한 실험실의 표준 프로토콜에 따라 암 세포주를 성장시킵니다.
    참고: 낮은 계대 세포(p < 10)는 일반적으로 처리되지 않은 세포 샘플에서 더 낮은 수준의 복제 노화, 즉 더 낮은 배경이 있기 때문에 선호됩니다.
  2. 약물에 의한 노화 유도 하루 전에 트립신-EDTA 0.25%(또는 권장)로 세포를 수확합니다. 동일한 부피의 완전한 배양 배지를 추가하여 트립신을 중화시키고 세포 현탁액을 멸균 원추형 튜브로 옮깁니다.
    참고: 이 단계는 현탁 셀에는 필요하지 않습니다.
  3. 표준 혈구계 방법을 사용하여 세포를 계수하고 세포/mL를 기록합니다. 표준 6웰 플라스틱 배양 접시에서 1 × 10 3-10 × 103 cells/cm2에서 세포를 플레이트합니다.
    참고: 최적의 도금 밀도는 세포의 증식 속도에 따라 달라지며 사용자가 결정해야 합니다. 세포는 치료 시 약 10%-20% 컨플루언시에서 로그 단계 성장에 있어야 합니다(즉, 도금 후 18-24시간 배양 후). 부유 세포의 시작 밀도(세포/mL)는 사용자가 결정해야 합니다. 6웰 플레이트는 일반적으로 하나의 표준 유세포분석 샘플에 대해 웰당 충분한 노화 세포를 생성합니다. 유동 분류의 경우, 다운스트림 분석을 위해 충분한 수의 노화 세포를 회수할 수 있도록 훨씬 더 큰 표면적(예: 다중 P150 플레이트)을 사용해야 합니다(≥1 × 106).
  4. 플레이팅된 세포를 5%CO2 및 습도 팬이 있는 37°C 인큐베이터에서 밤새도록(18-24 h) 배양한다.
  5. 도금된 세포를 노화 유도 화학 요법 약물로 처리합니다. 적어도 하나의 양성 대조군, 예를 들어 에토포시드 (ETO) 또는 블레오마이신 (BLM)을 포함한다. 약물 당 중복 우물을 준비하십시오. 차량 전용으로 처리된 한 세트를 제어로 포함합니다.
    알림: 각 실험제에 대한 용량 곡선은 사용 중인 세포주에서 노화 유도를 위한 최적의 농도를 결정하기 위해 사용자가 테스트해야 합니다.
  6. 노화의 시작을 허용하기 위해 5%CO2 및 습도 팬이 있는 37°C 인큐베이터에서 4일 동안 세포를 배양한다. 광학 현미경을 사용하여 예상되는 형태 변화를 매일 검사합니다.
    알림: 3-5일의 잠복기는 노화 발병 속도에 따라 허용될 수 있습니다. 배지를 변경하고 원하는 대로 제제를 재적용(또는 재도포하지 않음)하여 건강한 성장 조건을 촉진하는 동시에 노화 세포의 허용 가능한 비율을 달성할 수 있습니다.
  7. 노화가 시작된 후, 트립신-EDTA 0.25%를 첨가하여 37°C에서 5분 동안 세포를 수확한다. 세포가 현탁액으로 해리되면 동일한 부피의 완전한 배지로 트립신을 중화시킵니다.
    참고: 이 단계는 현탁액에서 성장하는 세포에는 필요하지 않습니다. 표면 마커 염색이 수행되는 경우 트립신-EDTA는 세포의 표면 항원을 일시적으로 파괴할 수 있으므로 사용을 피하십시오. 대신, 멸균 플라스틱 세포 스크레이퍼(또는 표면 항원을 보존하도록 설계된 대체 해리 시약)를 사용하여 단층을 부드럽게 해리합니다.
  8. 혈구계를 사용하여 각 샘플의 세포를 계수합니다. 각 샘플에 대한 셀/mL를 계산합니다.
    참고: 트리판 블루를 추가하여 이 시점(즉, 약물 처리로 인해)에서 죽은 세포의 백분율을 평가할 수 있지만 DDAOG 염색 워크플로우 동안 형광 생존율 염료로 세포 사멸도 측정합니다.
  9. 분취량 ≥0.5 × 시료당 106 세포를 1.7mL 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다.
    참고: 샘플당 세포 수는 모든 샘플에서 표준화되어야 합니다.
  10. 4°C의 미세 원심분리기에서 1,000× g 에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다. 상청액을 제거하십시오.
    알림: 냉장 마이크로 원심분리기를 사용할 수 없는 경우 특정 탄성 셀 유형에 대해 주변 온도에서 원심분리를 수행하는 것이 허용될 수 있습니다.
  11. 섹션 4의 DDAOG 염색을 진행합니다.

3. 생쥐에서 확립 된 종양에서 화학 요법 약물에 의한 노화 유도

참고: 종양 세포가 FACS로 분류되는 경우 생물안전 캐비닛에서 작업하고 멸균 기기, 절차 및 시약으로 작업하여 각 단계에서 멸균을 보장합니다.

  1. 표준 방법에 따라 암세포를 피하에 주사하여 마우스 종양 모델을 만듭니다(예: Appelbe et al.19).
    참고: 주사할 암세포의 수, 주사 부위 및 적절한 마우스 균주는 각 프로토콜에 맞게 최적화되어야 합니다. 여기서, B16-F10 세포를 식염수 0.1mL(1 × 107 cells/mL)에 1 × 106 세포로 피하 주사하였다.
    1. 주사를 수행하기 전에 trypan blue를 사용하는 세포의 생존율이 >90 %인지 확인하십시오. 마우스를 이소 플루 란으로 마취하십시오.
    2. 6-7주령의 암컷 C57/BL6 마우스를 3% 이소플루란과 공기의 혼합물로 마취시키고 멸균된 생물안전 캐비닛 내에 배치된 유도 챔버에서 이러한 조건 하에서 유지합니다. 마우스의 발을 부드럽게 꼬집어 마취를 확인하십시오. 시술 중 각막 건조를 방지하기 위해 양쪽 눈에 멸균 수의학 연고를 바르십시오. 절차 중에 가열 램프를 사용하여 마우스 체온을 유지하십시오.
    3. 멸균 생물안전 캐비닛 내부에서 작업하면서 유도 챔버에서 마우스를 제거하고 3% 이소플루란 공급을 제공하는 노즈 콘과 접촉하도록 놓습니다. 깨끗한 전기 면도기를 사용하여 주사 부위의 측면 부위를 면도하십시오. 주사 직전에 튜브를 수동으로 뒤집어 준비된 세포 현탁액을 간단히 혼합하고 멸균 0.5G 바늘이 장착된 멸균 27mL 주사기를 사용하여 면도한 측면에 세포 현탁액을 피하 주사합니다. 후드에서 마우스를 제거하고 복구 케이지로 옮깁니다.
    4. 회복 케이지에서 마우스가 흉골 누운 자세를 유지하고 올바른 반사를 보여 주며 케이지에서 안전하게 움직일 수있을만큼 충분한 의식을 회복 할 때까지 마우스의 활력 징후를 지속적으로 모니터링하십시오. 마우스를 방치하거나 종양 세포 접종을받은 동물을 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사로 돌려 보내지 마십시오. 접종된 모든 마우스를 매일 모니터링하여 체중 감소, 활동/이동성 감소 및 신경학적 증상을 확인합니다. 모든 범주에서 심각한 증상을 보이는 마우스를 안락사시킵니다. 접종 후 통증 증상을 보이는 마우스의 경우 부 프레 노르 핀 (0.1-0.2 mg / kg)을 한 번 피하 투여하십시오.
      참고: 부프레노르핀 후 지속적인 통증을 보이는 마우스는 안락사시켜야 합니다.
  2. 암세포 접종 후 5-7 일부터 2-3 일마다 캘리퍼스로 종양 성장을 측정합니다. 종양이 부피가 50mm 3 ± 10mm3에 도달하면 노화 치료를 시작하십시오.
    참고 :이 연구에서는 10mg / kg의 USP 등급 독소루비신 염산염 (DOX) 또는 PEG화 리포좀 독소루비신 (PLD)을 0.9 % 염화나트륨 주사 (USP)로 투여했습니다. 약물은 종양이 50mm 3 ± 10mm3에 도달했을 때부터 시작하여 5 일에 한 번씩 복강 내 3 회 주사되었습니다. 마우스는 종양에서 TIS의 발병을 허용하기 위해 최종 치료 후 7일 동안 회복되었습니다. 노화 유도 투여량 및 다른 치료 및/또는 종양 모델에 대한 조건은 최적화되어야 한다.
  3. 최종 약물 치료 후 7일째에, 실험실 동물 작업 가이드라인에 따라CO2 과량투여 및 자궁경부 탈구 또는 다른 승인된 방법으로 마우스를 희생시킨다. 종양을 절제하고 멸균 RPMI 성장 배지로 채워진 멸균 튜브 또는 6 웰 플레이트에 수집합니다 (처리 중 생존력을 보존하기 위해).
    참고: 조직학적 검사(예: X-Gal 또는 면역조직화학)를 수행하는 경우 여기에서 종양을 이등분할 수 있으며, O.C.T. 매립 배지에서 절반의 스냅 냉동을 하고 냉동 조직 조직학을 위한 표준 절차를 사용하여 냉동 절제할 수 있습니다. 나머지 종양 절반은 해리 및 DDAOG 염색을 위한 풍부한 물질을 생성해야 합니다.
  4. 하나의 종양을 5mL의 RPMI 배지가 들어있는 P100 플라스틱 접시에 옮깁니다. 메스를 사용하여 종양을 조각으로 만듭니다.
  5. 부유 세포와 파편이 들어있는 종양 조각 현탁액 5mL를 15mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 큰 파편이 있는 경우 이 현탁액을 옮기기 위해 25mL 혈청학적 피펫의 더 넓은 팁을 사용하십시오. 재료를 수집하기 위해 추가 양의 멸균 RPMI로 접시를 헹굽니다. 뚜껑을 덮고 원추형 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
  6. 나머지 종양에 대해 3.45-3.5 단계를 반복하십시오. 교차 오염을 피하기 위해 각 종양에 대해 별도의 플레이트와 메스를 사용하거나 종양 사이에 PBS로 잘 헹굽니다. 각 종양을 다지기 위해 5mL의 신선한 배지를 사용하십시오.
  7. 종양 해리 용액을 준비하십시오 : RPMI-100 배지 (FBS 제외)에서 1640 μg / mL 리베라 제 TL + 100 μg / mL DNAse I.
    참고: 종양 해리 용액에 대한 많은 효과적인 제형이 존재하며 다양한 제조업체의 다양한 효소 및 기타 성분을 포함할 수 있습니다. 성분의 최적 농도는 종양 유형에 따라 크게 다를 수 있습니다. 적혈구가 종양에 많이 존재하는 경우 적혈구 용해가 추가로 수행 될 수 있습니다. 죽은 세포가 문제인 경우 죽은 세포 제거 키트를 사용할 수 있습니다. 사용자가 높은 생존력과 오염 세포, 결합 물질 및 파편의 낮은 존재를 제공하는 최적의 종양 해리 조건을 독립적으로 결정하는 것이 좋습니다.
  8. 원뿔형 튜브의 모든 종양 샘플을 1,000 × g (4 ° C)에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 상청액을 제거하십시오.
  9. 종양 물질의 부피에 따라 각 종양 샘플에 1-5mL의 종양 해리 용액을 추가합니다. 튜브에 종양 물질 펠릿을 초과하는 1-2mL가 있는지 확인하십시오. 적당한 속도로 소용돌이를 섞습니다.
  10. 샘플을 37 ° C 인큐베이터에 넣고 45 분 동안 빠르게 회전시킵니다. 15분마다 잠시 소용돌이.
  11. 각 샘플을 100μm 세포 여과기를 통해 50mL 원뿔형 튜브로 여과합니다. 샘플의 점성이 너무 높아 필터를 통과할 수 없는 경우 RPMI-1640 배지 10mL를 추가하여 희석합니다. 필터를 RPMI 배지로 헹구어 잔류 세포를 수집합니다.
  12. 혈구계를 사용하여 각 샘플에 대한 세포/mL를 계산합니다.
  13. 분취량은 종양 샘플 당 5 × 106 세포의 2개 이상의 복제물.
  14. 1,000 × g (4 ° C)에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 상청액을 제거하십시오.
  15. (선택 사항) 원하는 경우 나중에 DDAOG 염색을 위해 종양 샘플을 동결보존합니다.
    1. 해리된 종양 세포 펠렛을 동결보존 배지에 재현탁합니다: 50% FBS, 40% RPMI-1640, 10% DMSO, 5 × 106 cells/mL의 멸균 조건 하에서 제조.
    2. 세포 현탁액 1mL를 각 냉동 바이알에 분취합니다.
    3. -80 ° C에서 이소프로판올 세포 냉동 용기에서 24 시간 동안 냉동 비알을 동결시킵니다. 그런 다음 장기 보관을 위해 액체 질소 냉동 보관으로 옮깁니다 (>1 주).
    4. 염색이 필요한 경우 얼음에서 냉동 바이알을 해동하고 섹션 4의 DDAOG 염색을 진행합니다.
      참고: 일부 종양은 동결보존을 통해 생존 가능하지 않을 수 있으며 이 과정에 대한 복원력은 관심 있는 종양 모델에 대해 사용자가 평가해야 합니다.
  16. DDAOG 염색에 대해서는 섹션 4로 진행합니다.

4. 세포 또는 종양 샘플에서 SA-β-Gal의 DDAOG 염색

  1. 1 μM의 최종 농도를 위해 1 mM 바필로마이신 A1 스톡을 1:1,000x의 DMEM 배지(FBS 제외)로 희석합니다.
  2. 준비된 Baf-DMEM 용액을 1 × 106 cells/mL의 농도로 세포 펠릿 샘플(2.11단계 또는 3.16단계)에 추가합니다.
    참고: 예를 들어, 샘플당 0.5 × 106 셀을 사용하는 경우 0.5mL의 Baf-DMEM을 추가합니다. 종양의 경우 5 mL의 Baf-DMEM에서 5 × 106 세포를 염색 할 수 있습니다.
  3. 느린 속도로 설정된 회전 장치/셰이커에서 37°C(CO2 제외)에서 30분 동안 배양합니다.
    참고: 용액을 산성화하여 Baf 및 DDAOG 염색을 방해할 수 있는 염색 공정을 위한 CO2 인큐베이터를 피하십시오.
  4. 세척하지 않고 DDAOG 원액(5mg/mL)을 1:500x(최종 10μg/mL)에 각 샘플에 추가합니다. 혼합 할 피펫. 37 ° C (CO2없이)의 회전 장치 / 셰이커에서 60 분 동안 교체하십시오. 직사광선을 피하십시오.
  5. 4°C에서 1,000 x g 에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다. 상청액을 제거하십시오.
  6. 튜브와 피펫당 1mL의 얼음처럼 차가운 0.5% BSA로 세척하여 혼합합니다. 튜브를 4°C에서 1,000 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 제거합니다. 이 단계를 2x 반복하여 세포를 완전히 씻으십시오. 상청액을 제거하고 계속 진행하십시오.
    알림: 원하지 않는 형광 방출(460/610nm)을 나타낼 수 있는 절단되지 않은 DDAOG를 제거하려면 4.6단계의 세척 단계를 수행하는 것이 중요합니다.
    참고: 세포 표면 마커에 대한 면역 염색의 경우 아래 섹션 5로 진행하십시오.
  7. (선택 사항) 추후 분석을 위한 DDAOG 염색 세포의 고정 및 보관
    1. 세척된 각 샘플에 얼음처럼 차가운 4% 파라포름알데히드 0.5mL를 적가합니다. 혼합 할 피펫.
    2. 실온에서 10분 동안 배양합니다.
    3. 세포를 1mL의 PBS로 2x 세척합니다.
    4. 유세포분석 전에 4°C에서 최대 1주일 동안 샘플을 보관하십시오.
      참고: 고정 샘플의 경우 4.8단계를 건너뜁니다.
  8. 칼세인 바이올렛 450 AM 스톡(1 mM)을 1:1,000x로 희석하여 1% BSA-PBS(최종 1μM)로 희석합니다. 300 μL (배양된 세포 샘플의 경우) 또는 1,000 μL (종양 샘플의 경우)를 단계 4.6으로부터의 세척된 세포 펠릿에 첨가한다. 어둠 속에서 얼음 위에서 15 분 동안 배양하십시오.
  9. 유세포분석 설정(섹션 6)으로 진행합니다.

5. (선택 사항) DDAOG와 조합된 세포 표면 마커에 대한 면역염색

참고: 모든 유세포분석 실험과 마찬가지로 DDAOG만 있고 형광 항체만 있는 단일 염색 대조군 샘플을 준비하여 형광 채널에서 누화(있는 경우)를 결정해야 합니다. 누화가 관찰되는 경우, 표준 유세포 분석 보상이 수행되어야 한다(20).

  1. 단계 4.6에서 수득한 세포 펠렛을 100 μL의 염색 완충액(1x PBS 중 1% BSA)에 재현탁시킨다.
  2. 세포 종(마우스 또는 인간)에 적합한 Fc 수용체 차단 시약을 제조업체가 권장하는 적정에 추가합니다. 24°C에서 10분 동안 배양합니다.
  3. 형광단 접합 항체를 제조업체가 권장하는(또는 사용자가 결정한) 적정으로 추가합니다. 빛으로부터 보호되는 얼음 위에서 20 분 동안 배양하십시오.
  4. 4 °C에서 1,000 × g 으로 5분 동안 튜브를 원심분리합니다. 상청액을 제거하십시오.
  5. 튜브와 피펫당 1mL의 얼음 냉세척 완충액(0.5% BSA-PBS)으로 세척하여 혼합합니다. 튜브를 4° C에서 1,000 ×g에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 제거한다. 이 단계를 2x 반복하여 세포를 완전히 씻으십시오.
  6. 1 mM 칼세인 바이올렛 450 AM을 1:1,000x에서 1% BSA-PBS로 희석합니다. 단계 5.5에서 세척된 세포 펠릿에 300 μL를 첨가한다. 어둠 속에서 얼음 위에서 15 분 동안 배양하십시오.
  7. 유세포 분석 (섹션 6-7)을 진행하십시오.

6. 유세포분석기 설정 및 데이터 수집

  1. 세포 샘플을 유세포분석 기기와 호환되는 튜브로 옮깁니다. 튜브를 얼음 위에 놓고 빛으로부터 보호하십시오.
    참고: 세포 현탁액에서 응집체가 관찰되면 분석 전에 현탁액을 70-100μm 세포 스트레이너에 통과시킵니다. 40μm 스트레이너는 더 큰 노화 세포 중 일부를 배제 할 수 있으므로 사용하지 마십시오.
  2. 참조된 소프트웨어( 재료 표 참조)에서 1) FSC-A 대 SSC-A 도트 플롯, 2) 보라색 채널 히스토그램, 3) 원적색 채널(예: APC-A) 대 녹색 채널(예: FITC-A) 도트 플롯을 엽니다.
    참고: 이중 제외 플롯과 단일 채널 히스토그램도 사용할 수 있지만 반드시 필요한 것은 아닙니다.
  3. 세포분석기 데이터 수집을 시작합니다.
    1. DDAOG로 염색된 차량 전용 제어 샘플을 흡기 포트에 놓습니다. 낮은 섭취 속도에서 샘플 데이터 수집을 시작하십시오.
    2. 사건의 >90%가 플롯 내에 포함되도록 FSC 및 SSC 전압을 조정합니다. 셀이 그림에 잘 맞지 않으면 영역 배율 설정을 0.33-0.5단위로 낮춥니다.
    3. 데이터를 기록하지 않고 차량 전용 샘플을 제거합니다.
    4. (선택 사항) 무지개 교정 마이크로스피어 한 방울을 PBS 1mL가 있는 세포분석기 튜브에 추가합니다. 튜브를 세포계 흡입구에 놓습니다. 샘플 데이터 수집을 시작합니다.
    5. 무지개 마이크로스피어의 상단 피크가 각 채널에서 104-10 5 단위의 상대 형광 범위에 있고 모든 피크가 각 채널에서 잘 분리되도록 보라색, 녹색 및 원적색 채널 전압을 조정합니다. 10,000개의 이벤트를 기록합니다. 튜브를 제거하십시오.
  4. DDAOG로 염색된 양성 대조군 샘플(예를 들어, BLM, ETO)을 흡기 포트에 놓는다. 저속에서는 샘플 데이터를 수집합니다. FSC, SSC, 보라색, 녹색 및 원적색 채널에서 이벤트를 관찰하여 이벤트의 90% 이상이 모든 플롯에 포함되도록 합니다. 차량 전용 제어와 비교하여 AF 및 DDAOG 신호의 증가를 찾으십시오.
  5. 분류 세포분석기를 사용하는 경우 이 단계에서 정렬을 시작합니다.
    1. 기록 보관을 위해 대조군 샘플과 정렬된 각 샘플에 대해 10,000개의 셀을 기록합니다.
    2. 원하는 양의 세포(≥1 × 106 이 일반적으로 적합함)를 3-5mL의 배양 배지가 있는 기기에 적합한 수집 튜브에 분류합니다.
    3. 분류 후 다운스트림 배양 또는 분석으로 진행합니다.
    4. 정렬된 샘플의 일상적인 분석을 위해 섹션 7로 건너뜁니다.
  6. 형광 항체를 사용하는 경우 섹션 5에서 준비한 염색되지 않은, 단일 염색 및 이중 염색된 샘플을 사용하여 여기에서 채널 전압을 최적화하십시오.
    알림: 여기에 사용된 보정된 유세포분석기의 경우 최적의 채널 전압은 일반적으로 250에서 600(중간 범위) 사이로 떨어지지만 최적의 전압 및 채널 전압 범위는 기기마다 다릅니다. 볼륨을 사용하지 마십시오.tage 신호를 억제하거나 노이즈를 증폭할 수 있는 매우 낮거나 높은 범위에서.
  7. 6.1-6.5단계를 완료하고 필요에 따라 세포계 설정을 조정한 후 모든 샘플에 대한 데이터를 기록합니다. 모든 샘플 기록에 대해 설정이 균일하게 유지되는지 확인합니다. 배양된 세포 샘플당 ≥10,000개의 이벤트 또는 종양 세포 샘플당 ≥100,000개의 이벤트를 기록합니다.
    참고: 데이터 수집 소프트웨어(예: FACSDiva)를 사용하여 게이팅 및 분석을 수행할 수 있지만 별도의 분석 소프트웨어(FlowJo)를 사용하여 수집 후 수행할 완전한 게이팅 및 분석 워크플로는 아래 섹션 7에 설명되어 있습니다. 획득 후 분석은 세포분석기 워크스테이션에서 시간을 줄이고 전용 분석 소프트웨어에 포함된 추가 도구를 활용하는 데 선호됩니다.
  8. 샘플 데이터를 .fcs 파일 형식으로 저장합니다. 유세포 분석 소프트웨어(예: FlowJo)가 장착된 워크스테이션 컴퓨터로 파일을 내보냅니다. 섹션 7로 이동합니다.

7. 유세포 분석 데이터 분석

참고: 제시된 워크플로는 FlowJo 소프트웨어를 사용합니다. 대안적인 유세포분석 데이터 분석 소프트웨어는 이 섹션에 설명된 주요 단계를 유사하게 따르는 경우 사용할 수 있습니다.

  1. FlowJo 소프트웨어를 사용하여 6.7단계의 .fcs 데이터 파일을 엽니다.
  2. 레이아웃 윈도우를 엽니다.
  3. 모든 샘플을 레이아웃 창으로 끌어다 놓습니다.
  4. 게이트 생존 세포.
    1. 먼저 차량 전용 컨트롤의 샘플 데이터를 두 번 클릭하여 데이터 창을 엽니다.
    2. 데이터를 보라색 채널 히스토그램으로 시각화합니다. 죽은 세포보다 더 밝은 형광을 기반으로 CV450으로 염색된 생존 세포를 식별합니다.
    3. 단일 게이트 히스토그램 도구를 사용하여 생존 가능한 셀만 포함하도록 게이트를 그립니다. 실행 가능한 게이트의 이름을 지정합니다.
    4. 그런 다음 샘플 레이아웃 창에서 실행 가능한 게이트를 다른 셀 샘플로 끌어 게이트를 균일하게 적용합니다.
    5. 레이아웃 창에서 모든 샘플을 보라색 채널(생존력) 히스토그램으로 시각화합니다. 계속하기 전에 생존 가능한 세포 게이팅이 샘플 전체에서 적절한지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 필요에 따라 조정하십시오.
      참고: 생존력 염색은 치료 또는 종양에 따라 변이를 나타낼 수 있습니다.
  5. 게이트 노화 세포.
    1. 차량 전용 컨트롤에 대한 제어된 실행 가능한 셀 데이터를 두 번 클릭하여 데이터 창을 엽니다.
    2. 데이터를 원적색 채널(DDAOG) 대 녹색 채널(AF)에 대한 점도표로 시각화합니다.
    3. 사각형 게이팅 도구를 사용하여 DDAOG+ 및 AF+ (오른쪽 위 사분면)인 셀의 <5%를 포함하도록 게이트를 그립니다. 게이트의 이름을 노인으로 지정하십시오.
    4. 그런 다음 샘플 레이아웃 창에서 노화 게이트를 다른 셀 샘플의 실행 가능한 하위 집합으로 끌어 게이트를 균일하게 적용합니다.
    5. 레이아웃 창으로 섹션 7.4에서 제어된 실행 가능한 모든 셀 하위 집합을 끌어다 놓습니다. 실행 가능한 모든 샘플을 원적(예: APC-A) 대 녹색 채널(예: FITC-A) 점도표로 시각화합니다.
    6. 7.5.3단계에서 그린 노화 게이트가 모든 플롯에서 표시되고 차량 전용 제어용 게이트가 ≤5%-10% 노화 셀을 나타내는지 확인합니다.
  6. 위의 단계를 사용하여 노화 세포의 백분율이 결정되면 FlowJo 플롯을 사용하여 결과 데이터를 제시하고 데이터 테이블에 요약하거나 표준 소프트웨어를 사용하여 통계적으로 분석합니다.

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Representative Results

SA-β-Gal에 의한 노화의 검출을 위한 X-Gal 및C12-FDG에 대한 DDAOG의 비교가능성을 입증하기 위해 여러 실험을 수행하였다. 먼저, X-Gal을 사용하여 ETO에 의해 유도된 노화 B16-F10 흑색종 세포를 염색하였다(도 2A). ETO 처리 된 세포의 하위 집합에서 강렬한 파란색이 발생한 반면 다른 세포는 덜 강렬한 파란색 염색을 나타 냈습니다. 형태학은 대부분의 ETO 처리된 세포에서 확대되었다. 형광 SA-β-Gal 기질C12-FDG(녹색) 또는 DDAOG(원적색)로 ETO 처리된 세포를 염색한 결과, X-Gal과 유사한 염색 패턴과 강도 변화가 나타났습니다(그림 2B). 그러나, 녹색C12-FDG 방출은 세포 AF와 중첩되었고(도 2C), 이는 노화 세포(17)에 축적되는 것으로 알려져 있다. 대조적으로, AF는 DDAOG의 원적색 방출 범위에서 무시할 수 있었습니다.

형광 현미경을 사용하여 노화 세포의 점수를 매기고 계수하는 대신, 유세포분석기의 고처리량 기능을 활용하여 짧은 시간(시료당 <5분)에 샘플당 수천 개의 세포에 대한 데이터를 수집하는 것이 더 편리했습니다. 먼저, 최적의 데이터 수집을 보장하기 위해 일련의 표준 유세포분석 설정 파라미터가 구현되었습니다(그림 3). 일반적인 접근 방식에 따라 광 산란 매개 변수는 세포의 부피 (전방 산란, FSC) 및 입도 (측면 산란, SSC)를 시각화하도록 설정되었습니다 (그림 3A). 여기에서 우리는 ETO 처리 된 세포의 부피가 증가하는 추세에 주목했으며, 이는 현미경을 사용하여 노화 세포에서 일반적으로 관찰되는 확대 된 형태와 일치했습니다. 플롯에서 더 큰 셀을 시각화하기 위해 기본 영역 스케일링 설정(셀 유형 및 처리에 따라 0.33-0.50 단위로)을 줄여야 했습니다. 일부 세포주/처리의 경우 증가된 입도(SSC)도 분명했습니다(데이터는 표시되지 않음). 전반적으로, 산란 평가는 세포 산란 데이터가 예상대로 나타나고, 과도한 세포 파편이 존재하지 않으며, 세포가 적절한 유속(~100-1000 cells/s)으로 세포분석기를 통해 처리되고 있는지 확인하기 위한 품질 관리 단계로 사용되었습니다. 기기 설정에만 사용되는 품질 관리 단계로서 여기서는 게이팅이나 분석이 수행되지 않았습니다.

유세포분석 설정의 두 번째(선택 사항) 단계는 형광 검출 전압이 허용 가능한 범위로 설정되었는지 확인하기 위해 상업적으로 이용 가능한 "무지개" 교정 입자 샘플을 간략하게 분석하는 것이었습니다(그림 3B). 가장 밝은 피크는 각 채널에서 상대 형광 강도의 1 × 104 단위 및 1 ×10 5 단위 사이에서 설정되었으며, 명확하게 정의된 낮은 강도 피크, 각 피크 사이의 충분한 분리 및 이웃 피크의 중첩이 없었습니다. 10,000 마이크로스피어의 대조군 샘플을 이러한 전압 설정을 사용하여 기록하였다. 그런 다음 마이크로스피어를 각 세포분석 세션에서 이러한 방식으로 사용하여 프로토콜 과정에서 데이터 수집의 균일성을 개선했습니다.

다음으로, 비히클 전용 또는 ETO 처리된 세포의 샘플을 각각의 형광 채널에서 시각화하고, 게이트를 설정하였다. 세포 생존율 게이트는 보라색 채널에서 CV450 생존율 염색의 신호에 기초하여 설정하였다(도 3C). 비히클 전용 처리된 세포는 88%의 생존율을 나타내었고, ETO 처리된 세포는 75%의 생존율을 나타냈다 (최종 세포 샘플에서; 추가 죽은 세포는 초기에 폐기된 배양 배지에서 제거되고 염색 과정 동안 기계적으로 분해되었을 가능성이 있음). 다음으로, 생존 가능한 게이팅된 세포는 녹색(도 3D) 및 원적색(도 3E) 방출 채널에서 시각화하였다. 녹색 AFHI 및 원적색 DDAOGHI에 대한 게이트는 비히클 전용 세포의 <5%로 설정되었고, 이들 게이트는 ETO 처리된 세포에 적용되었다. 이 접근법을 사용하여, ETO 처리된 세포의 46%가 AF HI이고 33%가 DDAOGHI인 것으로 결정되었다; 이 값은 문헌과 우리 실험실의 수많은 반복 실험 결과를 기반으로 한 예상 범위에 있었습니다. 세포분석기 설정이 완료되면 실험의 모든 세포 샘플을 동일한 데이터 수집 설정을 사용하여 실행했습니다. 샘플당 10,000개의 이벤트에 대한 데이터를 얻었습니다.

대표적인 분석 데이터는 도 4에 나타내었다. B16-F10 뮤린 흑색종 세포 또는 A549 인간 폐 선암 세포를 암 세포주 모델로 사용하였다. 각 세포주는 노화를 유도하는 것으로 알려진 화학요법제(ETO 또는 BLM)를 4일 동안 처리하여 노화를 유도하거나 비히클만을 유도하였다. 또한, DDAOG 프로브의 특이성을 입증하기 위해 공지된 세놀리틱제 ABT-26321 을 2일 동안 노화세포 유도에 첨가하였다. ABT-263 샘플만을 추가 대조군으로 준비하였다. 여기서 데이터는 DDAOG(670nm 방출) 대 AF(525nm)를 사용하는 2D 도트 플롯으로 시각화됩니다. 그림 3 의 워크플로우를 세포분석기 설정에 사용했으며, 비히클 전용 세포의 <5%가 TIS로 점수가 매겨지도록 TIS 게이트를 설정했습니다. B16-F10 세포 (그림 4A)를 사용한 결과는 생존 가능한 B16-F10 세포의 35 % ( 그림 2D, E에 표시된 비교 가능한 데이터와 유사)에서 ETO가 TIS를 유도하고 세놀리틱 제가 TIS 세포 (<2 %)를 거의 완전히 제거했음을 보여주었습니다. A549 세포 (그림 4B)에서 BLM은 생존 가능한 세포의 66 %에서 TIS를 유도했으며 ABT-263은 백분율을 15 %로 감소시켰다. ABT-263 단독은 처리되지 않은 증식 세포에 독성이 없었습니다.

또한 형광 항체 동시 염색이 DADOG 노화 분석과 호환되어 TIS 관련 또는 새로운 표면 마커의 스크리닝을 용이하게 한다는 것을 입증하는 것을 목표로 했습니다. 여기서, B16-F10 마우스 흑색종 세포를 다시 4일 동안 TIS 유도 ETO(또는 비히클)로 처리하였다. 그런 다음, TIS를 평가하기 위해 DDAOG로 세포를 염색하고, TIS와 관련된 표면 마커 DPP422를 검출하기 위해 형광 항체로 둘 다 염색하였다(도 5). R-피코에리트린(PE)에 접합된 항-DPP4를 사용했으며, 사용된 유세포분석기에서 PE와 DDAOG 및 AF의 무시할 수 있는 중복을 확인했습니다(보충 그림 S2). >5,000개의 생존 세포에 대한 PE 채널 데이터(그림 5A)의 히스토그램은 ETO 처리된 세포의 42%가 DPP4+임을 보여주었습니다(양성 게이트를 설정하기 위해 비히클 전용 샘플을 사용함). 동일한 샘플에 대한 2D 점도표를 시각화한 결과(그림 5B, C) ETO 처리 세포의 44%가 DDAOG(즉, 노화) 및 DPP4에 대해 이중 양성인 반면 비히클 전용 세포의 4%는 양성임을 나타냅니다. 이러한 데이터는 표면 마커 항체를 사용한 생세포 염색이 DDAOG 노화 분석과 함께 가능하다는 것을 보여줍니다.

살아있는 세포 염색 방법의 잠재적 인 문제에는 긴 분석 세션 (>1 시간) 동안 발생하는 세포 사멸과 다양한 시점 (최대 며칠 간격)에서 샘플을 가장 효율적으로 염색하고 분석하는 방법이 포함됩니다. 염색된 세포의 용매 기반 고정은 염색되는 즉시 샘플을 고정한 다음 하나의 온도 안정 배치로 분석할 때까지 냉장고에 보관할 수 있기 때문에 이러한 두 가지 문제를 모두 해결합니다. 따라서 DDAOG로 염색 된 살아있는 세포를 100 % 메탄올 또는 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 고정하고 1 ° C에서 최대 4 주일 동안 보관할 수 있는지 테스트했습니다. 바람직하지 않게, 메탄올 고정은 DDAOG 신호를 감소시키고 AF를 상당히 감소시켰다 (데이터는 나타내지 않음); 따라서, 고정 용매로서 메탄올의 사용은 피되어야한다. 그러나 DDAOG로 염색한 후 10분 동안 4% PFA에 고정된 세포의 경우 그림 6에서 볼 수 있듯이 PFA를 사용한 고정이 훨씬 더 성공적이었습니다. 고정되지 않은 대조군 샘플 (그림 6A; 처리되지 않은, 5 % 및 BLM, 67 % DDAOGHI AFHI)과 비교하여, 고정 샘플 (그림 6B)은 처리되지 않은 세포 (9 %)에서 약간 더 높은 배경을 나타 냈으며 BLM 처리 된 세포 (80 %)에서 노화로 점수가 매겨진 세포의 비율이 더 높았다. 이 효과는 밤새 보관 된 고정 샘플 (그림 6C, 미처리, 12 % 및 BLM, 72 %)과 4 ° C에서 1 주일 동안 보관 한 경우에도 나타났습니다 (그림 6D; 14 % 및 70 %). PFA 고정으로 인한 형광의 약간의 증가에도 불구하고, BLM에 의한 노화의 유도는 일치하는 처리되지 않은 샘플과 비교하여 모든 고정 샘플에서 여전히 분명했습니다. 또한, 세포는 7일째까지 약간의 열화만으로 저장에 손상되지 않은 상태로 유지되었으며 문제가 있는 응집은 관찰되지 않았습니다. 우리는 나중에 배치 분석을 위해 세포 샘플을 수정하고 저장할 수 있는 편리함이 특히 많은 샘플 또는 시점을 사용한 실험에서 PFA 고정으로 인한 약간 더 높은 배경을 용인하는 것을 정당화할 것이라고 결론지었습니다.

세포 기반 노화 연구의 일반적인 과제는 세포 집단에서 노화의 이질적인 시작입니다. 여기서 우리는 DDAOG가 생존 가능한 노화 세포의 FACS에 사용될 수 있으며 수집된 세포가 다운스트림 시험관 내 분석을 위한 배양에서 생존한다는 것을 보여줍니다(그림 7). FACS에 의해 세포를 분류하기 위해, 세포는 설명된 바와 같이 처리 및 염색되고, 여기에 도시된 DDAOG 대 AF 게이팅 전략을 사용하여 FACS 가능 유세포분석기에 의해 분류된다(도 7A). 장기 독성 문제로 인해 생존력 프로브가 여기에 사용되지 않으므로 수집된 세포에서 위양성 파편을 제거하기 위해 최종 노화 세포 게이팅(보충 그림 S3) 전에 엄격한 산란 게이팅을 수행하는 것이 좋습니다. 이는 표준 FACS 게이팅 절차로, 경험이 어느 정도 있는 사용자에게 익숙해야 하며 계측기에서 소프트웨어를 사용하여 신속하게 설정할 수 있습니다(<10분).

BLM 처리된 A549 세포의 샘플을 분류한 후, 우리는 10 × 103 cells/cm2에서 5일 동안(n = 6 반복) 동안 표준 멀티웰 접시에서 배양하기 위해 세포를 반환했습니다. 분류되지 않은 대조군을 동일한 밀도로 플레이팅하고, 나란히 성장시키고, 미처리 및 BLM-처리된 세포를 포함시켰다. 세포를 매일 관찰하였다; 분류된 세포의 경우, 유의한 세포 사멸 또는 증식으로의 복귀는 관찰되지 않았다. 분류된 세포는 배양 과정에서 5일 동안 희박한(즉, 증식하지 않음) 상태로 유지된 반면, 처리되지 않은 세포와 BLM-처리된 세포는 도시된 바와 같이 합류하게 되었다. 5일째에, 세포를 PFA에 고정시키고, 형태 및 증식 마커에 대해 염색하였다(도 7B). 분류 된 세포의 특징적인 확대 형태는 필라멘트 액틴의 형광 Phalloidin 염색에 의해 밝혀졌으며, DAPI 염색은 확대 된 핵을 보여줍니다. 분류된 세포는 직경이 매우 크고(>10μm) 특징적인 둥근 외관을 가졌다. 예상대로, Ki67 항체 염색은 분류되지 않은 BLM 처리 샘플에서 부분 손실에 비해 분류 된 샘플에서 증식 마커의 완전한 손실을 나타 냈으며, Ki67의 정상 수준은 처리되지 않은 분류되지 않은 샘플의 많은 세포에서 관찰되었다. 샘플 전반에 걸쳐 균일한 이미징 설정을 사용하여 웰당 최소 3개의 이미지를 촬영했습니다. 대표적인 이미지가 도시되어 있다(도 7B).

마지막으로, 우리는 화학 요법 약물로 치료 된 마우스에서 확립 된 종양에서 발생하는 노화 세포가 DDAOG를 사용하여 확인 될 수 있는지 여부를 평가했다. B16-F10 흑색종 종양은 C57/BL6 마우스의 옆구리에서 유도되었고, 이어서 식염수만(그림 8A), DOX(그림 8B) 또는 PLD(그림 8C)로만 3회(즉, 5일마다) 치료되었습니다. 세 번째 치료 후, 마우스를 노화의 시작을 허용하기 위해 7일 동안 회복시킨 다음, 희생시키고 종양을 절제하였다. 종양은 절반으로 줄였으며 절반은 X-Gal 염색을 위해 냉동 조직 슬라이드를 준비하는 데 사용되었으며(그림 8) 절반은 단일 세포 현탁액으로 해리되고 DDAOG로 염색되었습니다(그림 8 및 보충 그림 S4). 조직의 X-Gal 염색은 긴 염색 기간(72시간)에도 불구하고 다소 약했지만 면밀한 검사 시 DOX 및 PLD 종양, 특히 DDAOG 흐름 분석에 의해 노화에 대해 양성 점수를 받은 종양에서 파란색 염색이 분명했습니다(그림 8B,C). 조직 슬라이드 당 최소 3 개의 이미지가 촬영되었으며 대표 이미지가 표시됩니다.

X-Gal과 비교할 때 DDAOG는 종양의 노화를 정량화하는 더 민감하고 정확한 방법이었습니다(그림 8). DDAOG 종양 분석을 위해, 가장 높은 형광 배경을 갖는 식염수-처리된 종양을 사용하여 노화 게이트를 <5%로 설정하여, 다른 염수-처리된 종양이 5% 이상의 노화를 기록하지 않았다. 그런 다음 이 노화 게이트를 모든 종양의 게이트 생존 세포에 배치-적용했습니다. 두 화학 요법 제제 모두 일부 종양 (DOX의 경우 5 개 종양 중 2 개, PLD의 경우 5 개 중 3 개)에서 노화를 유발했으며, 노화 종양 세포의 비율은 종양 당 3 %에서 36 %까지 다양했습니다. 모든 15개 종양에 대한 세포분석 데이터 플롯은 보충 그림 S4에 나타내고, 종양 세포분석 데이터의 요약은 도 8D 에 도시되어 있다(n=5; (*) p < 0.05 대 식염수-단독 대조군 분산의 F 검정). 우리는 DDAOG 대 AF 유세포 분석이 생체 내 노화 유도를 위해 종양 및 화학 요법 제제를 스크리닝하는 데 허용되는 방법이라고 결론지었습니다.

Figure 2
그림 2: DDAOG는 SA-β-Gal에 대한 민감하고 특이적인 염색입니다 . (A) X-Gal을 사용한 SA-β-Gal에 대한 기존 염색은 미처리(왼쪽) 또는 ETO 처리된(오른쪽) B16-F10 뮤린 흑색종 세포를 보여줍니다. ETO에 의해 유도 된 노화 : 세포는 상승 된 SA-β-Gal에 의한 X-Gal의 절단으로 인해 확대 된 형태 및 청색 염색을 나타냅니다. 스케일 바 = 10 μm. (B) C12-FDG (515 nm 방출, 녹색) 또는 DDAOG (660 nm, 빨간색)를 사용하여 ETO 처리 된 세포에서 SA-β-Gal에 대한 형광 염색. 염색 분포는 두 프로브에 대해 유사하며, 이는 DDAOG가C12-FDG와 유사한 방식으로 SA-β-Gal을 검출함을 나타낸다. (C) 녹색(525nm 방출, 왼쪽) 또는 원적색(660nm, 오른쪽) 방출 채널에서 염색되지 않은 ETO 처리된 세포에서 AF 평가. 리포푸신의 AF는 녹색 방출 채널에서 높고 원적색 채널에서는 무시할 수 있습니다. 노출 시간 = 각 이미지에 대해 2,000ms. 스케일 바 = 10 μm. 이 그림은 Flor와 Kron23에서 재 인쇄됩니다. 약어 : DDAO = 9H- (1,3- 디클로로 -9,9- 디메틸 아 크리 딘 -2- 온); DDAOG = DDAO-갈락토사이드; X-Gal = 5- 브로 모 -4- 클로로 -3- 인돌릴 -β- D- 갈 락토 피라 노 시드; UNT = 치료되지 않은; ETO = 에토포사이드; AF =자가 형광; C12-FDG = 5-도데카노일아미노플루오레세인 디-β-D-갈락토피라노사이드; SA-β-Gal = 노화 관련 베타-갈락토시다아제. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 유세포분석기 데이터 수집 설정 . (A) 세포의 대표적인 산점도 분포. FSC-A는 세포 부피의 판독값이고 SSC-A는 세포 세분성을 나타냅니다. 왼쪽 패널, A549 세포의 차량 전용 치료. 오른쪽 패널, 노화를 유도하는 ETO 치료. 현미경에서 명백한 확대 된 형태와 일치하는 ETO 처리 된 세포의 세포 부피가 커지는 추세에 주목하십시오. (B) 세포분석기의 검출기 전압을 설정하기 위해 5피크 상업용 "무지개" 형광 보정 마이크로스피어의 선택적 사용. 사용되는 각 형광 채널에서 최대 피크는 샘플이 실행되는 동안 세포분석기 검출기 전압을 조정하여 ≤1 x 105 상대 형광 단위로 설정해야 합니다. 왼쪽 패널, BV421 (보라색) 채널; 센터, FITC (녹색) 채널; 오른쪽, APC (빨간색) 채널. 5개의 형광 피크는 그림과 같이 뚜렷한 간격을 나타내야 합니다. (씨-에) (C) 보라색 CV450 염료를 사용한 생존율 염색을 위한 대표적인 단일채널 형광 데이터; (d) 세포의 녹색 자가형광; (E) DDAOG의 원적색 신호, SA-β-Gal 감지. 더 어두운 색 히스토그램, 차량 전용 치료; 밝은 색상의 히스토그램, ETO 처리. 부모 게이트는 각 플롯 위에 표시됩니다. 약어 : FSC-A = 전방 산란 피크 영역; SSC-A = 측면 산란 피크 면적; ETO = 에토포사이드; BV421-A = 브릴리언트 바이올렛 421 채널 피크 영역; FITC-A = 플루오레세인 이소티오시아네이트 채널 피크 면적; APC-A = 알로피코시아닌 채널 피크 면적; AF =자가 형광; DDAO = 9H- (1,3- 디클로로 -9,9- 디메틸 아 크리 딘 -2- 온); DDAOG = DDAO-갈락토사이드; VEH = 차량. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 유세포분석 노화 분석에 대한 대표 데이터 . (A) B16-F10 (좌측 상부) 비히클 단독, (우측 상부) ETO, (좌측 하부) ABT-263 (1 μM) 단독, 또는 (우측 하부) ETO 플러스 ABT-263으로 처리된 뮤린 흑색종 세포. (b) A549 (좌측 상부) 비히클 단독, (우측 상부) BLM, (좌측 하부) ABT-263 단독, 또는 (우측 하부) BLM 플러스 ABT-263으로 처리된 인간 폐 선암 세포. (ᄀ,ᄂ) 모든 플롯의 오른쪽 상단 사분면에있는 직사각형 게이트는 노화 세포 (DDAOGHI AFHI)를 정의합니다. 노화 세포의 백분율(샘플당 총 생존 세포)이 각 플롯에 표시됩니다. 약어 : DDAO = 9H- (1,3- 디클로로 -9,9- 디메틸 아 크리 딘 -2- 온); DDAOG = DDAO-갈락토사이드; ETO = 에토포사이드; BLM = 블레오마이신; VEH = 차량; TIS = 치료로 인한 노화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 노화 분석을 사용한 예시 세포 표면 마커의 공동 염색. (a) 생존 가능한 B16-F10 배양 세포의 표면에서 노화 마커 DPP4의 면역검출; 진한 주황색, 차량 전용; 라이트 오렌지, ETO. (ᄃ,씨) 중앙 및 오른쪽 패널: DDAOG 및 항-DPP4:PE와 공동 염색된 세포. DDAOG HI DPP4HI 세포는 플롯에 표시된 직사각형 게이트 내에 포함되며 샘플 당 이중 양성 세포의 백분율이 표시됩니다. 그림: 생존 가능한 게이트 세포. 약어 : DDAO = 9H- (1,3- 디클로로 -9,9- 디메틸 아 크리 딘 -2- 온); DDAOG = DDAO-갈락토사이드; ETO = 에토포사이드; VEH = 차량; DPP4 = 디펩티딜펩티다아제 4. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: 추후 분석을 위한 DDAOG 염색 세포 샘플의 사후 고정 및 보관 . (A) 대조군, 살아있는 A549 세포의 고정되지 않은 샘플을 처리하지 않은 (왼쪽) 또는 BLM으로 처리 (오른쪽)하여 노화를 유도 한 다음 염색하고 DDAOG 프로토콜 (고정 없음, Day 0)을 사용하여 즉시 분석했습니다. (B) (A)와 같이 제조된 시료를 즉시 4% 파라포름알데히드로 고정한 후 분석하였다(Day 0). (C) (A)에서와 같이 제조된 샘플을, 즉시 4% 파라포름알데히드에 고정하고, 분석 전에 4°C에서 밤새 저장하였다. (D) (A)와 같이 제조된 시료를 즉시 고정하고, 분석 전에 7일 동안 보관하였다. 모든 플롯의 오른쪽 상단 사분면에있는 직사각형 게이트는 노화 세포를 정의합니다 (DDAOGHI AFHI). 노화 세포의 백분율은 각 플롯에 표시됩니다. 약어 : TIS = 치료 유발 노화; DDAO = 9H- (1,3- 디클로로 -9,9- 디메틸 아 크리 딘 -2- 온); DDAOG = DDAO-갈락토사이드; BLM = 블레오마이신; AF =자가 형광. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
그림 7: 농축된 노화 세포 집단의 유세포분석 분류 및 검증. (A) 노화 세포 분류를 위한 게이트를 설정하는 데 사용된 처리되지 않은 DDAOG 염색 대조군(게이트 영역의 <5% 노화 세포)과 (오른쪽) 그림과 같이 분류 게이트를 사용하여 분류된 BLM 처리, DDAOG 염색 샘플을 보여주는 유세포 분석 데이터. (B) 노화 세포의 확대 형태를 보여주기 위해 F-액틴 및 DAPI(파란색)를 검출하기 위해 Phalloidin-Alexa Fluor 647(주황색 유사색)로 염색된 세포(왼쪽 열) 세포에 대한 형광 현미경 이미지 또는 (오른쪽 열) 노화 세포의 증식 손실을 감지하기 위해 토끼 Ki67 항체 및 항토끼 Alexa Fluor 594로 염색된 세포. 맨 위 줄, 처리되지 않은 세포 및 정렬되지 않은 세포. 중앙 행, BLM 처리 및 분류되지 않은 세포. 아래쪽 줄, BLM 처리 및 정렬 된 세포. 스케일 바 = 10 μm. 약어 : TIS = 치료 유발 노화; DDAO = 9H- (1,3- 디클로로 -9,9- 디메틸 아 크리 딘 -2- 온); DDAOG = DDAO-갈락토사이드; BLM = 블레오마이신; UNT = 치료되지 않은; DAPI = 4',6- 디아 미디 노 -2- 페닐 인돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 8
그림 8 : 화학 요법 약물로 치료 한 마우스의 종양에서 노화의 정량화. B16-F10 흑색종 종양은 C67BL/6 마우스의 옆구리에 확립되었고, 그런 다음 노화의 시작을 허용하기 위해 5일에 1주일마다 (A) 식염수, (B) DOX 또는 (C) PLD의 3회 용량으로 처리되었습니다. 종양을 절제하고 반으로 줄였습니다. 냉동 조직 슬라이드를 X-Gal 염색을 위해 한쪽 절반(위쪽 줄)에서 준비하고, 나머지 절반은 DDAOG 염색(아래쪽 줄)을 위해 해리시켰다. X-Gal 염색 이미지에서 파란색 세포는 SA-β-Gal HI 노화 세포이고 갈색 영역은 종양의 멜라닌으로 인한 것입니다. 대표적인 결과는 노화를 나타내는 그룹당 2개의 종양으로부터의 DOX 및 PLD에 대해 나타내었다. 모든 식염수 전용 종양은 무시할 수 있는 노화를 나타냈다. (D) 마우스에서 약물 처리 된 종양에서의 노화의 정량화. (*) p < 0.05 F 분산 검정에 의해, 군당 n=5마리의 마우스. 오차 막대, 평균 ± SEM. 약어 : DDAO = 9H- (1,3- 디클로로 -9,9- 디메틸 아 크리 딘 -2- 온); DDAOG = DDAO-갈락토사이드; DOX = 독소루비신; PLD = PEG화 리포좀 독소루비신; X-Gal = 5- 브로 모 -4- 클로로 -3- 인돌릴 -β- D- 갈 락토 피라 노 시드; AF =자가 형광. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S1: DDAOG 프로브의 화학 구조. DDAOG는 7- 하이드 록시 -9H- (1,3- 디클로로 -9,9- 디메틸 아 크리 딘 -2- 온)와 베타 갈 락토 시드의 접합체입니다. 베타-갈락토시다아제에 의해 절단될 때, 가수분해된 절단 생성물은 50nm 원적색 형광 방출 이동을 나타내어 600nm 이상의 여기로 특이적 검출을 가능하게 합니다. 약어 : DDAO = 9H- (1,3- 디클로로 -9,9- 디메틸 아 크리 딘 -2- 온); DDAOG = DDAO-갈락토사이드. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S2: 유세포분석기의 다른 형광 채널과의 DDAOG 혼선의 스펙트럼 스캔. 형광 항체 검출에 이용 가능한 채널을 확인하기 위해, BLM으로 처리되고 DDAOG(적색) 또는 염색되지 않은(흑색)으로 염색된 A549 세포를 사용하여 4-레이저, 15-채널 유세포분석기에서 스펙트럼 스캔을 수행하였다. 유세포분석기의 모든 채널에서 10,000개의 세포에 대한 데이터를 수집했습니다. (A) 405nm 레이저의 방출 채널: 왼쪽에서 오른쪽으로, BV421, BV510, BV605, BV660 및 BV711. BV605, BV660 및 BV711 채널에서 관찰된 누화는 보상 없이 DDAOG와의 공동 염색에 적합하지 않습니다. BV421 및 BV510은 공동염색에 적합하다(BV421은 전형적으로 생존성 염색에 사용됨). (B) 488nm 레이저의 방출 채널: FITC 및 PerCP-Cy5. PerCP-Cy5 채널에 대해 높은 누화가 관찰되었습니다. FITC는 공동 염색에 적합합니다. 그러나, FITC 채널은 일반적으로 녹색 방출 AF의 평가를 위한 DDAOG 분석에 사용된다는 점에 유의한다. (C) 561nm 레이저의 방출 채널 : PE, PE-Dazzle 594, PE-Cy5, PE-Cy5.5 및 PE-Cy7. PE 및 PE-Dazzle 594 채널은 이러한 형광단으로 표지된 항체의 검출에 적합합니다(PE는 이 연구에서 DPP4의 검출에 대해 입증되었습니다). (D) 640nm 레이저의 방출 채널: APC, APC-H700 및 APC-Cy7. 노화 세포의 DDAOG 신호는 APC 채널 (47.8 % 노화)에서 볼 수 있습니다. 신호는 APC-H700 및 APC-Cy7 채널과 겹치므로 상당한 스펙트럼 보정 없이는 동시 염색에 적합하지 않습니다. 약어 : BLM = 블레오 마이신; BV = 브릴리언트 바이올렛; FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트; PerCP = 페리디닌-엽록소 단백질; PE = 피코 에리트 린; DZ594 = 눈부심 594; APC = 알로피오시아닌; AF =자가 형광; DDAO = 9H- (1,3- 디클로로 -9,9- 디메틸 아 크리 딘 -2- 온); DDAOG = DDAO-갈락토사이드. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S3: 노화 세포의 FACS 분류를 위한 세포 게이팅 전략. 민감한 FACS 세포분석기를 통해 세포 현탁액을 통과시키려면 분류 순도와 최적의 기기 기능을 보장하기 위해 추가 게이팅이 필요할 수 있습니다. 예제 전략이 여기에 나와 있습니다. 다른 전략은 사용 중인 FACS 세포분석기에 대한 제조업체 권장 사항에 따라 가능합니다. 왼쪽 열, 비히클 전용 처리된 세포 제어. 우측 컬럼, BLM으로 처리된 A549 세포는 노화를 유도하여 분류될 수 있다. (A) 손상되지 않은 세포의 FSC-A (세포 부피) 대 SSC-A (세포 입도) 게이팅. 손상되지 않은 게이트는 분류된 샘플에서 세포 파편을 제거합니다. (b) FSC-A 대 FSC-H 순도 게이팅; 이중선과 파편을 제거합니다. (C) SSC-A 대 SSC-H 순도 게이팅; 이중선과 파편을 제거합니다. (D) APC-A 채널 (637 nm 여기, 670 nm ± 30 nm 방출, DDAOG에 사용됨) 대 FITC-A 채널 (488 nm 여기, 530 nm ± 30 nm 방출, AF에 사용됨)을 사용하여 관심 모집단에 대한 게이팅; 가능한 염색 아티팩트를 제거합니다. (E) 최종 분류를 위한 노화 세포 게이팅. 약어: FACS = 형광 활성화 세포 분류; BLM = 블레오마이신; FSC-A = 전방 산란 피크 영역; SSC-A = 측면 산란 피크 면적; FSC-H = 전방 산란 피크 높이; SSC-H = 측면 산란 피크 높이. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S4: 종양의 DDAOG 노화 유세포분석 염색. ≥50,000개의 생존 가능한 종양 세포에 대한 유세포분석 데이터. 노화 세포 게이트, 각 플롯의 오른쪽 상단 사분면. 노화 (생존 가능한) 종양 세포의 백분율이 게이트 내에 표시됩니다. 종양 치료에는 (A) 식염수만; (B) 독스; 및 (C) PLD. 마우스는 5일에 한 번씩, 3회 치료되었고, 희생 전에 노화가 시작될 수 있도록 회복을 위해 7일이 걸렸습니다. 병태 당 5 개의 종양을 분석했다. 약어 : AF =자가 형광; DDAO = 9H- (1,3- 디클로로 -9,9- 디메틸 아 크리 딘 -2- 온); DDAOG = DDAO-갈락토사이드; DOX = 독소루비신; PLD = PEG화 리포솜 독소루비신. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

지난 10여 년 동안 유세포분석은 종양 면역학의 새로운 인기, 저비용 유세포분석기의 개발 및 학술 기관의 공유 기기 시설 개선으로 인해 암 연구에서 보다 일반적인 분석 플랫폼이 되었습니다. 대부분의 최신 기기에는 보라색, 청록색 및 적색에서 원적색 광학 어레이가 장착되어 있기 때문에 다색 분석이 이제 표준입니다. 따라서, 이 DDAOG 프로토콜은 광범위한 유세포분석기와 호환될 가능성이 높다. 물론 모든 유세포분석기는 사용자가 평가해야 합니다. DDAOG 분석에 추가 형광단(예: 형광성, 접합 항체)을 추가할 때 특별한 주의를 기울여야 합니다. 채널 간 형광단 혼선의 평가는 다른 모든 관련 채널에서 시각화된 단일 염색 대조군을 사용하여 수행해야 합니다. 중첩이 관찰되면, 스펙트럼 보상은 전형적인 방법에 따른 보정을 위해 수행될 수 있다(20 ).

본원에 나타낸 연구 결과는 주로 DDAOG 유세포분석 분석이 세포 또는 종양에서 화학요법 약물에 의해 유도된 TIS에 대해 신속하고 정량적이며 해석하기 쉬운 결과를 생성할 수 있음을 입증하기 위한 것이다. ETO 23,24, DOX7,25 및 BLM26,27을 포함하여 여기에 사용된 제제는 다양한 암 세포주 24에서 TIS를 유도하는 것으로 문서화되었습니다. DDAOG 프로브의 특이성을 입증하기 위해, 공지된 세놀리틱 제제 ABT-26321이 배양물에서 노화 세포를 선택적으로 제거하는 것으로 입증되었다. 이 논문은 쥐 1마리(B16-F10)와 인간 1마리(A549) 배양 암 세포주, 및 마우스에서 확립된 B16-F10 종양의 사용을 보여줍니다. 그러나, β-Gal을 발현하고 표준 유세포분석 샘플 제제를 통해 생존력을 유지하는 임의의 세포가 사용될 수 있다. 특정 세포 유형은 TIS에 더 취약하거나 덜 취약할 수 있으며, 이는 대형 스크린이나 연구를 시작하기 전에 평가되어야 합니다. 제제 중에 세포가 분해되거나, 생존율이 좋지 않거나, TIS가 양성 제제 대조군을 사용하여 예상보다 훨씬 낮은 경우, 세포 유형은 노화 연구에 이상적인 모델이 아닐 수 있습니다. 여기에 표시된 제제 및 세포주는 잠재적인 TIS 유도제 또는 신규 세놀리틱의 추가 스크리닝에서 대조군으로 다른 그룹에 의해 사용될 수 있으며, 이는 이 분야에서 활성 목표로 남아 있습니다.

화학 요법 약물에 의해 유도 된 독성은 세포 유형에 따라 다를 수 있으며 분석 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 사용된 제제 및/또는 농도의 주요 관찰 효과가 급성 세포 사멸인 경우 전체 노화는 최소화될 수 있습니다. 생체내에서, 동물에서 높은 종양 괴사 또는 전신 독성은 제제 투여량을 낮춤으로써 회피되어야 한다. 분석 성공의 핵심은 생존력 분석 데이터(예: DDAOG 분석 내에서 CV450에서 제공)를 주의 깊게 검사하여 다양한 제제 농도를 테스트하는 것입니다. 시험관내에서, 처리된 동안 많은 죽은 세포가 플레이트로부터 분리되는 경우, 분석된 샘플의 배양 배지를 포함하여, 전체적으로 세포 사멸을 평가하는 것이 중요하다. CV450은이 분석과 호환되는 유일한 생존 성 염색이 아닙니다. 다른 바이올렛/블루 방출 형광단이 사용될 수 있다. 프로브 형광이 DDAOG 또는 AF와 크게 겹치지 않는 경우(또는 사용자가 중첩을 보정하기 위해 스펙트럼 보정을 수행하는 경우) 사용자가 염색된 샘플을 PFA로 고정하려는 경우에도 고정 가능한 생존력 프로브를 사용할 수 있습니다. 작용제 독성이 낮고 세포가 튼튼한 일부 경우에는 광 산란(FSC 대 SSC)에 의한 손상되지 않은 세포를 게이팅하는 것만으로도 분석을 위해 "생존 가능한" 세포를 분리하기에 충분할 수 있습니다.

이 시험관 내 프로토콜의 핵심 단계는 더 낮은 범위의 로그 성장 밀도 (일반적으로 2 × 10 3-5 × 103 cells/cm2)의 세포를 플레이트하여 빠른 초기 증식을 허용하여 대부분의 세포에서 화학 요법 약물의 흡수를 용이하게하는 것입니다. 일단 치료되면, TIS의 발병을위한 시간을 허용하는 것도 중요합니다 : 시험관 내, 약물의 존재하에 4 일 ± 1 일; 생체 내, 최종 화학 요법 치료 후 7 일의 회복. 기재된 바와 같이 DDAOG로 염색한 후, 도시된 바와 같이, 즉 노화 세포의 백분율(총 생존 가능)을 결정하기 위해 각 샘플에서 DDAOG 대 AF 세포를 게이팅하는 것과 같이 세포측정 데이터의 정량적 분석을 수행해야 한다. 선택적 단계에는 유세포분석을 표준화하기 위한 형광 "무지개" 교정 마이크로스피어의 사용, 염색된 샘플의 PFA 고정, 표면 마커에 대한 공동 면역염색, 다운스트림 분석을 위한 노화 세포를 풍부하게 하기 위한 흐름 분류가 포함됩니다. 그러나 이러한 각 선택적 단계는 특정 응용 프로그램에서 주요 이점을 제공합니다. 교정 마이크로스피어는 여러 세션에 걸쳐 세포분석 설정을 표준화하고 사용자가 노화 및 생존력 검출에 유용한 범위에서 전압을 초기에 설정할 수 있도록 하며 이후 최소한의 조정으로 가능합니다. 샘플의 PFA 고정은 세포를 안정화시키고 나중에 큰 세포 세트의 배치 분석을 허용합니다. 표면 마커에 대한 공동면역염색은 새로운 노화 관련 단백질 및 면역 상호작용을 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다. 향후 연구에서는 DDAOG와 함께 세포 내 노화 마커의 동시 염색을 검증할 계획입니다.

FACS로 TIS 세포를 분류하면 이종 집단에서 생존 가능한 TIS 세포를 풍부하게 할 수 있으며, 이는 웨스턴 블로팅, 단백질체학 또는 전사체학과 같은 다운스트림 분석에 대한 판독을 혼란스럽게 할 수 있습니다. 분류 후, 최대 5일 동안 다시 배양된 TIS 세포에서 DDAOG의 유의한 독성이 관찰되지 않았습니다. 그러나 분류된 세포는 Baf로 처리되고 내재화된 DDAOG(SA-β-Gal에 의해 아크리딘 염료인 DDAO로 절단됨)가 FACS 기기를 통과하는 기계적 응력을 받았다는 점을 고려해야 합니다. 따라서 노화와 관련이없는 특정 생물학적 변화가 분류 된 세포에 존재할 수 있습니다. 그러나, 본 연구에서, 분류된 세포는 노화의 강한 특징을 유지하였고, 분류되지 않은 대조군과 비교했을 때 특징적인 단백질체학 및 전사체학 결과28을 제공하였다. FACS를 사용하여 종양에서 노화 세포를 수집하고 분석하는 다소 명백한 유용성에도 불구하고이 절차는 문헌에서 거의 사용되지 않았습니다. 일부 그룹은 마우스 조직에서 노화 세포를 확인하기 위해 p16Ink4a 루시페라아제 또는 형광 리포터를 사용했으며, 형광 리포터는 일부 연구에서 FACS 분류를 가능하게 했습니다29,30. 연구 결과는 일반적으로 유도제 또는 종양 유형에 관계없이, 종양 내의 TIS가 부분적 내지 드물게 발생하며, 종양 세포의 100%에 거의 도달하지 않는다는 데 동의한다(31). DDAOG 방법을 사용한 세포의 FACS 분류는 트랜스제닉 구축물을 발현할 필요 없이 종양으로부터 희귀 TIS 세포의 수집을 용이하게 허용한다.

현재, 마우스 모델에서 대부분의 노화 연구는 X-Gal 및 면역조직화학 마커32,33의 조합을 사용하여 생체 외에서 수행됩니다. 그러나 종양 조직을 사용하여 TIS ex vivo를 평가하는 것은 특히 X-Gal을 사용하는 경우 긴 과정이 될 수 있습니다. 이 절차에는 종양 동결 보존, 슬라이드에 대한 냉동 절제, X-Gal 염색, 커버 유리 장착, 건조, 이미징 및 "파란색" 세포 점수 매기기(최소 며칠간의 접근 방식)가 필요합니다. 면역조직화학은 훨씬 빠르거나 쉽지 않으며, 멀티플렉스 분석이 최적화되지 않는 한 각 마커와 각 종양의 X-Gal에 대해 다른 조직 섹션을 사용하고 점수를 매겨야 하므로 프로세스의 프런트 엔드에서 더 많은 시간을 추가해야 합니다. 조직 절편은 종양의 단 하나의 얇은 단면만을 샘플링하는 반면, 노화 세포(많은 세포 유형과 마찬가지로)는 종양 전체에 걸쳐 3D 공간에 불균일하게 분포될 수 있다(29). 느리고 오래된 조직학 방법에서 종양에 대한보다 빠르고 쉽게 정량화 할 수있는 노화 분석으로 이동하는 것이 현장에서 시급히 필요합니다. DDAOG 유세포분석을 사용하여 15개의 종양 세트를 해리 및 염색하여 종양 수확 후 실습 시간 1일 이내에 결정적이고 정량적인 노화 데이터를 얻을 수 있습니다. 종양의 절반을 각 샘플에 대해 처리하여, 종양 당 3D 공간의 샘플링을 개선하였다. 이 DDAOG 유세포분석 접근법은 종양에서 TIS 평가를 위한 조직 슬라이드 기반 방법보다 훨씬 빠르고 신뢰할 수 있습니다.

X-Gal 및 기타 방법에 비해 많은 장점을 통해 DDAOG 프로토콜이 새로운 황금 표준 노화 분석법이 될 것을 옹호합니다. 일반적으로 허용되는 노화 마커인 SA-β-Gal과 연령 관련 AF의 무표지 감지를 두 번째 마커로 사용합니다. 이러한 형광단은 대부분의 표준 유세포분석기와 호환됩니다. 상기 분석은 약물-처리된 배양된 세포주 또는 종양으로부터 용이하게 수득된 샘플을 사용하여 죽은 세포 및 파편을 배제하는 생존성 염색을 포함한다. 살아있는 세포 샘플은 선택적으로 용매 고정 또는 냉동 보존되어 대규모 연구의 배치 분석을 용이하게 할 수 있습니다(예: 여러 제제를 사용하여 시간 경과에 따른 TIS의 발병을 평가하기 위한 시점 사용). 염색 프로세스는 완료하는 데 실험실 작업의 반나절 미만이 소요되며 데이터 수집은 일반적으로 샘플당 <5분입니다. 데이터 분석도 마찬가지로 빠르고 간단하여 지루한 세포 점수 매기기 및 계수 없이 샘플당 TIS 세포의 백분율에 대한 정량적 데이터를 생성합니다. 샘플을 FACS로 분류하여 TIS 세포의 농축 집단을 회수할 수 있으며, 이는 다운스트림 분석에서 세포 이질성으로 인한 노이즈를 줄입니다. 우리는 DDAOG 분석법이 많은 경우 X-Gal을 대체하여 시험관 내 및 생체 내에서 TIS 유도제 및 세놀리틱스의 스크리닝을 용이하게 하여 노화 연구 분야에서 더 빠르고 신뢰할 수 있는 발견으로 이어질 수 있다고 믿습니다.

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Disclosures

저자는이 연구에 대해 선언 할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgments

유세포분석 기기에 대한 지원을 해주신 시카고 대학교의 세포분석 및 항체 핵심 시설에 감사드립니다. 시카고 대학의 동물 연구 센터는 동물 주택을 제공했습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bafilomycin A1 Research Products International B40500
Bleomycin sulfate  Cayman 13877
Bovine serum albumin (BSA) US Biological A1380
Calcein Violet 450 AM viability dye ThermoFisher Scientific 65-0854-39 eBioscience
DPP4 antibody, PE conjugate Biolegend 137803 Clone H194-112
Cell line: A549 human lung adenocarcinoma American Type Culture Collection CCL-185
Cell line: B16-F10 mouse melanoma American Type Culture Collection CRL-6475
Cell scraper Corning 3008
Cell strainers, 100 µm Falcon 352360
DDAO-Galactoside Life Technologies D6488
DMEM medium 1x Life Technologies 11960-069
DMSO Sigma D2438
DNAse I Sigma DN25
Doxorubicin, hydrochloride injection (USP) Pfizer NDC 0069-3032-20
Doxorubicin, PEGylated liposomal (USP) Sun Pharmaceutical NDC 47335-049-40
EDTA 0.5 M Life Technologies 15575-038
Etoposide  Cayman 12092
FBS Omega  FB-11
Fc receptor blocking reagent Biolegend 101320 Anti-mouse CD16/32
Flow cytometer (cell analyzer) Becton Dickinson (BD) Various LSRFortessa
Flow cytometer (cell sorter) Becton Dickinson (BD) Various FACSAria
GlutaMax 100x Life Technologies 35050061
HEPES 1 M Lonza BW17737
Liberase TL Sigma 5401020001 Roche
Paraformaldehyde 16% Electron Microscopy Sciences 15710
Penicillin/Streptomycin 100x Life Technologies 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) 1x Corning MT21031CV Dulbecco's PBS (without calcium and magnesium)
Rainbow calibration particles, ultra kit SpheroTech UCRP-38-2K 3.5-3.9 µm, 2E6/mL
RPMI-1640 medium 1x Life Technologies 11875-119
Sodium chloride 0.9% (USP) Baxter Healthcare Corporation 2B1324
Software for cytometer data acquisition, "FACSDiva" Becton Dickinson (BD) n/a Contact BD for license
Software for cytometer data analysis, "FlowJo" TreeStar n/a Contact TreeStar for license
Trypsin-EDTA 0.25% Life Technologies 25200-114

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References

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암 연구 187호 노화 암 화학요법 유세포분석 형광탐침 멀티플렉스
유세포분석을 통한 노화 종양 세포의 식별 및 농축을 위한 원적색 형광 노화 관련 β-갈락토시다아제 프로브
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Flor, A., Pagacz, J., Thompson, D., Kron, S. Far-Red Fluorescent Senescence-Associated β-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (187), e64176, doi:10.3791/64176 (2022).

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