Far-Red Fluoreszenz-Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase-Sonde zur Identifizierung und Anreicherung von seneszenten Tumorzellen mittels Durchflusszytometrie
Summary
Ein Protokoll zur fluoreszierenden, durchflusszytometrischen Quantifizierung von seneszenten Krebszellen, die durch Chemotherapeutika in Zellkultur oder in murinen Tumormodellen induziert werden, wird vorgestellt. Optionale Verfahren umfassen die Co-Immunfärbung, die Probenfixierung zur Erleichterung der Analyse großer Chargen oder Zeitpunkte sowie die Anreicherung lebensfähiger seneszenter Zellen durch durchflusszytometrische Sortierung.
Abstract
Zelluläre Seneszenz ist ein Zustand des proliferativen Stillstands, der durch biologische Schäden induziert wird, der normalerweise über Jahre in alternden Zellen entsteht, aber auch schnell in Tumorzellen als Reaktion auf Schäden auftreten kann, die durch verschiedene Krebsbehandlungen induziert werden. Die Seneszenz von Tumorzellen wird im Allgemeinen als unerwünscht angesehen, da alternde Zellen gegen den Tod resistent werden und die Tumorremission blockieren, während sie die Tumormalignität und die Behandlungsresistenz verschlimmern. Daher ist die Identifizierung von seneszenten Tumorzellen von anhaltendem Interesse für die Krebsforschungsgemeinschaft. Es gibt verschiedene Seneszenzassays, von denen viele auf der Aktivität des bekannten Seneszenzmarkers basieren, der Seneszenz-assoziierten Beta-Galactosidase (SA-β-Gal).
Typischerweise wird der SA-β-Gal-Assay unter Verwendung eines chromogenen Substrats (X-Gal) an festen Zellen durchgeführt, wobei die langsame und subjektive Zählung von “blauen” alternden Zellen durch Lichtmikroskopie durchgeführt wird. Verbesserte Assays mit zellpermeanten, fluoreszierenden SA-β-Gal-Substraten, einschließlich C12-FDG (grün) und DDAO-Galactosid (DDAOG; weit rot), haben die Analyse lebender Zellen ermöglicht und die Verwendung von Hochdurchsatz-Fluoreszenzanalyseplattformen, einschließlich Durchflusszytometern, ermöglicht. C12-FDG ist eine gut dokumentierte Sonde für SA-β-Gal, aber ihre grün fluoreszierende Emission überlappt sich mit der intrinsischen zellulären Autofluoreszenz (AF), die während der Seneszenz aufgrund der Akkumulation von Lipofuszin-Aggregaten entsteht. Durch die Verwendung der tiefroten SA-β-Gal-Sonde DDAOG kann die grünzelluläre Autofluoreszenz als sekundärer Parameter zur Bestätigung der Seneszenz verwendet werden, was die Zuverlässigkeit des Assays erhöht. Die verbleibenden Fluoreszenzkanäle können für die Färbung der Zelllebensfähigkeit oder die optionale fluoreszierende Immunmarkierung verwendet werden.
Mit Hilfe der Durchflusszytometrie demonstrieren wir die Verwendung von DDAOG und Lipofuszin-Autofluoreszenz als Dual-Parameter-Assay zur Identifizierung von seneszenten Tumorzellen. Es wird eine Quantifizierung des Prozentsatzes lebensfähiger seneszenter Zellen durchgeführt. Falls gewünscht, kann ein optionaler Immunmarkierungsschritt enthalten sein, um die interessierenden Antigene der Zelloberfläche zu bewerten. Identifizierte seneszente Zellen können auch flusszytometrisch sortiert und für die nachgeschaltete Analyse gesammelt werden. Gesammelte seneszente Zellen können sofort lysiert (z. B. für Immunoassays oder Omics-Analysen) oder weiter kultiviert werden.
Introduction
Seneszente Zellen sammeln sich normalerweise während des normalen biologischen Alterns über Jahre in Organismen an, können sich aber auch schnell in Tumorzellen als Reaktion auf Schäden entwickeln, die durch verschiedene Krebsbehandlungen, einschließlich Bestrahlung und Chemotherapie, verursacht werden. Obwohl sie sich nicht mehr vermehren, können therapieinduzierte seneszente (TIS) Tumorzellen zur Behandlungsresistenz beitragen und ein Rezidiv bewirken 1,2,3. Von TIS-Zellen sezernierte Faktoren können die Tumormalignität verschlimmern, indem sie Immunevasion oder Metastasierung fördern 4,5. TIS-Zellen entwickeln komplexe, kontextspezifische Phänotypen, veränderte Stoffwechselprofile und einzigartige Immunantworten 6,7,8. Daher ist die Identifizierung und Charakterisierung von TIS-Tumorzellen, die durch verschiedene Krebsbehandlungsansätze induziert werden, ein Thema von anhaltendem Interesse für die Krebsforschungsgemeinschaft.
Zum Nachweis von TIS-Tumorzellen sind konventionelle Seneszenz-Assays weit verbreitet, die hauptsächlich auf dem Nachweis einer erhöhten Aktivität des Seneszenzmarkerenzyms, der lysosomalen Beta-Galactosidase GLB19, basieren. Der Nachweis bei einem nahezu neutralen (statt sauren) lysosomalen pH-Wert ermöglicht den spezifischen Nachweis von Seneszenz-assoziierter Beta-Galactosidase (SA-β-Gal)10. Ein seit mehreren Jahrzehnten verwendeter Standard-SA-β-Gal-Assay verwendet X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid), ein blau-chromogenes Beta-Galactosidase-Substrat, um SA-β-Gal in fixierten Zellen lichtmikroskopischnachzuweisen11. Der X-Gal-Assay ermöglicht die qualitative visuelle Bestätigung von TIS unter Verwendung handelsüblicher Reagenzien und Laborgeräte. Ein einfaches Durchlichtmikroskop ist das einzige Instrument, das erforderlich ist, um das Vorhandensein des blauen Chromogens zu bewerten. Das X-Gal-Färbeverfahren kann jedoch nicht empfindlich sein und manchmal mehr als 24 Stunden dauern, bis sich die Farbe entwickelt. Auf die Färbung folgt eine subjektive Bewertung einzelner seneszenter Zellen mit niedrigem Durchsatz, basierend auf der Zählung der Zellen, die eine gewisse Intensität des blauen Chromogens unter einem Lichtmikroskop aufweisen. Da X-Gal zellundurchlässig ist, erfordert dieser Assay lösungsmittelfixierte Zellen, die für die nachgeschaltete Analyse nicht gewonnen werden können. Bei der Arbeit mit begrenzten Proben von Tieren oder Patienten kann dies ein großer Nachteil sein.
Verbesserte SA-β-Gal-Assays unter Verwendung zellpermeanter, fluoreszierender Enzymsubstrate, einschließlich C 12-FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranosid, grün) und DDAOG (9H-(1,3-Dichlor-9,9-dimethylacridin-2-on-7-yl) β-D-Galactopyranosid, weit rot) sind bereits in der Literaturerschienen 12,13,14,15. Die chemische Sondenstruktur und die optischen Eigenschaften von DDAOG sind in der ergänzenden Abbildung S1 dargestellt. Diese zellpermeierten Sonden ermöglichen die Analyse lebender (und nicht fixierter) Zellen, und fluoreszierende statt chromogene Sonden erleichtern die Verwendung von schnellen Hochdurchsatz-Fluoreszenzanalyseplattformen, einschließlich High-Content-Screening-Instrumenten und Durchflusszytometern. Sortierdurchflusszytometer ermöglichen die Gewinnung angereicherter Populationen lebender alternder Zellen aus Zellkulturen oder Tumoren für die nachgeschaltete Analyse (z. B. Western Blotting, ELISA oder Omics). Die Fluoreszenzanalyse liefert auch ein quantitatives Signal, das eine genauere Bestimmung des Prozentsatzes der alternden Zellen innerhalb einer bestimmten Probe ermöglicht. Zusätzliche Fluoreszenzsonden, einschließlich Viabilitätssonden und fluorophormarkierter Antikörper, können problemlos für die Multiplexanalyse von Zielen jenseits von SA-β-Gal hinzugefügt werden.
Ähnlich wie DDAOG ist C12-FDG eine Fluoreszenzsonde für SA-β-Gal, aber ihre grün fluoreszierende Emission überlappt sich mit intrinsischem zellulärem AF, der während der Seneszenz aufgrund der Akkumulation von Lipofuszin-Aggregaten in Zellen16 entsteht. Durch die Verwendung der tiefroten DDAOG-Sonde kann grüner zellulärer AF als sekundärer Parameter zur Bestätigung der Seneszenzverwendet werden 17. Dies verbessert die Assay-Zuverlässigkeit durch die Verwendung eines zweiten Markers zusätzlich zu SA-β-Gal, der oft als einzelner Marker für die Seneszenz18 unzuverlässig sein kann. Da der Nachweis von endogenem Vorhofflimmern in seneszenten Zellen ein markierungsfreier Ansatz ist, ist es eine schnelle und einfache Möglichkeit, die Spezifität unseres DDAOG-basierten Assays zu erweitern.
In diesem Protokoll demonstrieren wir die Verwendung von DDAOG und AF als schnellen Dual-Parameter-Durchflusszytometrie-Assay zur Identifizierung lebensfähiger TIS-Tumorzellen aus In-vitro-Kulturen oder isoliert aus medikamentös behandelten Tumoren, die in Mäusen etabliert wurden (Abbildung 1). Das Protokoll verwendet Fluorophore, die mit einer Vielzahl von handelsüblichen Durchflusszytometrie-Analysatoren und -Sortierern kompatibel sind (Tabelle 1). Die Quantifizierung des Prozentsatzes lebensfähiger seneszenter Zellen mittels Standard-Durchflusszytometrie-Analyse ist möglich. Falls gewünscht, kann ein optionaler Immunmarkierungsschritt durchgeführt werden, um die interessierenden Zelloberflächenantigene gleichzeitig mit der Seneszenz zu bewerten. Identifizierte seneszente Zellen können auch mit der Standard-Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS) angereichert werden.
Abbildung 1: Experimenteller Workflow. Eine schematische Zusammenfassung der wichtigsten Punkte des DDAOG-Assays. (A) Ein TIS-induzierendes Medikament wird Säugetierkulturzellen zugesetzt oder tumortragenden Mäusen verabreicht. Zeit ist dann für den Beginn der TIS vorgesehen: für Zellen, 4 Tage nach der Behandlung; für Mäuse, insgesamt 22 Tage, mit drei Behandlungen alle 5 Tage plus 7 Tage Erholung. Zellen werden geerntet oder Tumore in Suspension dissoziiert. (B) Die Proben werden mit Baf behandelt, um den lysosomalen pH-Wert für den Nachweis von SA-β-Gal für 30 min einzustellen; dann wird eine DDAOG-Sonde für 60 min hinzugefügt, um SA-β-Gal zu erkennen. Die Proben werden 2x in PBS gewaschen und kurz ein Lebensfähigkeitsfleck hinzugefügt (15 min). Optional können Proben in offenen Fluoreszenzkanälen mit fluoreszierenden Antikörpern angefärbt und/oder für eine spätere Analyse fixiert werden. (C) Die Proben werden mit einem Standard-Durchflusszytometer analysiert. Lebensfähige Zellen werden in Punktdiagrammen visualisiert, die rotes DDAOG (was SA-β-Gal anzeigt) versus grüne Autofluoreszenz (Lipofuszin) zeigen. Ein Gate zur Bestimmung des Prozentsatzes der TIS-Zellen wird basierend auf unbehandelten Kontrollproben (nicht gezeigt) erstellt. Wenn ein Sortierzytometer (FACS) verwendet wird, können TIS-Zellen gesammelt und für weitere In-vitro-Assays wieder in Kultur gebracht oder für molekularbiologische Assays lysiert und verarbeitet werden. Abkürzungen: DDAO = 9H-(1,3-Dichlor-9,9-dimethylacridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galactosid; TIS = therapieinduzierte Seneszenz; FL-Ab = fluorophorkonjugierter Antikörper; Baf = Bafilomycin A1; SA-β-Gal = Seneszenz-assoziierte Beta-Galaktosidase; PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung; FACS = fluoreszenzaktivierte Zellsortierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Fluorophor | Erkennt | Ex/Em (nm) | Zytometerlaser (nm) | Zytometerdetektor / Bandpassfilter (nm) |
| DDAOG | SA-β-Gal | 645/6601 | 640 | 670 / 30 |
| AF | Lipofuszin | < 600 | 488 | 525 / 50 |
| CV450 | Lebensfähigkeit | 408/450 | 405 | 450 / 50 |
| PE | Antikörper/Oberflächenmarker | 565/578 | 561 | 582 / 15 |
Tabelle 1: Optische Spezifikationen für Fluorophore und Zytometer. Die in diesem Protokoll verwendeten Zytometerspezifikationen sind für ein Gerät mit insgesamt 4 Lasern und 15 Emissionsdetektoren aufgeführt. DDAOG, das bei 645/660 nm nachgewiesen wird, ist die Form der Sonde, die von SA-β-Gal1 gespalten wurde. Unspaltetes DDAOG kann bei 460/610 nm eine geringe Fluoreszenz aufweisen, wird aber durch Waschschritte im Protokoll entfernt. Abkürzungen: DDAO = 9H-(1,3-Dichlor-9,9-dimethylacridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galactosid; AF = Autofluoreszenz; PE = Phycoerythrin; SA-β-Gal = Seneszenz-assoziierte Beta-Galaktosidase.
Protocol
Representative Results
Discussion
In den letzten zehn Jahren hat sich die Durchflusszytometrie aufgrund der zunehmenden Popularität der Tumorimmunologie, der Entwicklung kostengünstigerer Durchflusszytometer und der Verbesserung gemeinsamer Instrumentierungseinrichtungen an akademischen Einrichtungen zu einer immer häufigeren Assay-Plattform in der Krebsforschung entwickelt. Multicolor-Assays sind jetzt Standard, da die meisten neueren Instrumente mit violetten, blau-grünen und roten bis fernroten optischen Arrays ausgestattet sind. Daher ist dieses …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken der Cytometry and Antibody Core Facility der University of Chicago für die Unterstützung bei der Durchflusszytometrie. Das Animal Research Center an der University of Chicago stellte Tierunterkünfte zur Verfügung.
Materials
| Bafilomycin A1 | Research Products International | B40500 | |
| Bleomycin sulfate | Cayman | 13877 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | US Biological | A1380 | |
| Calcein Violet 450 AM viability dye | ThermoFisher Scientific | 65-0854-39 | eBioscience |
| DPP4 antibody, PE conjugate | Biolegend | 137803 | Clone H194-112 |
| Cell line: A549 human lung adenocarcinoma | American Type Culture Collection | CCL-185 | |
| Cell line: B16-F10 mouse melanoma | American Type Culture Collection | CRL-6475 | |
| Cell scraper | Corning | 3008 | |
| Cell strainers, 100 µm | Falcon | 352360 | |
| DDAO-Galactoside | Life Technologies | D6488 | |
| DMEM medium 1x | Life Technologies | 11960-069 | |
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| DNAse I | Sigma | DN25 | |
| Doxorubicin, hydrochloride injection (USP) | Pfizer | NDC 0069-3032-20 | |
| Doxorubicin, PEGylated liposomal (USP) | Sun Pharmaceutical | NDC 47335-049-40 | |
| EDTA 0.5 M | Life Technologies | 15575-038 | |
| Etoposide | Cayman | 12092 | |
| FBS | Omega | FB-11 | |
| Fc receptor blocking reagent | Biolegend | 101320 | Anti-mouse CD16/32 |
| Flow cytometer (cell analyzer) | Becton Dickinson (BD) | Various | LSRFortessa |
| Flow cytometer (cell sorter) | Becton Dickinson (BD) | Various | FACSAria |
| GlutaMax 100x | Life Technologies | 35050061 | |
| HEPES 1 M | Lonza | BW17737 | |
| Liberase TL | Sigma | 5401020001 | Roche |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Life Technologies | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1x | Corning | MT21031CV | Dulbecco's PBS (without calcium and magnesium) |
| Rainbow calibration particles, ultra kit | SpheroTech | UCRP-38-2K | 3.5-3.9 µm, 2E6/mL |
| RPMI-1640 medium 1x | Life Technologies | 11875-119 | |
| Sodium chloride 0.9% (USP) | Baxter Healthcare Corporation | 2B1324 | |
| Software for cytometer data acquisition, "FACSDiva" | Becton Dickinson (BD) | n/a | Contact BD for license |
| Software for cytometer data analysis, "FlowJo" | TreeStar | n/a | Contact TreeStar for license |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Life Technologies | 25200-114 |
References
- Saleh, T., Tyutyunyk-Massey, L., Gewirtz, D. A. Tumor cell escape from therapy-induced senescence as a model of disease recurrence after dormancy. Cancer Research. 79 (6), 1044-1046 (2019).
- Wang, B., Kohli, J., Demaria, M. Senescent cells in cancer therapy: friends or foes. Trends in Cancer. 6 (10), 838-857 (2020).
- Prasanna, P. G., et al. Therapy-induced senescence: Opportunities to improve anticancer therapy. Journal of the National Cancer Institute. 113 (10), 1285-1298 (2021).
- Velarde, M. C., Demaria, M., Campisi, J. Senescent cells and their secretory phenotype as targets for cancer therapy. Interdisciplinary Topics in Gerontology and Geriatrics. 38, 17-27 (2013).
- Ou, H. L., et al. Cellular senescence in cancer: from mechanisms to detection. Molecular Oncology. 15 (10), 2634-2671 (2021).
- Hernandez-Segura, A., Nehme, J., Demaria, M. Hallmarks of cellular senescence. Trends in Cell Biology. 28 (6), 436-453 (2018).
- Bojko, A., Czarnecka-Herok, J., Charzynska, A., Dabrowski, M., Sikora, E. Diversity of the senescence phenotype of cancer cells treated with chemotherapeutic agents. Cells. 8 (12), 1501 (2019).
- Mikuła-Pietrasik, J., Niklas, A., Uruski, P., Tykarski, A., Książek, K. Mechanisms and significance of therapy-induced and spontaneous senescence of cancer cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (2), 213-229 (2020).
- Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging cell. 5 (2), 187-195 (2006).
- Itahana, K., Itahana, Y., Dimri, G. P. Colorimetric detection of senescence-associated β galactosidase. Methods in Molecular Biology. 965, 143-156 (2013).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9363-9367 (1995).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
- Noppe, G., et al. Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts. Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).
- Tung, C. -. H., et al. In vivo imaging of β-galactosidase activity using far red fluorescent switch. Cancer Research. 64 (5), 1579-1583 (2004).
- Gong, H., et al. beta-Galactosidase activity assay using far-red-shifted fluorescent substrate DDAOG. Analytical Biochemistry. 386 (1), 59-64 (2009).
- Terman, A., Brunk, U. T. Lipofuscin: Mechanisms of formation and increase with age. APMIS. 106 (2), 265-276 (1998).
- Georgakopoulou, E. A., et al. Specific lipofuscin staining as a novel biomarker to detect replicative and stress-induced senescence. A method applicable in cryo-preserved and archival tissues. Aging. 5 (1), 37-50 (2013).
- Wang, B., Demaria, M. The quest to define and target cellular senescence in cancer. Cancer Research. 81 (24), 6087-6089 (2021).
- Appelbe, O. K., Zhang, Q., Pelizzari, C. A., Weichselbaum, R. R., Kron, S. J. Image-guided radiotherapy targets macromolecules through altering the tumor microenvironment. Molecular Pharmaceutics. 13 (10), 3457-3467 (2016).
- Maciorowski, Z., Chattopadhyay, P. K., Jain, P. Basic multicolor flow cytometry. Current Protocols in Immunology. 117, 1-38 (2017).
- Fan, Y., Cheng, J., Zeng, H., Shao, L. Senescent cell depletion through targeting BCL-family proteins and mitochondria. Frontiers in Physiology. 11, 593630 (2020).
- Kim, K. M., et al. Identification of senescent cell surface targetable protein DPP4. Genes and Development. 31 (15), 1529-1534 (2017).
- Flor, A. C., Kron, S. J. Lipid-derived reactive aldehydes link oxidative stress to cell senescence. Cell Death Discovery. 7 (9), 2366 (2016).
- Jochems, F., et al. The Cancer SENESCopedia: A delineation of cancer cell senescence. Cell reports. 36 (4), 109441 (2021).
- Fallah, M., et al. Doxorubicin and liposomal doxorubicin induce senescence by enhancing nuclear factor kappa B and mitochondrial membrane potential. Life Sciences. 232, 116677 (2019).
- Kasper, M., Barth, K. Bleomycin and its role in inducing apoptosis and senescence in lung cells – modulating effects of caveolin-1. Current Cancer Drug Targets. 9 (3), 341-353 (2009).
- Muthuramalingam, K., Cho, M., Kim, Y. Cellular senescence and EMT crosstalk in bleomycin-induced pathogenesis of pulmonary fibrosis-an in vitro analysis. Cell Biology International. 44 (2), 477-487 (2020).
- Flor, A. C., Wolfgeher, D., Wu, D., Kron, S. J. A signature of enhanced lipid metabolism, lipid peroxidation and aldehyde stress in therapy-induced senescence. Cell Death Discovery. 3, 17075 (2017).
- Burd, C. E., et al. Monitoring tumorigenesis and senescence in vivo with a p16(INK4a)-luciferase model. Cell. 152 (1-2), 340-351 (2013).
- Liu, J. Y., et al. Cells exhibiting strong p16 (INK4a) promoter activation in vivo display features of senescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2603-2611 (2019).
- Wang, L., Lankhorst, L., Bernards, R. Exploiting senescence for the treatment of cancer. Nature Reviews Cancer. 22 (6), 340-355 (2022).
- Baek, K. -. H., Ryeom, S. Detection of oncogene-induced senescence in vivo. Methods in Molecular Biology. 1534, 185-198 (2017).
- González-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Muñoz-Espín, D. A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo. The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).
