Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

בדיקה פלואורסצנטית פלואורסצנטית β-גלקטוזידאז הקשורה לזיהוי והעשרה של תאי גידול סנסנטיים על ידי ציטומטריה של זרימה

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64176
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Molecular Genetics and Cell Biology, University of Chicago

Summary

פרוטוקול לכימות ציטומטרי פלואורסצנטי, זרימה של תאים סרטניים סנסנטיים המושרים על ידי תרופות כימותרפיות בתרבית תאים או במודלים של גידולי מורין. הליכים אופציונליים כוללים co-immunostaining, קיבוע דגימה כדי להקל על אצווה גדולה או ניתוח נקודת זמן, והעשרה של תאים senescent קיימא על ידי מיון ציטומטרי זרימה.

Abstract

סנסנציה תאית היא מצב של מעצר שגשוג הנגרם על ידי נזק ביולוגי שבדרך כלל מצטבר לאורך שנים בתאים מזדקנים, אך עשוי להופיע במהירות גם בתאי הגידול כתגובה לנזק הנגרם על ידי טיפולים שונים בסרטן. סנסנציה של תאי גידול נחשבת בדרך כלל לבלתי רצויה, שכן תאים סנסנטיים הופכים עמידים למוות וחוסמים את הפוגה של הגידול תוך החרפת ממאירות הגידול ועמידות לטיפול. לכן, זיהוי של תאים סרטניים סנסנטיים הוא עניין מתמשך לקהילת חקר הסרטן. קיימים מבחני סנסנציה שונים, רבים מהם מבוססים על פעילותו של סמן הסנסנציה הידוע, בטא-גלקטוזידאז הקשור לסנסנציה (SA-β-Gal).

בדרך כלל, בדיקת SA-β-Gal מבוצעת באמצעות מצע כרומוגני (X-Gal) על תאים קבועים, עם ספירה איטית וסובייקטיבית של תאים סנסנטיים "כחולים" על ידי מיקרוסקופיית אור. בדיקות משופרות המשתמשות במצעי SA-β-Gal פלואורסצנטיים החודשים לתאים, כולל C12-FDG (ירוק) ו-DDAO-Galactoside (DDAOG; אדום-רחוק), אפשרו ניתוח של תאים חיים ואפשרו שימוש בפלטפורמות ניתוח פלואורסצנטיות בתפוקה גבוהה, כולל ציטומטרים של זרימה. C12-FDG היא בדיקה מתועדת היטב עבור SA-β-Gal, אך פליטת הפלואורסצנט הירוקה שלה חופפת לאוטופלואורסצנציה תאית פנימית (AF) המתעוררת במהלך סנסנציה עקב הצטברות של אגרגטים ליפופוסצין. על ידי שימוש בגשושית SA-β-Gal האדומה הרחוקה DDAOG, ניתן להשתמש ב-autofluorescence של תאים ירוקים כפרמטר משני כדי לאשר את הסנסנציה, ולהוסיף אמינות לבדיקה. ניתן להשתמש בתעלות הפלואורסצנטיות הנותרות לצורך צביעת כדאיות התאים או לתיוג חיסוני פלואורסצנטי אופציונלי.

באמצעות ציטומטריה של זרימה, אנו מדגימים את השימוש ב- DDAOG וב- lipofuscin autofluorescence כבדיקה דו-פרמטרית לזיהוי תאי גידול סנסנטיים. כמות של אחוז התאים senescent קיימא מבוצעת. אם תרצה, ניתן לכלול שלב אופציונלי של תיוג חיסוני כדי להעריך אנטיגנים מעניינים על פני התא. תאים סנסנטיים מזוהים יכולים גם להיות ממוינים בצורה ציטומטרית ונאספים לניתוח במורד הזרם. תאים סנסנטיים שנאספו יכולים להיות שוכבים באופן מיידי (למשל, לצורך בדיקות חיסוניות או 'ניתוח אומיקה') או בתרבית נוספת.

Introduction

תאים סנסנטיים בדרך כלל מצטברים באורגניזמים במשך שנים במהלך הזדקנות ביולוגית רגילה, אך עשויים גם להתפתח במהירות בתאי הגידול כתגובה לנזק הנגרם על ידי טיפולים שונים בסרטן, כולל הקרנות וכימותרפיה. למרות שאינם מתרבים עוד, תאי גידול סנסנטיים (TIS) הנגרמים על ידי טיפול עשויים לתרום לעמידות לטיפול ולהניע הישנותשל 1,2,3. גורמים המופרשים על ידי תאי TIS יכולים להחמיר את ממאירות הגידול על ידי קידום התחמקות חיסונית או גרורות 4,5. תאי TIS מפתחים פנוטיפים מורכבים וספציפיים להקשר, פרופילים מטבוליים משתנים ותגובות חיסוניות ייחודיות 6,7,8. לכן, זיהוי ואפיון של תאי גידול מסוג TIS המושרים על ידי גישות שונות לטיפול בסרטן הוא נושא שמעניין באופן שוטף את קהילת חקר הסרטן.

כדי לזהות תאים סרטניים מסוג TIS, נעשה שימוש נרחב במבחני סנסנציה קונבנציונליים, המבוססים בעיקר על גילוי פעילות מוגברת של אנזים סמן הסנסנציה, הבטא-גלקטוזידאז הליזוזומלי GLB19. זיהוי ב-pH ליזוזומלי כמעט נייטרלי (ולא חומצי) מאפשר זיהוי ספציפי של בטא-גלקטוזידאז (SA-β-Gal) הקשור לסנסנציה10. בדיקת SA-β-Gal סטנדרטית שנמצאת בשימוש כבר כמה עשורים משתמשת ב-X-Gal (5-ברומו-4-כלורו-3-אינדוליל-β-D-גלקטופירנוסייד), מצע בטא-גלקטוזידאז כרומוגני כחול, כדי לזהות SA-β-Gal בתאים קבועים על ידי מיקרוסקופיית אור11. בדיקת X-Gal מאפשרת אישור חזותי איכותי של TIS תוך שימוש בריאגנטים ובציוד מעבדה זמינים בדרך כלל. מיקרוסקופ אור בסיסי המועבר הוא המכשור היחיד הנדרש להערכת נוכחותו של הכרומוגן הכחול. עם זאת, הליך צביעת X-Gal עלול להיות חסר רגישות, ולעתים נדרשות יותר מ-24 שעות להתפתחות צבע. לאחר מכן מכתים ניקוד סובייקטיבי בעל תפוקה נמוכה של תאים סנסנטיים בודדים בהתבסס על ספירת התאים המציגים רמה מסוימת של עוצמה של הכרומוגן הכחול תחת מיקרוסקופ אור. מכיוון ש-X-Gal הוא אטום לתאים, בדיקה זו דורשת תאים קבועים בממס, שלא ניתן לשחזר לצורך ניתוח במורד הזרם. כאשר עובדים עם דגימות מוגבלות מבעלי חיים או מחולים, זה יכול להיות חיסרון גדול.

מבחני SA-β-Gal משופרים המשתמשים בסובסטרטים של אנזימים פלואורסצנטיים חדירים לתאים, כולל C 12-FDG (5-דודקנוילאמינופלואורסצין Di-β-D-גלקטופירנוזיד, ירוק) ו-DDAOG (9H-(1,3-דיכלורו-9,9-דימתיל-אקרידין-2-אחד-7-yl) β-D-גלקטופירנוסייד, אדום רחוק) הופיעו בעבר בספרות12,13,14,15. מבנה הגשושית הכימית והמאפיינים האופטיים של DDAOG מוצגים באיור משלים S1. גשושיות אלה, המיועדות לתאים, מאפשרות ניתוח של תאים חיים (ולא קבועים), וגשושיות פלואורסצנטיות ולא כרומוגניות מאפשרות שימוש בפלטפורמות ניתוח פלואורסצנטיות מהירות בתפוקה גבוהה, כולל מכשירי סינון בעלי תוכן גבוה וציטומטרים של זרימה. מיון ציטומטרים של זרימה מאפשר התאוששות של אוכלוסיות מועשרות של תאים חיים מתרביות תאים או גידולים לניתוח במורד הזרם (למשל, כתם מערבי, ELISA או 'אומיקה'). ניתוח פלואורסצנטי מספק גם אות כמותי, המאפשר קביעה מדויקת יותר של אחוז התאים הסנסנטיים בתוך דגימה נתונה. ניתן להוסיף בקלות בדיקות פלואורסצנטיות נוספות, כולל בדיקות כדאיות ונוגדנים המסומנים בפלואורופור, לניתוח מרובב של מטרות מעבר ל-SA-β-Gal.

בדומה ל-DDAOG, C12-FDG היא בדיקה פלואורסצנטית עבור SA-β-Gal, אך פליטת הפלואורסצנט הירוקה שלה חופפת למיקוד אוטומטי תאי פנימי, המתעורר במהלך סנסנציה עקב הצטברות של אגרגטים ליפופוסצין בתאים16. על ידי שימוש בגשושית DDAOG בצבע אדום רחוק, ניתן להשתמש במיקוד אוטומטי תאי ירוק כפרמטר משני לאישור סנסנציה17. זה משפר את אמינות הבדיקה על ידי שימוש בסמן שני בנוסף ל- SA-β-Gal, שלעתים קרובות יכול להיות לא אמין כסמן יחיד עבור senescence18. מכיוון שזיהוי של AF אנדוגני בתאים סנסנטיים הוא גישה נטולת תוויות, זוהי דרך מהירה ופשוטה להרחיב את הספציפיות של הבדיקה מבוססת ה- DDAOG שלנו.

בפרוטוקול זה, אנו מדגימים את השימוש ב-DDAOG וב-AF כבדיקת ציטומטריה מהירה של זרימה דו-פרמטרית לזיהוי תאי גידול TIS בני קיימא מתרביות מבחנה או מבודדים מגידולים שטופלו בתרופות שהוקמו בעכברים (איור 1). הפרוטוקול משתמש בפלואורופורים התואמים למגוון רחב של מנתחי וממיינים סטנדרטיים של ציטומטריה של זרימה מסחרית (טבלה 1). כמות של אחוז התאים הסנסוניים בני קיימא באמצעות ניתוח ציטומטריה של זרימה סטנדרטית מופעלת. אם תרצה, ניתן לבצע שלב חיסוני אופציונלי כדי להעריך אנטיגנים בעלי עניין על פני התא במקביל לסנסנציה. ניתן גם להעשיר תאים סנסנטיים מזוהים באמצעות מתודולוגיית מיון תאים פלואורסצנטית סטנדרטית (FACS).

Figure 1
איור 1: זרימת עבודה ניסיונית. סכמטי המסכם נקודות מפתח של מבחן DDAOG. (A) תרופה הגורמת ל-TIS מתווספת לתאים בתרבית של יונקים או ניתנת לעכברים נושאי גידול. לאחר מכן הזמן מותר להופעת TIS: לתאים, 4 ימים לאחר הטיפול; עבור עכברים, 22 ימים בסך הכל, עם שלושה טיפולים כל 5 ימים ועוד 7 ימי התאוששות. תאים נקצרים או גידולים מנותקים לתוך ההשעיה. (B) דגימות מטופלות ב-Baf כדי להתאים את ה-pH הליזוזומלי לזיהוי SA-β-Gal למשך 30 דקות; לאחר מכן, גשושית DDAOG מתווספת למשך 60 דקות כדי לזהות SA-β-Gal. דגימות נשטפות 2x ב- PBS, וכתם כדאיות מתווסף לזמן קצר (15 דקות). לחלופין, ניתן להכתים דגימות בנוגדנים פלואורסצנטיים בתעלות פלואורסצנטיות פתוחות ו/או לתקן אותן לצורך ניתוח מאוחר יותר. (C) דגימות מנותחות באמצעות ציטומטר זרימה סטנדרטי. תאים בני קיימא מוצגים באופן חזותי בחלקות נקודות המציגות DDAOG אדום (המציין SA-β-Gal) לעומת אוטופלואורסצנציה ירוקה (lipofuscin). שער לקביעת אחוז תאי ה- TIS נקבע על סמך דגימות בקרה לא מטופלות (לא מוצגות). אם נעשה שימוש בציטומטר מיון (FACS), ניתן לאסוף תאי TIS ולהחזירם לתרבית לצורך בדיקות נוספות במבחנה או לשכב ולעבד אותם למבחני ביולוגיה מולקולרית. קיצורים: DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-גלקטוסייד; TIS = סנסנציה הנגרמת על ידי טיפול; FL-Ab = נוגדן מצומד פלואורופור; Baf = Bafilomycin A1; SA-β-Gal = בטא-גלקטוזידאז הקשור לסנסנציה; PBS = מלח חצוב פוספט; FACS = מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

פלואורופור מזהה Ex/Em (ננומטר) לייזר ציטומטר (ננומטר) גלאי ציטומטר / מסנן פס פס (nm)
DDAOG SA-β-גל 645/6601 640 670 / 30
מיקוד אוטומטי ליפופוסקין < 600 488 525 / 50
CV450 כדאיות 408/450 405 450 / 50
PE נוגדן/סמן פני השטח 565/578 561 582 / 15

טבלה 1: מפרטים אופטיים של פלואורופורים וציטומטר. מפרטי ציטומטר המשמשים בפרוטוקול זה מפורטים עבור מכשיר עם סך של 4 לייזרים ו -15 גלאי פליטה. DDAOG שזוהה ב-645/660 ננומטר הוא הצורה של הגשושית שנבקעה על ידי SA-β-Gal1. DDAOG לא יציב יכול להפגין פלואורסצנטיות ברמה נמוכה ב-460/610 ננומטר, אך הוא מוסר על ידי שלבי שטיפה בפרוטוקול. קיצורים: DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-גלקטוסייד; AF = אוטופלואורסצנציה; PE = פיקואריתרין; SA-β-Gal = בטא-גלקטוזידאז הקשור לסנסנציה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל עבודות בעלי החיים המתוארות אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת שיקגו.

1. הכנה ואחסון של פתרונות מלאי

הערה: אם התאים ימוינו בזרימה, יש להכין את כל הפתרונות בטכניקות סטריליות ולסנן אותם דרך התקן מסנן של 0.22 מיקרומטר.

  1. הכינו תמיסת מלאי של DDAO-גלקטוזיד במינון 5 מ"ג/מ"ל ב-DMSO. Aliquot ב 50 μL לכל צינור (או נפח הרצוי). יש לאחסן בטמפרטורה של −20°C בחושך למשך עד שנה.
  2. הכן פתרון מלאי של Bafilomycin A1 ב- 1 mM ב- DMSO. Aliquot ב 50 μL לכל צינור (או נפח הרצוי). יש לאחסן בטמפרטורה של −20°C למשך עד 6 חודשים.
  3. הכן תמיסת מלאי של Calcein Violet 450 AM ב- 1 mM ב- DMSO. Aliquot ב 50 μL לכל צינור (או נפח הרצוי). יש לאחסן בטמפרטורה של −20°C בחושך למשך עד שנה.
  4. לטיפול בתאים בתרבית במבחנה, הכינו 10 mM תמיסות מלאי מרוכזות של חומרים מעוררי סנסנציה בממס המתאים, ועקרו באמצעות מסנני מזרק של 0.2 מיקרומטר. יש לאחסן בטמפרטורה של 20°C- או לפי הוראות היצרן.
    הערה: לצורך אספקת חומרים כימותרפיים מעוררי סנסנציה in vivo (לעכברים עם גידולים מבוססים), הסוכנים צריכים להיות בדרגה USP ומדוללים למלח ממלאי מרוכז ממש לפני ההזרקה.
  5. הכן מדיום תרבית שלם עבור קווי התאים שבהם נעשה שימוש.
    הערה: לדוגמה, הכינו מדיום לתאי B16-F10 או A549 עם DMEM 1x + 10% FBS + תחליף גלוטמין אחד + פניצילין/סטרפטומיצין אחד. המדיה חייבת להישמר סטרילית. ניתן להשתמש בנוסחאות מדיה אחרות הספציפיות לקו התא. רכיבים מסוימים כגון גלוטתיון עשויים, במקרים מסוימים, להפריע להתפרצות של senescence. בדיקה אמפירית של ניסוחים מדיה שונים צריך להתבצע אם הופעת senescence נמוך מהצפוי או לא נצפתה עם סוכני כימותרפיה שליטה.
  6. הכינו מכתימים ומאגרי כביסה.
    1. יש להכין 1% אלבומין מסרום בקר (BSA) ב-PBS אחד לשימוש בהליכי צביעה. יש להמיס 2 גרם BSA ב-200 מ"ל של PBS ולערבב במשך 10 דקות, או עד להמסה מלאה, בטמפרטורת החדר.
    2. הכינו 0.5% BSA ב-PBS אחד כמאגר כביסה. דילל 100 מ"ל של 1% BSA מוכן בשלב 1.6.1 לתוך 100 מ"ל של 1x PBS עבור 0.5% BSA.
    3. אחסנו מאגרים בטמפרטורה של 4 °C למשך עד חודש אחד.
  7. יש להכין 4% פרפורמלדהיד ב-PBS אחד. השתמש באמפולות פרפורמלדהיד אטומות הזמינות מסחרית (לדוגמה, 16% v/v) לנוחות ויציבות: 2.5 מ"ל של 16% PFA + 7.5 מ"ל של PBS אחד (= 10 מ"ל של 4% PFA). התאם את עוצמת הקול המוכנה בהתאם לנפח הכולל הדרוש לכל ניסוי.
    הערה: הכן לפי הצורך לקיבוע תאים בלבד; להכין טרי בכל פעם.
  8. הכן מאגר מיון FACS: 1x PBS, 1 mM EDTA, 25 mM HEPES, 1% BSA (pH 7.2). מסנן סטרילי באמצעות מכשיר סינון של 0.22 מיקרומטר ומאחסן ב- 4 °C למשך עד חודש.
    הערה: הכן לפי הצורך למיון FACS בלבד. נוסחאות מאגר מיון זרימה עשויות להשתנות בין מכשירי FACS. הניסוח הנ"ל תואם את המכשיר ששימש במחקר זה (ראו טבלת חומרים). עיין בהנחיות היצרן.
  9. הכן פתרון דיסוציאציה של הגידול: 20 מיקרוגרם / מ"ל ליבראז TL + 100 מיקרוגרם / מ"ל DNAse I במדיה RPMI-1640 (ללא FBS או תוספי מזון אחרים). פתרונות מלאי שימושיים לשמירה על היד של Liberase TL (מוכן ומאוחסן לפי הוראות היצרן) ו- DNAse I (100 מ"ג/מ"ל במים מזוקקים כפולים [ddH2O], המאוחסנים בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס).
    הערה: יש להכין לפי הצורך אם משתמשים בגידולים בלבד; להכין טרי בכל פעם.

2. אינדוקציה של senescence על ידי תרופות כימותרפיות בתאים סרטניים בתרבית

הערה: כל שלבי המניפולציה של התאים בסעיף זה צריכים להתבצע בארון בטיחות ביולוגית תוך שימוש בשיטות סטריליות. סעיף זה נכתב עבור סוגי תאים דבקים. ניתן להשתמש בתאי תרחיף עם שינויים מתאימים כאמור.

  1. לגדל קווי תאים סרטניים על פי הפרוטוקול הסטנדרטי של הספק או המעבדה שסיפקה את קווי התאים הספציפיים שבהם נעשה שימוש.
    הערה: תאי מעבר נמוך (p < 10) מועדפים בדרך כלל מכיוון שיהיו רמות נמוכות יותר של סנסנציה משוכפלת, כלומר רקע נמוך יותר, בדגימות תאים שלא טופלו.
  2. יום אחד לפני השראת סנסנציה על ידי תרופות, קציר תאים עם טריפסין-EDTA 0.25% (או לפי המומלץ). נטרול טריפסין על ידי הוספת נפח שווה של מדיום תרבית שלם, והעברת השעיית התא לצינור חרוטי סטרילי.
    הערה: שלב זה אינו נחוץ עבור תאי תרחיף.
  3. לספור את התאים בשיטת ההאציטומטר הסטנדרטית ולרשום תאים/מ"ל. תאי צלחת ב 1 × 10 3-10 × 103 תאים / ס"מ2 בכלי תרבית פלסטיק סטנדרטיים 6 בארות.
    הערה: צפיפות הציפוי האופטימלית תלויה בקצב ההתרבות של התאים ויש לקבוע אותה על-ידי המשתמש. התאים צריכים להיות בשלבי גדילה בטמפרטורה של כ-10%-20% בזמן הטיפול (כלומר, לאחר דגירה של 18-24 שעות לאחר הציפוי). הצפיפות ההתחלתית (תאים/מ"ל) של תאי ההשעיה צריכה להיקבע על-ידי המשתמש. לוחות של שש בארות מניבים בדרך כלל מספיק תאים סנסנטיים לכל באר עבור דגימת ניתוח ציטומטריה סטנדרטית אחת. אם ממיינים זרימה, יש להשתמש בשטח פנים גדול בהרבה (למשל, לוחות P150 מרובים) כדי לאפשר התאוששות של מספר מספיק של תאים סנסנטיים עבור בדיקות במורד הזרם (≥1 × 106).
  4. תאי דגירה מצופים למשך הלילה (18-24 שעות) באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 ותבנית לחות.
  5. טפלו בתאים המצופים באמצעות תרופות כימותרפיות מעוררות סנסנציה. כלול לפחות בקרה חיובית אחת, למשל, אטופוסיד (ETO) או בלומיצין (BLM). הכן בארות כפולות לכל תרופה. כלול ערכה אחת המטופלת ברכב בלבד כבקרה.
    הערה: עקומת מינון עבור כל חומר ניסיוני צריכה להיבדק על ידי המשתמש כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי עבור אינדוקציה של סנסנציה בקווי התאים שבהם נעשה שימוש.
  6. לדגור תאים במשך 4 ימים באינקובטור 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 ומחבת לחות כדי לאפשר את הופעת senescence. יש לבחון מדי יום את השינויים הצפויים במורפולוגיה באמצעות מיקרוסקופ אור.
    הערה: זמני הדגירה בין 3-5 ימים עשויים להתקבל בהתאם לקצב הופעת הסנסנציה. ניתן לשנות את המדיה ולהחיל מחדש את הסוכן (או לא), לפי הצורך, כדי לקדם תנאי גדילה בריאים תוך השגת אחוז מקובל של תאים סנסנטיים.
  7. לאחר הופעת senescence, לקצור את התאים על ידי הוספת טריפסין-EDTA 0.25% במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. כאשר תאים מנותקים לתוך ההשעיה, לנטרל טריפסין עם נפח שווה של מדיום שלם.
    הערה: שלב זה אינו נחוץ עבור תאים הגדלים בתרחיף. אם תבוצע צביעת סמן פני השטח, הימנעו משימוש בטריפסין-EDTA מכיוון שהוא יכול להרוס באופן זמני אנטיגנים על פני השטח על התאים. במקום זאת, נתקו בעדינות את המונו-שכבה באמצעות מגרד תאי פלסטיק סטרילי (או מגיב דיסוציאציה חלופי שנועד לשמר אנטיגנים על פני השטח).
  8. ספור את התאים בכל דגימה באמצעות המציטומטר. חשב את התאים/מ"ל עבור כל דגימה.
    הערה: ניתן להוסיף טריפאן כחול כדי להעריך את אחוז התאים המתים בשלב זה (כלומר, עקב טיפול תרופתי), אך מוות תאי ייקבע גם באמצעות צבע כדאיות פלואורסצנטי במהלך תהליך העבודה של צביעת DDAOG.
  9. Aliquot ≥0.5 × 106 תאים לכל דגימה לתוך צינורות microcentrifuge 1.7 מ"ל.
    הערה: יש לתקנן את מספר התאים לכל דגימה בכל הדגימות.
  10. צנטריפוגה את הצינורות במשך 5 דקות ב 1,000 × גרם במיקרוצנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנטנט.
    הערה: אם מיקרוצנטריפוגה בקירור אינה זמינה, ייתכן שיהיה מקובל לבצע צנטריפוגות בטמפרטורת הסביבה עבור סוגי תאים גמישים מסוימים.
  11. המשך לצביעת DDAOG בסעיף 4.

3. אינדוקציה של senescence על ידי תרופות כימותרפיות בגידולים שנקבעו בעכברים

הערה: אם תאי הגידול ימוינו באמצעות FACS, ודא סטריליות בכל שלב על-ידי עבודה בארון בטיחות ביולוגית ועבודה עם מכשירים, נהלים וריאגנטים סטריליים.

  1. צור מודלים של גידולי עכברים על ידי הזרקת תאים סרטניים באופן תת עורי, על פי שיטות סטנדרטיות (למשל, Appelbe et al.19).
    הערה: יש להתאים את מספר התאים הסרטניים שיש להזריק, את מקום ההזרקה ואת זן העכבר המתאים לכל פרוטוקול. כאן, תאי B16-F10 הוזרקו תת עורית ב 1 × 106 תאים ב 0.1 מ"ל של מלוחים (1 × 107 תאים / מ"ל).
    1. ודא כי הכדאיות של תאים באמצעות כחול טריפאן הוא >90% לפני ביצוע זריקות. הרדימו את העכברים עם איזופלורן.
    2. מרדימים נקבות C57/BL6 בנות 6-7 שבועות בתערובת של 3% איזופלורן ואוויר ומתחזקות בתנאים אלה בתא אינדוקציה הממוקם בתוך ארון בטיחות ביולוגית סטרילי. אשר הרדמה על ידי צביטה עדינה של כף הרגל של העכבר. יש למרוח משחה וטרינרית סטרילית על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות של הקרנית במהלך ההליך. במהלך ההליך, לשמור על טמפרטורת הגוף של העכבר באמצעות מנורת חימום.
    3. בעבודה בתוך ארון בטיחות ביולוגית סטרילי, הסר את העכבר מתא האינדוקציה והנח אותו במגע עם חרוט אף המספק אספקת איזופלורן של 3%. יש לגלח את אזור האגף במקום ההזרקה באמצעות סכין גילוח חשמלי נקי. ערבבו את מתלי התאים המוכנים לזמן קצר על ידי היפוך ידני של הצינור ממש לפני ההזרקה, והזריקו את מתלה התא באופן תת-עורי לתוך האגף המגולח באמצעות מזרק סטרילי של 0.5 מ"ל המצויד במחט סטרילית של 27 גרם. הסר את העכבר ממכסה המנוע והעבר אותו לכלוב ההתאוששות.
    4. בכלוב ההתאוששות, עקוב אחר הסימנים החיוניים של העכברים ברציפות עד שהם חזרו להכרה מספקת כדי לשמור על יציבות עצם החזה, להדגים את רפלקס הימין, והם מסוגלים לנוע בבטחה בכלוב. אין להשאיר עכברים ללא השגחה או להחזיר בעלי חיים שעברו חיסון תאי גידול לחברתם של בעלי חיים אחרים עד להחלמתם המלאה. עקוב אחר כל העכברים המחוסנים מדי יום לירידה במשקל, פעילות מופחתת / ניידות ותסמינים נוירולוגיים; להרדים עכברים המציגים תסמינים חמורים בכל קטגוריה. לעכברים המציגים תסמיני כאב לאחר החיסון, יש לתת בופרנורפין (0.1-0.2 מ"ג/ק"ג) פעם אחת באופן תת-עורי.
      הערה: יש להרדים עכברים המפגינים כאב מתמשך לאחר בופרנורפין.
  2. החל 5-7 ימים לאחר חיסון תאים סרטניים, למדוד את צמיחת הגידול עם קליפרים כל 2-3 ימים. ליזום טיפול פרוזנסנטי כאשר הגידול הגיע 50 מ"מ 3 ± 10 מ"מ 3 נפח.
    הערה: בעבודה זו, מינונים של דוקסורוביצין הידרוכלוריד (DOX) או דוקסורוביצין ליפוזומלי (PLD) בדרגה של 10 מ"ג/ק"ג ניתנו בהזרקת נתרן כלורי (USP) ב-0.9%. תרופות הוזרקו תוך צפק 3x, אחת ל 5 ימים, החל כאשר הגידולים הגיעו 50 מ"מ 3 ± 10 מ"מ3. עכברים התאוששו במשך 7 ימים לאחר הטיפול הסופי כדי לאפשר את הופעת TIS בגידולים. יש לייעל את מינוני האינדוקציה של Senescence ואת התנאים לטיפולים אחרים ו/או למודלים של גידולים.
  3. לאחר 7 ימים לאחר הטיפול התרופתי הסופי, להקריב את העכברים על ידי מנת יתר של CO2 ונקע צוואר הרחם או שיטות מאושרות אחרות בהתאם להנחיות העבודה של חיות מעבדה. הבלו את הגידולים ואסוף אותם בצינורות סטריליים או צלחות 6 בארות מלאות במדיום גידול RPMI סטרילי (כדי לשמר את הכדאיות במהלך העיבוד).
    הערה: אם מבצעים בדיקה היסטולוגית (למשל, X-Gal או אימונוהיסטוכימיה), ניתן לחתוך גידולים כאן, כאשר חצי הקפאה ב-O.C.T. מטמיעה בינוני וקריוקציה באמצעות הליכים סטנדרטיים להיסטולוגיה של רקמות קפואות. מחצית הגידול הנותרת צריכה להניב חומר רב לדיסוציאציה וכתמת DDAOG.
  4. מעבירים גידול אחד לצלחת פלסטיק P100 המכילה 5 מ"ל של מדיום RPMI. טחנו את הגידול לחתיכות באמצעות אזמל.
  5. העבר 5 מ"ל של ההשעיה של חתיכות הגידול המכילות תאים מרחפים ופסולת לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. השתמש בקצה הרחב יותר של פיפט סרולוגי של 25 מ"ל להעברת מתלה זה אם קיימת פסולת גדולה. שטפו את התבנית בנפח נוסף של RPMI סטרילי לאיסוף חומרים. מכסים ומניחים את הצינור החרוטי על הקרח.
  6. חזור על שלבים 3.45-3.5 עבור הגידולים הנותרים. יש להשתמש בצלחת ואיזמל נפרדים לכל גידול כדי למנוע זיהום צולב, או לשטוף היטב עם PBS בין הגידולים. יש להשתמש ב-5 מ"ל של מדיום טרי לטחינת כל גידול.
  7. הכן את פתרון הדיסוציאציה של הגידול: 20 מיקרוגרם / מ"ל ליבראז TL + 100 מיקרוגרם / מ"ל DNAse I במדיה RPMI-1640 (ללא FBS).
    הערה: קיימות פורמולציות יעילות רבות עבור פתרונות דיסוציאציה של גידולים ויכולות לכלול מגוון אנזימים ורכיבים אחרים מיצרנים שונים. ריכוזים אופטימליים של רכיבים יכולים להשתנות מאוד בין סוגי גידולים. אם תאי דם אדומים נמצאים מאוד בגידול, תזה של תאי דם אדומים עשויה להתבצע בנוסף; אם תאים מתים הם בעיה, ניתן להשתמש בערכת הסרת תאים מתים. מומלץ מאוד למשתמש לקבוע באופן עצמאי תנאי דיסוציאציה אופטימליים של הגידול המספקים כדאיות גבוהה ונוכחות נמוכה של תאים מזהמים, חומר חיבור ופסולת.
  8. צנטריפוגה כל דגימות הגידול בצינורות חרוטיים במשך 5 דקות ב 1,000 × גרם (4 מעלות צלזיוס). הסר את הסופרנטנט.
  9. הוסף 1-5 מ"ל של תמיסת דיסוציאציה של הגידול לכל דגימת גידול, בהתאם לנפח חומר הגידול. ודא שיש 1-2 מ"ל עודף של כדור חומר הגידול בצינור. מערבולת במהירות מתונה לערבוב.
  10. מניחים את הדגימות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם סיבוב מהיר למשך 45 דקות. מערבולת לזמן קצר כל 15 דקות.
  11. סנן כל דגימה דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל. אם הדגימות צמיגות מכדי לעבור דרך המסנן, הוסף 10 מ"ל של RPMI-1640 בינוני כדי לדלל. שטפו את המסננים במדיום RPMI כדי לאסוף את שאריות התאים.
  12. השתמש בהמציטומטר כדי לספור את התאים/מ"ל עבור כל דגימה.
  13. Aliquot שני או יותר שכפולים של 5 × 106 תאים לכל דגימת גידול.
  14. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 1,000 × גרם (4 מעלות צלזיוס). הסר את הסופרנטנט.
  15. (אופציונלי) הקפיא את דגימות הגידול להכתמת DDAOG מאוחרת יותר אם תרצה בכך.
    1. יש לתלות מחדש את גלולת תאי הגידול המנותקת במדיום שימור בהקפאה: 50% FBS, 40% RPMI-1640, 10% DMSO, מוכן בתנאים סטריליים ב 5 × 106 תאים / מ"ל.
    2. Aliquot 1 מ"ל של השעיית התא לתוך כל cryovial.
    3. מקפיאים את הקריוביאלים למשך 24 שעות במיכל הקפאת תאי איזופרופנול בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס; לאחר מכן, העבר ל- cryostorage חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך יותר (>1 שבוע).
    4. כאשר רוצים להכתים, הפשירו את הקריביאלים על הקרח והמשיכו לצביעת DDAOG בסעיף 4.
      הערה: גידולים מסוימים עשויים שלא להישאר בני קיימא באמצעות שימור בהקפאה, ועמידות לתהליך זה צריכה להיות מוערכת על ידי המשתמש עבור מודל הגידול של עניין.
  16. המשך לסעיף 4 לצביעת DDAOG.

4. צביעת DDAOG של SA-β-Gal בדגימות תאים או גידולים

  1. יש לדלל מלאי של 1 mM Bafilomycin A1 ב-1:1,000x למדיום DMEM (ללא FBS) לקבלת ריכוז סופי של 1 μM.
  2. הוסף תמיסת Baf-DMEM מוכנה לדגימות כדורי התא (משלב 2.11 או שלב 3.16) לקבלת ריכוז של 1 × 106 תאים למ"ל.
    הערה: לדוגמה, אם אתה משתמש ב- 0.5 × 106 תאים לדגימה, הוסף 0.5 מ"ל של Baf-DMEM. עבור גידולים, 5 × 106 תאים יכולים להיות מוכתמים ב 5 מ"ל של Baf-DMEM.
  3. דגירה במשך 30 דקות ב-37°C (ללא CO2) על סיבוב / שייקר שנקבע במהירות איטית.
    הערה: הימנעו מאינקובטורים של CO2 לתהליך הצביעה, מה שעלול להחמצה של תמיסות ובכך להפריע לצביעת Baf ו-DDAOG.
  4. ללא שטיפה, הוסיפו את תמיסת המלאי DDAOG (5 מ"ג/מ"ל) בטמפרטורה של 1:500x (10 מיקרוגרם/מ"ל סופית) לכל דגימה. פיפטה לערבוב. יש להחליף על רוטטור/שייקר בטמפרטורה של 37°C (ללא CO2) למשך 60 דקות. יש להגן מפני אור ישיר.
  5. צנטריפוגה את הצינורות במשך 5 דקות ב 1,000 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנטנט.
  6. יש לשטוף עם 1 מ"ל של 0.5% BSA קר כקרח לכל צינור ופיפטה כדי לערבב. צנטריפוגה את הצינורות במשך 5 דקות ב 1,000 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס ולהסיר את supernatant. חזור על שלב זה 2x כדי לשטוף היטב את התאים. הסר את הסופר-נטנט והמשך.
    הערה: חשוב לבצע את שלבי השטיפה בשלב 4.6 כדי להסיר DDAOG, אשר יכול להפגין פליטה פלואורסצנטית לא רצויה (460/610 ננומטר).
    הערה: אם יש צורך במערכת החיסון עבור סמני פני התא, המשך לסעיף 5 להלן.
  7. (אופציונלי) קיבוע ואחסון של תאים מוכתמים DDAOG לניתוח מאוחר יותר
    1. הוסיפו 0.5 מ"ל של פרפורמלדהיד קר כקרח 4% פרפורמלדהיד לכל דגימה שטופה. פיפטה לערבוב.
    2. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. לשטוף את התאים 2x עם 1 מ"ל של PBS.
    4. אחסן את הדגימות למשך עד שבוע אחד בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לפני ניתוח ציטומטריה של זרימה.
      הערה: עבור דוגמאות קבועות, דלג על שלב 4.8.
  8. יש לדלל את מלאי Calcein Violet 450 AM (1 mM) ב-1:1,000x ל-1% BSA-PBS (1 μM סופי). הוסף 300 μL (עבור דגימות תאים בתרבית) או 1,000 μL (עבור דגימות גידול) לכדורי התאים השטופים משלב 4.6. דגירה במשך 15 דקות על קרח בחושך.
  9. המשך להגדרת ציטומטריה של זרימה (סעיף 6).

5. (אופציונלי) חיזוק חיסוני לסמני פני התא בשילוב עם DDAOG

הערה: כמו בכל ניסוי ציטומטריה של זרימה, יש להכין דגימות בקרה מוכתמות בודדות עם DDAOG בלבד ונוגדן פלואורסצנטי בלבד כדי לקבוע crosstalk (אם בכלל) על פני תעלות פלואורסצנטיות. אם crosstalk הוא ציין, פיצוי ציטומטריה זרימה סטנדרטית צריך להתבצע20.

  1. השהה את כדורי התא שהתקבלו בשלב 4.6 ב- 100 μL של חיץ מכתים (1% BSA ב- 1x PBS).
  2. הוסף את מגיב חסימת קולטן Fc המתאים למין התא (עכבר או אדם) בטיטרציה המומלצת על ידי היצרן. דגירה במשך 10 דקות ב 24 מעלות צלזיוס.
  3. יש להוסיף נוגדנים מצומדים לפלואורופור בטיטרציה המומלצת על ידי היצרן (או נקבעת על ידי המשתמש). דגירה במשך 20 דקות על קרח, מוגן מפני אור.
  4. צנטריפוגה את הצינורות במשך 5 דקות ב 1,000 × גרם ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנטנט.
  5. יש לשטוף עם 1 מ"ל של מאגר כביסה קר כקרח (0.5% BSA-PBS) לכל צינור ופיפטה כדי לערבב. צנטריפוגה את הצינורות במשך 5 דקות ב 1,000 × גרם ב 4 מעלות צלזיוס ולהסיר את supernatant. חזור על שלב זה 2x כדי לשטוף היטב את התאים.
  6. יש לדלל 1 mM Calcein Violet 450 AM בשעה 1:1,000x ל-1% BSA-PBS. יש להוסיף 300 μL לכדורי התא השטופים משלב 5.5. דגירה במשך 15 דקות על קרח בחושך.
  7. המשך לניתוח ציטומטריה של זרימה (סעיפים 6-7).

6. הגדרת ציטומטר זרימה ואיסוף נתונים

  1. העבר את דגימות התאים לצינורות התואמים למכשיר הציטומטריה של הזרימה. מניחים את הצינורות על קרח ושומרים עליהם מוגנים מפני אור.
    הערה: אם נצפים אגרגטים במתלי התאים, מעבירים את המתלה דרך מסננות תאים של 70-100 מיקרומטר לפני הניתוח. אין להשתמש במסננים של 40 מיקרומטר מכיוון שהם יכולים להוציא חלק מהתאים הסנסנטיים הגדולים יותר.
  2. בתוכנה המוזכרת (ראה טבלת החומרים), פתח את העלילות הבאות: 1) FSC-A לעומת תרשים נקודה SSC-A, 2) היסטוגרמה של ערוץ סגול, 3) ערוץ אדום רחוק (למשל, APC-A) לעומת ערוץ ירוק (למשל, FITC-A) מתווה נקודה.
    הערה: ניתן להשתמש גם בעלילות אי-הכללה כפולות ובהיסטוגרמות חד-ערוציות, אך הן אינן נדרשות בהחלט.
  3. ייזום רכישת נתוני ציטומטר.
    1. הנח את דגימת הבקרה לרכב בלבד מוכתמת ב- DDAOG על פתח הכניסה. במהירות צריכה נמוכה, להתחיל לרכוש נתונים לדוגמה.
    2. התאם את מתחי FSC ו- SSC כך ש- >90% מהאירועים ייכללו בעלילה. אם התאים אינם מתאימים היטב לחלקה, הנמיכו את הגדרת קנה המידה של השטח ל-0.33-0.5 יחידות.
    3. הסר את דוגמת הרכב בלבד מבלי להקליט נתונים.
    4. (אופציונלי) הוסף טיפה אחת של מיקרוספרות כיול קשת לצינור ציטומטר עם 1 מ"ל של PBS. הנח את הצינור על יציאת הכניסה של הציטומטר. התחל לרכוש נתונים לדוגמה.
    5. התאם את מתחי התעלה הסגולה, הירוקה והאדומה הרחוקה כך שהשיא העליון של מיקרוספרה קשת בענן יהיה בטווח של 104-10 5 יחידות של פלואורסצנציה יחסית בכל ערוץ וכל הפסגות מופרדות היטב בכל ערוץ. שיא של 10,000 אירועים. הסר את הצינור.
  4. הנח את דגימת הבקרה החיובית (לדוגמה, BLM, ETO) מוכתמת ב- DDAOG על יציאת הכניסה. במהירות נמוכה, לרכוש נתונים לדוגמה. התבונן באירועים בערוצים FSC, SSC, סגול, ירוק ואדום רחוק כדי להבטיח שלמעלה מ-90% מהאירועים כלולים בכל המגרשים. חפש עלייה באות המיקוד האוטומטי וה-DDAOG לעומת שליטה ברכב בלבד.
  5. אם אתה משתמש בציטומטר מיון, התחל מיון בשלב זה.
    1. למטרות שמירת רשומות, רשום 10,000 תאים עבור דגימת הבקרה וכל דגימה ממוינת.
    2. מיין את כמות התאים הרצויה (≥1 × 106 מתאים בדרך כלל) לצינור איסוף המתאים למכשיר עם מדיום תרבית של 3-5 מ"ל.
    3. לאחר המיון, המשך לתרבות או ניתוח במורד הזרם.
    4. דלג לסעיף 7 לניתוח שגרתי של דגימות ממוינות.
  6. אם משתמשים בנוגדנים פלואורסצנטיים, מטב את מתחי התעלה כאן באמצעות הדגימות הלא מוכתמות, המוכתמות הבודדות והמוכתמות הכפולות שהוכנו בסעיף 5.
    הערה: עבור ציטומטר הזרימה המכויל המשמש כאן, מתחי התעלה האופטימליים ירדו בדרך כלל בין 250 ל- 600 (טווח ביניים), אך המתחים האופטימליים וטווחי מתחי התעלה ישתנו בין מכשירים. הימנע משימוש במתחים בטווחים נמוכים או גבוהים מאוד, שעלולים לדכא אות או להגביר רעש.
  7. לאחר השלמת שלבים 6.1-6.5 וביצוע התאמות להגדרות הציטומטר לפי הצורך, רשום נתונים עבור כל הדגימות. ודא שההגדרות נשארות אחידות עבור כל ההקלטות לדוגמה. תעד ≥10,000 אירועים לכל דגימת תא בתרבית או ≥100,000 אירועים לכל דגימת תא גידול.
    הערה: למרות שניתן לבצע gating וניתוח באמצעות תוכנה לרכישת נתונים (לדוגמה, FACSDiva), זרימת עבודה מלאה של gating וניתוח שתתבצע לאחר הרכישה באמצעות תוכנת ניתוח נפרדת (FlowJo) מתוארת בסעיף 7 להלן. ניתוח לאחר הרכישה עדיף לקצר את הזמן בתחנת העבודה ציטומטר ולנצל כלים נוספים הכלולים בתוכנת הניתוח הייעודית.
  8. שמור נתונים לדוגמה בתבנית קובץ .fcs. ייצא את הקבצים למחשב תחנת עבודה המצויד בתוכנה לניתוח ציטומטריה של זרימה (לדוגמה, FlowJo). המשך לסעיף 7.

7. ניתוח נתוני ציטומטריה של זרימה

הערה: זרימת העבודה המוצגת משתמשת בתוכנת FlowJo. ניתן להשתמש בתוכנה חלופית לניתוח נתוני ציטומטריה של זרימה אם השלבים העיקריים המתוארים בסעיף זה מתבצעים באופן דומה.

  1. באמצעות תוכנת FlowJo, פתח קבצי נתונים .fcs משלב 6.7.
  2. פתח את חלון הפריסה.
  3. גרור ושחרר את כל הדוגמאות לחלון הפריסה.
  4. שער תאים קיימא.
    1. תחילה לחץ פעמיים על הנתונים לדוגמה עבור פקד הרכב בלבד כדי לפתוח את חלון הנתונים שלו.
    2. הצג את הנתונים באופן חזותי כהיסטוגרמה של ערוץ סגול. זהה את התאים בני הקיימא המוכתמים על-ידי CV450 בהתבסס על הפלואורסצנטיות הבהירה יותר שלהם מאשר התאים המתים.
    3. צייר שער באמצעות כלי ההיסטוגרמה בעלת השער הבודד כדי לכלול תאים בני קיימא בלבד. תן שם לשער קיימא.
    4. לאחר מכן, מחלון פריסת הדגימה, גרור את השער בר-הקיימא אל דגימות התאים האחרות כדי להחיל את השער באופן אחיד.
    5. בחלון הפריסה, הצג באופן חזותי את כל הדוגמאות כהיסטוגרמות של ערוץ סגול (כדאיות). ודא כי גידור תאים בר קיימא מתאים על פני דגימות לפני שתמשיך; אם לא, בצע התאמות לפי הצורך.
      הערה: צביעת כדאיות יכולה להציג שינויים בין טיפולים או גידולים.
  5. שער תאים סנסנטיים.
    1. לחץ פעמיים על נתוני התא המגודרים עבור בקרת הרכב בלבד כדי לפתוח את חלון הנתונים שלה.
    2. הצג את הנתונים באופן חזותי כמתווה נקודה עבור ערוץ אדום רחוק (DDAOG) לעומת ערוץ ירוק (AF).
    3. צייר שער באמצעות כלי חיתוך המלבן כדי לכלול <5% מהתאים DDAOG+ ו- AF+ (הרביע הימני העליון). תן שם לשער.
    4. לאחר מכן, מחלון פריסת הדגימה, גרור את השער הסנסנטי אל תת-הקבוצות הקיימות של דגימות התאים האחרות כדי להחיל את השער באופן אחיד.
    5. לתוך חלון הפריסה, גרור ושחרר את כל קבוצות המשנה של התאים הקיימות המגודרות בסעיף 7.4. הצג באופן חזותי את כל הדוגמאות הקיימות כעלילות נקודה אדומות רחוקות (לדוגמה, APC-A) לעומת עלילות נקודה של ערוץ ירוק (לדוגמה, FITC-A).
    6. ודא שהשער הסנסנטי המשורטט בשלב 7.5.3 גלוי בכל המגרשים ושהשער לבקרת הרכב בלבד מציג ≤5%-10% תאים סנסנטיים.
  6. לאחר שאחוז התאים הסנסנטיים נקבע באמצעות השלבים לעיל, הצג את הנתונים שהתקבלו באמצעות חלקות FlowJo, שסוכמו בטבלת נתונים ו/או נותחו סטטיסטית באמצעות תוכנה סטנדרטית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מספר ניסויים בוצעו כדי להדגים את יכולת ההשוואה של DDAOG ל-X-Gal ו-C12-FDG לזיהוי סנסנציה על ידי SA-β-Gal. ראשית, X-Gal שימש להכתמת תאי מלנומה מסוג B16-F10 המושרים על-ידי ETO (איור 2A). צבע כחול עז התפתח בתת-קבוצה של תאים שטופלו ב-ETO, בעוד שתאים אחרים הפגינו פחות כתמים כחולים עזים. המורפולוגיה הוגדלה ברוב התאים שטופלו ב-ETO. צביעת תאים שטופלו ב-ETO במצע פלואורסצנטי SA-β-Gal C12-FDG (ירוק) או DDAOG (אדום רחוק) הדגימה דפוסי צביעה ושינויי עוצמה דומים לאלה של X-Gal (איור 2B). עם זאת, פליטת C12-FDG ירוקה חפפה למיקוד אוטומטי תאי (איור 2C), שידוע כי הוא מצטבר בתאים סנסנטיים17. לעומת זאת, AF היה זניח בטווח הפליטה האדום הרחוק של DDAOG.

במקום להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להבקיע ולספור תאים סנסנטיים, היה כדאי יותר לנצל את יכולות התפוקה הגבוהה של ציטומטר זרימה כדי להשיג נתונים עבור אלפי תאים לכל דגימה בזמן קצר (<5 דקות לדגימה). ראשית, סדרה של פרמטרים סטנדרטיים של הגדרת ציטומטריה של זרימה יושמו כדי להבטיח קבלת נתונים אופטימלית (איור 3). בעקבות גישה טיפוסית, נקבעו פרמטרים של פיזור אור כדי להמחיש את הנפח (פיזור קדימה, FSC) והגרעיניות (פיזור צדדי, SSC) של תאים (איור 3A). כאן ציינו את המגמה של נפח מוגבר של תאים שטופלו ב-ETO, מה שהסכים עם המורפולוגיה המוגדלת שנצפתה בדרך כלל עבור תאים סנסנטיים באמצעות מיקרוסקופיה. היה צורך בהפחתה בהגדרות ברירת המחדל של שינוי קנה המידה של השטח (ל-0.33-0.50 יחידות, תלוי בסוג התא ובטיפול) כדי לדמיין יותר מהתאים הגדולים יותר בעלילה. בחלק מקווי התאים/טיפולים ניכרה גם רמת גרעיניות מוגברת (SSC) (נתונים שלא הוצגו). בסך הכל, הערכת הפיזור שימשה כשלב בקרת איכות כדי לוודא שנתוני פיזור התאים הופיעו כצפוי, פסולת תאים מוגזמת לא הייתה נוכחת, ותאים עובדו דרך הציטומטר בקצבי זרימה מתאימים (~100-1000 תאים לשנייה). כשלב בקרת איכות המשמש רק להתקנת מכשירים, לא בוצע כאן ניתוח או ניתוח.

שלב שני (אופציונלי) במערך הציטומטריה של זרימה היה לנתח בקצרה דגימה של חלקיקי כיול "קשת" זמינים מסחרית כדי להבטיח שמתחי הגילוי הפלואורסצנטיים הוגדרו בטווחים מקובלים (איור 3B). הפסגה הבהירה ביותר נקבעה בין 1 × 104 יחידות ו-1 × 105 יחידות של עוצמה פלואורסצנטית יחסית בכל ערוץ, עם פסגות מוגדרות בבירור בעוצמה נמוכה יותר, הפרדה מספקת בין כל פסגה, וללא חפיפה של פסגות שכנות. דגימת בקרה של 10,000 מיקרוספרות נרשמה באמצעות הגדרות מתח אלה. לאחר מכן נעשה שימוש במיקרוספרות באופן זה בכל מפגש ציטומטריה כדי לשפר את אחידות רכישת הנתונים במהלך הפרוטוקול.

לאחר מכן, דגימות של תאים שטופלו ברכב בלבד או ב-ETO הודגמו בכל תעלה פלואורסצנטית, ונקבעו שערים. שערי הכדאיות של התאים נקבעו על סמך האות של כתם הכדאיות CV450 בתעלה הסגולה (איור 3C). תאים שטופלו ברכב בלבד הפגינו כדאיות של 88%, ותאים שטופלו ב-ETO הפגינו כדאיות של 75% (בדגימת התאים הסופית; תאים מתים נוספים ככל הנראה הוסרו בתחילה במדיית התרבית שהושלכה והתפוררו מכנית במהלך תהליך ההכתמה). לאחר מכן, תאים מגודרים בני קיימא הודגמו בערוצי הפליטה הירוקים (איור 3D) והאדומים-רחוקים (איור 3E). שערים עבורAF HI ירוק ו-DDAOGHI אדום רחוק נקבעו על <5% מתאי הרכב בלבד, ושערים אלה יושמו לאחר מכן על תאים שטופלו ב-ETO. באמצעות גישה זו, נקבע כי 46% מהתאים שטופלו ב-ETO היו AF HI ו-33% היו DDAOGHI; ערכים אלה היו בטווח הצפוי בהתבסס על ספרות ומתוצאות של ניסויים משוכפלים רבים במעבדה שלנו. לאחר השלמת הגדרת הציטומטר, כל דגימות התאים בניסוי הופעלו באמצעות הגדרות רכישת נתונים זהות. התקבלו נתונים עבור 10,000 אירועים לכל מדגם.

נתוני הבדיקה המייצגים מוצגים באיור 4. תאי מלנומה של מורין B16-F10 או תאי אדנוקרצינומה של ריאה אנושית A549 שימשו כמודלים של קו תאים סרטניים. כל קו תאים טופל בחומר כימותרפי הידוע כגורם סנסנציה (ETO או BLM) למשך 4 ימים כדי לגרום לסנסנציה או לרכב בלבד. יתר על כן, הסוכן הסנוליטי הידוע ABT-26321 נוסף לתאים סנסנטיים מושרים במשך יומיים כדי להדגים את הספציפיות של גשושית DDAOG. ABT-263 רק דגימות הוכנו כבקרות נוספות. כאן, הנתונים מוצגים באופן חזותי כחלקות נקודה דו-ממדיות עם DDAOG (פליטת 670 ננומטר) לעומת מיקוד אוטומטי (525 ננומטר). זרימת העבודה מאיור 3 שימשה להתקנת ציטומטר, ושער TIS נקבע כך ש-<5% מתאי הרכב בלבד קיבלו ציון TIS. תוצאות שהשתמשו בתאי B16-F10 (איור 4A) הראו ש-ETO גרם ל-TIS ב-35% מתאי B16-F10 בני קיימא (בדומה לנתונים המקבילים המוצגים באיור 2D,E) והחומר הסנוליטי חיסל כמעט לחלוטין תאי TIS (<2%). בתאי A549 (איור 4B), BLM גרם ל-TIS ב-66% מהתאים בני הקיימא, ו-ABT-263 הפחית את האחוז ל-15%. ABT-263 לבדו לא היה רעיל לתאים לא מטופלים ומתרבים.

בנוסף, ביקשנו להראות כי צביעה משותפת של נוגדנים פלואורסצנטיים תואמת לבדיקת הסנסנציה של DDAOG כדי להקל על ההקרנה של סמני פני שטח הקשורים ל-TIS או חדשים. כאן, תאי מלנומה של עכבר B16-F10 טופלו שוב ב-ETO (או ברכב) הגורם ל-TIS במשך 4 ימים. לאחר מכן, התאים הוכתמו שניהם ב-DDAOG כדי להעריך TIS ובנוגדן פלואורסצנטי כדי לזהות את סמן פני השטח DPP422 הקשור ל-TIS (איור 5). נעשה שימוש באנטי-DPP4 המצומד ל-R-פיקוריתרין (PE), ואישרנו חפיפה זניחה של PE עם DDAOG ו-AF בציטומטר הזרימה שבו נעשה שימוש (איור משלים S2). היסטוגרמה של נתוני ערוץ PE (איור 5A) עבור >5,000 תאים בני קיימא הראתה ש-42% מהתאים שטופלו ב-ETO היו DPP4+ (תוך שימוש בדגימת הרכב בלבד כדי לקבוע את שער החיוביות). הדמיה של חלקות דו-ממדיות של נקודות עבור אותן דגימות (איור 5B,C) הצביעה על כך ש-44% מהתאים שטופלו ב-ETO היו חיוביים פעמיים עבור DDAOG (כלומר, senescent) ו-DPP4 לעומת 4% מתאי הרכב בלבד. נתונים אלה מראים כי צביעת תאים חיים עם נוגדנים לסמני פני השטח אפשרית בשילוב עם בדיקת הסנסנציה של DDAOG.

חששות פוטנציאליים מכל שיטת צביעת תאים חיים כוללים מוות תאי המתרחש במהלך פגישות ניתוח ממושכות (>1 שעות) וכיצד להכתים ולנתח דגימות בצורה היעילה ביותר על פני נקודות זמן רבות ושונות (בהפרש של עד ימים). קיבוע מבוסס ממס של תאים מוכתמים נותן מענה לשני החששות הללו, שכן ניתן לתקן דגימות ברגע שהן מוכתמות ואז לאחסן אותן במקרר עד לניתוח באצווה אחת יציבה בטמפרטורה. לכן, בדקנו אם תאים חיים המוכתמים ב-DDAOG יכולים להיות קבועים עם 100% מתנול או 4% פרפורמלדהיד (PFA) ומאוחסנים עד שבוע אחד בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. באופן לא רצוי, קיבוע מתנול הפחית את אות ה- DDAOG והפחית באופן משמעותי את המיקוד האוטומטי (נתונים שלא הוצגו); לפיכך, יש להימנע משימוש במתנול כממס קיבוע. עם זאת, קיבוע עם PFA היה הרבה יותר מוצלח, כפי שניתן לראות באיור 6 עבור תאים קבועים ב-4% PFA במשך 10 דקות לאחר הכתמה ב-DDAOG. בהשוואה לדגימות בקרה לא מתוקנות (איור 6A; לא מטופלות, 5% ו-BLM, 67% DDAOGHI AFHI), דגימות קבועות (איור 6B) הציגו רקע מעט גבוה יותר בתאים לא מטופלים (9%) וגם אחוז גבוה יותר של תאים שקיבלו ניקוד כ-senescent בתאים שטופלו ב-BLM (80%). השפעה זו נצפתה גם בדגימות קבועות שאוחסנו במשך הלילה (איור 6C; לא מטופל, 12% ו-BLM, 72%) ואוחסנו במשך שבוע אחד בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס (איור 6D; 14% ו-70%). למרות העלייה הקלה בפלואורסצנציה הנגרמת על ידי קיבוע PFA, האינדוקציה של senescence על ידי BLM עדיין ניכרה בכל הדגימות הקבועות לעומת הדגימה התואמת שלא טופלה. יתר על כן, התאים נותרו שלמים באחסון עם הידרדרות קלה בלבד עד יום 7, ולא נצפתה צבירה בעייתית. אנו מסיקים כי הנוחות של היכולת לתקן ולאחסן דגימות תאים לניתוח אצווה מאוחר יותר תצדיק לסבול את הרקע מעט גבוה יותר הנגרם על ידי קיבוע PFA, במיוחד בניסויים עם דגימות רבות או נקודות זמן.

אתגר נפוץ בחקר סנסנציה מבוססת תאים הוא התפרצות הטרוגנית של סנסנציה באוכלוסיות תאים. כאן אנו מראים ש-DDAOG יכול לשמש ל-FACS של תאים סנסנטיים בני קיימא, ושהתאים שנאספו שורדים בתרבית עבור מבחני מבחנה במורד הזרם (איור 7). כדי למיין תאים לפי FACS, תאים מטופלים ומוכתמים, כמתואר, וממוינים על-ידי ציטומטר זרימה בעל יכולת FACS באמצעות אסטרטגיית ה-DDAOG לעומת AF gating המוצגת כאן (איור 7A). מכיוון שלא נעשה כאן שימוש בבדיקת כדאיות עקב חששות רעילות ארוכי טווח, אנו ממליצים על פיזור מחמיר שיבוצע לפני גידת התאים הסנסנטיים הסופית (איור משלים S3) כדי לסלק פסולת חיובית כוזבת מהתאים שנאספו. אלה הם נהלי FACS סטנדרטיים שאמורים להיות מוכרים למשתמש מנוסה למדי וניתן לבסס אותם במהירות באמצעות תוכנה במכשיר (<10 דקות).

לאחר מיון דגימה של תאי A549 שטופלו ב-BLM, החזרנו את התאים לתרבית במנות מולטיוול סטנדרטיות למשך 5 ימים (n = 6 שכפולים) ב-10 × 10 תאים3 /ס"מ2. פקדים לא ממוינים היו מצופים באותה צפיפות, גודלו לצד, ותאים שלא טופלו וטופלו ב-BLM נכללו. תאים נצפו מדי יום; עבור תאים ממוינים, לא נצפה מוות תאי משמעותי או חזרה להתרבות. תאים ממוינים נשארו דלילים (כלומר, לא מתרבים) במשך 5 ימים בתרבית, בעוד שתאים שלא טופלו ותאים שטופלו ב-BLM הפכו למפגשים כפי שמוצג. ביום החמישי, התאים תוקנו ב-PFA והוכתמו עבור סמני מורפולוגיה והתפשטות (איור 7B). המורפולוגיה המוגדלת האופיינית של תאים ממוינים התגלתה על ידי צביעת פלואורסצנטי פלואידין של אקטין נימה, כאשר DAPI מכתים כדי להראות גרעינים מוגדלים. התאים הממוינים היו בקוטר גדול מאוד (>10 מיקרומטר) עם מראה מעוגל אופייני. כצפוי, צביעת נוגדנים של Ki67 גילתה אובדן מוחלט של סמן ההתפשטות בדגימה הממוינת לעומת אובדן חלקי בדגימה הלא ממוינת שטופלה ב-BLM, ורמות נורמליות של Ki67 נצפו בתאים רבים בדגימה הלא ממוינת-לא ממוינת. לפחות שלוש תמונות צולמו בכל באר באמצעות הגדרות הדמיה אחידות על פני דגימות. מוצגות תמונות מייצגות (איור 7B).

לבסוף, הערכנו אם ניתן לזהות תאים סנסנטיים הנובעים מגידולים שהוקמו בעכברים שטופלו בתרופות כימותרפיות באמצעות DDAOG. גידולי מלנומה B16-F10 הושרה באגף של עכברי C57/BL6, שטופלו שלוש פעמים (כלומר, כל 5 ימים) עם תמיסת מלח בלבד (איור 8A), DOX (איור 8B) או PLD (איור 8C). לאחר הטיפול השלישי, העכברים התאוששו במשך 7 ימים כדי לאפשר את הופעת הסנסנציה ולאחר מכן הוקרבו ונכרתו גידולים. הגידולים היו חצויים, כאשר מחציתם שימשו להכנת שקופיות רקמה קפואות לצביעת X-Gal (איור 8) ומחציתם נותקו לתרחיפים חד-תאיים והוכתמו ב-DDAOG (איור 8 ואיור משלים S4). צביעת X-Gal ברקמות הייתה חלשה למדי למרות משך הכתמים הארוך (72 שעות), אך כתמים כחולים ניכרו בגידולי DOX ו-PLD לאחר בדיקה מדוקדקת, במיוחד בגידולים שגם קיבלו ציון חיובי לסנסנציה על ידי בדיקת זרימת DDAOG (איור 8B,C). לפחות שלוש תמונות צולמו בכל שקופית רקמה ומוצגות תמונות מייצגות.

בהשוואה ל-X-Gal, DDAOG הייתה דרך רגישה ומדויקת יותר לכמת סנסנציה בגידולים (איור 8). לצורך ניתוח גידול DDAOG, הגידול שטופל במי מלח עם הרקע הפלואורסצנטי הגבוה ביותר שימש לקביעת שער הסנסנציה על <5%, כך שהגידולים האחרים שטופלו במי מלח לא קיבלו ציון של מעל 5% סנסנציה. שער סנסנציה זה הוחל לאחר מכן באצווה על תאים בני קיימא מגודרים מכל הגידולים. שני החומרים הכימותרפיים גרמו לסנסנציה בחלק מהגידולים (שניים מתוך חמישה גידולים עבור DOX, שלושה מתוך חמישה עבור PLD), כאשר אחוזי תאי הגידול הסנסנטיים נעו בין 3% ל-36% לכל גידול. חלקות נתוני ציטומטריה עבור כל 15 הגידולים מוצגות באיור משלים S4, וסיכום של נתוני ציטומטריה של גידולים מוצג באיור 8D (n = 5; (*) p < 0.05 לעומת קבוצת ביקורת עם תמיסת מלח בלבד לפי מבחן השונות F). אנו מסיקים כי ציטומטריה של זרימת DDAOG לעומת AF היא שיטה מקובלת לסינון גידולים וחומרים כימותרפיים להשראת סנסנציה in vivo.

Figure 2
איור 2: DDAOG הוא כתם רגיש וספציפי עבור SA-β-Gal. (A) צביעה קונבנציונלית עבור SA-β-Gal באמצעות X-Gal המציגה תאי מלנומה מסוג B16-F10 שלא טופלו (משמאל) או שטופלו ב-ETO (מימין). סנסציה המושרה על ידי ETO: תאים מציגים מורפולוגיה מוגדלת וכתמים כחולים עקב ביקוע של X-Gal על ידי SA-β-Gal מוגבה. פסי קנה מידה = 10 מיקרומטר. (B) צביעה פלואורסצנטית עבור SA-β-Gal בתאים שטופלו ב-ETO באמצעות C12-FDG (פליטת 515 ננומטר, ירוקה) או DDAOG (660 ננומטר, אדום). התפלגות הכתמים דומה עבור שתי הבדיקות, מה שמצביע על כך ש-DDAOG מזהה SA-β-Gal באופן דומה ל-C12-FDG. (C) הערכה של AF בתאים לא מוכתמים, שטופלו ב-ETO, בערוץ הפליטה הירוק (פליטה של 525 ננומטר, משמאל) או באדום רחוק (660 ננומטר, מימין). AF מליפופוסצין גבוה בתעלת הפליטה הירוקה וזניח בערוץ האדום הרחוק. זמן חשיפה = 2,000 אלפיות השנייה עבור כל תמונה. סרגלי קנה מידה = 10 מיקרומטר. איור זה נדפס מחדש מתוך פלור וקרון23. קיצורים: DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-גלקטוסייד; X-Gal = 5-ברומו-4-כלורו-3-אינדוליל-β-D-גלקטופירנוזיד; UNT = לא מטופל; ETO = אטופוסיד; AF = אוטופלואורסצנציה; C12-FDG = 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside; SA-β-Gal = בטא-גלקטוזידאז הקשור לסנסנציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: הגדרת קליטת נתונים של ציטומטר זרימה. (A) פיזור מייצג של התפלגות התאים. FSC-A הוא קריאה של נפח התא, ו- SSC-A מציין גרעיניות תאית. פאנל שמאלי, טיפול ברכב בלבד בתאי A549. פאנל ימני, טיפול ETO כדי לגרום לסנסנציה. שימו לב למגמה של הגדלת נפח התאים של תאים שטופלו ב-ETO, בהתאם למורפולוגיה המוגדלת הניכרת במיקרוסקופיה. (B) שימוש אופציונלי במיקרו-ספירות כיול פלואורסצנטיות "קשת" מסחריות של 5 שיאים כדי להגדיר את מתחי הגלאי של הציטומטר. בכל תעלה פלואורסצנטית שנעשה בה שימוש, יש להגדיר את השיא המרבי ≤1 x 105 יחידות פלואורסצנטיות יחסיות על ידי התאמת מתח גלאי הציטומטר בזמן שהדגימות פועלות. פאנל שמאלי, ערוץ BV421 (סגול); מרכז, ערוץ FITC (ירוק); מימין, ערוץ APC (אדום). חמש הפסגות הפלואורסצנטיות צריכות להציג ריווח שונה כפי שמוצג. (ג-ה) נתוני פלואורסצנציה חד-ערוציים מייצגים עבור (C) צביעת כדאיות באמצעות צבע CV450 סגול; (D) אוטופלואורסצנציה ירוקה של תאים; (E) אות אדום רחוק מ-DDAOG, המזהה SA-β-Gal. היסטוגרמה של צבע כהה יותר, טיפול ברכב בלבד; היסטוגרמה בצבע בהיר יותר, טיפול ETO. שערי אב מסומנים מעל כל חלקה. קיצורים: FSC-A = אזור פיזור-שיא קדימה; SSC-A = אזור פיזור צדדי; ETO = אטופוסיד; BV421-A = סגול מבריק 421 אזור שיא ערוץ; FITC-A = אזור שיא ערוץ איזותיוציאנט פלואורסצנטי; APC-A = אזור שיא ערוץ אלופיקוציאנין; AF = אוטופלואורסצנציה; DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-גלקטוסייד; VEH = רכב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: נתונים מייצגים עבור בדיקת ציטומטריה של זרימה . (A) תאי מלנומה מסוג מורין B16-F10 שטופלו ברכב (משמאל למעלה) בלבד, (מימין למעלה) ETO, (משמאל למטה) ABT-263 (1 μM) בלבד, או (מימין למטה) ETO בתוספת ABT-263. (B) A549 תאי אדנוקרצינומה של ריאה אנושית שטופלו ברכב (משמאל למעלה) בלבד, (מימין למעלה) BLM, (משמאל למטה) ABT-263 בלבד, או (מימין למטה) BLM בתוספת ABT-263. (א,ב) שערים מלבניים ברבעים הימניים העליונים של כל החלקות מגדירים תאים סנסנטיים (DDAOGHI AFHI). אחוז התאים הסנסנטיים (מתוך סך התאים בני הקיימא לכל דגימה) מצוין בכל עלילה. קיצורים: DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-גלקטוסייד; ETO = אטופוסיד; BLM = בלומיצין; VEH = רכב; TIS = סנסנציה הנגרמת על ידי טיפול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: צביעה משותפת של סמן פני שטח של תא לדוגמה עם בדיקת סנסנציה. (A) זיהוי חיסוני של סמן סנסנציה DPP4 על פני השטח של תאים בתרבית B16-F10 בני קיימא; כתום כהה, רכב בלבד; כתום בהיר, ETO. (ב,ג) לוחות מרכזיים וימניים: תאים המוכתמים במשותף ב-DDAOG וב-anti-DPP4:PE. DDAOG HI DPP4HI תאים כלולים בתוך שערים מלבניים המוצגים על המגרשים, ואחוז התאים החיוביים הכפולים לכל דגימה מצוין. מוצג: תאים מגודרים. קיצורים: DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-גלקטוסייד; ETO = אטופוסיד; VEH = רכב; DPP4 = דיפטידיל פפטידאז 4. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: קיבוע ואחסון לאחר הכתמה של דגימות תאים מוכתמים ב-DDAOG לצורך ניתוח מאוחר יותר. (A) בקרה, דגימות לא מתוקנות של תאי A549 חיים שלא טופלו (משמאל) או שטופלו ב-BLM (מימין) כדי לגרום לסנסנציה, ולאחר מכן הוכתמו ונותחו מיד באמצעות פרוטוקול DDAOG (ללא קיבוע, יום 0). (B) דגימות שהוכנו כמו ב-(A) ולאחר מכן תוקנו מיד ב-4% פרפורמלדהיד ונותחו (יום 0). (C) דגימות שהוכנו כמו ב-(A), תוקנו מיד ב-4% פרפורמלדהיד, ואוחסנו למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לפני הניתוח. (ד) דגימות שהוכנו כאמור ב-(א), תוקנו מיד ואוחסנו במשך 7 ימים לפני הניתוח. שערים מלבניים ברבעים הימניים העליונים של כל החלקות מגדירים תאים סנסנטיים (DDAOGHI AFHI). אחוז התאים הסנסנטיים מצוין בכל עלילה. קיצורים: TIS = סנסנציה הנגרמת על ידי טיפול; DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-גלקטוסייד; BLM = בלומיצין; AF = אוטופלואורסצנציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 7
איור 7: מיון ציטומטרי של זרימה ואימות של אוכלוסיות תאים סנסנטיים מועשרים. (A) נתוני מיון ציטומטריים של זרימה המציגים (משמאל) את הבקרה הלא מטופלת, המוכתמת ב-DDAOG, המשמשת להגדרת השער למיון תאים סנסנטיים (<5% תאים סנסנטיים באזור מגודר) ו(מימין) את הדגימה המוכתמת ב-BLM שהוכתמה ב-DDAOG שמונתה באמצעות שער המיון כפי שמוצג. (B) תמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית עבור תאים (עמודה שמאלית) המוכתמים בפלודין-אלקסה פלואור 647 (פסאודו-צבע כתום) כדי לזהות F-אקטין ו-DAPI (כחול) כדי לנטרל גרעינים, המדגימים מורפולוגיה מוגדלת של תאים סנסנטיים, או (עמודה ימנית) תאים מוכתמים בנוגדן ארנב Ki67 ואנטי-ארנב Alexa Fluor 594 כדי לזהות אובדן התפשטות בתאים סנסנטיים. שורה עליונה, תאים לא מטופלים ולא ממוינים. שורה מרכזית, תאים מטופלים BLM ותאים לא ממוינים. שורה תחתונה, תאים מטופלים BLM וממוינים. סרגלי קנה מידה = 10 מיקרומטר. קיצורים: TIS = סנסנציה הנגרמת על ידי טיפול; DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-גלקטוסייד; BLM = בלומיצין; UNT = לא מטופל; DAPI = 4',6-diamidino-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 8
איור 8: כימות של סנסנציה בגידולים מעכברים שטופלו בתרופות כימותרפיות. גידולי מלנומה B16-F10 הוקמו באגפים של עכברי C67BL/6, אשר טופלו לאחר מכן בשלוש מנות של (A) מלוחים, (B) DOX או (C) PLD כל 5 ימים ועוד שבוע אחד כדי לאפשר את הופעת הסנסנציה. הגידולים נכרתו והושחתו בחצי; מגלשות רקמה קפואות הוכנו ממחצית אחת לצביעת X-Gal (שורה עליונה), והחצי השני היה מנותק לצביעת DDAOG (שורה תחתונה). בתמונות מוכתמות X-Gal, תאים כחולים הם תאים סנסנטיים מסוג SA-β-Gal HI , בעוד שאזורים חומים נובעים ממלנין בגידולים. תוצאות מייצגות מוצגות עבור DOX ו- PLD משני גידולים לכל קבוצה שהפגינו סנסנציה. כל הגידולים המלוחים בלבד הפגינו זניחות. (D) כימות של סנסנציה בגידולים שטופלו בתרופות מעכברים. (*) p < 0.05 על ידי F מבחן שונות, n = 5 עכברים לכל קבוצה. פסי שגיאה, ממוצע ± SEM. קיצורים: DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-גלקטוסייד; DOX = דוקסורוביצין; PLD = דוקסורוביצין ליפוזומלי פגום; X-Gal = 5-ברומו-4-כלורו-3-אינדוליל-β-D-גלקטופירנוזיד; AF = אוטופלואורסצנציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור משלים S1: המבנה הכימי של גשושית DDAOG. DDAOG הוא צמד של 7-הידרוקסי-9H-(1,3-דיכלורו-9,9-דימתיל-אקרידין-2-אחד) ובטא גלקטוזיד. כאשר הוא נבקע על ידי בטא-גלקטוזידאז, מוצר המחשוף שעבר הידרוליזה מציג הסטת EMSSION פלואורסצנטית באדום רחוק של 50 ננומטר, המאפשרת את הזיהוי הספציפי שלו עם עירור מעל 600 ננומטר. קיצורים: DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-גלקטוסייד. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S2: סריקה ספקטרלית של DDAOG crosstalk עם ערוצים פלואורסצנטיים אחרים של ציטומטר הזרימה. כדי לזהות ערוצים זמינים לזיהוי נוגדנים פלואורסצנטיים, בוצעה סריקה ספקטרלית על ציטומטר זרימה של 4 לייזרים, 15 ערוצים באמצעות תאי A549 שטופלו ב-BLM והוכתמו ב-DDAOG (אדום) או לא מוכתמים (שחורים). נתונים בכל ערוץ של ציטומטר הזרימה נרכשו עבור 10,000 תאים. (A) ערוצי פליטה של לייזר 405 ננומטר: משמאל לימין, BV421, BV510, BV605, BV660 ו- BV711. ה-crosstalk שנצפה בתעלות BV605, BV660 ו-BV711 הופך אותם ללא מתאימים לצביעה משותפת עם DDAOG ללא פיצוי. BV421 ו-BV510 מתאימים לצביעה משותפת (שימו לב ש-BV421 משמש בדרך כלל לצביעת כדאיות). (B) ערוצי פליטה של לייזר 488 ננומטר: FITC ו- PerCP-Cy5. תצפית גבוהה על הצלבה נצפתה עבור ערוץ PerCP-Cy5. FITC מתאים לצביעה משותפת; עם זאת, שים לב שערוץ FITC משמש בדרך כלל בבדיקת DDAOG להערכת AF פליטה ירוקה. (C) ערוצי פליטה של לייזר 561 ננומטר: PE, PE-Dazzle 594, PE-Cy5, PE-Cy5.5 ו-PE-Cy7. תעלות PE ו-PE-Dazzle 594 מתאימות לזיהוי נוגדנים המסומנים בפלואורופורים אלה (PE מודגם לזיהוי DPP4 במחקר זה). (D) ערוצי פליטה של לייזר 640 ננומטר: APC, APC-H700 ו-APC-Cy7. אות ה-DDAOG של התאים הסנסנטיים נראה בערוץ ה-APC (47.8% סנסנטי). האות חופף לערוצי APC-H700 ו-APC-Cy7, מה שהופך אותם ללא מתאימים לצביעה משותפת ללא פיצוי ספקטרלי משמעותי. קיצורים: BLM = בלאומיצין; BV = סגול מבריק; FITC = פלואורסצין איזותיוציאנט; PerCP = חלבון פרידינין-כלורופיל; PE = פיקואריתרין; DZ594 = מסנוור 594; APC = אלופיוציאנין; AF = אוטופלואורסצנציה; DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-גלקטוסייד. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S3: אסטרטגיית גרירת תאים למיון FACS של תאים סנסנטיים. העברת תרחיף של תאים דרך ציטומטר FACS רגיש יכולה לדרוש גידור נוסף כדי להבטיח את טוהר המיון ואת פונקציונליות המכשיר האופטימלית. אסטרטגיה לדוגמה מוצגת כאן. אסטרטגיות אחרות אפשריות בהתאם להמלצות היצרן עבור ציטומטר FACS בשימוש. עמודה שמאלית, בקרת תאים המטופלת ברכב בלבד. עמודה ימנית, תאי A549 שטופלו ב-BLM כדי לגרום למיון סנסנציה. (A) FSC-A (נפח תא) לעומת SSC-A (גרעיניות תאים) של תאים שלמים. השער השלם מסלק את פסולת התאים מהדגימה הממוינת. (ב) FSC-A לעומת FSC-H טוהר גטינג; מסיר כפילים ופסולת. (C) SSC-A לעומת SSC-H טוהר גטינג; מסיר כפילים ופסולת. (D) גאטינג לאוכלוסיית בעלי העניין באמצעות ערוץ APC-A (עירור של 637 ננומטר, 670 ננומטר ± פליטת 30 ננומטר, המשמש ל-DDAOG) לעומת ערוץ FITC-A (עירור של 488 ננומטר, 530 ננומטר ± פליטת 30 ננומטר, המשמש ל-AF); מסיר ממצאי צביעה אפשריים. (E) גידור תאים סנסנטיים למיון סופי. קיצורים: FACS = מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה; BLM = בלומיצין; FSC-A = אזור פיזור-שיא קדימה; SSC-A = אזור פיזור צדדי; FSC-H = גובה שיא פיזור קדימה; SSC-H = גובה שיא פיזור צדדי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S4: צביעת ציטומטריה של זרימת DDAOG של גידולים. נתוני ציטומטריה של זרימה עבור ≥50,000 תאי גידול בני קיימא. שער תא סנסנטי, רביע ימני עליון של כל חלקה. אחוז תאי הגידול הסנסנטיים (של בני קיימא) מוצג בתוך השער. הטיפולים בגידולים כוללים (A) מי מלח בלבד; (ב) דוקס; ו-(ג) PLD. עכברים טופלו שלוש פעמים, אחת ל-5 ימים, עם 7 ימים להחלמה כדי לאפשר את הופעת הסנסנס לפני ההקרבה. נותחו חמישה גידולים בכל מצב. קיצורים: AF = autofluorescence; DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-גלקטוסייד; DOX = דוקסורוביצין; PLD = דוקסורוביצין ליפוזומלי פגום. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במהלך העשור האחרון לערך, ציטומטריה של זרימה הפכה לפלטפורמת בדיקה נפוצה יותר בחקר הסרטן בשל הפופולריות המתפתחת של אימונולוגיה של גידולים, פיתוח ציטומטרים של זרימה בעלות נמוכה יותר ושיפור מתקני מכשור משותפים במוסדות אקדמיים. בדיקות צבעוניות הן כעת סטנדרטיות, מכיוון שרוב המכשירים החדשים מצוידים במערכים אופטיים סגולים, כחולים-ירוקים ואדומים עד אדומים רחוקים. לפיכך, פרוטוקול DDAOG זה עשוי להיות תואם למגוון רחב של ציטומטרים של זרימה. כמובן, כל ציטומטר זרימה צריך להיות מוערך על ידי המשתמש. יש לנקוט משנה זהירות בעת הוספת פלואורופורים נוספים (למשל, נוגדנים פלואורסצנטיים מצומדים) לבדיקת DDAOG. הערכה של הצלבת פלואורופור בין ערוצים צריכה להתבצע באמצעות בקרות מוכתמות בודדות המוצגות באופן חזותי בכל הערוצים הרלוונטיים האחרים. אם נצפתה חפיפה, ניתן לבצע פיצוי ספקטרלי20 לתיקון בשיטות אופייניות.

הממצאים המוצגים כאן נועדו בראש ובראשונה להדגים כי בדיקת הציטומטריה של זרימת DDAOG יכולה להניב תוצאות מהירות, כמותיות וקלות לפענוח עבור TIS המושרה על ידי תרופות כימותרפיות בתאים או בגידולים. החומרים המשמשים כאן, כולל ETO 23,24, DOX7,25 ו- BLM26,27, תועדו כגורמים ל-TIS בקווי תאים סרטניים שונים 24. כדי להדגים את הספציפיות של גשושית DDAOG, הסוכן הסנוליטי הידוע ABT-26321 הודגם כמבטל באופן סלקטיבי תאים סנסנטיים בתרבית. מאמר זה מדגים את השימוש בקו תאים סרטניים בתרבית של מורין אחד (B16-F10) ובאדם אחד (A549), כמו גם בגידולי B16-F10 שהוקמו בעכברים. עם זאת, ניתן להשתמש בכל התאים המבטאים β-Gal ושומרים על הכדאיות באמצעות הכנת דגימת ציטומטריה סטנדרטית של זרימה. סוגי תאים מסוימים עשויים להיות שבירים יותר או נוטים פחות ל-TIS, ויש להעריך זאת לפני היציאה למסך גדול או למחקר. אם תאים מתפוררים בהכנה, הכדאיות ירודה, או ש-TIS נמוך בהרבה מהצפוי באמצעות בקרות סוכן חיוביות, ייתכן שסוג התא אינו מהווה מודל אידיאלי למחקרים על סנסנציה. הסוכנים וקווי התאים המוצגים כאן יכולים לשמש קבוצות אחרות כבקרות בסינון נוסף של חומרים פוטנציאליים הגורמים ל-TIS או סנוליטים חדשים, שנותרו מטרה פעילה בתחום.

רעילות המושרה על ידי תרופות כימותרפיות יכולה להשתנות בין סוגי תאים ולהשפיע על תוצאות הבדיקה. אם ההשפעה הנצפית העיקרית של הסוכן ו/או הריכוז שבו נעשה שימוש היא מוות חריף של תאים, הסנסנציה הכללית עשויה להיות מינימלית. in vivo, נמק גידול גבוה או רעילות מערכתית בבעלי חיים יש להימנע על ידי הורדת מינון הסוכן. המפתח להצלחת הבדיקה הוא בדיקה של מגוון ריכוזי סוכנים, תוך בדיקה מדוקדקת של נתוני בדיקת הכדאיות (למשל, כפי שסופק על ידי CV450 בתוך בדיקת DDAOG). במבחנה, אם תאים מתים רבים מתנתקים מהצלחת במהלך הטיפול, כולל מדיום התרבית בדגימה המנותחת, חשוב להעריך את מות התאים בסך הכל. CV450 אינו כתם הכדאיות היחיד התואם לבדיקה זו; ניתן להשתמש בפלואורופורים אחרים הפולטים סגולים/כחולים. ניתן להשתמש בבדיקות כדאיות הניתנות לתיקון גם אם המשתמש מתכנן לתקן את הדגימות המוכתמות באמצעות PFA, בתנאי שהפלואורסצנציה של הבדיקה אינה חופפת באופן משמעותי ל- DDAOG או AF (או שהמשתמש מבצע פיצוי ספקטרלי כדי לתקן חפיפה). במקרים מסוימים שבהם רעילות הסוכן נמוכה והתאים חזקים, ניתן להספיק לתאים שלמים על ידי פיזור אור (FSC לעומת SSC) כדי לבודד תאים "בני קיימא" לצורך ניתוח.

שלב מפתח בפרוטוקול in vitro זה הוא צלחת תאים בטווח התחתון של צפיפות גדילת לוג (בדרך כלל 2 × 103-5 × 103 תאים / ס"מ2) כדי לאפשר התפשטות ראשונית מהירה, אשר מקלה על ספיגת התרופה הכימותרפית על ידי רוב התאים. לאחר הטיפול, חשוב גם לאפשר זמן להתפרצות של TIS: במבחנה, 4 ימים ± 1 יום בנוכחות התרופה; in vivo, 7 ימי החלמה לאחר הטיפול הכימותרפי הסופי. לאחר צביעה עם DDAOG כמתואר, ניתוח כמותי של נתונים ציטומטריים צריך להתבצע כפי שמוצג, כלומר, gating DDAOG לעומת תאי AF בכל דגימה כדי לקבוע את אחוז התאים senescent (של סך קיימא). צעדים אופציונליים כוללים שימוש במיקרוספרות כיול "קשת" פלואורסצנטיות כדי לתקנן ציטומטריה של זרימה, קיבוע PFA של דגימות מוכתמות, קו-אימונוסטינינג עבור סמני פני שטח, ומיון זרימה להעשרת תאים סנסנטיים עבור בדיקות במורד הזרם. עם זאת, כל אחד משלבים אופציונליים אלה מספק יתרונות מרכזיים ביישומים מסוימים. מיקרו-ספירות הכיול מתקננות את מערך הציטומטריה על פני הפעלות מרובות ומאפשרות למשתמש להגדיר בתחילה מתחים בטווח שימושי לזיהוי סנסנציה וכדאיות, עם התאמות מינימליות לאחר מכן. קיבוע PFA של דגימות מייצב את התאים ומאפשר ניתוח אצווה של קבוצות גדולות של תאים במועד מאוחר יותר. ניתן להשתמש ב-Co-immunostaining עבור סמני פני השטח כדי לסנן חלבונים חדשים הקשורים לסנסנציה ואינטראקציות חיסוניות. במחקרים עתידיים, אנו מתכננים לאמת את הצביעה המשותפת של סמני סנסנציה תוך-תאיים באמצעות DDAOG.

מיון תאי TIS על ידי FACS מאפשר העשרה של תאי TIS בני קיימא מאוכלוסיות הטרוגניות, מה שיכול לבלבל קריאות עבור מבחנים במורד הזרם כגון כתם מערבי, פרוטאומיקה או תעתיק. לאחר המיון, לא נצפתה רעילות משמעותית של DDAOG בתאי TIS שהוכנסו בחזרה לתרבית למשך עד 5 ימים. עם זאת, יש לקחת בחשבון שתאים ממוינים טופלו ב-Baf, הופנמו ב-DDAOG (שנבקע על-ידי SA-β-Gal ל-DDAO, צבע אקרידין), והיו נתונים ללחץ מכני העובר דרך מכשיר ה-FACS. לכן, שינויים ביולוגיים מסוימים שאינם קשורים לסנסנציה עשויים להימצא בתאים הממוינים. עם זאת, במחקר זה, התאים הממוינים שמרו על תכונות חזקות של סנסנציה וסיפקו תוצאות פרוטאומיקה ותעתיק אופייניות28 בהשוואה לבקרות לא ממוינות. למרות התועלת הברורה במקצת של שימוש ב- FACS כדי לאסוף ולנתח תאים סנסנטיים מגידולים, הליך זה שימש לעתים רחוקות בספרות. קבוצות מסוימות השתמשו ב-p16Ink4a luciferase או בכתבים פלואורסצנטיים כדי לזהות תאים סנסנטיים ברקמות עכברים, כאשר כתבים פלואורסצנטיים מאפשרים מיון FACS במחקרים מסוימים29,30. הממצאים מסכימים באופן כללי כי ללא קשר לסוכן האינדוקציה או לסוג הגידול, TIS בגידולים הוא תופעה חלקית עד נדירה, ולעתים רחוקות מגיע ל -100% מתאי הגידול31. מיון FACS של תאים בשיטת DDAOG מאפשר בקלות איסוף של תאי TIS נדירים מגידולים, ללא צורך לבטא מבנים מהונדסים.

נכון לעכשיו, רוב מחקרי הסנסנציה במודלים של עכברים נערכים ex vivo באמצעות שילוב של X-Gal וסמנים אימונוהיסטוכימיים32,33. עם זאת, הערכת TIS ex vivo באמצעות רקמות גידול יכולה להיות תהליך ממושך, במיוחד כאשר נעשה שימוש ב- X-Gal. הליך זה דורש שמירה על הקפאת גידול, הקפאה על שקופיות, צביעת X-Gal, הרכבת זכוכית כיסוי, ייבוש, הדמיה וניקוד תאים "כחולים" - גישה רב-יומית לכל הפחות. אימונוהיסטוכימיה אינה מהירה או קלה בהרבה, ויש להשתמש במקטעי רקמה שונים ולהבקיע אותם עבור כל סמן בתוספת X-Gal בכל גידול, אלא אם כן הניתוח המרובה ממוטב, מה שמוסיף עוד זמן בחזית התהליך. חתכי רקמות דוגמים רק חתך דק אחד של הגידול, בעוד שתאים סנסנטיים (כמו סוגי תאים רבים) עשויים להתפזר באופן לא אחיד במרחב התלת-ממדי לאורך גידולים29. זה נחוץ בדחיפות בתחום כדי להתרחק משיטות היסטולוגיה איטיות ומיושנות לעבר בדיקת סנסנציה מהירה יותר וניתנת לכימות בקלות עבור גידולים. באמצעות ציטומטריה של זרימת DDAOG, קבוצה של 15 גידולים יכולה להיות מנותקת ומוכתמת כדי לקבל נתוני סנסנציה כמותיים חד-משמעיים בפחות מיום אחד של זמן מעשי לאחר קציר הגידול. מחצית מהגידול עובדה עבור כל דגימה, מה ששיפר את הדגימה של שטח תלת-ממדי לכל גידול. גישה זו של ציטומטריה של זרימת DDAOG מהירה ואמינה יותר באופן משמעותי משיטות מבוססות שקופיות רקמות להערכת TIS בגידולים.

עם יתרונותיו הרבים על פני X-Gal ושיטות אחרות, אנו תומכים בפרוטוקול DDAOG שיהפוך למבחן החדש של תקן הזהב. הוא משתמש הן בסמן הסנסנציה המקובל, SA-β-Gal, והן בזיהוי ללא תוויות של מיקוד אוטומטי הקשור לגיל כסמן שני. פלואורופורים אלה תואמים לרוב הציטומטרים הסטנדרטיים של זרימה. הבדיקה כוללת כתם כדאיות לשלילת תאים מתים ופסולת באמצעות דגימות המתקבלות בקלות מקווי תאים או גידולים בתרבית שטופלו בתרופות. לחלופין, דגימות של תאים חיים יכולות להיות קבועות בממס או בהקפאה כדי להקל על ניתוח אצווה של מחקרים גדולים, למשל, שימוש בנקודות זמן כדי להעריך את הופעת TIS לאורך זמן באמצעות סוכנים מרובים תהליך ההכתמה לוקח פחות מחצי יום של עבודת מעבדה להשלים, ואיסוף הנתונים הוא בדרך כלל <5 דקות לכל דגימה. ניתוח הנתונים מהיר ופשוט באופן דומה, ומפיק נתונים כמותיים על אחוז תאי ה-TIS לכל דגימה ללא ניקוד וספירה מייגעים של תאים. ניתן למיין דגימות באמצעות FACS כדי לשחזר אוכלוסיות מועשרות של תאי TIS, מה שמפחית את הרעש מההטרוגניות התאית בניתוחים במורד הזרם. אנו מאמינים שבדיקת DDAOG יכולה, במקרים רבים, להחליף את X-Gal, להקל על סינון של חומרים מעוררי TIS וסנוליטים במבחנה וב - in vivo, מה שמוביל לתגליות מהירות ואמינות יותר בתחום מחקר הסנסנציה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר על מחקר זה.

Acknowledgments

אנו מודים למתקן ליבת הציטומטריה והנוגדנים באוניברסיטת שיקגו על התמיכה במכשור ציטומטריה של זרימה. המרכז לחקר בעלי חיים באוניברסיטת שיקגו סיפק דיור לבעלי חיים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bafilomycin A1 Research Products International B40500
Bleomycin sulfate  Cayman 13877
Bovine serum albumin (BSA) US Biological A1380
Calcein Violet 450 AM viability dye ThermoFisher Scientific 65-0854-39 eBioscience
DPP4 antibody, PE conjugate Biolegend 137803 Clone H194-112
Cell line: A549 human lung adenocarcinoma American Type Culture Collection CCL-185
Cell line: B16-F10 mouse melanoma American Type Culture Collection CRL-6475
Cell scraper Corning 3008
Cell strainers, 100 µm Falcon 352360
DDAO-Galactoside Life Technologies D6488
DMEM medium 1x Life Technologies 11960-069
DMSO Sigma D2438
DNAse I Sigma DN25
Doxorubicin, hydrochloride injection (USP) Pfizer NDC 0069-3032-20
Doxorubicin, PEGylated liposomal (USP) Sun Pharmaceutical NDC 47335-049-40
EDTA 0.5 M Life Technologies 15575-038
Etoposide  Cayman 12092
FBS Omega  FB-11
Fc receptor blocking reagent Biolegend 101320 Anti-mouse CD16/32
Flow cytometer (cell analyzer) Becton Dickinson (BD) Various LSRFortessa
Flow cytometer (cell sorter) Becton Dickinson (BD) Various FACSAria
GlutaMax 100x Life Technologies 35050061
HEPES 1 M Lonza BW17737
Liberase TL Sigma 5401020001 Roche
Paraformaldehyde 16% Electron Microscopy Sciences 15710
Penicillin/Streptomycin 100x Life Technologies 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) 1x Corning MT21031CV Dulbecco's PBS (without calcium and magnesium)
Rainbow calibration particles, ultra kit SpheroTech UCRP-38-2K 3.5-3.9 µm, 2E6/mL
RPMI-1640 medium 1x Life Technologies 11875-119
Sodium chloride 0.9% (USP) Baxter Healthcare Corporation 2B1324
Software for cytometer data acquisition, "FACSDiva" Becton Dickinson (BD) n/a Contact BD for license
Software for cytometer data analysis, "FlowJo" TreeStar n/a Contact TreeStar for license
Trypsin-EDTA 0.25% Life Technologies 25200-114

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saleh, T., Tyutyunyk-Massey, L., Gewirtz, D. A. Tumor cell escape from therapy-induced senescence as a model of disease recurrence after dormancy. Cancer Research. 79 (6), 1044-1046 (2019).
  2. Wang, B., Kohli, J., Demaria, M. Senescent cells in cancer therapy: friends or foes. Trends in Cancer. 6 (10), 838-857 (2020).
  3. Prasanna, P. G., et al. Therapy-induced senescence: Opportunities to improve anticancer therapy. Journal of the National Cancer Institute. 113 (10), 1285-1298 (2021).
  4. Velarde, M. C., Demaria, M., Campisi, J. Senescent cells and their secretory phenotype as targets for cancer therapy. Interdisciplinary Topics in Gerontology and Geriatrics. 38, 17-27 (2013).
  5. Ou, H. L., et al. Cellular senescence in cancer: from mechanisms to detection. Molecular Oncology. 15 (10), 2634-2671 (2021).
  6. Hernandez-Segura, A., Nehme, J., Demaria, M. Hallmarks of cellular senescence. Trends in Cell Biology. 28 (6), 436-453 (2018).
  7. Bojko, A., Czarnecka-Herok, J., Charzynska, A., Dabrowski, M., Sikora, E. Diversity of the senescence phenotype of cancer cells treated with chemotherapeutic agents. Cells. 8 (12), 1501 (2019).
  8. Mikuła-Pietrasik, J., Niklas, A., Uruski, P., Tykarski, A., Książek, K. Mechanisms and significance of therapy-induced and spontaneous senescence of cancer cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (2), 213-229 (2020).
  9. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  10. Itahana, K., Itahana, Y., Dimri, G. P. Colorimetric detection of senescence-associated β galactosidase. Methods in Molecular Biology. 965, 143-156 (2013).
  11. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  12. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
  13. Noppe, G., et al. Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts. Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).
  14. Tung, C. -H., et al. In vivo imaging of β-galactosidase activity using far red fluorescent switch. Cancer Research. 64 (5), 1579-1583 (2004).
  15. Gong, H., et al. beta-Galactosidase activity assay using far-red-shifted fluorescent substrate DDAOG. Analytical Biochemistry. 386 (1), 59-64 (2009).
  16. Terman, A., Brunk, U. T. Lipofuscin: Mechanisms of formation and increase with age. APMIS. 106 (2), 265-276 (1998).
  17. Georgakopoulou, E. A., et al. Specific lipofuscin staining as a novel biomarker to detect replicative and stress-induced senescence. A method applicable in cryo-preserved and archival tissues. Aging. 5 (1), 37-50 (2013).
  18. Wang, B., Demaria, M. The quest to define and target cellular senescence in cancer. Cancer Research. 81 (24), 6087-6089 (2021).
  19. Appelbe, O. K., Zhang, Q., Pelizzari, C. A., Weichselbaum, R. R., Kron, S. J. Image-guided radiotherapy targets macromolecules through altering the tumor microenvironment. Molecular Pharmaceutics. 13 (10), 3457-3467 (2016).
  20. Maciorowski, Z., Chattopadhyay, P. K., Jain, P. Basic multicolor flow cytometry. Current Protocols in Immunology. 117, 1-38 (2017).
  21. Fan, Y., Cheng, J., Zeng, H., Shao, L. Senescent cell depletion through targeting BCL-family proteins and mitochondria. Frontiers in Physiology. 11, 593630 (2020).
  22. Kim, K. M., et al. Identification of senescent cell surface targetable protein DPP4. Genes and Development. 31 (15), 1529-1534 (2017).
  23. Flor, A. C., Kron, S. J. Lipid-derived reactive aldehydes link oxidative stress to cell senescence. Cell Death Discovery. 7 (9), 2366 (2016).
  24. Jochems, F., et al. The Cancer SENESCopedia: A delineation of cancer cell senescence. Cell reports. 36 (4), 109441 (2021).
  25. Fallah, M., et al. Doxorubicin and liposomal doxorubicin induce senescence by enhancing nuclear factor kappa B and mitochondrial membrane potential. Life Sciences. 232, 116677 (2019).
  26. Kasper, M., Barth, K. Bleomycin and its role in inducing apoptosis and senescence in lung cells - modulating effects of caveolin-1. Current Cancer Drug Targets. 9 (3), 341-353 (2009).
  27. Muthuramalingam, K., Cho, M., Kim, Y. Cellular senescence and EMT crosstalk in bleomycin-induced pathogenesis of pulmonary fibrosis-an in vitro analysis. Cell Biology International. 44 (2), 477-487 (2020).
  28. Flor, A. C., Wolfgeher, D., Wu, D., Kron, S. J. A signature of enhanced lipid metabolism, lipid peroxidation and aldehyde stress in therapy-induced senescence. Cell Death Discovery. 3, 17075 (2017).
  29. Burd, C. E., et al. Monitoring tumorigenesis and senescence in vivo with a p16(INK4a)-luciferase model. Cell. 152 (1-2), 340-351 (2013).
  30. Liu, J. Y., et al. Cells exhibiting strong p16 (INK4a) promoter activation in vivo display features of senescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2603-2611 (2019).
  31. Wang, L., Lankhorst, L., Bernards, R. Exploiting senescence for the treatment of cancer. Nature Reviews Cancer. 22 (6), 340-355 (2022).
  32. Baek, K. -H., Ryeom, S. Detection of oncogene-induced senescence in vivo. Methods in Molecular Biology. 1534, 185-198 (2017).
  33. González-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Muñoz-Espín, D. A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo. The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).

Tags

חקר הסרטן גיליון 187 Senescence סרטן כימותרפיה ציטומטריה של זרימה בדיקה פלואורסצנטית מולטיפלקס
בדיקה פלואורסצנטית פלואורסצנטית β-גלקטוזידאז הקשורה לזיהוי והעשרה של תאי גידול סנסנטיים על ידי ציטומטריה של זרימה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Flor, A., Pagacz, J., Thompson, D.,… More

Flor, A., Pagacz, J., Thompson, D., Kron, S. Far-Red Fluorescent Senescence-Associated β-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (187), e64176, doi:10.3791/64176 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter