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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Sonde β-galactosidase associée à la sénescence fluorescente rouge lointain pour l’identification et l’enrichissement de cellules tumorales sénescentes par cytométrie en flux

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64176
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Molecular Genetics and Cell Biology, University of Chicago

Summary

Un protocole de quantification fluorescente par cytométrie en flux des cellules cancéreuses sénescentes induites par des médicaments de chimiothérapie en culture cellulaire ou dans des modèles tumoraux murins est présenté. Les procédures facultatives comprennent le co-immunomarquage, la fixation d’échantillons pour faciliter l’analyse de grands lots ou de points temporels, et l’enrichissement de cellules sénescentes viables par tri cytométrique en flux.

Abstract

La sénescence cellulaire est un état d’arrêt prolifératif induit par des dommages biologiques qui s’accumulent normalement au fil des ans dans les cellules vieillissantes, mais qui peut également émerger rapidement dans les cellules tumorales en réponse aux dommages induits par divers traitements contre le cancer. La sénescence des cellules tumorales est généralement considérée comme indésirable, car les cellules sénescentes deviennent résistantes à la mort et bloquent la rémission tumorale tout en exacerbant la tumeur maligne et la résistance au traitement. Par conséquent, l’identification des cellules tumorales sénescentes est d’un intérêt continu pour la communauté de recherche sur le cancer. Il existe divers tests de sénescence, dont beaucoup sont basés sur l’activité du marqueur de sénescence bien connu, la bêta-galactosidase associée à la sénescence (SA-β-Gal).

Typiquement, le test SA-β-Gal est réalisé à l’aide d’un substrat chromogène (X-Gal) sur des cellules fixes, avec le dénombrement lent et subjectif des cellules sénescentes « bleues » par microscopie optique. Des tests améliorés utilisant des substrats fluorescents SA-β-Gal perméables aux cellules, y compris C12-FDG (vert) et DDAO-Galactoside (DDAOG; rouge lointain), ont permis l’analyse de cellules vivantes et l’utilisation de plates-formes d’analyse fluorescentes à haut débit, y compris des cytomètres en flux. C12-FDG est une sonde bien documentée pour SA-β-Gal, mais son émission fluorescente verte chevauche l’autofluorescence cellulaire intrinsèque (AF) qui survient pendant la sénescence en raison de l’accumulation d’agrégats de lipofuscine. En utilisant la sonde rouge lointain SA-β-Gal DDAOG, l’autofluorescence cellulaire verte peut être utilisée comme paramètre secondaire pour confirmer la sénescence, ajoutant ainsi de la fiabilité au test. Les canaux de fluorescence restants peuvent être utilisés pour la coloration de la viabilité cellulaire ou l’immunomarquage fluorescent facultatif.

En utilisant la cytométrie en flux, nous démontrons l’utilisation de DDAOG et de l’autofluorescence de la lipofuscine comme test à double paramètre pour l’identification des cellules tumorales sénescentes. La quantification du pourcentage de cellules sénescentes viables est effectuée. Si vous le souhaitez, une étape facultative d’immunomarquage peut être incluse pour évaluer les antigènes de surface cellulaire d’intérêt. Les cellules sénescentes identifiées peuvent également être triées cytométriquement en flux et collectées pour analyse en aval. Les cellules sénescentes collectées peuvent être immédiatement lysées (par exemple, pour des tests immunologiques ou des analyses omiques) ou cultivées.

Introduction

Les cellules sénescentes s’accumulent normalement dans les organismes au fil des ans au cours du vieillissement biologique normal, mais peuvent également se développer rapidement dans les cellules tumorales en réponse aux dommages induits par divers traitements contre le cancer, y compris la radiothérapie et la chimiothérapie. Bien qu’elles ne prolifèrent plus, les cellules tumorales sénescentes induites par le traitement (TIS) peuvent contribuer à la résistance au traitement et entraîner une récidive 1,2,3. Les facteurs sécrétés par les cellules TIS peuvent exacerber la tumeur maligne en favorisant l’évasion immunitaire ou les métastases 4,5. Les cellules TIS développent des phénotypes complexes et spécifiques au contexte, des profils métaboliques modifiés et des réponses immunitaires uniques 6,7,8. Par conséquent, l’identification et la caractérisation des cellules tumorales TIS induites par diverses approches de traitement du cancer est un sujet d’intérêt continu pour la communauté de recherche sur le cancer.

Pour détecter les cellules tumorales TIS, les tests de sénescence conventionnels sont largement utilisés, principalement basés sur la détection d’une activité accrue de l’enzyme marqueur de sénescence, la bêta-galactosidase lysosomale GLB19. La détection à un pH lysosomal presque neutre (plutôt qu’acide) permet une détection spécifique de la bêta-galactosidase associée à la sénescence (SA-β-Gal)10. Un test SA-β-Gal standard utilisé depuis plusieurs décennies utilise X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), un substrat chromogène bleu de la bêta-galactosidase, pour détecter la SA-β-Gal dans les cellules fixes par microscopieoptique 11. Le test X-Gal permet la confirmation visuelle qualitative du TIS à l’aide de réactifs et d’équipements de laboratoire couramment disponibles. Un microscope optique transmis de base est le seul instrument nécessaire pour évaluer la présence du chromogène bleu. Cependant, la procédure de coloration X-Gal peut manquer de sensibilité, nécessitant parfois plus de 24 heures pour que la couleur se développe. La coloration est suivie d’un score subjectif à faible débit des cellules sénescentes individuelles basé sur le comptage des cellules présentant un certain niveau d’intensité du chromogène bleu au microscope optique. Comme X-Gal est imperméable aux cellules, ce test nécessite des cellules fixées au solvant, qui ne peuvent pas être récupérées pour une analyse en aval. Lorsque vous travaillez avec des échantillons limités d’animaux ou de patients, cela peut être un inconvénient majeur.

Des dosages SA-β-Gal améliorés utilisant des substrats enzymatiques fluorescents perméants aux cellules, y compris le C 12-FDG (5-dodécanoylaminofluorescéine Di-β-D-Galactopyranoside, vert) et le DDAOG (9H-(1,3-dichloro-9,9-diméthylacridin-2-one-7-yl) β-D-galactopyranoside, rouge lointain) ont déjà paru dans la littérature12,13,14,15. La structure chimique de la sonde et les caractéristiques optiques du DDAOG sont illustrées à la figure supplémentaire S1. Ces sondes perméables permettent l’analyse de cellules vivantes (plutôt que fixes), et les sondes fluorescentes plutôt que chromogènes facilitent l’utilisation de plates-formes d’analyse fluorescentes rapides à haut débit, y compris des instruments de dépistage à haute teneur et des cytomètres en flux. Les cytomètres de flux de tri permettent la récupération de populations enrichies de cellules sénescentes vivantes à partir de cultures cellulaires ou de tumeurs pour une analyse en aval (par exemple, Western blotting, ELISA ou « omiques »). L’analyse de fluorescence fournit également un signal quantitatif, permettant une détermination plus précise du pourcentage de cellules sénescentes dans un échantillon donné. Des sondes fluorescentes supplémentaires, y compris des sondes de viabilité et des anticorps marqués au fluorophore, peuvent facilement être ajoutées pour l’analyse multiplexée de cibles au-delà de SA-β-Gal.

Semblable au DDAOG, le C12-FDG est une sonde fluorescente pour SA-β-Gal, mais son émission fluorescente verte chevauche la FA cellulaire intrinsèque, qui survient lors de la sénescence en raison de l’accumulation d’agrégats de lipofuscine dans les cellules16. En utilisant la sonde DDAOG rouge lointain, la FA cellulaire verte peut être utilisée comme paramètre secondaire pour confirmer la sénescence17. Cela améliore la fiabilité du test en utilisant un deuxième marqueur en plus du SA-β-Gal, qui peut souvent être peu fiable en tant que marqueur unique de la sénescence18. Comme la détection de la FA endogène dans les cellules sénescentes est une approche sans marquage, il s’agit d’un moyen rapide et simple d’étendre la spécificité de notre test basé sur DDAOG.

Dans ce protocole, nous démontrons l’utilisation de DDAOG et de la FA comme test rapide de cytométrie en flux à double paramètre pour l’identification de cellules tumorales TIS viables à partir de cultures in vitro ou isolées de tumeurs traitées par des médicaments établies chez la souris (Figure 1). Le protocole utilise des fluorophores compatibles avec une large gamme d’analyseurs et de trieurs de cytométrie en flux commerciaux standard (tableau 1). La quantification du pourcentage de cellules sénescentes viables à l’aide de l’analyse par cytométrie en flux standard est activée. Si vous le souhaitez, une étape facultative d’immunomarquage peut être effectuée pour évaluer les antigènes de surface cellulaire d’intérêt en même temps que la sénescence. Les cellules sénescentes identifiées peuvent également être enrichies à l’aide de la méthodologie standard de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS).

Figure 1
Figure 1 : Flux de travail expérimental. Un schéma résumant les points clés du test DDAOG. (A) Un médicament inducteur de TIS est ajouté à des cellules cultivées de mammifères ou administré à des souris porteuses de tumeurs. Un délai est alors prévu pour l’apparition du TIS: pour les cellules, 4 jours après le traitement; pour les souris, 22 jours au total, avec trois traitements tous les 5 jours plus 7 jours de récupération. Les cellules sont récoltées ou les tumeurs sont dissociées en suspension. (B) Les échantillons sont traités avec Baf pour ajuster le pH lysosomal pour la détection de SA-β-Gal pendant 30 min; ensuite, la sonde DDAOG est ajoutée pendant 60 minutes pour détecter SA-β-Gal. Les échantillons sont lavés 2x dans du PBS, et une tache de viabilité est brièvement ajoutée (15 min). En option, les échantillons peuvent être colorés avec des anticorps fluorescents dans des canaux de fluorescence ouverts et / ou fixés pour une analyse ultérieure. (C) Les échantillons sont analysés à l’aide d’un cytomètre en flux standard. Les cellules viables sont visualisées dans des diagrammes de points montrant le DDAOG rouge (indiquant SA-β-Gal) par rapport à l’autofluorescence verte (lipofuscine). Une porte pour déterminer le pourcentage de cellules TIS est établie en fonction des échantillons témoins non traités (non représentés). Si un cytomètre de tri (FACS) est utilisé, les cellules TIS peuvent être collectées et remises en culture pour d’autres tests in vitro ou lysées et traitées pour des essais de biologie moléculaire. Abréviations : DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-diméthylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-Galactoside; TIS = sénescence induite par la thérapie; FL-Ab = anticorps conjugué au fluorophore; Baf = Bafilomycine A1; SA-β-Gal = bêta-galactosidase associée à la sénescence; PBS = solution saline tamponnée au phosphate; FACS = tri cellulaire activé par fluorescence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Fluorophore Détecte Ex/Em (nm) Cytomètre laser (nm) Détecteur cytomètre / filtre passe-bande (nm)
Le SA-β-Gal 645/6601 640 670 / 30
AF Lipofuscine < 600 488 525 / 50
CV450 Viabilité 408/450 405 450 / 50
PE Anticorps/marqueur de surface 565/578 561 582 / 15

Tableau 1 : Fluorophores et spécifications optiques du cytomètre. Les spécifications du cytomètre utilisées dans ce protocole sont répertoriées pour un instrument avec un total de 4 lasers et 15 détecteurs d’émission. DDAOG détecté à 645/660 nm est la forme de la sonde clivée par SA-β-Gal1. Le DDAOG onculé peut présenter une fluorescence de faible niveau à 460/610 nm, mais il est éliminé par les étapes de lavage prévues dans le protocole. Abréviations : DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-diméthylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-Galactoside; AF = autofluorescence; PE = phycoérythrine; SA-β-Gal = bêta-galactosidase associée à la sénescence.

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Protocol

Tous les travaux sur les animaux décrits ont été approuvés par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Chicago.

1. Préparation et stockage des solutions mères

REMARQUE: Si les cellules doivent être triées en flux, toutes les solutions doivent être préparées à l’aide de techniques stériles et filtrées à travers un dispositif filtrant de 0,22 μm.

  1. Préparer une solution mère de DDAO-Galactoside à 5 mg/mL dans du DMSO. Aliquote à 50 μL par tube (ou volume souhaité). Conserver à −20 °C dans l’obscurité jusqu’à 1 an.
  2. Préparer une solution mère de Bafilomycine A1 à 1 mM dans du DMSO. Aliquote à 50 μL par tube (ou volume souhaité). Conserver à −20 °C jusqu’à 6 mois.
  3. Préparer une solution mère de Calcein Violet 450 AM à 1 mM dans du DMSO. Aliquote à 50 μL par tube (ou volume souhaité). Conserver à −20 °C dans l’obscurité jusqu’à 1 an.
  4. Pour le traitement in vitro de cellules cultivées, préparer des solutions mères concentrées de 10 mM d’agent(s) induisant la sénescence dans le solvant approprié et stériliser à l’aide de filtres à seringue de 0,2 μm. Conserver à −20 °C ou selon les directives du fabricant.
    REMARQUE: Pour l’administration d’agents de chimiothérapie induisant la sénescence in vivo (à des souris présentant des tumeurs établies), les agents doivent être de qualité USP et dilués dans une solution saline à partir d’un stock concentré juste avant l’injection.
  5. Préparer un milieu de culture complet pour la ou les lignées cellulaires utilisées.
    REMARQUE: Par exemple, préparez un milieu pour les cellules B16-F10 ou A549 avec DMEM 1x + 10% FBS + 1x substitut de glutamine + 1x pénicilline / streptomycine. Les milieux doivent être maintenus stériles. D’autres formulations de milieux spécifiques à la lignée cellulaire peuvent être utilisées. Certains composants tels que le glutathion peuvent, dans certains cas, interférer avec l’apparition de la sénescence. Des essais empiriques de diverses formulations de milieux doivent être effectués si le début de la sénescence est plus faible que prévu ou n’a pas été observé avec les agents de chimiothérapie témoins.
  6. Préparez les tampons de coloration et de lavage.
    1. Préparer 1% d’albumine sérique bovine (BSA) dans 1x PBS pour une utilisation dans les procédures de coloration. Dissoudre 2 g de BSA dans 200 mL de PBS et agiter pendant 10 minutes, ou jusqu’à dissolution complète, à température ambiante.
    2. Préparez 0,5% de BSA dans 1x PBS comme tampon de lavage. Diluer 100 mL du BSA à 1 % préparé à l’étape 1.6.1 dans 100 mL de 1x PBS pour 0,5 % de BSA.
    3. Conserver les tampons à 4 °C jusqu’à 1 mois.
  7. Préparer 4% de paraformaldéhyde dans 1x PBS. Utiliser des ampoules de paraformaldéhyde scellées disponibles dans le commerce (p. ex. 16 % v/v) pour plus de commodité et de stabilité : 2,5 mL de PFA à 16 % + 7,5 mL de 1x PBS (= 10 mL de PFA à 4 %). Ajustez le volume préparé en fonction du volume total nécessaire par expérience.
    REMARQUE: Préparez-vous au besoin pour la fixation de la cellule seulement; Préparez frais à chaque fois.
  8. Préparer le tampon de tri FACS: 1x PBS, 1 mM EDTA, 25 mM HEPES, 1% BSA (pH 7,2). Filtrer stérile à travers un dispositif de filtration de 0,22 μm et conserver à 4 °C jusqu’à 1 mois.
    REMARQUE: Préparez-vous au besoin pour le tri FACS uniquement. Les formulations tampons de tri en flux peuvent varier d’un instrument FACS à l’autre. La formulation ci-dessus est compatible avec l’instrument utilisé dans cette étude (voir le tableau des matériaux). Consultez les directives du fabricant.
  9. Préparer la solution de dissociation tumorale : 20 μg/mL de Liberase TL + 100 μg/mL de DNAse I dans un milieu RPMI-1640 (sans FBS ni autres suppléments). Il est utile de conserver sous la main des solutions mères de Liberase TL (préparée et conservée selon les directives du fabricant) et de DNAse I (100 mg/mL dans de l’eau bidistillée [ddH2O], stockée à −20°C).
    REMARQUE: Préparez-vous au besoin si vous utilisez uniquement des tumeurs; Préparez frais à chaque fois.

2. Induction de la sénescence par des agents chimiothérapeutiques dans des cellules cancéreuses en culture

REMARQUE : Toutes les étapes de manipulation cellulaire décrites dans cette section doivent être effectuées dans une enceinte de biosécurité en utilisant des pratiques stériles. Cette section est écrite pour les types de cellules adhérentes. Les cellules de suspension peuvent être utilisées avec les modifications appropriées, comme indiqué.

  1. Cultiver des lignées cellulaires cancéreuses selon le protocole standard du fournisseur ou du laboratoire qui a fourni la ou les lignées cellulaires spécifiques utilisées.
    NOTE: Les cellules à passage bas (p < 10) sont généralement préférées car il y aura des niveaux plus faibles de sénescence réplicative, c’est-à-dire un fond inférieur, dans les échantillons de cellules non traitées.
  2. Un jour avant l’induction de la sénescence par des médicaments, récolter des cellules avec de la trypsine-EDTA 0,25% (ou comme recommandé). Neutraliser la trypsine en ajoutant un volume égal de milieu de culture complet et transférer la suspension cellulaire dans un tube conique stérile.
    Remarque : Cette étape n’est pas nécessaire pour les cellules de suspension.
  3. Compter les cellules à l’aide de la méthode standard de l’hémocytomètre et enregistrer les cellules/mL. Cellules à plaques à 1 × 10 3-10× 103 cellules/cm2 dans des boîtes de culture en plastique standard à 6 puits.
    REMARQUE: La densité optimale de placage dépend du taux de prolifération des cellules et doit être déterminée par l’utilisateur. Les cellules devraient être en phase logarithmique de croissance à une confluence d’environ 10 % à 20 % au moment du traitement (c.-à-d. après une incubation de 18 à 24 heures après le placage). La densité de départ (cellules/mL) des cellules en suspension doit être déterminée par l’utilisateur. Les plaques à six puits produisent généralement suffisamment de cellules sénescentes par puits pour un échantillon standard d’analyse de cytométrie en flux. En cas de tri en flux, une surface beaucoup plus grande (p. ex. plusieurs plaques P150) devrait être utilisée pour permettre la récupération d’un nombre suffisant de cellules sénescentes pour les essais en aval (≥1 × 106).
  4. Incuber les cellules plaquées pendant la nuit (18-24 h) dans un incubateur à 37 °C avec 5% de CO2 et un bac d’humidité.
  5. Traiter les cellules plaquées avec un ou plusieurs agents chimiothérapeutiques induisant la sénescence. Inclure au moins un témoin positif, p. ex. l’étoposide (ETO) ou la bléomycine (BLM). Préparez des puits en double par médicament. Inclure un ensemble traité avec véhicule uniquement comme contrôle.
    REMARQUE : Une courbe de dose pour chaque agent expérimental doit être testée par l’utilisateur afin de déterminer la concentration optimale pour l’induction de la sénescence dans la ou les lignées cellulaires utilisées.
  6. Incuber les cellules pendant 4 jours dans un incubateur à 37 °C avec 5% de CO2 et un bac d’humidité pour permettre l’apparition de la sénescence. Examiner quotidiennement les changements morphologiques attendus à l’aide d’un microscope optique.
    NOTE: Des temps d’incubation de 3 à 5 jours peuvent être acceptables en fonction du taux d’apparition de la sénescence. Les milieux peuvent être changés et l’agent réappliqué (ou non), comme souhaité, pour favoriser des conditions de croissance saines tout en atteignant un pourcentage acceptable de cellules sénescentes.
  7. Après le début de la sénescence, récolter les cellules en ajoutant 0,25% de trypsine-EDTA pendant 5 min à 37 °C. Lorsque les cellules sont dissociées en suspension, neutraliser la trypsine avec un volume égal de milieu complet.
    REMARQUE: Cette étape n’est pas nécessaire pour les cellules qui se développent en suspension. Si la coloration des marqueurs de surface doit être effectuée, éviter l’utilisation de trypsine-EDTA car elle peut détruire temporairement les antigènes de surface sur les cellules. Au lieu de cela, dissociez délicatement la monocouche à l’aide d’un grattoir cellulaire en plastique stérile (ou d’un réactif de dissociation alternatif conçu pour préserver les antigènes de surface).
  8. Compter les cellules de chaque échantillon à l’aide d’un hémocytomètre. Calculer les cellules/mL pour chaque échantillon.
    REMARQUE: Le bleu de trypan peut être ajouté pour évaluer le pourcentage de cellules mortes à ce stade (c’est-à-dire en raison d’un traitement médicamenteux), mais la mort cellulaire sera également déterminée avec un colorant de viabilité fluorescent pendant le flux de travail de coloration DDAOG.
  9. Aliquote ≥0,5 × 106 cellules par échantillon dans des tubes microcentrifugés de 1,7 mL.
    REMARQUE : Le nombre de cellules par échantillon doit être normalisé pour tous les échantillons.
  10. Centrifuger les tubes pendant 5 min à 1 000 × g dans une microcentrifugeuse à 4 °C. Retirez le surnageant.
    REMARQUE : Si une microcentrifugeuse réfrigérée n’est pas disponible, il peut être acceptable d’effectuer des centrifugations à température ambiante pour certains types de cellules résilientes.
  11. Passez à la coloration DDAOG à la section 4.

3. Induction de la sénescence par des médicaments de chimiothérapie dans les tumeurs établies chez la souris

REMARQUE: Si les cellules tumorales doivent être triées par FACS, assurez-vous de la stérilité à chaque étape en travaillant dans une armoire de biosécurité et en travaillant avec des instruments, des procédures et des réactifs stériles.

  1. Créer des modèles tumoraux de souris en injectant des cellules cancéreuses par voie sous-cutanée, selon des méthodes standard (par exemple, Appelbe et al.19).
    REMARQUE : Le nombre de cellules cancéreuses à injecter, le site d’injection et la souche de souris appropriée doivent être optimisés pour chaque protocole. Ici, les cellules B16-F10 ont été injectées par voie sous-cutanée à 1 × 106 cellules dans 0,1 mL de solution saline (1 × 107 cellules/mL).
    1. Vérifiez que la viabilité des cellules utilisant le bleu de trypan est de >90% avant d’effectuer des injections. Anesthésiez les souris avec de l’isoflurane.
    2. Anesthésier les souris femelles C57/BL6 âgées de 6 à 7 semaines avec un mélange d’isoflurane à 3 % et d’air et les maintenir dans ces conditions dans une chambre d’induction placée dans une enceinte de biosécurité stérile. Confirmez l’anesthésie en pinçant doucement le pied de la souris. Appliquez une pommade vétérinaire stérile sur les deux yeux pour empêcher le séchage de la cornée pendant la procédure. Pendant la procédure, maintenez la température corporelle de la souris à l’aide d’une lampe chauffante.
    3. Travaillant à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité stérile, retirez la souris de la chambre d’induction et placez-la en contact avec un cône nasal fournissant 3% d’isoflurane. Rasez la zone de flanc au site d’injection à l’aide d’un rasoir électrique propre. Mélanger brièvement la suspension cellulaire préparée en retournant manuellement le tube juste avant l’injection et injecter la suspension cellulaire par voie sous-cutanée dans le(s) flanc(s) rasé(s) à l’aide d’une seringue stérile de 0,5 mL munie d’une aiguille stérile de 27 G. Retirez la souris du capot et transférez-la dans la cage de récupération.
    4. Dans la cage de récupération, surveiller les signes vitaux des souris en continu jusqu’à ce qu’elles aient repris suffisamment conscience pour maintenir la position couchée sternale, démontrer le réflexe de redressement et être capables de se déplacer en toute sécurité dans la cage. Ne laissez pas les souris sans surveillance et ne retournez pas les animaux qui ont subi une inoculation de cellules tumorales en compagnie d’autres animaux jusqu’à ce qu’ils soient complètement rétablis. Surveiller quotidiennement toutes les souris inoculées pour détecter la perte de poids, la réduction de l’activité / mobilité et les symptômes neurologiques; Euthanasier les souris présentant des symptômes graves dans n’importe quelle catégorie. Pour les souris présentant des symptômes de douleur après l’inoculation, administrer la buprénorphine (0,1-0,2 mg / kg) une fois par voie sous-cutanée.
      REMARQUE : Les souris présentant une douleur persistante après la buprénorphine doivent être euthanasiées.
  2. En commençant 5 à 7 jours après l’inoculation des cellules cancéreuses, mesurez la croissance tumorale avec des étriers tous les 2-3 jours. Initier un traitement prosénescent lorsque la tumeur a atteint 50 mm 3 ± 10 mm3 en volume.
    NOTE: Dans ce travail, des doses de chlorhydrate de doxorubicine de qualité USP (DOX) ou de doxorubicine liposomale pégylée (PLD) à 10 mg / kg ont été administrées en injection de chlorure de sodium à 0,9% (USP). Les médicaments ont été injectés par voie intrapéritonéale 3x, une fois tous les 5 jours, à partir du moment où les tumeurs ont atteint 50 mm 3 ± 10 mm3. Les souris se sont rétablies pendant 7 jours après le traitement final pour permettre l’apparition du TIS dans les tumeurs. Les dosages d’induction de la sénescence et les conditions pour d’autres traitements et / ou modèles tumoraux doivent être optimisés.
  3. 7 jours après le traitement médicamenteux final, sacrifier les souris par surdosagede CO 2 et luxation cervicale ou d’autres méthodes approuvées conformément aux directives de travail des animaux de laboratoire. Extrayez les tumeurs et recueillez-les dans des tubes stériles ou des plaques à 6 puits remplies d’un milieu de croissance RPMI stérile (pour préserver la viabilité pendant le traitement).
    REMARQUE: Si vous effectuez un examen histologique (par exemple, X-Gal ou immunohistochimie), les tumeurs peuvent être divisées ici, avec une moitié congelée dans un milieu d’incorporation O.C.T. et cryosectionnée en utilisant des procédures standard pour l’histologie des tissus congelés. La moitié tumorale restante devrait fournir un matériau abondant pour la dissociation et la coloration DDAOG.
  4. Transférer une tumeur dans une boîte en plastique P100 contenant 5 ml de milieu RPMI. Hacher la tumeur en morceaux à l’aide d’un scalpel.
  5. Transférer 5 mL de la suspension de morceaux tumoraux contenant des cellules en suspension et des débris dans un tube conique de 15 mL. Utilisez l’embout le plus large d’une pipette sérologique de 25 ml pour transférer cette suspension en présence de gros débris. Rincer le plat avec un volume supplémentaire de RPMI stérile pour recueillir les matériaux. Boucher et placer le tube conique sur de la glace.
  6. Répétez les étapes 3.45-3.5 pour les tumeurs restantes. Utilisez une plaque et un scalpel séparés pour chaque tumeur pour éviter la contamination croisée, ou rincez bien avec du PBS entre les tumeurs. Utilisez 5 mL de milieu frais pour hacher chaque tumeur.
  7. Préparer la solution de dissociation tumorale : 20 μg/mL de Liberase TL + 100 μg/mL de DNAse I dans un milieu RPMI-1640 (sans FBS).
    REMARQUE: De nombreuses formulations efficaces pour les solutions de dissociation tumorale existent et peuvent inclure une variété d’enzymes et d’autres composants de différents fabricants. Les concentrations optimales de composants peuvent varier considérablement selon les types de tumeurs. Si les globules rouges sont fortement présents dans la tumeur, la lyse des globules rouges peut également être effectuée; Si les cellules mortes sont un problème, une trousse d’élimination des cellules mortes peut être utilisée. Il est fortement recommandé à l’utilisateur de déterminer indépendamment les conditions optimales de dissociation tumorale qui assurent une viabilité élevée et une faible présence de cellules contaminantes, de matériaux conjonctifs et de débris.
  8. Centrifuger tous les échantillons tumoraux dans des tubes coniques pendant 5 min à 1 000 × g (4 °C). Retirez le surnageant.
  9. Ajouter 1-5 mL de solution de dissociation tumorale à chaque échantillon tumoral, en fonction du volume de matériel tumoral. Assurez-vous qu’il y a 1-2 mL en excès de la pastille de matériel tumoral dans le tube. Vortex à une vitesse modérée pour mélanger.
  10. Placer les échantillons dans un incubateur à 37 °C avec rotation rapide pendant 45 min. Vortex brièvement toutes les 15 minutes.
  11. Filtrer chaque échantillon à travers une crépine cellulaire de 100 μm dans un tube conique de 50 mL. Si les échantillons sont trop visqueux pour passer à travers le filtre, ajouter 10 mL de milieu RPMI-1640 à diluer. Rincer les filtres avec un milieu RPMI pour recueillir les cellules résiduelles.
  12. Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules/ml pour chaque échantillon.
  13. Aliquote deux réplicas ou plus de 5 × 106 cellules par échantillon tumoral.
  14. Centrifuger pendant 5 min à 1 000 × g (4 °C). Retirez le surnageant.
  15. (Facultatif) Cryoconserver les échantillons tumoraux pour une coloration DDAOG ultérieure si vous le souhaitez.
    1. Resuspendre la pastille de cellules tumorales dissociées dans un milieu de cryoconservation : 50% FBS, 40% RPMI-1640, 10% DMSO, préparé dans des conditions stériles à 5 × 106 cellules/mL.
    2. Aliquote 1 mL de suspension cellulaire dans chaque cryovial.
    3. Congeler les cryovials pendant 24 h dans un récipient de congélation de cellules isopropanol à −80 °C; Ensuite, transférer dans un cryostockage d’azote liquide pour un stockage à plus long terme (>1 semaine).
    4. Lorsque la coloration est souhaitée, décongeler les cryovials sur la glace et procéder à la coloration DDAOG dans la section 4.
      REMARQUE: Certaines tumeurs peuvent ne pas rester viables par cryoconservation, et la résilience à ce processus doit être évaluée par l’utilisateur pour le modèle tumoral d’intérêt.
  16. Passez à la section 4 pour la coloration DDAOG.

4. Coloration DDAOG de SA-β-Gal dans des échantillons cellulaires ou tumoraux

  1. Diluer 1 mM de Bafilomycine A1 à 1:1 000x dans un milieu DMEM (sans FBS) pour une concentration finale de 1 μM.
  2. Ajouter la solution préparée de Baf-DMEM aux échantillons de granulés cellulaires (à partir de l’étape 2.11 ou 3.16) pour une concentration de 1 × 106 cellules/mL.
    REMARQUE : Par exemple, si vous utilisez 0,5 × 106 cellules par échantillon, ajoutez 0,5 mL de Baf-DMEM. Pour les tumeurs, 5 × 106 cellules peuvent être colorées dans 5 mL de Baf-DMEM.
  3. Incuber pendant 30 min à 37 °C (sans CO2) sur un rotateur/agitateur réglé à vitesse lente.
    REMARQUE: Évitez les incubateurs de CO2 pour le processus de coloration, qui peuvent acidifier les solutions et ainsi interférer avec la coloration Baf et DDAOG.
  4. Sans laver, ajouter la solution mère DDAOG (5 mg/mL) à 1:500x (10 μg/mL final) à chaque échantillon. Pipette à mélanger. Remplacer sur un rotateur/agitateur à 37 °C (sans CO2) pendant 60 min. Protéger de la lumière directe.
  5. Centrifuger les tubes pendant 5 min à 1 000 x g à 4 °C. Retirez le surnageant.
  6. Laver avec 1 ml de BSA glacé à 0,5 % par tube et à la pipette pour mélanger. Centrifuger les tubes pendant 5 min à 1 000 x g à 4 °C et retirer le surnageant. Répétez cette étape 2x pour bien laver les cellules. Retirez le surnageant et continuez.
    REMARQUE: Il est important d’effectuer les étapes de lavage de l’étape 4.6 pour éliminer le DDAOG onculé, qui peut présenter une émission de fluorescence indésirable (460/610 nm).
    REMARQUE : En cas d’immunomarquage des marqueurs de surface cellulaire, passez à la section 5 ci-dessous.
  7. (Facultatif) Fixation et stockage de cellules colorées DDAOG pour analyse ultérieure
    1. Ajouter goutte à goutte 0,5 mL de paraformaldéhyde glacé à 4 % à chaque échantillon lavé. Pipette à mélanger.
    2. Incuber pendant 10 min à température ambiante.
    3. Lavez les cellules 2x avec 1 mL de PBS.
    4. Conservez les échantillons jusqu’à 1 semaine à 4 °C avant l’analyse par cytométrie en flux.
      Remarque : Pour les échantillons fixes, ignorez l’étape 4.8.
  8. Diluer le stock Calcein Violet 450 AM (1 mM) à 1:1 000x dans 1% BSA-PBS (1 μM final). Ajouter 300 μL (pour les échantillons de cellules en culture) ou 1 000 μL (pour les échantillons tumoraux) aux pastilles de cellules lavées à partir de l’étape 4.6. Incuber pendant 15 min sur de la glace dans l’obscurité.
  9. Passez à la configuration de la cytométrie en flux (section 6).

5. (Facultatif) Immunomarquage pour les marqueurs de surface cellulaire en combinaison avec DDAOG

REMARQUE : Comme pour toute expérience de cytométrie en flux, des échantillons témoins à coloration unique contenant uniquement du DDAOG et des anticorps fluorescents seulement doivent être préparés pour déterminer la diaphonie (le cas échéant) entre les canaux de fluorescence. Si la diaphonie est observée, une compensation de cytométrie de flux standard doit être effectuée20.

  1. Resuspendre les pastilles de cellule obtenues à l’étape 4.6 dans 100 μL de tampon de coloration (1% BSA dans 1x PBS).
  2. Ajouter le réactif bloquant le récepteur Fc approprié pour l’espèce cellulaire (souris ou humain) au titrage recommandé par le fabricant. Incuber pendant 10 min à 24 °C.
  3. Ajouter des anticorps conjugués au fluorophore au titrage recommandé par le fabricant (ou déterminé par l’utilisateur). Incuber pendant 20 min sur glace, à l’abri de la lumière.
  4. Centrifuger les tubes pendant 5 min à 1 000 × g à 4 °C. Retirez le surnageant.
  5. Laver avec 1 ml de tampon de lavage glacé (0,5 % BSA-PBS) par tube et pipette pour mélanger. Centrifuger les tubes pendant 5 min à 1 000 × g à 4 °C et retirer le surnageant. Répétez cette étape 2x pour bien laver les cellules.
  6. Diluer 1 mM Calcein Violet 450 AM à 1:1 000x dans 1% BSA-PBS. Ajouter 300 μL aux pastilles de cellules lavées à partir de l’étape 5.5. Incuber pendant 15 min sur de la glace dans l’obscurité.
  7. Procéder à l’analyse par cytométrie en flux (sections 6 et 7).

6. Configuration du cytomètre en flux et acquisition de données

  1. Transférer les échantillons cellulaires dans des tubes compatibles avec l’instrument de cytométrie en flux. Placez les tubes sur de la glace et gardez-les à l’abri de la lumière.
    NOTE: Si des agrégats sont observés dans les suspensions cellulaires, faire passer la suspension dans des crépines cellulaires de 70 à 100 μm avant l’analyse. N’utilisez pas de crépines de 40 μm, car elles peuvent exclure certaines des plus grandes cellules sénescentes.
  2. Dans le logiciel référencé (voir le tableau des matériaux), ouvrez les graphiques suivants : 1) diagramme de points FSC-A vs SSC-A, 2) histogramme de canal violet, 3) diagramme de points de canal rouge lointain (par exemple, APC-A) ou de canal vert (par exemple, FITC-A).
    REMARQUE : Des diagrammes d’exclusion de doublets et des histogrammes monocanaux peuvent également être utilisés, mais ne sont pas strictement obligatoires.
  3. Initier l’acquisition des données du cytomètre.
    1. Placez l’échantillon témoin du véhicule uniquement taché avec DDAOG sur l’orifice d’admission. À une faible vitesse d’admission, commencez à acquérir des données d’échantillonnage.
    2. Ajustez les tensions FSC et SSC de sorte que > 90 % des événements soient contenus dans le graphique. Si les cellules ne s’adaptent pas bien au tracé, abaissez le paramètre de mise à l’échelle de la zone à 0,33-0,5 unité.
    3. Retirez l’échantillon du véhicule uniquement sans enregistrer de données.
    4. (Facultatif) Ajouter une gouttelette de microsphères d’étalonnage arc-en-ciel dans un tube cytométrique avec 1 mL de PBS. Placez le tube sur l’orifice d’admission du cytomètre. Commencez à acquérir des exemples de données.
    5. Ajustez les tensions des canaux violet, vert et rouge lointain de sorte que le pic supérieur de la microsphère arc-en-ciel soit compris entre 10 4 et 105 unités de fluorescence relative dans chaque canalet que tous les pics soient bien séparés dans chaque canal. Record de 10 000 événements. Retirez le tube.
  4. Placer l’échantillon témoin positif (p. ex. BLM, ETO) coloré au DDAOG sur l’orifice d’admission. À faible vitesse, acquérir des échantillons de données. Observez les événements dans les canaux FSC, SSC, violet, vert et rouge lointain pour vous assurer que plus de 90% des événements sont contenus dans toutes les placettes. Recherchez une augmentation du signal AF et DDAOG par rapport au contrôle du véhicule uniquement.
  5. Si vous utilisez un cytomètre de tri, lancez le tri à cette étape.
    1. Aux fins de la tenue des dossiers, consigner 10 000 cellules pour l’échantillon témoin et chaque échantillon trié.
    2. Trier la quantité souhaitée de cellules (≥1 × 106 convient généralement) dans un tube de collecte approprié à l’instrument avec 3 à 5 ml de milieu de culture.
    3. Après le tri, passez à la culture ou à l’analyse en aval.
    4. Passez à la section 7 pour l’analyse de routine des échantillons triés.
  6. Si vous utilisez des anticorps fluorescents, optimisez les tensions des canaux ici en utilisant les échantillons non colorés, monocolorés et à double coloration préparés dans la section 5.
    REMARQUE: Pour le cytomètre en flux étalonné utilisé ici, les tensions optimales des canaux se situent généralement entre 250 et 600 (milieu de gamme), mais les tensions optimales et les plages de tension de canal varient d’un instrument à l’autre. Évitez d’utiliser des tensions à des plages très basses ou élevées, qui peuvent supprimer le signal ou amplifier le bruit.
  7. Après avoir terminé les étapes 6.1 à 6.5 et apporté les ajustements nécessaires aux réglages du cytomètre, consignez les données de tous les échantillons. Assurez-vous que les paramètres restent uniformes pour tous les enregistrements d’échantillons. Enregistrez ≥10 000 événements par échantillon de cellules cultivées ou 100 000 ≥ événements par échantillon de cellules tumorales.
    REMARQUE : Bien que l’établissement de points de contrôle et l’analyse puissent être effectués à l’aide d’un logiciel d’acquisition de données (p. ex., FACSDiva), un flux de travail complet d’établissement de points de contrôle et d’analyse à effectuer après l’acquisition à l’aide d’un logiciel d’analyse distinct (FlowJo) est décrit à la section 7 ci-dessous. L’analyse post-acquisition est privilégiée pour réduire le temps passé au poste de travail du cytomètre et profiter des outils supplémentaires inclus dans le logiciel d’analyse dédié.
  8. Enregistrez des exemples de données au format de fichier .fcs. Exportez les fichiers vers un poste de travail équipé d’un logiciel d’analyse de cytométrie en flux (par exemple, FlowJo). Passez à la section 7.

7. Analyse des données de cytométrie en flux

REMARQUE: Le flux de travail présenté utilise le logiciel FlowJo. Un logiciel alternatif d’analyse des données de cytométrie en flux peut être utilisé si les étapes clés décrites dans cette section sont suivies de la même manière.

  1. À l’aide du logiciel FlowJo, ouvrez les fichiers de données .fcs de l’étape 6.7.
  2. Ouvrez la fenêtre de mise en page.
  3. Faites glisser et déposez tous les échantillons dans la fenêtre de mise en page.
  4. Portes des cellules viables.
    1. Double-cliquez d’abord sur les exemples de données pour la commande du véhicule uniquement pour ouvrir sa fenêtre de données.
    2. Visualisez les données sous forme d’histogramme à canal violet. Identifier les cellules viables colorées par CV450 en fonction de leur fluorescence plus brillante que les cellules mortes.
    3. Dessinez une porte à l’aide de l’outil d’histogramme à porte unique pour inclure uniquement les cellules viables. Nommez la porte viable.
    4. Ensuite, à partir de la fenêtre de disposition d’exemple, faites glisser la porte viable sur les autres échantillons de cellules pour appliquer la porte uniformément.
    5. Dans la fenêtre de mise en page, visualisez tous les échantillons sous forme d’histogrammes de canal violet (viabilité). Vérifier que le contrôle cellulaire viable est approprié pour tous les échantillons avant de procéder; Si ce n’est pas le cas, apportez les ajustements nécessaires.
      REMARQUE: La coloration de viabilité peut présenter des variations selon les traitements ou les tumeurs.
  5. Portes des cellules sénescentes.
    1. Double-cliquez sur les données de cellule viable fermées pour le contrôle du véhicule uniquement pour ouvrir sa fenêtre de données.
    2. Visualisez les données sous forme de diagramme à points pour le canal rouge lointain (DDAOG) par rapport au canal vert (AF).
    3. Dessinez une porte à l’aide de l’outil de contrôle rectangulaire pour inclure <5 % des cellules DDAOG+ et AF+ (quadrant supérieur droit). Nommez la porte sénescente.
    4. Ensuite, à partir de la fenêtre de disposition des exemples, faites glisser la porte sénescente sur les sous-ensembles viables des autres échantillons de cellules pour appliquer la porte uniformément.
    5. Dans la fenêtre de mise en page, faites glisser et déposez tous les sous-ensembles de cellules viables répertoriés dans la section 7.4. Visualisez tous les échantillons viables sous forme de diagrammes à points rouge lointain (p. ex., APC-A) ou en chenaux verts (p. ex., FITC-A).
    6. S’assurer que la barrière sénescente dessinée à l’étape 7.5.3 est visible sur toutes les placettes et que la barrière de contrôle du véhicule seulement présente ≤5 % à 10 % de cellules sénescentes.
  6. Une fois que le pourcentage de cellules sénescentes a été déterminé à l’aide des étapes ci-dessus, présenter les données résultantes à l’aide des diagrammes FlowJo, résumés dans un tableau de données et/ou analysés statistiquement à l’aide d’un logiciel standard.

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Representative Results

Plusieurs expériences ont été réalisées pour démontrer la comparabilité du DDAOG au X-Gal et au C12-FDG pour la détection de la sénescence par SA-β-Gal. Tout d’abord, X-Gal a été utilisé pour colorer les cellules sénescentes du mélanome B16-F10 induites par ETO (Figure 2A). Une couleur bleue intense s’est développée dans un sous-ensemble de cellules traitées par ETO, tandis que d’autres cellules présentaient une coloration bleue moins intense. La morphologie a été élargie dans la plupart des cellules traitées par ETO. La coloration des cellules traitées par ETO avec un substrat fluorescent SA-β-Gal C12-FDG (vert) ou DDAOG (rouge lointain) a montré des profils de coloration et des variations d’intensité comparables à X-Gal (Figure 2B). Cependant, l’émission de C12-FDG vert chevauchait la FA cellulaire (Figure 2C), qui est connue pour s’accumuler dans les cellules sénescentes17. En revanche, la FA était négligeable dans la gamme d’émissions rouge lointain du DDAOG.

Au lieu d’utiliser un microscope à fluorescence pour marquer et compter les cellules sénescentes, il était plus opportun de tirer parti des capacités à haut débit d’un cytomètre en flux pour acquérir des données pour des milliers de cellules par échantillon en peu de temps (<5 min par échantillon). Tout d’abord, une série de paramètres standard de configuration de cytométrie en flux ont été mis en œuvre pour assurer une acquisition optimale des données (Figure 3). Suivant une approche typique, des paramètres de diffusion de la lumière ont été définis pour visualiser le volume (diffusion directe, FSC) et la granularité (diffusion latérale, SSC) des cellules (Figure 3A). Ici, nous avons noté la tendance à l’augmentation du volume de cellules traitées par ETO, ce qui concordait avec la morphologie élargie généralement observée pour les cellules sénescentes par microscopie. Une réduction des paramètres de mise à l’échelle par défaut (à 0,33-0,50 unité selon le type de cellule et le traitement) était nécessaire pour visualiser un plus grand nombre de cellules plus grandes sur la parcelle. Pour certaines lignées cellulaires/traitements, une granularité accrue (SSC) était également évidente (données non présentées). Dans l’ensemble, l’évaluation de la dispersion a été utilisée comme étape de contrôle de la qualité pour vérifier que les données de dispersion cellulaire apparaissaient comme prévu, qu’il n’y avait pas de débris cellulaires excessifs et que les cellules étaient traitées dans le cytomètre à des débits appropriés (~100-1000 cellules/s). En tant qu’étape de contrôle de la qualité utilisée uniquement pour la configuration de l’instrument, aucun point de contrôle ou analyse n’a été effectué ici.

Une deuxième étape (facultative) de la configuration de la cytométrie en flux consistait à analyser brièvement un échantillon de particules d’étalonnage « arc-en-ciel » disponibles dans le commerce pour s’assurer que les tensions de détection fluorescentes étaient réglées dans des plages acceptables (figure 3B). Le pic le plus brillant a été réglé entre 1 × 104 unités et 1 × 105 unités d’intensité fluorescente relative dans chaque canal, avec des pics d’intensité plus faible clairement définis, une séparation suffisante entre chaque pic et aucun chevauchement des pics voisins. Un échantillon témoin de 10 000 microsphères a été enregistré en utilisant ces réglages de tension. Les microsphères ont ensuite été utilisées de cette manière à chaque séance de cytométrie afin d’améliorer l’uniformité de l’acquisition des données au cours du protocole.

Ensuite, des échantillons de cellules traitées uniquement par véhicule ou par ETO ont été visualisés dans chaque canal fluorescent, et des barrières ont été installées. Les portes de viabilité cellulaire ont été réglées en fonction du signal de la coloration de viabilité CV450 dans le canal violet (Figure 3C). Les cellules traitées uniquement par véhicule présentaient une viabilité de 88 % et les cellules traitées par ETO présentaient une viabilité de 75 % (dans l’échantillon cellulaire final; d’autres cellules mortes ont probablement été initialement éliminées dans des milieux de culture mis au rebut et désintégrées mécaniquement pendant le processus de coloration). Ensuite, des cellules fermées viables ont été visualisées dans les canaux d’émission vert (Figure 3D) et rouge lointain (Figure 3E). Les portes pour l’AF HI verte et la DDAOGHI rouge lointain ont été fixées à <5% des cellules du véhicule uniquement, et ces portes ont ensuite été appliquées aux cellules traitées par ETO. À l’aide de cette approche, il a été déterminé que 46 % des cellules traitées par ETO étaient AF HI et 33 % étaient DDAOGHI ; Ces valeurs se situaient dans la fourchette attendue d’après la littérature et les résultats de nombreuses expériences répétées dans notre laboratoire. Une fois la configuration du cytomètre terminée, tous les échantillons de cellules de l’expérience ont été exécutés en utilisant des paramètres d’acquisition de données identiques. Des données pour 10 000 événements par échantillon ont été obtenues.

Des données d’essai représentatives sont présentées à la figure 4. Des cellules de mélanome murin B16-F10 ou des cellules d’adénocarcinome pulmonaire humain A549 ont été utilisées comme modèles de lignées cellulaires cancéreuses. Chaque lignée cellulaire a été traitée avec un agent de chimiothérapie connu pour induire la sénescence (ETO ou BLM) pendant 4 jours pour induire la sénescence ou véhicule seulement. De plus, l’agent sénolytique connu ABT-26321 a été ajouté aux cellules sénescentes induites pendant 2 jours pour démontrer la spécificité de la sonde DDAOG. Seuls les échantillons ABT-263 ont été préparés comme témoins supplémentaires. Ici, les données sont visualisées sous forme de diagrammes de points 2D avec DDAOG (émission de 670 nm) par rapport à AF (525 nm). Le flux de travail de la figure 3 a été utilisé pour la configuration du cytomètre, et une porte TIS a été réglée de telle sorte que <5% des cellules du véhicule uniquement ont obtenu le score TIS. Les résultats obtenus à l’aide de cellules B16-F10 (Figure 4A) ont montré que l’ETO induisait le TIS dans 35 % des cellules B16-F10 viables (similaire aux données comparables présentées à la Figure 2D,E) et que l’agent sénolytique éliminait presque complètement les cellules TIS (<2 %). Dans les cellules A549 (Figure 4B), le BLM a induit le TIS dans 66% des cellules viables, et ABT-263 a réduit le pourcentage à 15%. ABT-263 seul n’était pas toxique pour les cellules proliférantes non traitées.

Nous avons également cherché à démontrer que la cocoloration des anticorps fluorescents était compatible avec le test de sénescence DDAOG pour faciliter le criblage de marqueurs de surface associés au TIS ou nouveaux. Ici, les cellules de mélanome de souris B16-F10 ont de nouveau été traitées avec ETO (ou véhicule) induisant le TIS pendant 4 jours. Ensuite, les cellules ont été colorées avec DDAOG pour évaluer TIS et avec un anticorps fluorescent pour détecter le marqueur de surface associé au TIS DPP422 (Figure 5). L’anti-DPP4 conjugué à la R-phycoérythrine (PE) a été utilisé, et nous avons confirmé un chevauchement négligeable de l’EP avec le DDAOG et la FA sur le cytomètre en flux utilisé (figure supplémentaire S2). Un histogramme des données des canaux PE (Figure 5A) pour >5 000 cellules viables a montré que 42% des cellules traitées par ETO étaient DPP4+ (en utilisant l’échantillon de véhicule uniquement pour définir la porte de positivité). La visualisation de diagrammes de points 2D pour les mêmes échantillons (figure 5B,C) a indiqué que 44 % des cellules traitées par ETO étaient doublement positives pour le DDAOG (c.-à-d. sénescent) et la DPP4 contre 4 % des cellules véhicule. Ces données démontrent que la coloration de cellules vivantes avec des anticorps marqueurs de surface est possible en combinaison avec le test de sénescence DDAOG.

Les préoccupations potentielles avec toute méthode de coloration de cellules vivantes comprennent la mort cellulaire survenant pendant de longues séances d’analyse (>1 h) et la façon la plus efficace de colorer et d’analyser les échantillons à de nombreux moments différents (jusqu’à quelques jours d’intervalle). La fixation à base de solvant des cellules colorées répond à ces deux préoccupations, car les échantillons peuvent être fixés dès qu’ils sont colorés, puis stockés au réfrigérateur jusqu’à l’analyse dans un lot stable à température. Ainsi, nous avons testé si les cellules vivantes colorées au DDAOG pouvaient être fixées avec 100% de méthanol ou 4% de paraformaldéhyde (PFA) et stockées jusqu’à 1 semaine à 4 ° C. Malheureusement, la fixation au méthanol a diminué le signal DDAOG et réduit considérablement la mise au point automatique (données non présentées); Par conséquent, l’utilisation de méthanol comme solvant de fixation doit être évitée. Cependant, la fixation avec le PFA a été beaucoup plus efficace, comme le montre la figure 6 pour les cellules fixées dans du PFA à 4% pendant 10 minutes après coloration avec DDAOG. Comparativement aux échantillons témoins non fixés (figure 6A; non traité, 5 % et BLM, 67 % DDAOG HI AF HI HI HI), les échantillons fixes (figure 6B) présentaient un fond légèrement plus élevé dans les cellules non traitées (9 %) et également un pourcentage plus élevé de cellules sénescentes dans les cellules traitées par BLM (80 %). Cet effet a également été observé dans des échantillons fixes conservés pendant la nuit (Figure 6C ; non traité, 12 % et BLM, 72 %) et conservés pendant 1 semaine à 4 °C (Figure 6D ; 14 % et 70 %). Malgré les légères augmentations de fluorescence causées par la fixation de PFA, l’induction de la sénescence par BLM était toujours évidente dans tous les échantillons fixes par rapport à l’échantillon non traité apparié. De plus, les cellules sont restées intactes pendant le stockage avec seulement une légère détérioration au jour 7, et aucune agrégation problématique n’a été observée. Nous concluons que la commodité de pouvoir fixer et stocker des échantillons de cellules pour une analyse ultérieure par lots justifiera de tolérer le bruit de fond légèrement plus élevé causé par la fixation PFA, en particulier dans les expériences avec de nombreux échantillons ou points temporels.

Un défi commun dans la recherche sur la sénescence cellulaire est l’apparition hétérogène de la sénescence dans les populations cellulaires. Ici, nous montrons que le DDAOG peut être utilisé pour le FACS de cellules sénescentes viables et que les cellules collectées survivent en culture pour des essais in vitro en aval (Figure 7). Pour trier les cellules par FACS, les cellules sont traitées et colorées, comme décrit, et triées par un cytomètre en flux compatible FACS en utilisant la stratégie de contrôle DDAOG versus AF illustrée ici (Figure 7A). Comme une sonde de viabilité n’est pas utilisée ici en raison de préoccupations de toxicité à long terme, nous recommandons d’effectuer un contrôle de diffusion rigoureux avant le contrôle final des cellules sénescentes (figure supplémentaire S3) afin d’éliminer les débris faussement positifs des cellules collectées. Il s’agit de procédures standard de contrôle FACS qui devraient être familières à un utilisateur modérément expérimenté et qui peuvent être rapidement établies à l’aide d’un logiciel à l’instrument (<10 min).

Après avoir trié un échantillon de cellules A549 traitées par BLM, nous avons remis les cellules en culture dans des boîtes multipuits standard pendant 5 jours (n = 6 répétitions) à 10 × 103 cellules / cm2. Les témoins non triés ont été plaqués à la même densité, cultivés à côté, et les cellules non traitées et traitées BLM ont été incluses. Des cellules ont été observées quotidiennement; Pour les cellules triées, aucune mort cellulaire significative ou retour à la prolifération n’a été observé. Les cellules triées sont restées clairsemées (c.-à-d. qu’elles ne prolifèrent pas) pendant 5 jours en culture, tandis que les cellules non traitées et traitées par BLM sont devenues confluentes, comme indiqué. Le jour 5, les cellules ont été fixées dans le PFA et colorées pour la morphologie et les marqueurs de prolifération (Figure 7B). La morphologie élargie caractéristique des cellules triées a été révélée par coloration fluorescente de phalloïdine de l’actine filamenteuse, avec coloration DAPI pour montrer des noyaux élargis. Les cellules triées avaient un très grand diamètre (>10 μm) avec un aspect arrondi caractéristique. Comme prévu, la coloration des anticorps Ki67 a révélé une perte complète du marqueur de prolifération dans l’échantillon trié par rapport à une perte partielle dans l’échantillon non trié traité par BLM, et des niveaux normaux de Ki67 ont été observés dans de nombreuses cellules de l’échantillon non traité-non trié. Au moins trois images ont été prises par puits en utilisant des paramètres d’imagerie uniformes sur les échantillons. Des images représentatives sont présentées (figure 7B).

Enfin, nous avons évalué si les cellules sénescentes apparaissant dans les tumeurs établies chez les souris traitées avec des médicaments chimiothérapeutiques pouvaient être identifiées à l’aide de DDAOG. Des tumeurs de mélanome B16-F10 ont été induites dans le flanc de souris C57 / BL6, qui ont ensuite été traitées trois fois (i.p., tous les 5 jours) avec une solution saline seule (Figure 8A), DOX (Figure 8B) ou PLD (Figure 8C). Après le troisième traitement, les souris ont récupéré pendant 7 jours pour permettre l’apparition de la sénescence et ont ensuite été sacrifiées et les tumeurs excisées. Les tumeurs ont été réduites de moitié, la moitié étant utilisée pour préparer des lames de tissus congelés pour la coloration X-Gal (Figure 8) et l’autre moitié dissociée en suspensions unicellulaires et colorée avec DDAOG (Figure 8 et Figure supplémentaire S4). La coloration X-Gal dans les tissus était plutôt faible malgré une longue durée de coloration (72 h), mais la coloration bleue était évidente dans les tumeurs DOX et PLD après un examen attentif, en particulier dans les tumeurs qui ont également obtenu un score positif pour la sénescence par le test de flux DDAOG (Figure 8B,C). Au moins trois images ont été prises par lame de tissu et des images représentatives sont présentées.

Par rapport à X-Gal, le DDAOG était un moyen plus sensible et plus précis de quantifier la sénescence dans les tumeurs (Figure 8). Pour l’analyse tumorale DDAOG, la tumeur traitée au sérum physiologique avec le fond de fluorescence le plus élevé a été utilisée pour régler la porte de sénescence à <5%, de sorte que les autres tumeurs traitées par une solution saline n’ont pas obtenu un score supérieur à 5% de sénescence. Cette porte de sénescence a ensuite été appliquée par lots sur des cellules viables fermées de toutes les tumeurs. Les deux agents de chimiothérapie ont induit la sénescence dans certaines tumeurs (deux tumeurs sur cinq pour DOX, trois sur cinq pour PLD), avec des pourcentages de cellules tumorales sénescentes variant de 3% à 36% par tumeur. Les diagrammes de données cytométriques pour les 15 tumeurs sont présentés dans la figure supplémentaire S4, et un résumé des données de cytométrie tumorale est présenté à la figure 8D (n = 5; (*) p < 0,05 par rapport au groupe témoin avec une solution saline seule selon le test de variance F). Nous concluons que la cytométrie en flux DDAOG versus AF est une méthode acceptable pour le dépistage des tumeurs et des agents de chimiothérapie pour l’induction de la sénescence in vivo.

Figure 2
Figure 2 : DDAOG est une coloration sensible et spécifique pour SA-β-Gal. (A) Coloration conventionnelle pour SA-β-Gal à l’aide de X-Gal montrant des cellules de mélanome murin B16-F10 non traitées (à gauche) ou traitées par ETO (à droite). Sénescence induite par ETO : les cellules présentent une morphologie élargie et une coloration bleue due au clivage de X-Gal par une SA-β-Gal élevée. Barres d’échelle = 10 μm. (B) Coloration fluorescente pour le SA-β-Gal dans les cellules traitées par ETO en utilisant soit C12-FDG (émission de 515 nm, vert) ou DDAOG (660 nm, rouge). La distribution des taches est similaire pour les deux sondes, ce qui indique que le DDAOG détecte le SA-β-Gal de la même manière que le C12-FDG. (C) Évaluation de la FA dans les cellules non colorées traitées par ETO dans le canal d’émission vert (émission de 525 nm, à gauche) ou rouge lointain (660 nm, à droite). La FA de la lipofuscine est élevée dans le canal d’émission vert et négligeable dans le canal rouge lointain. Temps d’exposition = 2 000 ms pour chaque image. Barres d’échelle = 10 μm. Cette figure est tirée de Flor et Kron23. Abréviations : DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-diméthylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-Galactoside; X-Gal = 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside; UNT = non traité; ETO = étoposide; AF = autofluorescence; C12-FDG = 5-dodécanoylaminofluorescéine di-β-D-galactopyranoside; SA-β-Gal = bêta-galactosidase associée à la sénescence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Configuration de l’acquisition des données du cytomètre en flux. (A) Distribution représentative des cellules par nuage de points. FSC-A est une lecture du volume cellulaire, et SSC-A indique la granularité cellulaire. Panneau de gauche, traitement des cellules A549 uniquement sur véhicule. Panneau droit, traitement ETO pour induire la sénescence. Notez la tendance à l’augmentation du volume cellulaire des cellules traitées par ETO, en accord avec la morphologie élargie évidente de la microscopie. (B) Utilisation facultative de microsphères commerciales d’étalonnage fluorescent « arc-en-ciel » à 5 pics pour régler les tensions du détecteur du cytomètre. Dans chaque canal de fluorescence utilisé, le pic maximal doit être réglé ≤1 x 105 unités fluorescentes relatives en ajustant la tension du détecteur de cytomètre pendant que les échantillons sont en marche. Panneau gauche, canal BV421 (violet); centre, canal FITC (vert); à droite, canal APC (rouge). Les cinq pics fluorescents doivent présenter un espacement distinct, comme illustré. (C-E) Données représentatives de fluorescence monocanal pour la coloration de viabilité (C) à l’aide d’un colorant violet CV450; (D) autofluorescence verte des cellules; (E) signal rouge lointain du DDAOG, détectant SA-β-Gal. Histogramme de couleur plus foncée, traitement pour véhicule uniquement; histogramme couleur plus claire, traitement ETO. Les portes parentales sont indiquées au-dessus de chaque parcelle. Abréviations : FSC-A = zone de pic de diffusion vers l’avant; SSC-A = aire de pic de diffusion latérale; ETO = étoposide; BV421-A = zone de crête du canal Brilliant Violet 421; FITC-A = surface de crête du canal isothiocyanate de fluorescéine; APC-A = zone de pic du canal allophycocyanine; AF = autofluorescence; DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-diméthylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-Galactoside; VEH = véhicule. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Données représentatives pour le test de sénescence par cytométrie en flux. (A) cellules de mélanome murin B16-F10 traitées avec un véhicule (en haut à gauche) seulement, (en haut à droite) ETO, (en bas à gauche) ABT-263 (1 μM) seulement, ou (en bas à droite) ETO plus ABT-263. (B) A549 cellules d’adénocarcinome pulmonaire humain traitées avec un véhicule (en haut à gauche) seulement, (en haut à droite) BLM, (en bas à gauche) ABT-263 seulement, ou (en bas à droite) BLM plus ABT-263. (A,B) Des portes rectangulaires dans les quadrants supérieurs droits de toutes les parcelles définissent les cellules sénescentes (DDAOG HI AFHI). Le pourcentage de cellules sénescentes (du total des cellules viables par échantillon) est indiqué sur chaque placette. Abréviations : DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-diméthylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-Galactoside; ETO = étoposide; BLM = bléomycine; VEH = véhicule; TIS = sénescence induite par la thérapie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Cocoloration d’un exemple de marqueur de surface cellulaire avec le test de sénescence. (A) Immunodétection du marqueur de sénescence DPP4 à la surface de cellules viables en culture B16-F10; orange foncé, véhicule seulement; orange clair, ETO. (B,C) Panneaux centraux et droits : cellules cocolorées avec DDAOG et anti-DPP4:PE. Les cellules DDAOG HI DPP4HI sont contenues dans des portes rectangulaires indiquées sur les placettes, et le pourcentage de cellules doublement positives par échantillon est indiqué. Illustré : cellules viables-dépendantes. Abréviations : DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-diméthylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-Galactoside; ETO = étoposide; VEH = véhicule; DPP4 = dipeptidyl peptidase 4. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Fixation post-coloration et stockage d’échantillons de cellules colorées au DDAOG en vue d’une analyse ultérieure. (A) Contrôle, échantillons non fixés de cellules A549 vivantes non traitées (à gauche) ou traitées avec BLM (à droite) pour induire la sénescence, puis colorées et immédiatement analysées selon le protocole DDAOG (sans fixation, jour 0). (B) Échantillons préparés comme au point A) puis immédiatement fixés dans du paraformaldéhyde à 4 % et analysés (jour 0). C) Échantillons préparés conformément au point A, immédiatement fixés dans du paraformaldéhyde à 4 % et conservés pendant une nuit à 4 °C avant analyse. D) Échantillons préparés conformément au point A), immédiatement fixés et conservés pendant 7 jours avant l’analyse. Des portes rectangulaires dans les quadrants supérieurs droits de toutes les parcelles définissent les cellules sénescentes (DDAOG HI AFHI). Le pourcentage de cellules sénescentes est indiqué sur chaque placette. Abréviations : TIS = sénescence induite par la thérapie; DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-diméthylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-Galactoside; BLM = bléomycine; AF = autofluorescence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Tri cytométrique en flux et validation des populations de cellules sénescentes enrichies. (A) Données de tri par cytométrie en flux montrant (à gauche) le contrôle non traité, coloré par DDAOG, utilisé pour régler la porte pour le tri des cellules sénescentes (<5% de cellules sénescentes dans la région fermée) et (à droite) l’échantillon traité BLM et coloré DDAOG qui a été trié à l’aide de la porte de tri comme indiqué. (B) Images de microscopie à fluorescence pour les cellules (colonne gauche) colorées avec Phalloïdine-Alexa Fluor 647 (pseudocouleur orange) pour détecter la F-actine et le DAPI (bleu) pour contrer les noyaux, démontrant une morphologie élargie des cellules sénescentes, ou des cellules (colonne droite) colorées avec des anticorps Ki67 de lapin et anti-lapin Alexa Fluor 594 pour détecter la perte de prolifération dans les cellules sénescentes. Rangée du haut, cellules non traitées et non triées. Rangée centrale, cellules traitées BLM et non triées. Rangée inférieure, cellules traitées BLM et triées. Barres d’échelle = 10 μm. Abréviations : TIS = sénescence induite par la thérapie; DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-diméthylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-Galactoside; BLM = bléomycine; UNT = non traité; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : Quantification de la sénescence dans les tumeurs de souris traitées avec des médicaments de chimiothérapie. Des tumeurs de mélanome B16-F10 ont été établies dans les flancs de souris C67BL / 6, qui ont ensuite été traitées avec trois doses de (A) solution saline, (B) DOX ou (C) PLD tous les 5 jours plus 1 semaine pour permettre l’apparition de la sénescence. Les tumeurs ont été excisées et réduites de moitié; Des lames de tissus congelés ont été préparées à partir d’une moitié pour la coloration X-Gal (rangée supérieure), et l’autre moitié a été dissociée pour la coloration DDAOG (rangée inférieure). Dans les images colorées X-Gal, les cellules bleues sont des cellules sénescentes SA-β-Gal HI, tandis que les régions brunes sont dues à la mélanine dans les tumeurs. Des résultats représentatifs sont présentés pour DOX et PLD de deux tumeurs par groupe qui présentaient une sénescence. Toutes les tumeurs salines présentaient une sénescence négligeable. (D) Quantification de la sénescence dans les tumeurs traitées par des médicaments chez la souris. (*) p < 0,05 par le test de variance F, n = 5 souris par groupe. Barres d’erreur, moyenne ± SEM. Abréviations : DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-diméthylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-Galactoside; DOX = doxorubicine; PLD = doxorubicine liposomale PEGylée; X-Gal = 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside; AF = autofluorescence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire S1 : Structure chimique de la sonde DDAOG. Le DDAOG est un conjugué de 7-hydroxy-9H-(1,3-dichloro-9,9-diméthylacridin-2-one) et de bêta-galactoside. Lorsqu’il est clivé par la bêta-galactosidase, le produit de clivage hydrolysé présente un décalage d’émission de fluorescence rouge lointain de 50 nm, permettant sa détection spécifique avec une excitation supérieure à 600 nm. Abréviations : DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-diméthylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-Galactoside. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S2 : balayage spectral de la diaphonie DDAOG avec d’autres canaux fluorescents du cytomètre en flux. Pour identifier les canaux disponibles pour la détection des anticorps fluorescents, un balayage spectral a été effectué sur un cytomètre en flux à 4 lasers et 15 canaux à l’aide de cellules A549 traitées avec BLM et colorées avec DDAOG (rouge) ou non colorées (noir). Les données dans chaque canal du cytomètre en flux ont été acquises pour 10 000 cellules. (A) Canaux d’émission du laser 405 nm : de gauche à droite, BV421, BV510, BV605, BV660 et BV711. La diaphonie observée dans les canaux BV605, BV660 et BV711 les rend impropres à la cocoloration avec DDAOG sans compensation. BV421 et BV510 conviennent à la cocoloration (notez que BV421 est généralement utilisé pour la coloration de viabilité). B) Canaux d’émission du laser 488 nm: FITC et PerCP-Cy5. Une diaphonie élevée a été observée pour le canal PerCP-Cy5. FITC convient à la cocoloration; cependant, notez que le canal FITC est généralement utilisé dans le test DDAOG pour l’évaluation de la FA à émission verte. (C) Canaux d’émission du laser 561 nm : PE, PE-Dazzle 594, PE-Cy5, PE-Cy5.5 et PE-Cy7. Les canaux PE et PE-Dazzle 594 conviennent à la détection d’anticorps marqués avec ces fluorophores (PE est démontré pour la détection de DPP4 dans cette étude). (D) Canaux d’émission du laser 640 nm : APC, APC-H700 et APC-Cy7. Le signal DDAOG des cellules sénescentes est visible dans le canal APC (47,8% sénescent). Le signal se chevauche dans les canaux APC-H700 et APC-Cy7, ce qui les rend impropres à la co-coloration sans compensation spectrale significative. Abréviations : BLM = bléomycine; BV = violet brillant; FITC = isothiocyanate de fluorescéine; PerCP = protéine péridinine-chlorophylle; PE = phycoérythrine; DZ594 = Éblouissement 594; APC = allophyocyanine; AF = autofluorescence; DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-diméthylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-Galactoside. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S3 : Stratégie de contrôle cellulaire pour le tri FACS des cellules sénescentes. Le passage d’une suspension de cellules à travers un cytomètre FACS sensible peut nécessiter un contrôle supplémentaire pour assurer la pureté du tri et la fonctionnalité optimale de l’instrument. Un exemple de stratégie est présenté ici. D’autres stratégies sont possibles en fonction des recommandations du fabricant pour le cytomètre FACS utilisé. Colonne de gauche, contrôle de cellule traitée uniquement par véhicule. Colonne droite, cellules A549 traitées avec BLM pour induire la sénescence à trier. (A) FSC-A (volume cellulaire) versus SSC-A (granularité cellulaire) gating of intacts. La porte intacte élimine les débris cellulaires de l’échantillon trié. B) Critères de pureté FSC-A par rapport à FSC-H; Enlève les doublets et les débris. (C) Critères de pureté de la SSC-A par rapport au SSC-H; Enlève les doublets et les débris. D) Établissement de points de contrôle pour la population d’intérêt utilisant le canal APC-A (excitation de 637 nm, émission de 670 nm ± 30 nm, utilisé pour le DDAOG) par rapport au canal FITC-A (excitation de 488 nm, émission de 530 nm ± 30 nm, utilisé pour la FA); Supprime les éventuels artefacts de coloration. (E) Contrôle des cellules sénescentes pour le tri final. Abréviations : FACS = tri cellulaire activé par fluorescence; BLM = bléomycine; FSC-A = aire du pic de diffusion vers l’avant; SSC-A = aire de pic de diffusion latérale; FSC-H = hauteur du pic de diffusion vers l’avant; SSC-H = hauteur du pic de diffusion latérale. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S4 : Coloration par cytométrie en flux de sénescence DDAOG des tumeurs. Données de cytométrie en flux pour ≥ 50 000 cellules tumorales viables. Porte cellulaire sénescente, quadrant supérieur droit de chaque parcelle. Le pourcentage de cellules tumorales sénescentes (viables) est indiqué à l’intérieur de la porte. Les traitements tumoraux comprenaient (A) une solution saline seulement; b) DOX; et c) PLD. Les souris ont été traitées trois fois, une fois tous les 5 jours, avec 7 jours de récupération pour permettre l’apparition de la sénescence avant le sacrifice. Cinq tumeurs par condition ont été analysées. Abréviations : AF = autofluorescence; DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-diméthylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-Galactoside; DOX = doxorubicine; PLD = doxorubicine liposomale PEGylée. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Au cours de la dernière décennie, la cytométrie en flux est devenue une plate-forme de dosage plus courante dans la recherche sur le cancer en raison de la popularité émergente de l’immunologie tumorale, du développement de cytomètres en flux à moindre coût et de l’amélioration des installations d’instrumentation partagées dans les établissements universitaires. Les tests multicolores sont maintenant standard, car la plupart des nouveaux instruments sont équipés de réseaux optiques violet, bleu-vert et rouge à rouge lointain. Ainsi, ce protocole DDAOG est susceptible d’être compatible avec un large éventail de cytomètres en flux. Bien sûr, tout cytomètre en flux doit être évalué par l’utilisateur. Des précautions particulières doivent être prises lors de l’ajout de fluorophores supplémentaires (p. ex. fluorescents, anticorps conjugués) au test DDAOG. Une évaluation de la diaphonie fluorophore entre les canaux doit être effectuée à l’aide de témoins à coloration unique visualisés dans tous les autres canaux pertinents. Si un chevauchement est observé, une compensation spectrale peut être effectuée20 pour correction en suivant des méthodes typiques.

Les résultats présentés ici visent principalement à démontrer que le test de cytométrie en flux DDAOG peut produire des résultats rapides, quantitatifs et faciles à interpréter pour le TIS induit par les médicaments de chimiothérapie dans les cellules ou les tumeurs. Les agents utilisés ici, y compris ETO 23,24, DOX7,25 et BLM26,27, ont été documentés pour induire TIS dans diverses lignées cellulaires cancéreuses 24. Pour démontrer la spécificité de la sonde DDAOG, il a été démontré que l’agent sénolytique connu ABT-26321 élimine sélectivement les cellules sénescentes en culture. Cet article démontre l’utilisation d’une lignée cellulaire cancéreuse en culture murine (B16-F10) et humaine (A549), ainsi que de tumeurs B16-F10 établies chez la souris. Cependant, toutes les cellules qui expriment β-Gal et conservent leur viabilité grâce à une préparation d’échantillon de cytométrie en flux standard peuvent être utilisées. Certains types de cellules peuvent être plus fragiles ou moins sujettes aux TIS, et cela devrait être évalué avant de se lancer dans un grand écran ou une étude. Si les cellules se désintègrent en préparation, si la viabilité est faible ou si le TIS est beaucoup plus faible que prévu en utilisant des témoins d’agents positifs, le type de cellule peut ne pas être un modèle idéal pour les études de la sénescence. Les agents et les lignées cellulaires présentés ici peuvent être utilisés par d’autres groupes comme témoins dans un dépistage plus approfondi d’agents inducteurs de SIT potentiels ou de nouveaux sénolytiques, ce qui reste un objectif actif dans le domaine.

La toxicité induite par les agents chimiothérapeutiques peut varier selon les types de cellules et affecter les résultats des essais. Si le principal effet observé de l’agent et/ou de la concentration utilisée est la mort cellulaire aiguë, la sénescence globale peut être minime. In vivo, une nécrose tumorale élevée ou une toxicité systémique chez l’animal doit être évitée en abaissant la dose d’agent. La clé du succès de l’essai est l’essai d’une gamme de concentrations d’agents, avec une inspection minutieuse des données d’essai de viabilité (par exemple, comme fourni par CV450 dans le test DDAOG). In vitro, si de nombreuses cellules mortes se détachent de la plaque pendant le traitement, y compris le milieu de culture dans l’échantillon analysé, il est important d’évaluer la mort cellulaire au total. CV450 n’est pas la seule coloration de viabilité compatible avec ce test; D’autres fluorophores émetteurs violet/bleu peuvent être utilisés. Des sondes de viabilité réparables peuvent également être utilisées si l’utilisateur prévoit de fixer les échantillons colorés avec du PFA, à condition que la fluorescence de la sonde ne chevauche pas de manière significative le DDAOG ou l’AF (ou que l’utilisateur effectue une compensation spectrale pour corriger le chevauchement). Dans certains cas où la toxicité de l’agent est faible et que les cellules sont robustes, il peut suffire d’isoler les cellules « viables » aux fins d’analyse.

Une étape clé de ce protocole in vitro consiste à plaquer les cellules dans la plage inférieure de densité de croissance logarithmique (généralement 2 × 10 3-5 × 103 cellules/cm2) pour permettre une prolifération initiale rapide, ce qui facilite l’absorption du médicament de chimiothérapie par la plupart des cellules. Une fois traité, il est également important de prévoir du temps pour l’apparition du TIS: in vitro, 4 jours ± 1 jour en présence du médicament; in vivo, 7 jours de récupération après le traitement final de chimiothérapie. Après coloration avec DDAOG comme décrit, l’analyse quantitative des données cytométriques doit être effectuée comme indiqué, c’est-à-dire l’analyse comparative des cellules DDAOG par rapport aux cellules AF dans chaque échantillon pour déterminer le pourcentage de cellules sénescentes (du total viable). Les étapes optionnelles comprennent l’utilisation de microsphères d’étalonnage fluorescentes « arc-en-ciel » pour normaliser la cytométrie en flux, la fixation PFA d’échantillons colorés, la co-immunomarquage pour les marqueurs de surface et le tri en flux pour enrichir les cellules sénescentes pour les essais en aval. Cependant, chacune de ces étapes facultatives offre des avantages clés dans certaines applications. Les microsphères d’étalonnage standardisent la configuration cytométrique sur plusieurs sessions et permettent à l’utilisateur de régler initialement les tensions dans une plage utile pour la détection de la sénescence et de la viabilité, avec un minimum d’ajustements par la suite. La fixation PFA des échantillons stabilise les cellules et permet une analyse par lots de grands ensembles de cellules à un moment ultérieur. La co-immunocoloration des marqueurs de surface peut être utilisée pour dépister de nouvelles protéines liées à la sénescence et des interactions immunitaires. Dans de futures études, nous prévoyons de valider la co-coloration des marqueurs de sénescence intracellulaire avec DDAOG.

Le tri des cellules TIS par FACS permet l’enrichissement de cellules TIS viables à partir de populations hétérogènes, ce qui peut confondre les lectures pour les tests en aval tels que le transfert Western, la protéomique ou la transcriptomique. Après tri, aucune toxicité significative du DDAOG n’a été observée dans les cellules TIS remises en culture pendant une période allant jusqu’à 5 jours. Cependant, il faut tenir compte du fait que les cellules triées ont été traitées avec du Baf, internalisées de DDAOG (qui est clivé par SA-β-Gal en DDAO, un colorant acridine) et soumises à des contraintes mécaniques traversant l’instrument FACS. Par conséquent, certaines altérations biologiques non liées à la sénescence peuvent être présentes dans les cellules triées. Cependant, dans cette étude, les cellules triées ont conservé de fortes caractéristiques de sénescence et ont fourni des résultats caractéristiques en protéomique et transcriptomique28 par rapport aux témoins non triés. Malgré l’utilité quelque peu évidente de l’utilisation de FACS pour collecter et analyser des cellules sénescentes de tumeurs, cette procédure a rarement été utilisée dans la littérature. Certains groupes ont utilisé la p16Ink4a luciférase ou des rapporteurs fluorescents pour identifier les cellules sénescentes dans les tissus de souris, les rapporteurs fluorescents permettant le tri FACS dans certaines études29,30. Les résultats s’accordent généralement à dire que, quel que soit l’agent d’induction ou le type de tumeur, le TIS dans les tumeurs est un événement partiel à rare, atteignant rarement 100% des cellules tumorales31. Le tri FACS des cellules à l’aide de la méthode DDAOG permet facilement la collecte de cellules TIS rares à partir de tumeurs, sans avoir besoin d’exprimer des constructions transgéniques.

Actuellement, la plupart des recherches sur la sénescence sur des modèles murins sont menées ex vivo à l’aide d’une combinaison de marqueurs X-Gal et d’immunohistochimie32,33. Pourtant, l’évaluation ex vivo du TIS à l’aide de tissus tumoraux peut être un processus long, en particulier lorsque X-Gal est utilisé. Cette procédure nécessite la cryoconservation de la tumeur, la cryosection sur lames, la coloration X-Gal, le montage du verre de couverture, le séchage, l’imagerie et la notation des cellules « bleues » - une approche de plusieurs jours au minimum. L’immunohistochimie n’est pas beaucoup plus rapide ou plus facile, et différentes sections de tissus doivent être utilisées et notées pour chaque marqueur plus X-Gal dans chaque tumeur, à moins que l’analyse multiplexée ne soit optimisée, ce qui ajoute plus de temps au début du processus. Les coupes de tissus n’échantillonnent qu’une seule section transversale mince de la tumeur, tandis que les cellules sénescentes (comme de nombreux types de cellules) peuvent être réparties de manière inégale dans l’espace 3D à travers les tumeurs29. Il est urgent sur le terrain de s’éloigner des méthodes histologiques lentes et dépassées vers un test de sénescence plus rapide et facilement quantifiable pour les tumeurs. En utilisant la cytométrie en flux DDAOG, un ensemble de 15 tumeurs a pu être dissocié et coloré pour obtenir des données de sénescence quantitatives concluantes en moins d’un jour de temps pratique après la récolte de la tumeur. La moitié de la tumeur a été traitée pour chaque échantillon, améliorant ainsi l’échantillonnage de l’espace 3D par tumeur. Cette approche de cytométrie en flux DDAOG est significativement plus rapide et plus fiable que les méthodes basées sur des lames tissulaires pour l’évaluation des TIS dans les tumeurs.

Avec ses nombreux avantages par rapport au X-Gal et à d’autres méthodes, nous plaidons pour que le protocole DDAOG devienne le nouveau test de sénescence de référence. Il utilise à la fois le marqueur de sénescence conventionnellement accepté, SA-β-Gal, et la détection sans marquage de la FA associée à l’âge comme deuxième marqueur. Ces fluorophores sont compatibles avec la plupart des cytomètres de flux standard. Le test comprend une coloration de viabilité pour exclure les cellules mortes et les débris à l’aide d’échantillons facilement obtenus à partir de lignées cellulaires ou de tumeurs cultivées traitées par médicament. Les échantillons de cellules vivantes peuvent éventuellement être fixés au solvant ou cryoconservés pour faciliter l’analyse par lots d’études de grande envergure, par exemple, en utilisant des points temporels pour évaluer l’apparition du TIS au fil du temps à l’aide de plusieurs agents Le processus de coloration prend moins d’une demi-journée de travail en laboratoire et l’acquisition des données est généralement de <5 min par échantillon. L’analyse des données est tout aussi rapide et simple, produisant des données quantitatives sur le pourcentage de cellules TIS par échantillon sans notation et comptage fastidieux des cellules. Les échantillons peuvent être triés par FACS pour récupérer des populations enrichies de cellules TIS, ce qui réduit le bruit de l’hétérogénéité cellulaire dans les analyses en aval. Nous pensons que le test DDAOG peut, dans de nombreux cas, remplacer X-Gal, facilitant le criblage d’agents inducteurs de TIS et de sénolytiques in vitro et in vivo, conduisant à des découvertes plus rapides et plus fiables dans le domaine de la recherche sur la sénescence.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer pour cette étude.

Acknowledgments

Nous remercions le Cytometry and Antibody Core Facility de l’Université de Chicago pour son soutien sur l’instrumentation de cytométrie en flux. Le Centre de recherche animale de l’Université de Chicago a fourni un logement pour animaux.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bafilomycin A1 Research Products International B40500
Bleomycin sulfate  Cayman 13877
Bovine serum albumin (BSA) US Biological A1380
Calcein Violet 450 AM viability dye ThermoFisher Scientific 65-0854-39 eBioscience
DPP4 antibody, PE conjugate Biolegend 137803 Clone H194-112
Cell line: A549 human lung adenocarcinoma American Type Culture Collection CCL-185
Cell line: B16-F10 mouse melanoma American Type Culture Collection CRL-6475
Cell scraper Corning 3008
Cell strainers, 100 µm Falcon 352360
DDAO-Galactoside Life Technologies D6488
DMEM medium 1x Life Technologies 11960-069
DMSO Sigma D2438
DNAse I Sigma DN25
Doxorubicin, hydrochloride injection (USP) Pfizer NDC 0069-3032-20
Doxorubicin, PEGylated liposomal (USP) Sun Pharmaceutical NDC 47335-049-40
EDTA 0.5 M Life Technologies 15575-038
Etoposide  Cayman 12092
FBS Omega  FB-11
Fc receptor blocking reagent Biolegend 101320 Anti-mouse CD16/32
Flow cytometer (cell analyzer) Becton Dickinson (BD) Various LSRFortessa
Flow cytometer (cell sorter) Becton Dickinson (BD) Various FACSAria
GlutaMax 100x Life Technologies 35050061
HEPES 1 M Lonza BW17737
Liberase TL Sigma 5401020001 Roche
Paraformaldehyde 16% Electron Microscopy Sciences 15710
Penicillin/Streptomycin 100x Life Technologies 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) 1x Corning MT21031CV Dulbecco's PBS (without calcium and magnesium)
Rainbow calibration particles, ultra kit SpheroTech UCRP-38-2K 3.5-3.9 µm, 2E6/mL
RPMI-1640 medium 1x Life Technologies 11875-119
Sodium chloride 0.9% (USP) Baxter Healthcare Corporation 2B1324
Software for cytometer data acquisition, "FACSDiva" Becton Dickinson (BD) n/a Contact BD for license
Software for cytometer data analysis, "FlowJo" TreeStar n/a Contact TreeStar for license
Trypsin-EDTA 0.25% Life Technologies 25200-114

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Recherche sur le cancer numéro 187 Sénescence cancer chimiothérapie cytométrie en flux sonde fluorescente multiplex
Sonde β-galactosidase associée à la sénescence fluorescente rouge lointain pour l’identification et l’enrichissement de cellules tumorales sénescentes par cytométrie en flux
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Flor, A., Pagacz, J., Thompson, D.,… More

Flor, A., Pagacz, J., Thompson, D., Kron, S. Far-Red Fluorescent Senescence-Associated β-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (187), e64176, doi:10.3791/64176 (2022).

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