Sonda de β-Galactosidase Associada à Senescência Fluorescente Vermelha Distante para Identificação e Enriquecimento de Células Tumorais Senescentes por Citometria de Fluxo

Summary

Um protocolo para quantificação citométrica de fluxo fluorescente de células cancerígenas senescentes induzidas por drogas quimioterápicas em cultura de células ou em modelos de tumores murinos é apresentado. Os procedimentos opcionais incluem co-imunocoloração, fixação de amostras para facilitar a análise de grandes lotes ou pontos de tempo e o enriquecimento de células senescentes viáveis por classificação citométrica de fluxo.

Abstract

A senescência celular é um estado de parada proliferativa induzido por danos biológicos que normalmente se acumula ao longo de anos em células envelhecidas, mas também pode surgir rapidamente em células tumorais como resposta a danos induzidos por vários tratamentos contra o câncer. A senescência das células tumorais é geralmente considerada indesejável, pois as células senescentes tornam-se resistentes à morte e bloqueiam a remissão do tumor, exacerbando a malignidade do tumor e a resistência ao tratamento. Portanto, a identificação de células tumorais senescentes é de interesse contínuo para a comunidade de pesquisa do câncer. Existem vários ensaios de senescência, muitos baseados na atividade do conhecido marcador de senescência, a beta-galactosidase associada à senescência (SA-β-Gal).

Normalmente, o ensaio SA-β-Gal é realizado usando um substrato cromogênico (X-Gal) em células fixas, com a enumeração lenta e subjetiva de células senescentes "azuis" por microscopia de luz. Ensaios aprimorados usando substratos SA-β-Gal fluorescentes e permeantes a células, incluindo C_12-FDG (verde) e DDAO-Galactoside (DDAOG; vermelho-distante), permitiram a análise de células vivas e permitiram o uso de plataformas de análise fluorescente de alto rendimento, incluindo citômetros de fluxo. C_12-FDG é uma sonda bem documentada para SA-β-Gal, mas sua emissão fluorescente verde se sobrepõe à autofluorescência celular intrínseca (FA) que surge durante a senescência devido ao acúmulo de agregados de lipofuscina. Ao utilizar a sonda SA-β-Gal DDAOG de vermelho distante, a autofluorescência celular verde pode ser usada como um parâmetro secundário para confirmar a senescência, adicionando confiabilidade ao ensaio. Os canais de fluorescência restantes podem ser usados para coloração de viabilidade celular ou imunomarcação fluorescente opcional.

Usando citometria de fluxo, demonstramos o uso de DDAOG e autofluorescência de lipofuscina como um ensaio de duplo parâmetro para a identificação de células tumorais senescentes. A quantificação da porcentagem de células senescentes viáveis é realizada. Se desejado, uma etapa opcional de imunomarcação pode ser incluída para avaliar antígenos de superfície celular de interesse. As células senescentes identificadas também podem ser classificadas citometricamente e coletadas para análise a jusante. As células senescentes coletadas podem ser imediatamente lisadas (por exemplo, para imunoensaios ou análise ômica) ou cultivadas posteriormente.

Introduction

As células senescentes normalmente se acumulam em organismos ao longo de anos durante o envelhecimento biológico normal, mas também podem se desenvolver rapidamente em células tumorais como resposta a danos induzidos por vários tratamentos contra o câncer, incluindo radiação e quimioterapia. Embora não proliferem mais, as células tumorais senescentes induzidas pela terapia (TIS) podem contribuir para a resistência ao tratamento e impulsionar a recorrência ^1,2,3. Fatores secretados pelas células TIS podem exacerbar a malignidade tumoral, promovendo evasão imune ou metástase ^4,5. As células TIS desenvolvem fenótipos complexos e específicos do contexto, perfis metabólicos alterados e respostas imunes únicas ^6,7,8. Portanto, a identificação e caracterização de células tumorais TIS induzidas por várias abordagens de tratamento do câncer é um tópico de interesse contínuo para a comunidade de pesquisa do câncer.

Para detectar células tumorais TIS, ensaios de senescência convencionais são amplamente utilizados, principalmente baseados na detecção de aumento da atividade da enzima marcadora de senescência, a beta-galactosidase lisossômica GLB1⁹. A detecção em um pH lisossômico quase neutro (em vez de ácido) permite a detecção específica de beta-galactosidase associada à senescência (SA-β-Gal)¹⁰. Um ensaio padrão SA-β-Gal que tem sido usado por várias décadas usa X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), um substrato cromogênico azul beta-galactosidase, para detectar SA-β-Gal em células fixas por microscopia de luz¹¹. O ensaio X-Gal permite a confirmação visual qualitativa do TIS utilizando reagentes comumente disponíveis e equipamentos de laboratório. Um microscópio básico de luz transmitida é a única instrumentação necessária para avaliar a presença do cromogênio azul. No entanto, o procedimento de coloração X-Gal pode não ter sensibilidade, às vezes exigindo mais de 24 horas para que a cor se desenvolva. A coloração é seguida por uma pontuação subjetiva de baixo rendimento de células senescentes individuais com base na contagem das células que exibem algum nível de intensidade do cromogênio azul sob um microscópio de luz. Como o X-Gal é impermeável a células, este ensaio requer células fixas com solvente, que não podem ser recuperadas para análise a jusante. Ao trabalhar com amostras limitadas de animais ou pacientes, isso pode ser uma grande desvantagem.

Ensaios melhorados de SA-β-Gal utilizando substratos enzimáticos fluorescentes e permeantes a células, incluindo C 12-FDG (5-dodecanoilaminofluoresceína Di-β-D-Galactopyranoside, verde) e DDAOG (9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-ona-7-il) β-D-Galactopyranoside, far-red) já apareceram na literatura^12,13,14,15. A estrutura da sonda química e as características ópticas do DDAOG são mostradas na Figura Suplementar S1. Essas sondas perfeitas por células permitem a análise de células vivas (em vez de fixas), e as sondas fluorescentes, em vez de cromogênicas, facilitam o uso de plataformas de análise fluorescente rápidas de alto rendimento, incluindo instrumentos de triagem de alto conteúdo e citômetros de fluxo. Os citômetros de fluxo de triagem permitem a recuperação de populações enriquecidas de células senescentes vivas de culturas celulares ou tumores para análise a jusante (por exemplo, western blotting, ELISA ou 'omics'). A análise de fluorescência também fornece um sinal quantitativo, permitindo uma determinação mais precisa da porcentagem de células senescentes dentro de uma determinada amostra. Sondas fluorescentes adicionais, incluindo sondas de viabilidade e anticorpos marcados com fluoróforos, podem ser prontamente adicionadas para análise multiplexada de alvos além de SA-β-Gal.

Semelhante ao DDAOG, o C_12-FDG é uma sonda fluorescente para SA-β-Gal, mas sua emissão fluorescente verde se sobrepõe à FA celular intrínseca, que surge durante a senescência devido ao acúmulo de agregados de lipofuscina nas células¹⁶. Utilizando a sonda DDAOG vermelho-distante, a FA celular verde pode ser utilizada como parâmetro secundário para confirmar a senescência¹⁷. Isso melhora a confiabilidade do ensaio com o uso de um segundo marcador, além do SA-β-Gal, que muitas vezes pode não ser confiável como um único marcador de senescência¹⁸. Como a detecção de FA endógena em células senescentes é uma abordagem livre de rótulos, é uma maneira rápida e simples de expandir a especificidade do nosso ensaio baseado em DDAOG.

Neste protocolo, demonstramos o uso de DDAOG e FA como um ensaio rápido de citometria de fluxo de dois parâmetros para a identificação de células tumorais TIS viáveis de culturas in vitro ou isoladas de tumores tratados com drogas estabelecidos em camundongos (Figura 1). O protocolo utiliza fluoróforos compatíveis com uma ampla gama de analisadores e classificadores de citometria de fluxo comercial padrão (Tabela 1). A quantificação da porcentagem de células senescentes viáveis usando a análise de citometria de fluxo padrão é habilitada. Se desejado, uma etapa opcional de imunomarcação pode ser realizada para avaliar antígenos de superfície celular de interesse concomitantemente com a senescência. As células senescentes identificadas também podem ser enriquecidas usando a metodologia padrão de classificação celular ativada por fluorescência (FACS).

Figura 1: Fluxo de trabalho experimental. Um esquema que resume os pontos-chave do ensaio DDAOG. (A) Uma droga indutora de TIS é adicionada a células cultivadas de mamíferos ou administrada a camundongos portadores de tumores. O tempo é então permitido para o início do TIS: para as células, 4 dias após o tratamento; para camundongos, 22 dias no total, com três tratamentos a cada 5 dias mais 7 dias de recuperação. As células são colhidas ou os tumores são dissociados em suspensão. (B) As amostras são tratadas com Baf para ajustar o pH lisossômico para detecção de SA-β-Gal por 30 min; em seguida, a sonda DDAOG é adicionada por 60 min para detectar SA-β-Gal. As amostras são lavadas 2x em PBS, e uma mancha de viabilidade é brevemente adicionada (15 min). Opcionalmente, as amostras podem ser coradas com anticorpos fluorescentes em canais de fluorescência abertos e/ou fixadas para análise posterior. (C) As amostras são analisadas usando um citômetro de fluxo padrão. Células viáveis são visualizadas em gráficos de pontos mostrando DDAOG vermelho (indicando SA-β-Gal) versus autofluorescência verde (lipofuscina). Uma porta para determinar a porcentagem de células TIS é estabelecida com base em amostras de controle não tratadas (não mostradas). Se um citômetro de classificação (FACS) for usado, as células TIS podem ser coletadas e colocadas de volta em cultura para ensaios in vitro adicionais ou lisadas e processadas para ensaios de biologia molecular. Abreviaturas: DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-ona); DDAOG = DDAO-Galactoside; TIS = senescência induzida pela terapia; FL-Ab = anticorpo conjugado com fluoróforo; Baf = Bafilomicina A1; SA-β-Gal = beta-galactosidase associada à senescência; PBS = solução salina tamponada com fosfato; FACS = classificação celular ativada por fluorescência. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Fluoróforo	Detecta	Ex/Em (nm)	Citômetro a laser (nm)	Detector de citômetro / filtro passa-banda (nm)
DDAOG	SA-β-Gal	645/6601	640	670 / 30
AF	Lipofuscina	< 600	488	525 / 50
CV450	Viabilidade	408/450	405	450 / 50
PE	Anticorpo/marcador de superfície	565/578	561	582 / 15

Tabela 1: Fluoróforos e especificações ópticas do citômetro. As especificações do citômetro utilizadas neste protocolo são listadas para um instrumento com um total de 4 lasers e 15 detectores de emissão. DDAOG detectado a 645/660 nm é a forma da sonda clivada por SA-β-Gal¹. O Uncleaved DDAOG pode apresentar fluorescência de baixo nível a 460/610 nm, mas é removido por etapas de lavagem no protocolo. Abreviaturas: DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-ona); DDAOG = DDAO-Galactoside; FA = autofluorescência; EP = ficoeritrina; SA-β-Gal = beta-galactosidase associada à senescência.

Protocol

Todo o trabalho com animais descrito foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Chicago.

1. Preparação e armazenagem de soluções-mãe

NOTA: Se as células forem classificadas por fluxo, todas as soluções devem ser preparadas usando técnicas estéreis e filtradas através de um dispositivo de filtro de 0,22 μm.

1. Preparar uma solução-mãe de DDAO-Galactoside a 5 mg/ml em DMSO. Alíquota a 50 μL por tubo (ou volume desejado). Conservar a -20 °C no escuro até 1 ano.
2. Preparar uma solução-mãe de Bafilomicina A1 a 1 mM em DMSO. Alíquota a 50 μL por tubo (ou volume desejado). Conservar a -20 °C até 6 meses.
3. Preparar uma solução de estoque de Calcein Violet 450 AM a 1 mM em DMSO. Alíquota a 50 μL por tubo (ou volume desejado). Conservar a -20 °C no escuro até 1 ano.
4. Para o tratamento de células cultivadas in vitro, preparar soluções-mãe concentradas de 10 mM de agente(s) indutor(es) de senescência no solvente apropriado e esterilizar utilizando filtros de seringa de 0,2 μm. Conservar a -20 °C ou conforme indicado pelo fabricante.
   NOTA: Para a administração de agentes quimioterápicos indutores de senescência in vivo (para camundongos com tumores estabelecidos), os agentes devem ser de grau USP e diluídos em solução salina a partir de estoque concentrado imediatamente antes da injeção.
5. Preparar o meio de cultura completo para a(s) linha(s) celular(is) que está a ser utilizada.
   NOTA: Por exemplo, prepare o meio para células B16-F10 ou A549 com DMEM 1x + 10% FBS + 1x substituto de glutamina + 1x penicilina/estreptomicina. Os meios devem ser mantidos estéreis. Outras formulações de meios específicos de linhagem celular podem ser usadas. Certos componentes, como a glutationa, podem, em alguns casos, interferir no início da senescência. Testes empíricos de várias formulações de meios devem ser realizados se o início da senescência for menor do que o esperado ou não observado com agentes quimioterápicos de controle.
6. Prepare os amortecedores de coloração e lave.
   1. Preparar 1% de albumina sérica bovina (BSA) em 1x PBS para uso em procedimentos de coloração. Dissolver 2 g de BSA em 200 ml de PBS e agitar durante 10 min, ou até dissolver totalmente, à temperatura ambiente.
   2. Prepare 0,5% de BSA em 1x PBS como um tampão de lavagem. Diluir 100 mL da ASC a 1% preparada na etapa 1.6.1 em 100 mL de 1x PBS para ASC a 0,5%.
   3. Armazenar os buffers a 4 °C por até 1 mês.
7. Prepare 4% de paraformaldeído em 1x PBS. Use ampolas de paraformaldeído seladas disponíveis comercialmente (por exemplo, 16% v/v) para conveniência e estabilidade: 2,5 mL de PFA a 16% + 7,5 mL de PBS 1x (= 10 mL de PFA a 4%). Ajuste o volume preparado dependendo do volume total necessário por experimento.
   NOTA: Prepare-se conforme necessário apenas para a fixação da célula; preparar fresco cada vez.
8. Prepare o tampão de classificação FACS: 1x PBS, 1 mM EDTA, 25 mM HEPES, 1% BSA (pH 7,2). Filtro estéril através de um dispositivo de filtração de 0,22 μm e conservar a 4 °C até 1 mês.
   NOTA: Prepare-se conforme necessário apenas para a classificação FACS. As formulações de tampão de classificação de fluxo podem variar entre os instrumentos FACS. A formulação acima é compatível com o instrumento utilizado neste estudo (ver Tabela de Materiais). Consulte as diretrizes do fabricante.
9. Preparar solução de dissociação tumoral: 20 μg/mL de Liberase TL + 100 μg/mL de DNAse I em meio RPMI-1640 (sem FBS ou outros suplementos). As soluções de reserva são úteis para manter à mão a Liberase TL (preparada e armazenada conforme indicado pelo fabricante) e a DNAse I (100 mg/ml em água duplamente destilada [ddH₂O], armazenada a -20 °C).
   NOTA: Prepare-se conforme necessário se estiver usando apenas tumores; preparar fresco cada vez.

2. Indução da senescência por quimioterápicos em células cancerígenas cultivadas

NOTA: Todas as etapas de manipulação celular nesta seção devem ser executadas em um gabinete de biossegurança usando práticas estéreis. Esta seção foi escrita para tipos de células aderentes. As células de suspensão podem ser utilizadas com as modificações adequadas, tal como indicado.

1. Cultivar linha(s) de células cancerígenas(s) de acordo com o protocolo padrão do fornecedor ou do laboratório que forneceu a(s) linha(s) celular(is) específica(s) utilizada(s).
   NOTA: Células de baixa passagem (p < 10) são geralmente preferidas, pois haverá níveis mais baixos de senescência replicativa, ou seja, fundo inferior, em amostras de células não tratadas.
2. Um dia antes da indução da senescência por drogas, colha as células com tripsina-EDTA a 0,25% (ou conforme recomendado). Neutralize a tripsina adicionando um volume igual de meio de cultura completo e transfira a suspensão celular para um tubo cônico estéril.
   NOTA: Este passo não é necessário para células de suspensão.
3. Conte as células usando o método padrão do hemacitômetro e registre as células/mL. Células de placa a 1 × 10 3-10 × 10³ células/cm² em pratos de cultura plástica padrão de 6 poços.
   NOTA: A densidade de revestimento ideal depende da taxa de proliferação de células e deve ser determinada pelo usuário. As células devem estar em fase logarítmica de crescimento com aproximadamente 10%-20% de confluência no momento do tratamento (ou seja, após 18-24 h de incubação após o plaqueamento). A densidade inicial (células/ml) das células em suspensão deve ser determinada pelo utilizador. Placas de seis poços normalmente produzem células senescentes suficientes por poço para uma amostra de análise de citometria de fluxo padrão. Se a classificação de fluxo, uma área de superfície muito maior (por exemplo, várias placas P150) deve ser usada para permitir a recuperação de um número suficiente de células senescentes para ensaios a jusante (≥1 × 10⁶).
4. Incubar células chapeadas durante a noite (18-24 h) em uma incubadora de 37 °C com 5% de CO₂ e uma panela de umidade.
5. Trate as células chapeadas com droga(s) quimioterápica indutora de senescência. Inclua pelo menos um controle positivo, por exemplo, etoposídeo (ETO) ou bleomicina (BLM). Prepare poços duplicados por medicamento. Inclua um conjunto tratado apenas com veículo como controle.
   NOTA: Uma curva de dose para cada agente experimental deve ser testada pelo usuário para determinar a concentração ideal para a indução de senescência na(s) linha(s) celular(is) que está sendo usada(s).
6. Incubar as células durante 4 dias numa incubadora a 37 °C com 5% de CO₂ e uma bandeja de humidade para permitir o aparecimento de senescência. Examine diariamente as mudanças morfológicas esperadas usando um microscópio de luz.
   NOTA: Os tempos de incubação de 3-5 dias podem ser aceitáveis, dependendo da taxa de início da senescência. A mídia pode ser alterada e o agente reaplicado (ou não), conforme desejado, para promover condições de crescimento saudáveis, alcançando uma porcentagem aceitável de células senescentes.
7. Após o início da senescência, colher as células adicionando tripsina-EDTA a 0,25% por 5 min a 37 °C. Quando as células são dissociadas em suspensão, neutralize a tripsina com um volume igual de meio completo.
   Observação : esta etapa não é necessária para células que crescem em suspensão. Se a coloração do marcador de superfície for realizada, evite o uso de tripsina-EDTA, pois pode destruir temporariamente os antígenos de superfície nas células. Em vez disso, dissociar suavemente a monocamada usando um raspador de células de plástico estéril (ou um reagente de dissociação alternativo projetado para preservar antígenos de superfície).
8. Conte as células em cada amostra usando um hemacitômetro. Calcular as células/ml para cada amostra.
   NOTA: O azul de tripano pode ser adicionado para avaliar a porcentagem de células mortas neste momento (ou seja, devido ao tratamento medicamentoso), mas a morte celular também será determinada com um corante de viabilidade fluorescente durante o fluxo de trabalho de coloração DDAOG.
9. Alíquota ≥0,5 × 10⁶ células por amostra em tubos de microcentrífuga de 1,7 mL.
   NOTA: O número de células por amostra deve ser padronizado em todas as amostras.
10. Centrifugar os tubos durante 5 min a 1.000 × g numa microcentrífuga a 4 °C. Remova o sobrenadante.
    NOTA: Se uma microcentrífuga refrigerada não estiver disponível, pode ser aceitável realizar centrifugações à temperatura ambiente para certos tipos de células resilientes.
11. Prossiga para a coloração DDAOG na secção 4.

3. Indução da senescência por quimioterápicos em tumores estabelecidos em camundongos

NOTA: Se as células tumorais forem classificadas pelo FACS, garanta a esterilidade em cada etapa, trabalhando em um gabinete de biossegurança e trabalhando com instrumentos, procedimentos e reagentes estéreis.

1. Criar modelos tumorais de camundongos injetando células cancerígenas por via subcutânea, de acordo com métodos padrão (por exemplo, Appelbe et ^al.19).
   NOTA: O número de células cancerosas a serem injetadas, o local de injeção e a cepa apropriada do camundongo devem ser otimizados para cada protocolo. Aqui, as células B16-F10 foram injetadas por via subcutânea a 1 × 10⁶ células em 0,1 mL de solução salina (1 × 10⁷ células/mL).
   1. Verifique se a viabilidade das células que utilizam azul de tripano é de >90% antes de realizar as injeções. Anestesiar os camundongos com isoflurano.
   2. Anestesiar camundongos C57/BL6 fêmeas de 6-7 semanas de idade com uma mistura de isoflurano a 3% e ar e manter sob essas condições em uma câmara de indução colocada dentro de um gabinete de biossegurança estéril. Confirme a anestesia apertando suavemente o pé do rato. Aplique pomada veterinária estéril em ambos os olhos para evitar a secagem da córnea durante o procedimento. Durante o procedimento, mantenha a temperatura do corpo do mouse usando uma lâmpada de aquecimento.
   3. Trabalhando dentro de um gabinete de biossegurança estéril, remova o rato da câmara de indução e coloque-o em contacto com um cone nasal que forneça um fornecimento de isoflurano a 3%. Raspe a área do flanco no local da injeção usando uma navalha elétrica limpa. Misture brevemente a suspensão celular preparada invertendo manualmente o tubo imediatamente antes da injeção e injete a suspensão celular por via subcutânea no(s) flanco(s) raspado(s) utilizando uma seringa estéril de 0,5 ml equipada com uma agulha estéril de 27 G. Remova o mouse do capô e transfira-o para a gaiola de recuperação.
   4. Na gaiola de recuperação, monitore os sinais vitais dos ratos continuamente até que eles tenham recuperado a consciência suficiente para manter a retração esternal, demonstrar o reflexo de endireitamento e sejam capazes de se mover com segurança na gaiola. Não deixe ratos sozinhos ou devolva animais que tenham sido submetidos à inoculação de células tumorais para a companhia de outros animais até que estejam totalmente recuperados. Monitorar todos os camundongos inoculados diariamente para perda de peso, atividade reduzida / mobilidade e sintomas neurológicos; eutanasiar ratos que apresentam sintomas graves em qualquer categoria. Para camundongos que apresentam sintomas de dor após a inoculação, administrar buprenorfina (0,1-0,2 mg/kg) uma vez por via subcutânea.
      NOTA: Os ratos que apresentam dor persistente após a buprenorfina devem ser sacrificados.
2. Começando 5-7 dias após a inoculação de células cancerígenas, meça o crescimento do tumor com paquímetros a cada 2-3 dias. Iniciar o tratamento prosenescente quando o tumor tiver atingido 50 mm 3 ± 10 mm³ em volume.
   NOTA: Neste trabalho, doses de cloridrato de doxorrubicina (DOX) grau USP ou doxorrubicina lipossomal PEGylated (PLD) a 10 mg/kg foram administradas em injeção de cloreto de sódio a 0,9% (USP). Os fármacos foram injetados por via intraperitoneal 3x, uma vez a cada 5 dias, iniciando-se quando os tumores atingiram 50 mm 3 ± 10 mm³. Os ratos se recuperaram por 7 dias após o tratamento final para permitir o início do TIS em tumores. As dosagens de indução de senescência e as condições para outros tratamentos e/ou modelos tumorais devem ser otimizadas.
3. Aos 7 dias após o tratamento medicamentoso final, sacrifique os ratos por overdose de CO₂ e luxação cervical ou outros métodos aprovados em conformidade com as diretrizes de trabalho em animais de laboratório. Excise os tumores e colete-os em tubos estéreis ou placas de 6 poços preenchidas com meio de crescimento RPMI estéril (para preservar a viabilidade durante o processamento).
   NOTA: Se estiver realizando um exame histológico (por exemplo, X-Gal ou imuno-histoquímica), os tumores podem ser bissectados aqui, com metade do snap-frozen em meio de incorporação O.C.T. e criosseccionados usando procedimentos padrão para histologia de tecido congelado. A metade tumoral restante deve produzir material abundante para dissociação e coloração DDAOG.
4. Transfira um tumor para um prato de plástico P100 contendo 5 mL de meio RPMI. Pice o tumor em pedaços usando um bisturi.
5. Transfira 5 mL da suspensão de pedaços tumorais contendo células suspensas e detritos para um tubo cônico de 15 mL. Use a ponta mais larga de uma pipeta sorológica de 25 mL para transferir esta suspensão se grandes detritos estiverem presentes. Lave o prato com um volume adicional de RPMI estéril para coletar materiais. Tampa e coloque o tubo cônico no gelo.
6. Repita os passos 3.45-3.5 para os tumores restantes. Use uma placa e bisturi separados para cada tumor para evitar a contaminação cruzada ou enxágue bem com PBS entre os tumores. Use 5 mL de meio fresco para picar cada tumor.
7. Preparar a solução de dissociação tumoral: 20 μg/mL de Liberase TL + 100 μg/mL de DNAse I em meio RPMI-1640 (sem FBS).
   NOTA: Existem muitas formulações eficazes para soluções de dissociação tumoral que podem incluir uma variedade de enzimas e outros componentes de diferentes fabricantes. As concentrações ideais de componentes podem variar muito entre os tipos de tumores. Se os glóbulos vermelhos estiverem altamente presentes no tumor, a lise dos glóbulos vermelhos pode ser conduzida adicionalmente; se as células mortas forem um problema, um kit de remoção de células mortas pode ser usado. É altamente recomendável que o usuário determine de forma independente as condições ideais de dissociação tumoral que proporcionam alta viabilidade e baixa presença de células contaminantes, material conjuntivo e detritos.
8. Centrifugar todas as amostras tumorais em tubos cônicos por 5 min a 1.000 × g (4 °C). Remova o sobrenadante.
9. Adicione 1-5 mL de solução de dissociação tumoral a cada amostra de tumor, dependendo do volume de material tumoral. Certifique-se de que há 1-2 mL em excesso do material tumoral no tubo. Vórtice a uma velocidade moderada para misturar.
10. Colocar as amostras numa incubadora a 37 °C com rotação rápida durante 45 min. Vórtice brevemente a cada 15 minutos.
11. Filtrar cada amostra através de um filtro celular de 100 μm para um tubo cónico de 50 ml. Se as amostras estiverem muito viscosas para passar pelo filtro, adicione 10 mL de meio RPMI-1640 para diluir. Lave os filtros com meio RPMI para coletar as células residuais.
12. Use um hemacitômetro para contar as células/mL para cada amostra.
13. Aliquot duas ou mais repetições de 5 × 10⁶ células por amostra tumoral.
14. Centrífuga durante 5 min a 4 °C (1.000 × g). Remova o sobrenadante.
15. (Opcional) Criopreservar as amostras de tumor para coloração DDAOG posterior, se desejado.
    1. Ressuspender o pellet de células tumorais dissociadas em meio de criopreservação: 50% FBS, 40% RPMI-1640, 10% DMSO, preparado em condições estéreis a 5 × 10⁶ células/mL.
    2. Aliquot 1 mL de suspensão celular em cada criovial.
    3. Congelar os criovios durante 24 h num recipiente de congelamento de células isopropanol a -80 °C; em seguida, transferir para o crioarmazenamento de nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo (>1 semana).
    4. Quando a coloração for desejada, descongele os criovios no gelo e prossiga para a coloração DDAOG na secção 4.
       NOTA: Alguns tumores podem não permanecer viáveis através da criopreservação, e a resiliência a esse processo deve ser avaliada pelo usuário para o modelo tumoral de interesse.
16. Prossiga para a secção 4 para coloração DDAOG.

4. Coloração DDAOG de SA-β-Gal em amostras celulares ou tumorais

1. Diluir 1 mM de Bafilomicina A1 em 1:1.000x em meio DMEM (sem FBS) para uma concentração final de 1 μM.
2. Adicionar a solução preparada de Baf-DMEM às amostras de pellets de células (das etapas 2.11 ou 3.16) para uma concentração de 1 × 10⁶ células/ml.
   NOTA: Por exemplo, se estiver usando 0,5 × 10⁶ células por amostra, adicione 0,5 mL de Baf-DMEM. Para tumores, 5 × 10⁶ células podem ser coradas em 5 mL de Baf-DMEM.
3. Incubar durante 30 min a 37 °C (sem CO₂) num rotador/agitador regulado a uma velocidade lenta.
   NOTA: Evite incubadoras de CO₂ para o processo de coloração, que podem acidificar as soluções e, assim, interferir com a coloração Baf e DDAOG.
4. Sem lavagem, adicionar a solução-mãe de DDAOG (5 mg/ml) a 1:500x (10 μg/ml final) a cada amostra. Pipeta para misturar. Substituir num rotador/agitador a 37 °C (sem CO₂) durante 60 minutos. Proteja da luz direta.
5. Centrifugar os tubos durante 5 min a 1.000 x g a 4 °C. Remova o sobrenadante.
6. Lave com 1 mL de BSA gelado a 0,5% por tubo e pipeta para misturar. Centrifugar os tubos durante 5 minutos a 1.000 x g a 4 °C e remover o sobrenadante. Repita este passo 2x para lavar bem as células. Remova o sobrenadante e prossiga.
   NOTA: É importante executar as etapas de lavagem na etapa 4.6 para remover o DDAOG tioved, que pode exibir emissão de fluorescência indesejada (460/610 nm).
   NOTA: Se a imunocoloração para marcadores da superfície celular, avance para a secção 5 abaixo.
7. (Opcional) Fixação e armazenamento de células coradas com DDAOG para posterior análise
   1. Adicionar 0,5 mL de paraformaldeído gelado a 4% gota a gota a cada amostra lavada. Pipeta para misturar.
   2. Incubar por 10 min à temperatura ambiente.
   3. Lave as células 2x com 1 mL de PBS.
   4. Conservar as amostras até 1 semana a 4 °C antes da análise da citometria de fluxo.
      Observação : para amostras fixas, ignore a etapa 4.8.
8. Diluir o estoque Calcein Violet 450 AM (1 mM) a 1:1.000x em 1% BSA-PBS (1 μM final). Adicionar 300 μL (para amostras de células cultivadas) ou 1.000 μL (para amostras tumorais) aos pellets de células lavadas a partir da etapa 4.6. Incube por 15 minutos no gelo no escuro.
9. Prossiga para a configuração da citometria de fluxo (secção 6).

5. (Opcional) Imunocoloração para marcadores de superfície celular em combinação com DDAOG

NOTA: Tal como acontece com qualquer experimento de citometria de fluxo, amostras de controle de coloração única com DDAOG apenas e apenas anticorpo fluorescente devem ser preparadas para determinar o crosstalk (se houver) através dos canais de fluorescência. Se for observada conversa cruzada, a compensação da citometria de fluxo padrão deve ser realizada²⁰.

1. Ressuspender os pellets celulares obtidos na etapa 4.6 em 100 μL de tampão de coloração (1% BSA em 1x PBS).
2. Adicione o reagente bloqueador do receptor Fc apropriado para a espécie celular (rato ou humano) na titulação recomendada pelo fabricante. Incubar durante 10 min a 24 °C.
3. Adicione anticorpos conjugados com fluoróforos na titulação recomendada pelo fabricante (ou determinada pelo utilizador). Incubar por 20 min no gelo, protegido da luz.
4. Centrifugar os tubos durante 5 minutos a 1.000 × g a 4 °C. Remova o sobrenadante.
5. Lave com 1 mL de tampão de lavagem gelado (0,5% BSA-PBS) por tubo e pipeta para misturar. Centrifugar os tubos durante 5 minutos a 1.000 × g a 4 °C e remover o sobrenadante. Repita este passo 2x para lavar bem as células.
6. Diluir 1 mM Calcein Violet 450 AM em 1:1.000x em 1% BSA-PBS. Adicionar 300 μL aos pellets de células lavadas a partir do passo 5.5. Incube por 15 minutos no gelo no escuro.
7. Prossiga para a análise da citometria de fluxo (seções 6-7).

6. Configuração do citômetro de fluxo e aquisição de dados

1. Transfira as amostras celulares para tubos compatíveis com o instrumento de citometria de fluxo. Coloque os tubos no gelo e mantenha-os protegidos da luz.
   NOTA: Se forem observados agregados nas suspensões celulares, passe a suspensão através de filtros celulares de 70-100 μm antes da análise. Não use filtros de 40 μm, pois eles podem excluir algumas das células senescentes maiores.
2. No software referenciado (consulte a Tabela de Materiais), abra os seguintes gráficos: 1) gráfico de pontos FSC-A vs SSC-A, 2) histograma de canal violeta, 3) canal vermelho distante (por exemplo, APC-A) versus gráfico de pontos de canal verde (por exemplo, FITC-A).
   NOTA: Gráficos de exclusão de dubleto e histogramas de canal único também podem ser usados, mas não são estritamente necessários.
3. Inicie a aquisição de dados do citômetro.
   1. Coloque a amostra de controlo apenas para veículos corada com DDAOG na porta de admissão. Em uma baixa velocidade de admissão, comece a adquirir dados de amostra.
   2. Ajuste as tensões FSC e SSC para que >90% dos eventos estejam contidos no gráfico. Se as células não se ajustarem bem no gráfico, diminua a configuração de dimensionamento de área para 0,33-0,5 unidades.
   3. Remova a amostra apenas para veículos sem registar dados.
   4. (Opcional) Adicione uma gota de microesferas de calibração do arco-íris a um tubo citômetro com 1 mL de PBS. Coloque o tubo na porta de entrada do citômetro. Comece a adquirir dados de exemplo.
   5. Ajuste as tensões dos canais violeta, verde e vermelho distante para que o pico superior da microesfera do arco-íris esteja na faixa de 10^{4-10 5} unidades de fluorescência relativa em cada canal e todos os picos estejam bem separados em cada canal. Registre 10.000 eventos. Remova o tubo.
4. Coloque a amostra de controle positivo (por exemplo, BLM, ETO) corada com DDAOG na porta de admissão. Em baixa velocidade, adquira dados de amostra. Observe os eventos nos canais FSC, SSC, violeta, verde e vermelho distante para garantir que mais de 90% dos eventos estejam contidos em todas as parcelas. Procure um aumento no sinal AF e DDAOG versus controle somente do veículo.
5. Se estiver usando um citômetro de classificação, inicie a classificação nesta etapa.
   1. Para fins de manutenção de registros, registre 10.000 células para a amostra de controle e cada amostra classificada.
   2. Classifique a quantidade desejada de células (≥1 × 10⁶ é tipicamente adequada) em um tubo de coleta apropriado para o instrumento com 3-5 mL de meio de cultura.
   3. Após a classificação, prossiga para a cultura ou análise a jusante.
   4. Vá para a seção 7 para a análise de rotina de amostras classificadas.
6. Se estiver usando anticorpos fluorescentes, otimize as tensões de canal aqui usando as amostras não coradas, de coloração simples e de dupla coloração preparadas na seção 5.
   NOTA: Para o citômetro de fluxo calibrado usado aqui, as tensões de canal ideais normalmente caem entre 250 e 600 (faixa média), mas as tensões ideais e as faixas de tensão de canal variam entre os instrumentos. Evite usar tensões em faixas muito baixas ou altas, que podem suprimir o sinal ou amplificar o ruído.
7. Depois de concluir as etapas 6.1-6.5 e fazer ajustes nas configurações do citômetro, conforme necessário, registre os dados de todas as amostras. Certifique-se de que as configurações permaneçam uniformes para todas as gravações de amostra. Registre ≥ 10.000 eventos por amostra de células cultivadas ou ≥ 100.000 eventos por amostra de células tumorais.
   NOTA: Embora o gating e a análise possam ser realizados usando software de aquisição de dados (por exemplo, FACSDiva), um fluxo de trabalho completo de gating e análise a ser conduzido após a aquisição usando software de análise separado (FlowJo) é descrito na seção 7 abaixo. A análise pós-aquisição é preferível para reduzir o tempo na estação de trabalho do citômetro e aproveitar as ferramentas adicionais incluídas no software de análise dedicado.
8. Salve dados de exemplo no formato de arquivo .fcs. Exporte os arquivos para um computador de estação de trabalho equipado com software de análise de citometria de fluxo (por exemplo, FlowJo). Prossiga para a seção 7.

7. Análise dos dados da citometria de fluxo

NOTA: O fluxo de trabalho apresentado utiliza o software FlowJo. Um software alternativo de análise de dados de citometria de fluxo pode ser usado se as principais etapas descritas nesta seção forem seguidas de forma semelhante.

1. Usando o software FlowJo, abra arquivos de dados .fcs da etapa 6.7.
2. Abra a janela de layout.
3. Arraste e solte todas as amostras na janela de layout.
4. Células viáveis de portão.
   1. Primeiro, clique duas vezes nos dados de amostra para o controle somente do veículo para abrir sua janela de dados.
   2. Visualize os dados como um histograma de canal violeta. Identifique as células viáveis coradas por CV450 com base em sua fluorescência mais brilhante do que as células mortas.
   3. Desenhe uma porta usando a ferramenta de histograma de porta única para incluir apenas células viáveis. Nomeie o portão viável.
   4. Em seguida, a partir da janela de layout de amostra, arraste a porta viável para as outras amostras de célula para aplicar a porta uniformemente.
   5. Na janela de layout, visualize todas as amostras como histogramas de canal violeta (viabilidade). Verificar se o controle celular viável é apropriado em todas as amostras antes de prosseguir; caso contrário, faça os ajustes necessários.
      NOTA: A coloração de viabilidade pode apresentar variações entre tratamentos ou tumores.
5. Células senescentes do portão.
   1. Clique duas vezes nos dados da célula viável fechada para que o controle somente do veículo abra sua janela de dados.
   2. Visualize os dados como um gráfico de pontos para canal vermelho distante (DDAOG) versus canal verde (AF).
   3. Desenhe uma porta usando a ferramenta de bloqueio de retângulo para incluir <5% das células DDAOG+ e AF⁺ (quadrante superior direito). Nomeie o portão senescente.
   4. Em seguida, a partir da janela de layout da amostra, arraste a porta senescente para os subconjuntos viáveis das outras amostras de células para aplicar a porta uniformemente.
   5. Na janela de layout, arraste e solte todos os subconjuntos de células viáveis fechados na seção 7.4. Visualize todas as amostras viáveis como gráficos de pontos vermelhos distantes (por exemplo, APC-A) versus canais verdes (por exemplo, FITC-A).
   6. Certifique-se de que o portão senescente desenhado na etapa 7.5.3 esteja visível em todas as parcelas e que o portão para o controle somente do veículo exiba células senescentes de ≤5%-10%.
6. Uma vez determinada a porcentagem de células senescentes usando as etapas acima, apresente os dados resultantes usando os gráficos FlowJo, resumidos em uma tabela de dados e/ou analisados estatisticamente usando o software padrão.

Representative Results

Vários experimentos foram realizados para demonstrar a comparabilidade do DDAOG com X-Gal e C_12-FDG para a detecção de senescência por SA-β-Gal. Primeiramente, o X-Gal foi utilizado para corar células senescentes de melanoma B16-F10 induzidas por ETO (Figura 2A). Uma cor azul intensa se desenvolveu em um subconjunto de células tratadas com ETO, enquanto outras células exibiram coloração azul menos intensa. A morfologia foi aumentada na maioria das células tratadas com ETO. A coloração de células tratadas com ETO com substrato fluorescente SA-β-Gal C_12-FDG (verde) ou DDAOG (vermelho-distante) demonstrou padrões de coloração e variações de intensidade comparáveis ao X-Gal (Figura 2B). No entanto, a emissão verde de C_12-FDG sobrepôs-se à FA celular (Figura 2C), que se sabe se acumular em células senescentes¹⁷. Em contraste, a FA foi insignificante na faixa de emissão de vermelho distante do DDAOG.

Em vez de usar um microscópio de fluorescência para pontuar e contar células senescentes, era mais conveniente aproveitar as capacidades de alto rendimento de um citômetro de fluxo para adquirir dados para milhares de células por amostra em um curto espaço de tempo (<5 min por amostra). Primeiramente, uma série de parâmetros padrão de configuração da citometria de fluxo foi implementada para garantir a aquisição ideal dos dados (Figura 3). Seguindo uma abordagem típica, os parâmetros de dispersão de luz foram definidos para visualizar o volume (espalhamento para frente, FSC) e granularidade (espalhamento lateral, SSC) das células (Figura 3A). Aqui, notamos a tendência de aumento do volume de células tratadas com ETO, o que concordou com a morfologia aumentada tipicamente observada para células senescentes usando microscopia. Uma redução nas configurações de dimensionamento de área padrão (para 0,33-0,50 unidades, dependendo do tipo de célula e do tratamento) foi necessária para visualizar mais células maiores no gráfico. Para algumas linhagens celulares/tratamentos, o aumento da granularidade (CSC) também foi evidente (dados não mostrados). No geral, a avaliação de dispersão foi usada como uma etapa de controle de qualidade para verificar se os dados de dispersão celular apareceram conforme o esperado, que o excesso de detritos celulares não estava presente e que as células estavam sendo processadas através do citômetro a taxas de fluxo apropriadas (~100-1000 células/s). Como uma etapa de controle de qualidade usada apenas para a configuração do instrumento, nenhum gating ou análise foi realizado aqui.

Um segundo passo (opcional) na configuração da citometria de fluxo foi analisar brevemente uma amostra de partículas de calibração "arco-íris" comercialmente disponíveis para garantir que as tensões de detecção fluorescente fossem definidas em faixas aceitáveis (Figura 3B). O pico mais brilhante foi definido entre 1 × 10⁴ unidades e 1 × 10⁵ unidades de intensidade fluorescente relativa em cada canal, com picos de menor intensidade claramente definidos, separação suficiente entre cada pico e nenhuma sobreposição de picos vizinhos. Uma amostra de controle de 10.000 microesferas foi registrada usando essas configurações de tensão. As microesferas foram então utilizadas dessa maneira em cada sessão de citometria para melhorar a uniformidade da aquisição de dados ao longo do protocolo.

Em seguida, amostras de células somente de veículo ou tratadas com ETO foram visualizadas em cada canal fluorescente e os portões foram definidos. As portas de viabilidade celular foram ajustadas com base no sinal de coloração de viabilidade CV450 no canal violeta (Figura 3C). As células tratadas apenas com veículos exibiram 88% de viabilidade, e as células tratadas com ETO exibiram 75% de viabilidade (na amostra final de células; células mortas adicionais provavelmente foram inicialmente removidas em meios de cultura descartados e desintegradas mecanicamente durante o processo de coloração). Em seguida, células fechadas viáveis foram visualizadas nos canais de emissão verde (Figura 3D) e vermelho-distante (Figura 3E). Os portões para AF HI verde e DDAOG^HI vermelho distante foram fixados em <5% das células somente de veículos, e esses portões foram então aplicados às células tratadas com ETO. Usando essa abordagem, determinou-se que 46% das células tratadas com ETO eram AF^HI e 33% eram DDAOG^HI; esses valores estavam na faixa esperada com base na literatura e a partir de resultados de inúmeros experimentos replicados em nosso laboratório. Uma vez que a configuração do citômetro foi concluída, todas as amostras de células no experimento foram executadas usando configurações idênticas de aquisição de dados. Foram obtidos dados para 10.000 eventos por amostra.

Os dados representativos do ensaio são mostrados na Figura 4. Células de melanoma murino B16-F10 ou células de adenocarcinoma pulmonar humano A549 foram usadas como modelos de linhagem celular de câncer. Cada linhagem celular foi tratada com um agente quimioterápico conhecido por induzir senescência (ETO ou BLM) por 4 dias para induzir senescência ou apenas veículo. Além disso, o agente senolítico conhecido ABT-263²¹ foi adicionado a células senescentes induzidas por 2 dias para demonstrar a especificidade da sonda DDAOG. Apenas amostras ABT-263 foram preparadas como controles adicionais. Aqui, os dados são visualizados como gráficos de pontos 2D com DDAOG (emissão de 670 nm) versus AF (525 nm). O fluxo de trabalho da Figura 3 foi usado para a configuração do citômetro, e uma porta TIS foi definida de tal forma que <5% das células somente de veículos pontuaram como TIS. Os resultados utilizando células B16-F10 (Figura 4A) mostraram que o ETO induziu TIS em 35% das células B16-F10 viáveis (semelhante aos dados comparáveis mostrados na Figura 2D,E) e o agente senolítico eliminou quase completamente as células TIS (<2%). Nas células A549 (Figura 4B), o BLM induziu TIS em 66% das células viáveis, e o ABT-263 reduziu a porcentagem para 15%. O ABT-263 sozinho não foi tóxico para as células proliferantes não tratadas.

Objetivou-se ainda demonstrar que a cocoloração de anticorpos fluorescentes era compatível com o ensaio de senescência DDAOG para facilitar a triagem de marcadores de superfície associados ao TIS ou novos. Aqui, as células de melanoma de camundongo B16-F10 foram novamente tratadas com ETO indutor de TIS (ou veículo) por 4 dias. Em seguida, as células foram coradas com DDAOG para avaliar o TIS e com um anticorpo fluorescente para detectar o marcador de superfície DPP4^{22 associado ao TIS} (Figura 5). Foi utilizado anti-DPP4 conjugado à R-ficoeritrina (EP), e confirmamos sobreposição insignificante de EP com DDAOG e FA no citômetro de fluxo utilizado (Figura Suplementar S2). Um histograma de dados do canal de EP (Figura 5A) para >5.000 células viáveis mostrou que 42% das células tratadas com ETO eram DPP4⁺ (usando a amostra somente de veículo para definir a porta de positividade). A visualização de gráficos de pontos 2D para as mesmas amostras (Figura 5B,C) indicou que 44% das células tratadas com ETO foram duplamente positivas para DDAOG (ou seja, senescentes) e DPP4 versus 4% das células somente para veículos. Esses dados demonstram que a coloração de células vivas com anticorpos marcadores de superfície é possível em combinação com o ensaio de senescência DDAOG.

Preocupações potenciais com qualquer método de coloração de células vivas incluem a morte celular que ocorre durante longas sessões de análise (>1 h) e como manchar e analisar amostras de forma mais eficiente em muitos pontos de tempo diferentes (até dias de intervalo). A fixação de células coradas à base de solvente aborda essas duas preocupações, pois as amostras podem ser fixadas assim que são coradas e, em seguida, armazenadas na geladeira até a análise em um lote estável à temperatura. Assim, testamos se as células vivas coradas com DDAOG poderiam ser fixadas com metanol a 100% ou paraformaldeído a 4% (PFA) e armazenadas por até 1 semana a 4 °C. Indesejavelmente, a fixação de metanol diminuiu o sinal DDAOG e reduziu significativamente a FA (dados não mostrados); portanto, o uso de metanol como solvente de fixação deve ser evitado. No entanto, a fixação com PFA foi muito mais bem-sucedida, como visto na Figura 6 para células fixadas em PFA a 4% por 10 min após a coloração com DDAOG. Em comparação com amostras de controle não fixas (Figura 6A; não tratadas, 5% e BLM, 67% DDAOG^HI AF^HI), amostras fixas (Figura 6B) exibiram fundo ligeiramente maior em células não tratadas (9%) e também uma porcentagem maior de células pontuando como senescentes em células tratadas com BLM (80%). Esse efeito também foi observado em amostras fixas armazenadas durante a noite (Figura 6C; não tratadas, 12% e BLM, 72%) e armazenadas por 1 semana a 4 °C (Figura 6D; 14% e 70%). Apesar dos ligeiros aumentos na fluorescência causados pela fixação de PFA, a indução da senescência pelo BLM ainda foi evidente em todas as amostras fixas versus a amostra não tratada pareada. Além disso, as células permaneceram intactas em armazenamento, com apenas uma ligeira deterioração até o Dia 7, e nenhuma agregação problemática foi observada. Concluímos que a conveniência de ser capaz de fixar e armazenar amostras de células para posterior análise em lote justificará tolerar o fundo ligeiramente maior causado pela fixação de PFA, particularmente em experimentos com muitas amostras ou pontos de tempo.

Um desafio comum na pesquisa de senescência baseada em células é o início heterogêneo da senescência em populações celulares. Aqui, mostramos que o DDAOG pode ser usado para FACS de células senescentes viáveis e que as células coletadas sobrevivem em cultura para ensaios in vitro a jusante (Figura 7). Para classificar as células por FACS, as células são tratadas e coradas, conforme descrito, e classificadas por um citômetro de fluxo compatível com FACS usando a estratégia de bloqueio DDAOG versus AF mostrada aqui (Figura 7A). Como uma sonda de viabilidade não é usada aqui devido a preocupações de toxicidade a longo prazo, recomendamos que o espalhamento rigoroso seja realizado antes do fechamento final de células senescentes (Figura Suplementar S3) para eliminar detritos falso-positivos das células coletadas. Estes são procedimentos de bloqueio FACS padrão que devem ser familiares a um usuário moderadamente experiente e podem ser rapidamente estabelecidos usando software no instrumento (<10 min).

Após a triagem de uma amostra de células A549 tratadas com BLM, retornamos as células à cultura em placas padrão de multipoços por 5 dias (n = 6 repetições) a 10 × 10³ células/cm². Controles não classificados foram banhados na mesma densidade, cultivados ao lado e células não tratadas e tratadas com BLM foram incluídas. As células foram observadas diariamente; para as células triadas, não foi observada morte celular significativa ou retorno à proliferação. As células classificadas permaneceram esparsas (ou seja, não proliferando) ao longo de 5 dias em cultura, enquanto as células não tratadas e tratadas com BLM tornaram-se confluentes, como mostrado. No 5º dia, as células foram fixadas em PFA e coradas para marcadores de morfologia e proliferação (Figura 7B). A morfologia aumentada característica das células classificadas foi revelada pela coloração fluorescente de faloidina da actina filamentosa, com coloração DAPI para mostrar núcleos aumentados. As células classificadas eram muito grandes em diâmetro (>10 μm) com uma aparência arredondada característica. Como esperado, a coloração do anticorpo Ki67 revelou uma perda completa do marcador de proliferação na amostra classificada versus uma perda parcial na amostra não classificada tratada com BLM, e níveis normais de Ki67 foram observados em muitas células na amostra não tratada. Pelo menos três imagens foram tiradas por poço usando configurações uniformes de imagem entre as amostras. Imagens representativas são mostradas (Figura 7B).

Finalmente, avaliamos se as células senescentes que surgem em tumores estabelecidos em camundongos tratados com drogas quimioterápicas poderiam ser identificadas usando DDAOG. Os tumores de melanoma B16-F10 foram induzidos no flanco de camundongos C57/BL6, que foram então tratados três vezes (i.p., a cada 5 dias) apenas com soro fisiológico (Figura 8A), DOX (Figura 8B) ou PLD (Figura 8C). Após o terceiro tratamento, os ratos se recuperaram por 7 dias para permitir o início da senescência e, em seguida, foram sacrificados e os tumores extirpados. Os tumores foram reduzidos pela metade, sendo metade utilizada para o preparo de lâminas de tecido congelado para coloração X-Gal (Figura 8) e metade dissociada em suspensões unicelulares e corada com DDAOG (Figura 8 e Figura Suplementar S4). A coloração X-Gal nos tecidos foi bastante fraca, apesar de uma longa duração de coloração (72 h), mas a coloração azul foi evidente nos tumores DOX e PLD após inspeção minuciosa, particularmente nos tumores que também pontuaram positivo para senescência pelo ensaio de fluxo DDAOG (Figura 8B,C). Pelo menos três imagens foram tiradas por lâmina de tecido e imagens representativas são mostradas.

Em comparação com o X-Gal, o DDAOG foi uma forma mais sensível e precisa de quantificar a senescência em tumores (Figura 8). Para a análise do tumor DDAOG, o tumor tratado com solução salina com o maior fundo de fluorescência foi usado para definir a porta de senescência em <5%, de modo que os outros tumores tratados com solução salina não pontuaram acima de 5% de senescência. Esta porta de senescência foi então aplicada em lote a células viáveis fechadas de todos os tumores. Ambos os quimioterápicos induziram senescência em alguns tumores (dois de cinco tumores para DOX, três de cinco para PLD), com porcentagens de células tumorais senescentes variando de 3% a 36% por tumor. Os gráficos de dados de citometria para todos os 15 tumores são mostrados na Figura Suplementar S4, e um resumo dos dados de citometria tumoral é mostrado na Figura 8D (n = 5; (*) p < grupo controle 0,05 vs. somente soro fisiológico pelo teste de variância F). Concluímos que a citometria de fluxo DDAOG versus FA é um método aceitável para o rastreamento de tumores e quimioterápicos para a indução de senescência in vivo.

Figura 2: DDAOG é uma coloração sensível e específica para SA-β-Gal. (A) Coloração convencional para SA-β-Gal usando X-Gal mostrando células de melanoma murino B16-F10 não tratadas (esquerda) ou tratadas com ETO (direita). Senescência induzida por ETO: as células exibem morfologia aumentada e coloração azul devido à clivagem de X-Gal por SA-β-Gal elevada. Barras de escala = 10 μm. (B) Coloração fluorescente para SA-β-Gal em células tratadas com ETO usando C_12-FDG (emissão de 515 nm, verde) ou DDAOG (660 nm, vermelho). A distribuição de coloração é semelhante para ambas as sondas, indicando que o DDAOG detecta SA-β-Gal de maneira semelhante ao C_12-FDG. (C) Avaliação da FA em células não coradas tratadas com ETO no canal de emissão verde (emissão de 525 nm, esquerda) ou vermelho-distante (660 nm, direita). A FA da lipofuscina é alta no canal de emissão verde e insignificante no canal vermelho distante. Tempo de exposição = 2.000 ms para cada imagem. Barras de escala = 10 μm. Esta figura é reimpressa de Flor e Kron²³. Abreviaturas: DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-ona); DDAOG = DDAO-Galactoside; X-Gal = 5-bromo-4-cloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside; UNT = não tratada; ETO = etoposídeo; FA = autofluorescência; C_12-FDG = 5-dodecanoilaminofluoresceína di-β-D-galactopiranosídeo; SA-β-Gal = beta-galactosidase associada à senescência. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Configuração de aquisição de dados do citômetro de fluxo. (A) Distribuição representativa do gráfico de dispersão das células. FSC-A é uma leitura do volume celular, e SSC-A indica granularidade celular. Painel esquerdo, tratamento apenas de veículo de células A549. Painel direito, tratamento ETO para induzir senescência. Observe a tendência para o aumento do volume celular de células tratadas com ETO, de acordo com a morfologia aumentada evidente na microscopia. (B) Uso opcional de microesferas de calibração fluorescentes "arco-íris" comerciais de 5 picos para definir as tensões do detector do citômetro. Em cada canal de fluorescência utilizado, o pico máximo deve ser ajustado ≤1 x 10⁵ unidades fluorescentes relativas, ajustando a tensão do detector do citômetro enquanto as amostras estão em execução. Painel esquerdo, canal BV421 (violeta); centro, canal FITC (verde); à direita, canal APC (vermelho). Os cinco picos fluorescentes devem apresentar espaçamento distinto, conforme mostrado. (C-E) Dados representativos de fluorescência de canal único para coloração de viabilidade (C) usando corante violeta CV450; (D) autofluorescência verde das células; (E) sinal vermelho-distante do DDAOG, detectando SA-β-Gal. Histograma de cor mais escura, tratamento apenas de veículo; histograma de cor mais clara, tratamento ETO. As portas principais são indicadas acima de cada parcela. Abreviaturas: FSC-A = área de dispersão para a frente; SSC-A = área de dispersão lateral e pico; ETO = etoposídeo; BV421-A = área de pico do canal Violeta Brilhante de 421; FITC-A = área de pico do canal de isotiocianato de fluoresceína; APC-A = área de pico do canal de aloficocianina; FA = autofluorescência; DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-ona); DDAOG = DDAO-Galactoside; VEH = veículo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Dados representativos para o ensaio de senescência por citometria de fluxo . (A) Células de melanoma murino B16-F10 tratadas apenas com veículo (superior esquerdo), ETO (superior direito), (inferior esquerdo) ABT-263 (1 μM) apenas, ou (inferior direito) ETO mais ABT-263. (B) Células de adenocarcinoma pulmonar humano A549 tratadas apenas com veículo (superior esquerdo), (superior direito) BLM, (inferior esquerdo) ABT-263 apenas, ou (inferior direito) BLM mais ABT-263. (A,B) As portas retangulares nos quadrantes superiores direitos de todas as parcelas definem as células senescentes (DDAOG^HI AF^HI). A percentagem de células senescentes (do total de células viáveis por amostra) é indicada em cada parcela. Abreviaturas: DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-ona); DDAOG = DDAO-Galactoside; ETO = etoposídeo; BLM = bleomicina; VEH = veículo; TIS = senescência induzida pela terapia. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Co-coloração de um exemplo de marcador de superfície celular com ensaio de senescência. (A) Imunodetecção do marcador de senescência DPP4 na superfície de células cultivadas com B16-F10 viáveis; laranja escuro, apenas para veículos; laranja claro, ETO. (B,C) Painéis central e direito: células coradas com DDAOG e anti-DPP4:PE. As células DDAOG HI DPP4^HI estão contidas dentro de portas retangulares mostradas nas parcelas, e a porcentagem de células duplamente positivas por amostra é indicada. Mostrado: células dependentes viáveis. Abreviaturas: DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-ona); DDAOG = DDAO-Galactoside; ETO = etoposídeo; VEH = veículo; DPP4 = dipeptidil peptidase 4. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Fixação pós-coloração e armazenamento de amostras de células coradas com DDAOG para análise posterior. (A) Controle, amostras não fixadas de células A549 vivas não tratadas (esquerda) ou tratadas com BLM (direita) para induzir senescência e, em seguida, coradas e imediatamente analisadas usando o protocolo DDAOG (sem fixação, Dia 0). (B) Amostras preparadas como em (A) e, em seguida, imediatamente fixadas em paraformaldeído a 4% e analisadas (Dia 0). (C) Amostras preparadas como em (A), imediatamente fixadas em paraformaldeído a 4% e armazenadas durante a noite a 4 °C antes da análise. (D) Amostras preparadas como em (A), imediatamente fixadas e armazenadas durante 7 dias antes da análise. As portas retangulares nos quadrantes superiores direitos de todas as parcelas definem células senescentes (DDAOG HI AF^HI). A percentagem de células senescentes é indicada em cada parcela. Abreviaturas: TIS = senescência induzida pela terapia; DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-ona); DDAOG = DDAO-Galactoside; BLM = bleomicina; FA = autofluorescência. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Classificação citométrica de fluxo e validação de populações de células senescentes enriquecidas. (A) Dados de classificação citométrica de fluxo mostrando (à esquerda) o controle não tratado, corado com DDAOG, usado para definir o portão para a classificação de células senescentes (<5% de células senescentes em região fechada) e (à direita) a amostra tratada com BLM, corada com DDAOG, que foi classificada usando a porta de classificação, conforme mostrado. (B) Imagens de microscopia de fluorescência para células (coluna esquerda) coradas com Phalloidin-Alexa Fluor 647 (pseudocor laranja) para detectar F-actina e DAPI (azul) para contracorar núcleos, demonstrando morfologia aumentada de células senescentes, ou (coluna direita) células coradas com anticorpo Ki67 coelho e anti-coelho Alexa Fluor 594 para detectar perda de proliferação em células senescentes. Células da linha superior, não tratadas e não classificadas. Fileira central, células tratadas com BLM e não classificadas. Linha inferior, células tratadas com BLM e classificadas. Barras de escala = 10 μm. Abreviaturas: TIS = senescência induzida pela terapia; DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-ona); DDAOG = DDAO-Galactoside; BLM = bleomicina; UNT = não tratada; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Quantificação da senescência em tumores de camundongos tratados com quimioterápicos. Tumores de melanoma B16-F10 foram estabelecidos nos flancos de camundongos C67BL/6, que foram então tratados com três doses de (A) solução salina, (B) DOX ou (C) PLD a cada 5 dias mais 1 semana para permitir o início da senescência. Os tumores foram excisados e reduzidos pela metade; lâminas de tecido congelado foram preparadas a partir de uma metade para coloração X-Gal (linha superior), e a outra metade foi dissociada para coloração DDAOG (linha inferior). Em imagens coradas com X-Gal, as células azuis são células senescentes SA-β-Gal ^HI , enquanto as regiões marrons são devidas à melanina em tumores. Resultados representativos são mostrados para DOX e PLD de dois tumores por grupo que exibiram senescência. Todos os tumores somente salinos exibiram senescência insignificante. (D) Quantificação da senescência em tumores tratados com drogas de camundongos. (*) p < 0,05 pelo teste de variância F, n = 5 camundongos por grupo. Barras de erro, média ± SEM. Abreviaturas: DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-ona); DDAOG = DDAO-Galactoside; DOX = doxorrubicina; PLD = doxorrubicina lipossômica PEGilada; X-Gal = 5-bromo-4-cloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside; FA = autofluorescência. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura Suplementar S1: Estrutura química da sonda DDAOG. DDAOG é um conjugado de 7-hidroxi-9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-ona) e beta galactosídeo. Quando clivado por beta-galactosidase, o produto de clivagem hidrolisada exibe um deslocamento de emssion de fluorescência vermelho-distante de 50 nm, permitindo sua detecção específica com excitação acima de 600 nm. Abreviaturas: DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-ona); DDAOG = DDAO-Galactoside. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar S2: Varredura espectral do crosstalk DDAOG com outros canais fluorescentes do citômetro de fluxo. Para identificar os canais disponíveis para a detecção de anticorpos fluorescentes, foi realizada uma varredura espectral em um citômetro de fluxo de 4 lasers e 15 canais, utilizando células A549 tratadas com BLM e coradas com DDAOG (vermelho) ou não corado (preto). Os dados em todos os canais do citômetro de fluxo foram adquiridos para 10.000 células. (A) Canais de emissão do laser de 405 nm: da esquerda para a direita, BV421, BV510, BV605, BV660 e BV711. A conversa cruzada observada nos canais BV605, BV660 e BV711 os torna inadequados para co-coloração com DDAOG sem compensação. BV421 e BV510 são adequados para co-coloração (note que BV421 é normalmente usado para coloração de viabilidade). (B) Canais de emissão do laser de 488 nm: FITC e PerCP-Cy5. Observou-se alta crosstalk para o canal PerCP-Cy5. O FITC é adequado para co-coloração; no entanto, observe que o canal FITC é normalmente usado no ensaio DDAOG para a avaliação de AF de emissão verde. (C) Canais de emissão do laser de 561 nm: PE, PE-Dazzle 594, PE-Cy5, PE-Cy5.5 e PE-Cy7. Os canais PE e PE-Dazzle 594 são adequados para a detecção de anticorpos marcados com esses fluoróforos (PE é demonstrado para a detecção de DPP4 neste estudo). (D) Canais de emissão do laser de 640 nm: APC, APC-H700 e APC-Cy7. O sinal DDAOG das células senescentes é visível no canal APC (47,8% senescente). O sinal se sobrepõe aos canais APC-H700 e APC-Cy7, tornando-os inadequados para co-coloração sem compensação espectral significativa. Abreviaturas: BLM = bleomicina; BV = Violeta Brilhante; FITC = isotiocianato de fluoresceína; PerCP = proteína peridinina-clorofila; EP = ficoeritrina; DZ594 = Deslumbramento 594; APC = alofiocianina; FA = autofluorescência; DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-ona); DDAOG = DDAO-Galactoside. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar S3: Estratégia de bloqueio celular para classificação FACS de células senescentes. A passagem de uma suspensão de células através de um citômetro FACS sensível pode exigir um controle adicional para garantir a pureza da classificação e a funcionalidade ideal do instrumento. Um exemplo de estratégia é mostrado aqui. Outras estratégias são possíveis dependendo das recomendações do fabricante para o citômetro FACS que está sendo usado. Coluna da esquerda, controle de célula tratado somente para veículos. Coluna da direita, células A549 tratadas com BLM para induzir a senescência a serem classificadas. (A) FSC-A (volume celular) versus SSC-A (granularidade celular) de células intactas. A porta intacta elimina os detritos celulares da amostra classificada. (B) FSC-A versus FSC-H purity gating; remove dubletos e detritos. (C) Medição de pureza SSC-A versus SSC-H; remove dubletos e detritos. (D) Gating para a população de interesse usando o canal APC-A (excitação de 637 nm, emissão de 670 nm ± 30 nm, usado para DDAOG) versus canal FITC-A (excitação de 488 nm, emissão de 530 nm ± 30 nm, usado para AF); remove possíveis artefatos de coloração. (E) Confinamento de células senescentes para triagem final. Abreviaturas: FACS = classificação celular ativada por fluorescência; BLM = bleomicina; FSC-A = área de dispersão-pico para a frente; SSC-A = área de dispersão lateral e pico; FSC-H = altura do pico de dispersão para a frente; SSC-H = altura do pico de dispersão lateral. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar S4: Coloração por citometria de fluxo de senescência DDAOG de tumores. Dados de citometria de fluxo para ≥50.000 células tumorais viáveis. Porta celular senescente, quadrante superior direito de cada parcela. A porcentagem de células tumorais senescentes (de viáveis) é mostrada dentro do portão. Os tratamentos tumorais incluíram (A) somente solução salina; (B) DOX; e (C) PLD. Os camundongos foram tratados três vezes, uma a cada 5 dias, com 7 dias para recuperação para permitir o início da senescência antes do sacrifício. Foram analisados cinco tumores por condição. Abreviaturas: FA = autofluorescência; DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-ona); DDAOG = DDAO-Galactoside; DOX = doxorrubicina; PLD = doxorrubicina lipossómica PEGilada. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Na última década, a citometria de fluxo tornou-se uma plataforma de ensaio mais comum na pesquisa do câncer devido à popularidade emergente da imunologia tumoral, ao desenvolvimento de citômetros de fluxo de baixo custo e à melhoria das instalações de instrumentação compartilhadas em instituições acadêmicas. Ensaios multicoloridos são agora padrão, já que a maioria dos instrumentos mais recentes são equipados com matrizes ópticas violeta, azul-verde e vermelho a vermelho-distante. Assim, é provável que este protocolo DDAOG seja compatível com uma ampla gama de citômetros de fluxo. Naturalmente, qualquer citômetro de fluxo deve ser avaliado pelo usuário. Deve-se ter um cuidado especial ao adicionar fluoróforos adicionais (por exemplo, anticorpos fluorescentes e conjugados) ao ensaio DDAOG. Uma avaliação do crosstalk de fluoróforo entre canais deve ser conduzida usando controles de coloração única visualizados em todos os outros canais relevantes. Se a sobreposição for observada, a compensação espectral pode ser realizada²⁰ para correção seguindo métodos típicos.

Os achados aqui apresentados destinam-se principalmente a demonstrar que o ensaio de citometria de fluxo DDAOG pode produzir resultados rápidos, quantitativos e fáceis de interpretar para o TIS induzido por drogas quimioterápicas em células ou tumores. Os agentes aqui utilizados, incluindo ETO 23,24, DOX^7,25 e BLM^26,27, foram documentados para induzir TIS em várias linhagens celulares de câncer ²⁴. Para demonstrar a especificidade da sonda DDAOG, o agente senolítico conhecido ABT-263²¹ demonstrou eliminar seletivamente células senescentes em cultura. Este trabalho demonstra o uso de uma linhagem celular de câncer cultivada murina (B16-F10) e uma humana (A549), bem como tumores B16-F10 estabelecidos em camundongos. No entanto, quaisquer células que expressem β-Gal e retenham a viabilidade através de uma preparação de amostra de citometria de fluxo padrão podem ser usadas. Certos tipos de células podem ser mais frágeis ou menos propensos ao TIS, e isso deve ser avaliado antes de embarcar em uma tela grande ou estudo. Se as células se desintegram na preparação, a viabilidade é fraca ou o TIS é muito menor do que o esperado usando controles de agentes positivos, o tipo de célula pode não ser um modelo ideal para estudos de senescência. Os agentes e linhagens celulares mostrados aqui podem ser usados por outros grupos como controles na triagem adicional de potenciais agentes indutores de TIS ou novos senolíticos, o que continua sendo um objetivo ativo no campo.

A toxicidade induzida por drogas quimioterápicas pode variar entre os tipos de células e afetar os resultados do ensaio. Se o efeito primário observado do agente e/ou concentração utilizada for a morte celular aguda, a senescência global pode ser mínima. In vivo, a elevada necrose tumoral ou toxicidade sistémica em animais deve ser evitada através da redução da dose do agente. A chave para o sucesso do ensaio é o teste de uma variedade de concentrações de agentes, com inspeção cuidadosa dos dados do ensaio de viabilidade (por exemplo, conforme fornecido pelo CV450 dentro do ensaio DDAOG). In vitro, se muitas células mortas se desprenderem da placa durante o tratamento, incluindo o meio de cultura na amostra analisada, é importante avaliar a morte celular no total. CV450 não é a única mancha de viabilidade compatível com este ensaio; outros fluoróforos emissores violeta/azul podem ser usados. Sondas de viabilidade corrigíveis também podem ser usadas se o usuário planeja fixar as amostras coradas com PFA, desde que a fluorescência da sonda não se sobreponha significativamente com DDAOG ou AF (ou o usuário conduza compensação espectral para corrigir a sobreposição). Em alguns casos em que a toxicidade do agente é baixa e as células são robustas, o controle de células intactas por dispersão de luz (FSC vs. SSC) pode ser suficiente para isolar células "viáveis" para análise.

Um passo fundamental neste protocolo in vitro é plaquear as células na faixa mais baixa de densidade de crescimento logarítmico (tipicamente 2 × 10 3-5 × 10³ células/cm²) para permitir a rápida proliferação inicial, o que facilita a absorção da droga quimioterápica pela maioria das células. Uma vez tratado, também é importante dar tempo para o início do TIS: in vitro, 4 dias ± 1 dia na presença da droga; in vivo, 7 dias de recuperação após o tratamento quimioterápico final. Após a coloração com DDAOG conforme descrito, a análise quantitativa dos dados citométricos deve ser realizada conforme mostrado, ou seja, o controle de DDAOG versus células FA em cada amostra para determinar a porcentagem de células senescentes (do total viável). As etapas opcionais incluem o uso de microesferas de calibração fluorescentes "arco-íris" para padronizar a citometria de fluxo, fixação de PFA de amostras coradas, co-imunocoloração para marcadores de superfície e classificação de fluxo para enriquecer células senescentes para ensaios a jusante. No entanto, cada uma dessas etapas opcionais oferece vantagens importantes em determinados aplicativos. As microesferas de calibração padronizam a configuração da citometria em várias sessões e permitem que o usuário defina inicialmente as tensões em uma faixa útil para detecção de senescência e viabilidade, com ajustes mínimos posteriormente. A fixação de PFA de amostras estabiliza as células e permite a análise em lote de grandes conjuntos de células em um momento posterior. A co-imunocoloração para marcadores de superfície pode ser usada para rastrear novas proteínas relacionadas à senescência e interações imunológicas. Em estudos futuros, planejamos validar a co-coloração de marcadores de senescência intracelular com DDAOG.

A classificação de células TIS por FACS permite o enriquecimento de células TIS viáveis de populações heterogêneas, o que pode confundir leituras para ensaios a jusante, como western blotting, proteômica ou transcriptômica. Após a classificação, não foi observada toxicidade significativa do DDAOG em células TIS colocadas de volta à cultura por até 5 dias. No entanto, deve-se levar em consideração que as células classificadas foram tratadas com Baf, DDAOG internalizado (que é clivado por SA-β-Gal para DDAO, um corante de acridina) e foram submetidas a estresse mecânico passando pelo instrumento FACS. Portanto, certas alterações biológicas não relacionadas à senescência podem estar presentes nas células classificadas. No entanto, neste estudo, as células classificadas mantiveram fortes características de senescência e forneceram resultados proteômicos e transcriptômicos característicos²⁸ quando comparadas aos controles não classificados. Apesar da utilidade um tanto óbvia do uso do FACS para coletar e analisar células senescentes de tumores, esse procedimento raramente tem sido utilizado na literatura. Alguns grupos utilizaram a luciferase p16^Ink4a ou repórteres fluorescentes para identificar células senescentes em tecidos de camundongos, com repórteres fluorescentes permitindo a classificação FACS em alguns estudos^29,30. Os achados geralmente concordam que, independentemente do agente de indução ou do tipo de tumor, o TIS em tumores é uma ocorrência parcial a rara, raramente atingindo 100% das células tumorais³¹. A classificação FACS de células usando o método DDAOG permite prontamente a coleta de células TIS raras de tumores, sem a necessidade de expressar construções transgênicas.

Atualmente, a maioria das pesquisas de senescência em modelos de camundongos é conduzida ex vivo utilizando uma combinação de X-Gal e marcadores imuno-histoquímicos^32,33. No entanto, avaliar o TIS ex vivo usando tecidos tumorais pode ser um processo demorado, particularmente quando o X-Gal é usado. Este procedimento requer criopreservação, criossecção em lâminas, coloração X-Gal, montagem de vidro de cobertura, secagem, imagem e pontuação de células "azuis" - uma abordagem de vários dias no mínimo. A imuno-histoquímica não é muito mais rápida ou fácil, e diferentes cortes de tecido devem ser usados e pontuados para cada marcador mais X-Gal em cada tumor, a menos que a análise multiplexada seja otimizada, adicionando mais tempo na extremidade frontal do processo. As seções de tecido coletam apenas uma seção transversal fina do tumor, enquanto as células senescentes (como muitos tipos de células) podem ser distribuídas de forma desigual no espaço 3D em todos os tumores²⁹. É urgentemente necessário no campo se afastar de métodos histológicos lentos e desatualizados em direção a um ensaio de senescência mais rápido e prontamente quantificável para tumores. Usando a citometria de fluxo DDAOG, um conjunto de 15 tumores poderia ser dissociado e corado para obter dados de senescência quantitativos conclusivos em menos de 1 dia de tempo prático após a colheita do tumor. Metade do tumor foi processada para cada amostra, melhorando a amostragem do espaço 3D por tumor. Esta abordagem de citometria de fluxo DDAOG é significativamente mais rápida e mais confiável do que os métodos baseados em lâminas teciduais para a avaliação do TIS em tumores.

Com suas muitas vantagens sobre o X-Gal e outros métodos, defendemos que o protocolo DDAOG se torne o novo ensaio de senescência padrão-ouro. Ele usa tanto o marcador de senescência convencionalmente aceito, SA-β-Gal, quanto a detecção sem rótulo de FA associada à idade como um segundo marcador. Esses fluoróforos são compatíveis com a maioria dos citômetros de fluxo padrão. O ensaio inclui uma mancha de viabilidade para excluir células mortas e detritos usando amostras prontamente obtidas de linhagens celulares cultivadas tratadas com drogas ou tumores. Opcionalmente, as amostras de células vivas podem ser fixadas com solvente ou criopreservadas para facilitar a análise em lote de grandes estudos, por exemplo, usando pontos de tempo para avaliar o início do TIS ao longo do tempo usando vários agentes O processo de coloração leva menos de meio dia de trabalho de laboratório para ser concluído e a aquisição de dados é tipicamente de < 5 minutos por amostra. A análise de dados é igualmente rápida e direta, produzindo dados quantitativos sobre a porcentagem de células TIS por amostra sem pontuação e contagem tediosas de células. As amostras podem ser classificadas por FACS para recuperar populações enriquecidas de células TIS, o que reduz o ruído da heterogeneidade celular em análises a jusante. Acreditamos que o ensaio DDAOG pode, em muitos casos, substituir o X-Gal, facilitando a triagem de agentes indutores de TIS e senolíticos in vitro e in vivo, levando a descobertas mais rápidas e confiáveis no campo da pesquisa de senescência.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bafilomycin A1	Research Products International	B40500
Bleomycin sulfate	Cayman	13877
Bovine serum albumin (BSA)	US Biological	A1380
Calcein Violet 450 AM viability dye	ThermoFisher Scientific	65-0854-39	eBioscience
DPP4 antibody, PE conjugate	Biolegend	137803	Clone H194-112
Cell line: A549 human lung adenocarcinoma	American Type Culture Collection	CCL-185
Cell line: B16-F10 mouse melanoma	American Type Culture Collection	CRL-6475
Cell scraper	Corning	3008
Cell strainers, 100 µm	Falcon	352360
DDAO-Galactoside	Life Technologies	D6488
DMEM medium 1x	Life Technologies	11960-069
DMSO	Sigma	D2438
DNAse I	Sigma	DN25
Doxorubicin, hydrochloride injection (USP)	Pfizer	NDC 0069-3032-20
Doxorubicin, PEGylated liposomal (USP)	Sun Pharmaceutical	NDC 47335-049-40
EDTA 0.5 M	Life Technologies	15575-038
Etoposide	Cayman	12092
FBS	Omega	FB-11
Fc receptor blocking reagent	Biolegend	101320	Anti-mouse CD16/32
Flow cytometer (cell analyzer)	Becton Dickinson (BD)	Various	LSRFortessa
Flow cytometer (cell sorter)	Becton Dickinson (BD)	Various	FACSAria
GlutaMax 100x	Life Technologies	35050061
HEPES 1 M	Lonza	BW17737
Liberase TL	Sigma	5401020001	Roche
Paraformaldehyde 16%	Electron Microscopy Sciences	15710
Penicillin/Streptomycin 100x	Life Technologies	15140122
Phosphate buffered saline (PBS) 1x	Corning	MT21031CV	Dulbecco's PBS (without calcium and magnesium)
Rainbow calibration particles, ultra kit	SpheroTech	UCRP-38-2K	3.5-3.9 µm, 2E6/mL
RPMI-1640 medium 1x	Life Technologies	11875-119
Sodium chloride 0.9% (USP)	Baxter Healthcare Corporation	2B1324
Software for cytometer data acquisition, "FACSDiva"	Becton Dickinson (BD)	n/a	Contact BD for license
Software for cytometer data analysis, "FlowJo"	TreeStar	n/a	Contact TreeStar for license
Trypsin-EDTA 0.25%	Life Technologies	25200-114