Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Far-rød fluorescerende senescens-associeret β-galactosidase sonde til identifikation og berigelse af senescent tumorceller ved flow cytometri

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64176
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Molecular Genetics and Cell Biology, University of Chicago

Summary

En protokol for fluorescerende, flowcytometrisk kvantificering af senescente kræftceller induceret af kemoterapilægemidler i cellekultur eller i murine tumormodeller præsenteres. Valgfrie procedurer omfatter co-immunostaining, prøvefiksering for at lette analyse af store batch- eller tidspunkter og berigelse af levedygtige senescente celler ved flowcytometrisk sortering.

Abstract

Cellulær ældning er en tilstand af proliferativ anholdelse induceret af biologisk skade, der normalt opstår over år i aldrende celler, men kan også opstå hurtigt i tumorceller som et svar på skader induceret af forskellige kræftbehandlinger. Tumorcelleældning betragtes generelt som uønsket, da senescente celler bliver resistente over for døden og blokerer tumorremission, mens de forværrer tumormalignitet og behandlingsresistens. Derfor er identifikationen af senescent tumorceller af løbende interesse for kræftforskningsmiljøet. Der findes forskellige ældningsassays, mange baseret på aktiviteten af den velkendte ældningsmarkør, ældningsassocieret beta-galactosidase (SA-β-Gal).

Typisk udføres SA-β-Gal-analysen ved hjælp af et kromogent substrat (X-Gal) på faste celler med langsom og subjektiv optælling af "blå" senescente celler ved lysmikroskopi. Forbedrede assays ved hjælp af cellepermeant, fluorescerende SA-β-Gal-substrater, herunder C12-FDG (grøn) og DDAO-Galactoside (DDAOG; far-red), har muliggjort analyse af levende celler og tilladt brugen af fluorescerende analyseplatforme med høj kapacitet, herunder flowcytometre. C12-FDG er en veldokumenteret sonde til SA-β-Gal, men dens grønne fluorescerende emission overlapper med iboende cellulær autofluorescens (AF), der opstår under ældning på grund af akkumulering af lipofuscinaggregater. Ved at bruge den langt røde SA-β-Gal-sonde DDAOG kan grøn cellulær autofluorescens bruges som en sekundær parameter til at bekræfte ældning, hvilket tilføjer pålidelighed til analysen. De resterende fluorescenskanaler kan bruges til cellelevedygtighedsfarvning eller valgfri fluorescerende immunmærkning.

Ved hjælp af flowcytometri demonstrerer vi brugen af DDAOG og lipofuscin autofluorescens som et dobbeltparameterassay til identifikation af senescent tumorceller. Kvantificering af procentdelen af levedygtige senescente celler udføres. Hvis det ønskes, kan et valgfrit immunmærkningstrin inkluderes for at evaluere celleoverfladeantigener af interesse. Identificerede senescente celler kan også flowcytometrisk sorteres og indsamles til downstream-analyse. Indsamlede senescente celler kan straks lyseres (f.eks. til immunassays eller 'omics-analyse) eller yderligere dyrkes.

Introduction

Senescente celler akkumuleres normalt i organismer over år under normal biologisk aldring, men kan også udvikle sig hurtigt i tumorceller som et svar på skader induceret af forskellige kræftbehandlinger, herunder stråling og kemoterapi. Selvom de ikke længere formerer sig, kan terapiinducerede senescent (TIS) tumorceller bidrage til behandlingsresistens og drive gentagelse 1,2,3. Faktorer udskilt af TIS-celler kan forværre tumormalignitet ved at fremme immununddragelse eller metastase 4,5. TIS-celler udvikler komplekse, kontekstspecifikke fænotyper, ændrede metaboliske profiler og unikke immunresponser 6,7,8. Derfor er identifikation og karakterisering af TIS tumorceller induceret af forskellige kræftbehandlingsmetoder et emne af løbende interesse for kræftforskningssamfundet.

Til påvisning af TIS-tumorceller anvendes konventionelle ældningsassays i vid udstrækning, primært baseret på påvisning af øget aktivitet af ældningsmarkørenzymet, den lysosomale beta-galactosidase GLB19. Detektion ved en næsten neutral (snarere end sur) lysosomal pH muliggør specifik påvisning af ældningsassocieret beta-galactosidase (SA-β-Gal)10. Et standard SA-β-Gal-assay, der er blevet brugt i flere årtier, bruger X-Gal (5-brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid), et blåt kromogent beta-galactosidasesubstrat, til at detektere SA-β-Gal i faste celler ved lysmikroskopi11. X-Gal-analysen muliggør kvalitativ visuel bekræftelse af TIS ved hjælp af almindeligt tilgængelige reagenser og laboratorieudstyr. Et grundlæggende transmitteret lysmikroskop er den eneste instrumentering, der kræves for at evaluere tilstedeværelsen af det blå kromogen. X-Gal-farvningsproceduren kan dog mangle følsomhed, hvilket nogle gange kræver mere end 24 timer, før farven udvikler sig. Farvning efterfølges af subjektiv scoring med lav gennemstrømning af individuelle senescente celler baseret på tælling af cellerne, der udviser en vis intensitet af det blå kromogen under et lysmikroskop. Da X-Gal er celle-uigennemtrængelig, kræver dette assay opløsningsmiddelfikserede celler, som ikke kan genvindes til downstream-analyse. Når du arbejder med begrænsede prøver fra dyr eller patienter, kan dette være en stor ulempe.

Forbedrede SA-β-Gal-assays ved anvendelse af cellepermeant, fluorescerende enzymsubstrater, herunder C 12-FDG (5-dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranosid, grøn) og DDAOG (9H-(1,3-dichlor-9,9-dimethylacridin-2-en-7-yl) β-D-Galactopyranosid, far-red) har tidligere optrådt i litteraturen12,13,14,15. DDAOG's kemiske sondestruktur og optiske egenskaber er vist i supplerende figur S1. Disse cellepermeanerede sonder tillader analyse af levende (snarere end faste) celler, og fluorescerende snarere end kromogene sonder letter brugen af hurtige fluorescerende analyseplatforme med høj kapacitet, herunder screeningsinstrumenter med højt indhold og flowcytometre. Sortering af flowcytometre muliggør genopretning af berigede populationer af levende senescente celler fra cellekulturer eller tumorer til downstream-analyse (f.eks. Western blotting, ELISA eller 'omics). Fluorescensanalyse giver også et kvantitativt signal, der giver mulighed for mere nøjagtig bestemmelse af procentdelen af senescente celler i en given prøve. Yderligere fluorescerende sonder, herunder levedygtighedssonder og fluorophoremærkede antistoffer, kan let tilføjes til multipleksanalyse af mål ud over SA-β-Gal.

I lighed med DDAOG er C12-FDG en fluorescerende sonde til SA-β-Gal, men dens grønne fluorescerende emission overlapper med iboende cellulær AF, som opstår under ældning på grund af akkumulering af lipofuscinaggregater i celler16. Ved at bruge den langt røde DDAOG-sonde kan grøn cellulær AF bruges som en sekundær parameter til at bekræfte ældning17. Dette forbedrer analysepålideligheden ved at bruge en anden markør ud over SA-β-Gal, som ofte kan være upålidelig som en enkelt markør for ældning18. Da påvisning af endogen AF i senescente celler er en etiketfri tilgang, er det en hurtig og enkel måde at udvide specificiteten af vores DDAOG-baserede assay.

I denne protokol demonstrerer vi brugen af DDAOG og AF som et hurtigt flowcytometriassay med to parametre til identifikation af levedygtige TIS-tumorceller fra in vitro-kulturer eller isoleret fra lægemiddelbehandlede tumorer etableret hos mus (figur 1). Protokollen bruger fluorophorer, der er kompatible med en bred vifte af standard kommercielle flowcytometrianalysatorer og sorterere (tabel 1). Kvantificering af procentdelen af levedygtige senescentceller ved hjælp af standard flowcytometrianalyse er aktiveret. Hvis det ønskes, kan der udføres et valgfrit immunmærkningstrin for at evaluere celleoverfladeantigener af interesse samtidig med ældning. Identificerede senescente celler kan også beriges ved hjælp af standard fluorescensaktiveret cellesorteringsmetode (FACS).

Figure 1
Figur 1: Eksperimentel arbejdsgang. En skematisk opsummering af nøglepunkter i DDAOG-analysen. (A) Et TIS-inducerende lægemiddel tilsættes til pattedyrsdyrkede celler eller administreres til tumorbærende mus. Der er derefter tid til at begynde med TIS: for celler, 4 dage efter behandling; for mus, 22 dage i alt, med tre behandlinger hver 5. dag plus 7 dages restitution. Celler høstes, eller tumorer dissocieres i suspension. (B) Prøver behandles med Baf for at justere lysosomal pH til påvisning af SA-β-Gal i 30 min. derefter tilsættes DDAOG-sonde i 60 minutter for at detektere SA-β-Gal. Prøver vaskes 2x i PBS, og der tilsættes kort en levedygtighedsplet (15 min). Eventuelt kan prøver farves med fluorescerende antistoffer i åbne fluorescenskanaler og / eller fastgøres til senere analyse. (C) Prøver analyseres ved hjælp af et standard flowcytometer. Levedygtige celler visualiseres i prikplotter, der viser rød DDAOG (indikerer SA-β-Gal) versus grøn autofluorescens (lipofuscin). En port til bestemmelse af procentdelen af TIS-celler etableres baseret på ubehandlede kontrolprøver (ikke vist). Hvis der anvendes et sorteringscytometer (FACS), kan TIS-celler opsamles og placeres tilbage i kultur til yderligere in vitro-assays eller lyseres og behandles til molekylærbiologiske assays. Forkortelser: DDAO = 9H-(1,3-dichlor-9,9-dimethylacridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galactoside; TIS = terapiinduceret ældning; FL-Ab = fluorophorekonjugeret antistof; Baf = Bafilomycin A1; SA-β-Gal = ældningsassocieret beta-galactosidase; PBS = fosfatbufferet saltvand; FACS = fluorescensaktiveret cellesortering. Klik her for at se en større version af denne figur.

Fluorophore Registrerer Eks/Em (nm) Cytometer laser (nm) Cytometerdetektor / båndpasfilter (nm)
DDAOG SA-β-Gal 645/6601 640 670 / 30
AF Lipofuscin < 600 488 525 / 50
CV450 Levedygtighed 408/450 405 450 / 50
PE Antistof/overflademarkør 565/578 561 582 / 15

Tabel 1: Fluoroforer og cytometer optiske specifikationer. Cytometerspecifikationer, der anvendes i denne protokol, er angivet for et instrument med i alt 4 lasere og 15 emissionsdetektorer. DDAOG detekteret ved 645/660 nm er formen af sonden spaltet af SA-β-Gal1. Uncleaved DDAOG kan udvise fluorescens på lavt niveau ved 460/610 nm, men fjernes ved vasketrin i protokollen. Forkortelser: DDAO = 9H-(1,3-dichlor-9,9-dimethylacridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galactoside; AF = autofluorescens; PE = phycoerythrin; SA-β-Gal = ældningsassocieret beta-galactosidase.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alt beskrevet dyrearbejde blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Chicago.

1. Fremstilling og opbevaring af stamopløsninger

BEMÆRK: Hvis celler skal flowsorteres, skal alle opløsninger fremstilles ved hjælp af sterile teknikker og filtreres gennem en 0,22 μm filteranordning.

  1. Der fremstilles en stamopløsning af DDAO-galactosid ved 5 mg/ml i DMSO. Aliquot ved 50 μL pr. rør (eller ønsket volumen). Opbevares ved -20 °C i mørke i op til 1 år.
  2. Forbered en stamopløsning af Bafilomycin A1 ved 1 mM i DMSO. Aliquot ved 50 μL pr. rør (eller ønsket volumen). Opbevares ved -20 °C i op til 6 måneder.
  3. Forbered en stamopløsning af Calcein Violet 450 AM ved 1 mM i DMSO. Aliquot ved 50 μL pr. rør (eller ønsket volumen). Opbevares ved -20 °C i mørke i op til 1 år.
  4. Til behandling af dyrkede celler in vitro fremstilles 10 mM koncentrerede stamopløsninger af ældningsfremkaldende middel(er) i det relevante opløsningsmiddel, og steriliseres ved hjælp af 0,2 μm sprøjtefiltre. Opbevares ved -20 °C eller som anvist af producenten.
    BEMÆRK: Ved levering af ældningsfremkaldende kemoterapimidler in vivo (til mus med etablerede tumorer) skal midlerne være USP-kvalitet og fortyndes til saltvand fra koncentreret lager lige før injektion.
  5. Forbered komplet dyrkningsmedium til den eller de cellelinjer, der anvendes.
    BEMÆRK: Forbered for eksempel medium til B16-F10- eller A549-celler med DMEM 1x + 10% FBS + 1x glutaminerstatning + 1x penicillin / streptomycin. Medier skal holdes sterile. Andre cellelinjespecifikke medieformuleringer kan anvendes. Visse komponenter såsom glutathion kan i nogle tilfælde forstyrre begyndelsen af ældning. Empirisk test af forskellige medieformuleringer bør udføres, hvis begyndelsen af ældning er lavere end forventet eller ikke observeres med kontrolkemoterapimidler.
  6. Forbered farvning og vask buffere.
    1. Der fremstilles 1% bovin serumalbumin (BSA) i 1x PBS til brug ved farvningsprocedurer. 2 g BSA opløses i 200 ml PBS og omrøres i 10 minutter eller ved stuetemperatur, indtil det er helt opløst.
    2. Forbered 0,5% BSA i 1x PBS som vaskebuffer. Fortynd 100 ml af 1% BSA fremstillet i trin 1.6.1 til 100 ml 1x PBS for 0,5% BSA.
    3. Opbevares buffere ved 4 °C i op til 1 måned.
  7. Forbered 4% paraformaldehyd i 1x PBS. Brug kommercielt tilgængelige, forseglede paraformaldehydampuller (f.eks. 16% v / v) for nemheds skyld og stabilitet: 2,5 ml 16% PFA + 7,5 ml 1x PBS (= 10 ml 4% PFA). Juster den forberedte diskenhed afhængigt af den samlede diskenhed, der er nødvendig pr. eksperiment.
    BEMÆRK: Forbered dig efter behov kun til cellefiksering; Forbered dig frisk hver gang.
  8. Forbered FACS-sorteringsbuffer: 1x PBS, 1 mM EDTA, 25 mM HEPES, 1% BSA (pH 7,2). Sterilt filter gennem en 0,22 μm filtreringsanordning og opbevares ved 4 °C i op til 1 måned.
    BEMÆRK: Forbered dig kun efter behov til FACS-sortering. Flowsorteringsbufferformuleringer kan variere på tværs af FACS-instrumenter. Ovenstående formulering er kompatibel med det instrument, der anvendes i denne undersøgelse (se Materialetabel). Se producentens retningslinjer.
  9. Forbered tumordissociationsopløsning: 20 μg / ml Liberase TL + 100 μg / ml DNAse I i RPMI-1640-medier (uden FBS eller andre kosttilskud). Stamopløsninger er nyttige til opbevaring af Liberase TL (tilberedt og opbevaret efter producentens anvisninger) og DNAse I (100 mg/ml i dobbeltdestilleret vand [ddH2O], opbevaret ved -20 °C).
    BEMÆRK: Forbered dig efter behov, hvis du kun bruger tumorer; Forbered dig frisk hver gang.

2. Induktion af ældning ved kemoterapimedicin i dyrkede kræftceller

BEMÆRK: Alle cellemanipulationstrin i dette afsnit skal udføres i et biosikkerhedsskab ved hjælp af steril praksis. Dette afsnit er skrevet til vedhæftede celletyper. Suspensionsceller kan anvendes med passende ændringer som nævnt.

  1. Dyrk kræftcellelinje (r) i henhold til standardprotokollen fra leverandøren eller laboratoriet, der leverede den eller de specifikke cellelinjer, der blev brugt.
    BEMÆRK: Celler med lav passage (p < 10) foretrækkes generelt, da der vil være lavere niveauer af replikativ ældning, dvs. lavere baggrund, i ubehandlede celleprøver.
  2. En dag før ældning af induktion af lægemidler, høst celler med trypsin-EDTA 0,25% (eller som anbefalet). Neutraliser trypsin ved at tilsætte et lige stort volumen komplet kulturmedium, og overfør cellesuspensionen til et sterilt konisk rør.
    BEMÆRK: Dette trin er ikke nødvendigt for suspensionsceller.
  3. Tæl cellerne ved hjælp af standard hæmacytometermetoden og registrer celler / ml. Pladeceller ved 1 × 10 3-10 × 103 celler/cm2 i standard 6-brønds plastkulturfade.
    BEMÆRK: Optimal belægningstæthed er afhængig af cellernes proliferationshastighed og bør være brugerbestemt. Celler skal være i logfasevækst ved ca. 10% -20% sammenløb på behandlingstidspunktet (dvs. efter 18-24 timers inkubation efter plettering). Suspensionscellernes startdensitet (celler/ml) skal være brugerbestemt. Seks-brøndsplader giver typisk nok senescentceller pr. Brønd til en standard flowcytometrianalyseprøve. Ved flowsortering skal der anvendes et meget større overfladeareal (f.eks. flere P150-plader) for at muliggøre genvinding af et tilstrækkeligt antal senescente celler til nedstrøms assays (≥1 × 106).
  4. Inkubere belagte celler natten over (18-24 timer) i en 37 °C inkubator med 5% CO2 og en fugtighedspande.
  5. Behandl de belagte celler med ældningsfremkaldende kemoterapilægemiddel (er). Medtag mindst én positiv kontrol, f.eks. etoposid (ETO) eller bleomycin (BLM). Forbered duplikatbrønde pr. Lægemiddel. Medtag et sæt behandlet med kun køretøj som kontrol.
    BEMÆRK: En dosiskurve for hvert eksperimentelt middel skal testes af brugeren for at bestemme den optimale koncentration for ældningsinduktion i den eller de cellelinjer, der anvendes.
  6. Inkubere celler i 4 dage i en 37 °C inkubator med 5% CO2 og en fugtighedspande for at muliggøre ældning. Undersøg dagligt for forventede morfologiændringer ved hjælp af et lysmikroskop.
    BEMÆRK: Inkubationstider fra 3-5 dage kan være acceptable afhængigt af ældningshastigheden. Medier kan ændres, og midlet genanvendes (eller ej), som ønsket, for at fremme sunde vækstbetingelser, samtidig med at der opnås en acceptabel procentdel af senescente celler.
  7. Efter ældningens begyndelse høstes cellerne ved at tilsætte trypsin-EDTA 0,25% i 5 minutter ved 37 °C. Når celler dissocieres i suspension, neutraliseres trypsin med et lige stort volumen komplet medium.
    BEMÆRK: Dette trin er ikke nødvendigt for celler, der vokser i suspension. Hvis overflademarkørfarvning vil blive udført, skal du undgå brug af trypsin-EDTA, da det midlertidigt kan ødelægge overfladeantigener på celler. I stedet adskilles monolaget forsigtigt ved hjælp af en steril plastcelleskraber (eller et alternativt dissociationsreagens designet til at bevare overfladeantigener).
  8. Tæl cellerne i hver prøve ved hjælp af et hæmacytometer. Beregn cellerne / ml for hver prøve.
    BEMÆRK: Trypanblå kan tilføjes for at evaluere procentdelen af døde celler på dette tidspunkt (dvs. på grund af lægemiddelbehandling), men celledød bestemmes også med et fluorescerende levedygtighedsfarvestof under DDAOG-farvningsarbejdsgangen.
  9. Aliquot ≥0,5 × 106 celler pr. prøve i 1,7 ml mikrocentrifugerør.
    BEMÆRK: Antallet af celler pr. prøve skal standardiseres på tværs af alle prøver.
  10. Rørene centrifugeres i 5 minutter ved 1.000 × g i en mikrocentrifuge ved 4 °C. Fjern supernatanten.
    BEMÆRK: Hvis en kølet mikrocentrifuge ikke er tilgængelig, kan det være acceptabelt at udføre centrifugeringer ved omgivelsestemperatur for visse elastiske celletyper.
  11. Fortsæt til DDAOG-farvning i afsnit 4.

3. Induktion af ældning ved kemoterapilægemidler i tumorer etableret hos mus

BEMÆRK: Hvis tumorceller vil blive FACS-sorteret, skal du sikre sterilitet på hvert trin ved at arbejde i et biosikkerhedsskab og arbejde med sterile instrumenter, procedurer og reagenser.

  1. Opret musetumormodeller ved at injicere kræftceller subkutant i henhold til standardmetoder (f.eks. Appelbe et al.19).
    BEMÆRK: Antallet af kræftceller, der skal injiceres, injektionsstedet og den passende musestamme skal optimeres for hver protokol. Her blev B16-F10-celler injiceret subkutant ved 1 × 106 celler i 0,1 ml saltvand (1 × 107 celler / ml).
    1. Kontroller, at levedygtigheden af celler, der bruger trypanblå, er >90%, før du udfører injektioner. Anæstetik musene med isofluran.
    2. Anæstetik 6-7 uger gamle C57/BL6-hunmus med en blanding af 3% isofluran og luft og oprethold under disse forhold i et induktionskammer placeret i et sterilt biosikkerhedsskab. Bekræft anæstesi ved forsigtigt at klemme musens fod. Påfør steril veterinærsalve på begge øjne for at forhindre hornhindetørring under proceduren. Under proceduren skal du opretholde musens kropstemperatur ved hjælp af en varmelampe.
    3. Arbejd inde i et sterilt biosikkerhedsskab, fjern musen fra induktionskammeret og placer den i kontakt med en næsekegle, der giver en 3% isofluranforsyning. Barber flankeområdet på injektionsstedet ved hjælp af en ren elektrisk barbermaskine. Bland den forberedte cellesuspension kortvarigt ved manuelt at vende røret lige før injektionen, og injicer cellesuspensionen subkutant i den eller de barberede flanker ved hjælp af en steril 0,5 ml sprøjte udstyret med en steril 27 G nål. Fjern musen fra emhætten og overfør den til genopretningsburet.
    4. I bjærgningsburet skal du overvåge musenes vitale tegn kontinuerligt, indtil de har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde sternal recumbency, demonstrere den korrigerende refleks og er i stand til sikkert at bevæge sig rundt i buret. Efterlad ikke mus uden opsyn eller returner dyr, der har gennemgået tumorcellepodning til selskab med andre dyr, indtil de er helt genoprettet. Overvåg alle podede mus dagligt for vægttab, nedsat aktivitet / mobilitet og neurologiske symptomer; Aflive mus, der udviser alvorlige symptomer i enhver kategori. For mus, der udviser smertesymptomer efter podning, administreres buprenorphin (0,1-0,2 mg / kg) en gang subkutant.
      BEMÆRK: Mus, der udviser vedvarende smerter efter buprenorphin, skal aflives.
  2. Start 5-7 dage efter kræftcellepodning, mål tumorvækst med tykkelser hver 2-3 dage. Start prosenescent behandling, når tumoren har nået 50 mm 3 ± 10 mm3 i volumen.
    BEMÆRK: I dette arbejde blev doser af USP-kvalitet doxorubicinhydrochlorid (DOX) eller PEGylated liposomal doxorubicin (PLD) ved 10 mg / kg administreret i 0,9% natriumchloridinjektion (USP). Narkotika blev injiceret intraperitonealt 3x, en gang hver 5. dag, startende når tumorer nåede 50 mm 3 ± 10 mm3. Mus kom sig i 7 dage efter den endelige behandling for at tillade udbrud af TIS i tumorer. Senescence induktionsdoser og betingelser for andre behandlinger og / eller tumormodeller bør optimeres.
  3. 7 dage efter den endelige lægemiddelbehandling ofres musene ved CO2 -overdosering og cervikal dislokation eller andre godkendte metoder i overensstemmelse med retningslinjerne for forsøgsdyrs arbejde. Skær tumorerne og saml dem i sterile rør eller 6-brøndsplader fyldt med sterilt RPMI-vækstmedium (for at bevare levedygtigheden under behandlingen).
    BEMÆRK: Hvis der udføres en histologisk undersøgelse (f.eks. X-Gal eller immunohistokemi), kan tumorer gennemskæres her, med en halv snap-frosset i O.C.T. indlejringsmedium og kryosektion ved hjælp af standardprocedurer for frossen vævshistologi. Den resterende tumorhalvdel bør give rigeligt materiale til dissociation og DDAOG-farvning.
  4. Overfør en tumor til en P100 plastskål indeholdende 5 ml RPMI-medium. Hak tumoren i stykker ved hjælp af en skalpel.
  5. Overfør 5 ml af suspensionen af tumorstykker indeholdende suspenderede celler og snavs til et 15 ml konisk rør. Brug den bredere spids af en 25 ml serologisk pipet til overførsel af denne suspension, hvis der er stort snavs til stede. Skyl skålen med et ekstra volumen sterilt RPMI for at samle materialer. Hætte og læg det koniske rør på is.
  6. Gentag trin 3,45-3,5 for de resterende tumorer. Brug en separat plade og skalpel til hver tumor for at undgå krydskontaminering, eller skyl godt med PBS mellem tumorer. Brug 5 ml frisk medium til hakning af hver tumor.
  7. Forbered tumordissociationsopløsningen: 20 μg / ml Liberase TL + 100 μg / ml DNAse I i RPMI-1640-medier (uden FBS).
    BEMÆRK: Der findes mange effektive formuleringer til tumordissociationsløsninger og kan omfatte en række enzymer og andre komponenter fra forskellige producenter. Optimale koncentrationer af komponenter kan variere meget på tværs af tumortyper. Hvis røde blodlegemer er stærkt til stede i tumoren, kan lysis af røde blodlegemer desuden udføres; Hvis døde celler er et problem, kan der anvendes et sæt til fjernelse af døde celler. Det anbefales stærkt, at brugeren uafhængigt bestemmer optimale tumordissociationsbetingelser, der giver høj levedygtighed og lav tilstedeværelse af forurenende celler, bindemateriale og snavs.
  8. Alle tumorprøver centrifugeres i koniske rør i 5 minutter ved 1.000 × g (4 °C). Fjern supernatanten.
  9. Tilsæt 1-5 ml tumordissociationsopløsning til hver tumorprøve afhængigt af mængden af tumormateriale. Sørg for, at der er 1-2 ml ud over tumormaterialepellet i røret. Vortex med moderat hastighed at blande.
  10. Prøverne anbringes i en 37 °C inkubator med hurtig rotation i 45 min. Vortex kort hvert 15. minut.
  11. Hver prøve filtreres gennem en 100 μm cellesi i et 50 ml konisk rør. Hvis prøverne er for tyktflydende til at passere gennem filteret, tilsættes 10 ml RPMI-1640 medium til fortynding. Skyl filtrene med RPMI-medium for at opsamle de resterende celler.
  12. Brug et hæmacytometer til at tælle cellerne / ml for hver prøve.
  13. Aliquot to eller flere replikater af 5 × 106 celler pr. Tumorprøve.
  14. Centrifuge i 5 minutter ved 1.000 × g (4 °C). Fjern supernatanten.
  15. (Valgfrit) Kryoprestuer tumorprøverne til senere DDAOG-farvning, hvis det ønskes.
    1. Resuspender den dissocierede tumorcellepellet i kryopræserveringsmedium: 50% FBS, 40% RPMI-1640, 10% DMSO, fremstillet under sterile forhold ved 5 × 106 celler / ml.
    2. Aliquot 1 ml cellesuspension i hver kryovial.
    3. Kryovialerne fryses i 24 timer i en isopropanolcellefrysningsbeholder ved -80 °C; Derefter overføres kryolagring af flydende nitrogen til langtidsopbevaring (>1 uge).
    4. Når farvning ønskes, optøes kryovialerne på is og fortsæt til DDAOG-farvning i afsnit 4.
      BEMÆRK: Nogle tumorer forbliver muligvis ikke levedygtige gennem kryopræservering, og modstandsdygtighed over for denne proces bør evalueres af brugeren for tumormodellen af interesse.
  16. Fortsæt til afsnit 4 for DDAOG-farvning.

4. DDAOG-farvning af SA-β-Gal i celle- eller tumorprøver

  1. 1 mM Bafilomycin A1-stammateriale fortyndes ved 1:1.000x i DMEM-medium (uden FBS) for en endelig koncentration på 1 μM.
  2. Tilsæt tilberedt Baf-DMEM-opløsning til cellepelletprøverne (fra trin 2.11 eller trin 3.16) for en koncentration på 1 × 106 celler/ml.
    BEMÆRK: Hvis du f.eks. bruger 0,5 × 106 celler pr. prøve, skal du tilføje 0,5 ml Baf-DMEM. For tumorer kan 5 × 106 celler farves i 5 ml Baf-DMEM.
  3. Der inkuberes i 30 minutter ved 37 °C (uden CO2) på en rotator/ryster, der er indstillet ved en langsom hastighed.
    BEMÆRK: Undgå CO2 -inkubatorer til farvningsprocessen, som kan forsure opløsninger og derved forstyrre Baf- og DDAOG-farvning.
  4. Uden vask tilsættes DDAOG-stamopløsningen (5 mg/ml) ved 1:500x (10 μg/ml endelig) til hver prøve. Pipette til blanding. Udskiftes på en rotator/ryster ved 37 °C (uden CO2) i 60 min. Beskyt mod direkte lys.
  5. Rør centrifugeres i 5 minutter ved 1.000 x g ved 4 °C. Fjern supernatanten.
  6. Vask med 1 ml iskold 0,5% BSA pr. rør og pipette til blanding. Rørene centrifugeres i 5 minutter ved 1.000 x g ved 4 °C, og supernatanten fjernes. Gentag dette trin 2x for at vaske cellerne grundigt. Fjern supernatanten og fortsæt.
    BEMÆRK: Det er vigtigt at udføre vasketrinnene i trin 4.6 for at fjerne ufortyndet DDAOG, som kan udvise uønsket fluorescensemission (460/610 nm).
    BEMÆRK: Hvis immunfarvning for celleoverflademarkører, fortsæt til punkt 5 nedenfor.
  7. (Valgfrit) Fiksering og opbevaring af DDAOG-farvede celler til senere analyse
    1. Der tilsættes 0,5 ml iskold 4% paraformaldehyd dråbevis til hver vasket prøve. Pipette til blanding.
    2. Inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur.
    3. Vask cellerne 2x med 1 ml PBS.
    4. Prøverne opbevares i op til 1 uge ved 4 °C inden flowcytometrianalyse.
      BEMÆRK: For faste prøver skal du springe trin 4.8 over.
  8. Fortynd Calcein Violet 450 AM-bestand (1 mM) ved 1:1.000x til 1% BSA-PBS (1 μM endelig). Der tilsættes 300 μL (for dyrkede celleprøver) eller 1.000 μL (for tumorprøver) til de vaskede cellepiller fra trin 4.6. Inkuber i 15 min på is i mørke.
  9. Fortsæt til opsætning af flowcytometri (punkt 6).

5. (Valgfrit) Immunostaining til celleoverflademarkører i kombination med DDAOG

BEMÆRK: Som med ethvert flowcytometriforsøg bør enkeltfarvede kontrolprøver kun med DDAOG og fluorescerende antistof være forberedt til at bestemme krydstale (hvis nogen) på tværs af fluorescenskanaler. Hvis krydstale observeres, skal standardflowcytometrikompensation udføres20.

  1. De cellepiller, der er opnået i trin 4,6, gensuspenderes i 100 μL farvningsbuffer (1 % BSA i 1x PBS).
  2. Fc-receptorblokerende reagens, der passer til cellearten (mus eller menneske) tilsættes ved den af producenten anbefalede titrering. Inkuberes i 10 minutter ved 24 °C.
  3. Tilsæt fluorophorekonjugerede antistoffer ved den titrering, der anbefales af producenten (eller bestemmes af brugeren). Inkuber i 20 minutter på is, beskyttet mod lys.
  4. Rør centrifugeres i 5 minutter ved 1.000 × g ved 4 °C. Fjern supernatanten.
  5. Der vaskes med 1 ml iskold vaskebuffer (0,5 % BSA-PBS) pr. rør og pipette til blanding. Rørene centrifugeres i 5 minutter ved 1.000 × g ved 4 °C, og supernatanten fjernes. Gentag dette trin 2x for at vaske cellerne grundigt.
  6. Fortynd 1 mM Calcein Violet 450 AM ved 1: 1,000x til 1% BSA-PBS. Der tilsættes 300 μL til de vaskede cellepiller fra trin 5.5. Inkuber i 15 min på is i mørke.
  7. Fortsæt til flowcytometrianalyse (afsnit 6-7).

6. Opsætning af flowcytometer og dataindsamling

  1. Overfør celleprøverne til rør, der er kompatible med flowcytometriinstrumentet. Placer rørene på is og hold dem beskyttet mod lys.
    BEMÆRK: Hvis der observeres aggregater i cellesuspensionerne, føres suspensionen gennem 70-100 μm cellesil inden analyse. Brug ikke 40 μm si, da de kan udelukke nogle af de større senescente celler.
  2. I den refererede software (se materialetabellen) skal du åbne følgende plots: 1) FSC-A vs SSC-A dot plot, 2) violet kanal histogram, 3) far-rød kanal (f.eks. APC-A) versus grøn kanal (f.eks. FITC-A) prikplot.
    BEMÆRK: Doublet exclusion plots og single-channel histogrammer kan også bruges, men er ikke strengt påkrævet.
  3. Start cytometerdataindsamling.
    1. Anbring kontrolprøven kun for køretøjer, der er farvet med DDAOG, på indsugningsporten. Ved en lav indtagshastighed skal du begynde at erhverve prøvedata.
    2. Juster FSC- og SSC-spændinger, så >90% af begivenhederne er indeholdt i plottet. Hvis celler ikke passer godt på plottet, skal du sænke arealskaleringsindstillingen til 0,33-0,5 enheder.
    3. Fjern prøven udelukkende af køretøjet uden at registrere data.
    4. (Valgfrit) Tilsæt en dråbe regnbuekalibreringsmikrosfærer til et cytometerrør med 1 ml PBS. Placer røret på cytometerindtagsporten. Begynd at erhverve prøvedata.
    5. Juster violette, grønne og langt røde kanalspændinger, så den øverste top af regnbuemikrosfæren ligger i området 104-10 5 enheder relativ fluorescens i hver kanal, og alle toppe er godt adskilt i hver kanal. Optag 10.000 begivenheder. Fjern røret.
  4. Den positive kontrolprøve (f.eks. BLM, ETO) farvet med DDAOG anbringes på indsugningsporten. Ved lav hastighed skal du erhverve prøvedata. Overhold begivenhederne i FSC, SSC, violette, grønne og langt røde kanaler for at sikre, at over 90% af begivenhederne er indeholdt i alle plots. Se efter en stigning i AF- og DDAOG-signal versus kontrol, der kun er beregnet til køretøjer.
  5. Hvis du bruger et sorteringscytometer, skal du starte sorteringen på dette trin.
    1. Til registreringsformål skal du registrere 10.000 celler til kontrolprøven og hver sorteret prøve.
    2. Sorter den ønskede mængde celler (≥1 × 106 er typisk egnet) i et instrument-passende opsamlingsrør med 3-5 ml kulturmedium.
    3. Efter sortering skal du fortsætte til downstream-kultur eller analyse.
    4. Spring til afsnit 7 for rutinemæssig analyse af sorterede prøver.
  6. Hvis du bruger fluorescerende antistoffer, skal du optimere kanalspændingerne her ved hjælp af de ufarvede, enkeltfarvede og dobbeltfarvede prøver, der er fremstillet i afsnit 5.
    BEMÆRK: For det kalibrerede flowcytometer, der anvendes heri, faldt optimale kanalspændinger typisk mellem 250 og 600 (mellemklasse), men de optimale spændinger og kanalspændingsområder vil variere på tværs af instrumenter. Undgå at bruge spændinger ved meget lave eller høje intervaller, som kan undertrykke signal eller forstærke støj.
  7. Når du har gennemført trin 6.1-6.5 og foretaget justeringer af cytometerindstillingerne efter behov, skal du registrere data for alle prøverne. Sørg for, at indstillingerne forbliver ensartede for alle prøveoptagelser. Optag ≥10.000 hændelser pr. dyrket celleprøve eller ≥100.000 hændelser pr. tumorcelleprøve.
    BEMÆRK: Selvom gating og analyse kan udføres ved hjælp af dataindsamlingssoftware (f.eks. FACSDiva), er en komplet gating- og analysearbejdsgang, der skal udføres efter erhvervelse ved hjælp af separat analysesoftware (FlowJo), beskrevet i afsnit 7 nedenfor. Analyse efter anskaffelse foretrækkes for at reducere tiden på cytometerarbejdsstationen og drage fordel af yderligere værktøjer, der er inkluderet i den dedikerede analysesoftware.
  8. Gem eksempeldata i .fcs-filformat. Eksporter filerne til en arbejdsstationscomputer, der er udstyret med flowcytometrianalysesoftware (f.eks. FlowJo). Fortsæt til afsnit 7.

7. Analyse af flowcytometridata

BEMÆRK: Den præsenterede arbejdsgang bruger FlowJo-software. Alternativ flowcytometridataanalysesoftware kan anvendes, hvis de vigtigste trin, der er beskrevet i dette afsnit, følges på samme måde.

  1. Brug FlowJo-software til at åbne .fcs-datafiler fra trin 6.7.
  2. Åbn layoutvinduet.
  3. Træk og slip alle eksempler i layoutvinduet.
  4. Gate levedygtige celler.
    1. Dobbeltklik først på eksempeldataene for kontrolelementet kun for at åbne datavinduet.
    2. Visualiser dataene som et violet kanalhistogram. Identificer de levedygtige celler, der er farvet af CV450 baseret på deres lysere fluorescens end de døde celler.
    3. Tegn en port ved hjælp af single-gate histogramværktøjet til kun at inkludere levedygtige celler. Navngiv porten levedygtig.
    4. Træk derefter den levedygtige port til de andre celleprøver fra eksempellayoutvinduet for at anvende porten ensartet.
    5. I layoutvinduet skal du visualisere alle prøver som violette kanal (levedygtighed) histogrammer. Kontroller, at levedygtig cellegating er passende på tværs af prøver, før du fortsætter; hvis ikke, foretag justeringer efter behov.
      BEMÆRK: Levedygtighedsfarvning kan udvise variationer på tværs af behandlinger eller tumorer.
  5. Gate senescent celler.
    1. Dobbeltklik på de lukkede levedygtige celledata for kontrolelementet kun for køretøjet for at åbne dets datavindue.
    2. Visualiser dataene som et prikdiagram for langt rød kanal (DDAOG) vs grøn kanal (AF).
    3. Tegn en port ved hjælp af rektangelgitterværktøjet for at inkludere <5% af celler, der er DDAOG + og AF + (øverste højre kvadrant). Navngiv porten senescent.
    4. Træk derefter den senescente port fra eksempellayoutvinduet til de levedygtige delmængder af de andre celleprøver for at anvende porten ensartet.
    5. I layoutvinduet skal du trække og slippe alle levedygtige celleundersæt, der er gated i afsnit 7.4. Visualiser alle levedygtige prøver som langt røde (f.eks. APC-A) versus grønne kanaldiagrammer (f.eks. FITC-A).
    6. Sørg for, at den senescente port, der er tegnet i trin 7.5.3, er synlig på alle plots, og at porten til betjeningsanordningen kun for køretøjet udviser ≤5%-10% senescente celler.
  6. Når procentdelen af senescente celler er blevet bestemt ved hjælp af ovenstående trin, skal du præsentere de resulterende data ved hjælp af FlowJo-plottene, opsummeret i en datatabel og / eller statistisk analyseret ved hjælp af standardsoftware.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Flere eksperimenter blev udført for at demonstrere sammenligneligheden af DDAOG med X-Gal og C12-FDG til påvisning af ældning af SA-β-Gal. For det første blev X-Gal brugt til at plette senescent B16-F10 melanomceller induceret af ETO (figur 2A). En intens blå farve udviklede sig i en delmængde af ETO-behandlede celler, mens andre celler udviste mindre intens blå farvning. Morfologi blev forstørret i de fleste ETO-behandlede celler. Farvning af ETO-behandlede celler med fluorescerende SA-β-Gal-substrat C12-FDG (grøn) eller DDAOG (far-rød) viste sammenlignelige farvningsmønstre og intensitetsvariationer med X-Gal (figur 2B). Imidlertid overlappede grøn C 12-FDG-emission med cellulær AF (figur 2C), som vides at akkumulere i senescente celler17. I modsætning hertil var AF ubetydelig i DDAOG's langt røde emissionsområde.

I stedet for at bruge et fluorescensmikroskop til at score og tælle senescente celler, var det mere hensigtsmæssigt at drage fordel af et flowcytometers høje gennemstrømningskapacitet til at erhverve data for tusindvis af celler pr. prøve på kort tid (<5 minutter pr. Prøve). Først blev en række standardflowcytometriopsætningsparametre implementeret for at sikre optimal dataindsamling (figur 3). Efter en typisk tilgang blev lysspredningsparametre indstillet til at visualisere volumen (fremadspredning, FSC) og granularitet (sidespredning, SSC) af celler (figur 3A). Her bemærkede vi tendensen til øget volumen af ETO-behandlede celler, hvilket var i overensstemmelse med den forstørrede morfologi, der typisk observeres for senescente celler ved hjælp af mikroskopi. En reduktion i standardarealskaleringsindstillinger (til 0,33-0,50 enheder afhængigt af celletype og behandling) var nødvendig for at visualisere flere af de større celler på plottet. For nogle cellelinjer/behandlinger var øget granularitet (SSC) også tydelig (data ikke vist). Samlet set blev scatter evaluering brugt som et kvalitetskontroltrin for at verificere, at cellespredningsdata fremkom som forventet, overdreven celleaffald var ikke til stede, og celler blev behandlet gennem cytometeret med passende strømningshastigheder (~ 100-1000 celler / s). Som et kvalitetskontroltrin, der kun blev brugt til instrumentopsætning, blev der ikke udført nogen gating eller analyse her.

Et andet (valgfrit) trin i flowcytometriopsætningen var kort at analysere en prøve af kommercielt tilgængelige "regnbue" kalibreringspartikler for at sikre, at de fluorescerende detektionsspændinger blev indstillet i acceptable intervaller (figur 3B). Den lyseste top blev indstillet mellem 1 × 104 enheder og 1 × 105 enheder relativ fluorescerende intensitet i hver kanal med klart definerede toppe med lavere intensitet, tilstrækkelig adskillelse mellem hver top og ingen overlapning af nabotoppe. En kontrolprøve på 10.000 mikrosfærer blev registreret ved hjælp af disse spændingsindstillinger. Mikrosfærerne blev derefter brugt på denne måde i hver cytometrisession for at forbedre ensartetheden af dataindsamling i løbet af protokollen.

Dernæst blev prøver af celler, der kun blev behandlet med køretøjer eller ETO, visualiseret i hver fluorescerende kanal, og porte blev indstillet. Cellelevedygtighedsporte blev indstillet ud fra signalet om CV450 levedygtighedsplet i den violette kanal (figur 3C). Celler, der kun blev behandlet med køretøjer, udviste 88% levedygtighed, og ETO-behandlede celler udviste 75% levedygtighed (i den endelige celleprøve; yderligere døde celler blev sandsynligvis oprindeligt fjernet i kasserede kulturmedier og mekanisk desintegreret under farvningsprocessen). Dernæst blev levedygtige gated celler visualiseret i de grønne (figur 3D) og far-røde (figur 3E) emissionskanaler. Porte til grøn AF HI og langt rød DDAOGHI blev indstillet til <5% af cellerne kun til køretøjer, og disse porte blev derefter anvendt på ETO-behandlede celler. Ved hjælp af denne tilgang blev det fastslået, at 46% af ETO-behandlede celler var AFHI og 33% var DDAOGHI; Disse værdier var i det forventede interval baseret på litteratur og fra resultater af adskillige replikateksperimenter i vores laboratorium. Når cytometeropsætningen var fuldført, blev alle celleprøver i eksperimentet kørt ved hjælp af identiske dataindsamlingsindstillinger. Data for 10.000 hændelser pr. prøve blev opnået.

Repræsentative analysedata er vist i figur 4. B16-F10 murine melanomceller eller A549 humane lungeadenocarcinomceller blev brugt som kræftcellelinjemodeller. Hver cellelinje blev behandlet med et kemoterapimiddel, der vides at inducere ældning (ETO eller BLM) i 4 dage for at inducere ældning eller kun køretøj. Endvidere blev det kendte senolytiske middel ABT-26321 tilsat til inducerede senescente celler i 2 dage for at demonstrere DDAOG-sondens specificitet. ABT-263 kun prøver blev fremstillet som yderligere kontrol. Her visualiseres data som 2D-prikplots med DDAOG (670 nm emission) versus AF (525 nm). Arbejdsgangen fra figur 3 blev brugt til cytometeropsætning, og en TIS-port blev indstillet således, at <5% af cellerne kun i køretøjet scorede som TIS. Resultater ved hjælp af B16-F10-celler (figur 4A) viste, at ETO inducerede TIS i 35% af levedygtige B16-F10-celler (svarende til de sammenlignelige data vist i figur 2D, E), og det senolytiske middel eliminerede næsten fuldstændigt TIS-celler (<2%). I A549-celler (figur 4B) inducerede BLM TIS i 66% af levedygtige celler, og ABT-263 reducerede procentdelen til 15%. ABT-263 alene var ikke giftigt for ubehandlede, prolifererende celler.

Vi havde endvidere til formål at demonstrere, at fluorescerende antistof-co-farvning var kompatibel med DDAOG-ældningsanalysen for at lette screeningen af TIS-associerede eller nye overflademarkører. Her blev B16-F10 musemelanomceller igen behandlet med TIS-inducerende ETO (eller køretøj) i 4 dage. Derefter blev celler både farvet med DDAOG for at evaluere TIS og med et fluorescerende antistof til at detektere den TIS-associerede overflademarkør DPP422 (figur 5). Anti-DPP4 konjugeret til R-phycoerythrin (PE) blev anvendt, og vi bekræftede ubetydelig overlapning af PE med DDAOG og AF på det anvendte flowcytometer (supplerende figur S2). Et histogram af PE-kanaldata (figur 5A) for >5.000 levedygtige celler viste, at 42% af de ETO-behandlede celler var DPP4+ (ved hjælp af prøven kun med køretøjer til at indstille positivitetsporten). Visualisering af 2D-prikplots for de samme prøver (figur 5B, C) viste, at 44% af ETO-behandlede celler var dobbeltpositive for DDAOG (dvs. senescent) og DPP4 versus 4% af celler, der kun var i køretøjet. Disse data viser, at levende cellefarvning med overflademarkørantistoffer er mulig i kombination med DDAOG-ældningsassayet.

Potentielle bekymringer med enhver levende cellefarvningsmetode inkluderer celledød, der forekommer under lange analysesessioner (>1 time), og hvordan man mest effektivt pletter og analyserer prøver på tværs af mange forskellige tidspunkter (op til dage fra hinanden). Opløsningsmiddelbaseret fiksering af farvede celler adresserer begge disse bekymringer, da prøver kan rettes, så snart de er farvet og derefter opbevares i køleskabet indtil analyse i en temperaturstabil batch. Således testede vi, om levende celler farvet med DDAOG kunne fikseres med 100% methanol eller 4% paraformaldehyd (PFA) og opbevares i op til 1 uge ved 4 °C. Uønsket reducerede methanolfiksering DDAOG-signalet og reducerede signifikant AF (data ikke vist); Derfor bør brugen af methanol som fikseringsmiddel undgås. Fiksering med PFA var dog meget mere vellykket, som det ses i figur 6 for celler fikseret i 4% PFA i 10 minutter efter farvning med DDAOG. Sammenlignet med ikke-fikserede kontrolprøver (figur 6A; ubehandlet, 5% og BLM, 67% DDAOG HI AFHI), udviste faste prøver (figur 6B) lidt højere baggrund i ubehandlede celler (9%) og også en højere procentdel af celler, der scorede som senescent i BLM-behandlede celler (80%). Denne effekt blev også set i faste prøver opbevaret natten over (figur 6C; ubehandlet, 12% og BLM, 72%) og opbevaret i 1 uge ved 4 °C (figur 6D; 14% og 70%). På trods af de små stigninger i fluorescens forårsaget af PFA-fiksering var induktionen af ældning af BLM stadig tydelig i alle faste prøver versus den matchede ubehandlede prøve. Endvidere forblev celler intakte på lager med kun lille forringelse på dag 7, og der blev ikke observeret nogen problematisk aggregering. Vi konkluderer, at bekvemmeligheden ved at kunne fiksere og opbevare celleprøver til senere batchanalyse vil retfærdiggøre at tolerere den lidt højere baggrund forårsaget af PFA-fiksering, især i forsøg med mange prøver eller tidspunkter.

En almindelig udfordring inden for cellebaseret ældningsforskning er den heterogene begyndelse af ældning i cellepopulationer. Her viser vi, at DDAOG kan bruges til FACS af levedygtige senescente celler, og at indsamlede celler overlever i kultur til downstream in vitro-assays (figur 7). For at sortere celler efter FACS behandles og farves celler som beskrevet og sorteres efter et FACS-kompatibelt flowcytometer ved hjælp af DDAOG versus AF-gating-strategien vist her (figur 7A). Da en levedygtighedssonde ikke anvendes her på grund af langsigtede toksicitetsproblemer, anbefaler vi, at der udføres streng spredningsgating inden den endelige senescente cellegating (supplerende figur S3) for at eliminere falsk-positivt affald fra de indsamlede celler. Disse er standard FACS-gatingprocedurer, der skal være velkendte for en moderat erfaren bruger og hurtigt kan etableres ved hjælp af software på instrumentet (<10 min).

Efter sortering af en prøve af BLM-behandlede A549-celler returnerede vi cellerne til dyrkning i standard multiwell-retter i 5 dage (n = 6 replikater) ved 10 × 103 celler / cm2. Usorterede kontroller blev belagt med samme tæthed, dyrket ved siden af, og ubehandlede og BLM-behandlede celler blev inkluderet. Celler blev observeret dagligt; For sorterede celler blev der ikke observeret nogen signifikant celledød eller tilbagevenden til spredning. Sorterede celler forblev sparsomme (dvs. ikke prolifererende) i løbet af 5 dage i kultur, mens ubehandlede og BLM-behandlede celler blev sammenflydende som vist. På dag 5 blev celler fikseret i PFA og farvet til morfologi og spredningsmarkører (figur 7B). Den karakteristiske forstørrede morfologi af sorterede celler blev afsløret ved fluorescerende Phalloidin-farvning af filamentøs actin, med DAPI-farvning for at vise forstørrede kerner. Sorterede celler var meget store i diameter (>10 μm) med et karakteristisk afrundet udseende. Som forventet afslørede Ki67-antistoffarvning et fuldstændigt tab af spredningsmarkøren i den sorterede prøve versus et delvist tab i den usorterede BLM-behandlede prøve, og normale niveauer af Ki67 blev set i mange celler i den ubehandlede usorterede prøve. Der blev taget mindst tre billeder pr. brønd ved hjælp af ensartede billeddannelsesindstillinger på tværs af prøver. Repræsentative billeder er vist (figur 7B).

Endelig vurderede vi, om senescente celler, der opstår i tumorer etableret hos mus behandlet med kemoterapeutiske lægemidler, kunne identificeres ved hjælp af DDAOG. B16-F10 melanomtumorer blev induceret i flanken af C57 / BL6 mus, som derefter blev behandlet tre gange (dvs. hver 5. dag) kun med saltvand (figur 8A), DOX (figur 8B) eller PLD (figur 8C). Efter den tredje behandling kom musene sig i 7 dage for at tillade begyndelsen af ældning og blev derefter ofret og tumorer udskåret. Tumorer blev halveret, hvor halvdelen blev brugt til at forberede frosne vævsdias til X-Gal-farvning (figur 8) og halvdelen dissocieret i enkeltcellesuspensioner og farvet med DDAOG (figur 8 og supplerende figur S4). X-Gal-farvning i væv var ret svag på trods af en lang farvningsvarighed (72 timer), men blå farvning var tydelig i DOX- og PLD-tumorer ved nøje inspektion, især i tumorer, der også scorede positivt for ældning ved DDAOG-flowassay (figur 8B, C). Der blev taget mindst tre billeder pr. vævsdias, og der vises repræsentative billeder.

Sammenlignet med X-Gal var DDAOG en mere følsom og præcis måde at kvantificere ældning i tumorer (figur 8). Til DDAOG-tumoranalyse blev den saltvandsbehandlede tumor med den højeste fluorescensbaggrund brugt til at indstille ældningsporten til <5%, således at de andre saltvandsbehandlede tumorer ikke scorede over 5% ældning. Denne ældningsport blev derefter batch-anvendt på gated levedygtige celler fra alle tumorer. Begge kemoterapimidler inducerede ældning i nogle tumorer (to af fem tumorer for DOX, tre af fem for PLD), med procentdele af senescent tumorceller varierende fra 3% til 36% pr. tumor. Cytometridataplots for alle 15 tumorer er vist i supplerende figur S4, og et resumé af tumorcytometridata er vist i figur 8D (n = 5; (*) p < 0,05 vs. kontrolgruppe kun for saltvand ved F-varianstesten). Vi konkluderer, at DDAOG versus AF flowcytometri er en acceptabel metode til screening af tumorer og kemoterapimidler til induktion af ældning in vivo.

Figure 2
Figur 2: DDAOG er en følsom og specifik plet for SA-β-Gal. (A) Konventionel farvning til SA-β-Gal ved hjælp af X-Gal, der viser ubehandlede (venstre) eller ETO-behandlede (højre) B16-F10 murine melanomceller. Senescens induceret af ETO: celler udviser forstørret morfologi og blå farvning på grund af spaltning af X-Gal ved forhøjet SA-β-Gal. Skalastænger = 10 μm. (B) Fluorescerende farvning til SA-β-Gal i ETO-behandlede celler ved hjælp af enten C12-FDG (515 nm emission, grøn) eller DDAOG (660 nm, rød). Farvningsfordelingen er ens for begge sonder, hvilket indikerer, at DDAOG registrerer SA-β-Gal på samme måde som C12-FDG. (C) Evaluering af AF i ikke-farvede, ETO-behandlede celler i enten den grønne (525 nm emission, venstre) eller far-rød (660 nm, højre) emissionskanal. AF fra lipofuscin er højt i den grønne emissionskanal og ubetydelig i den langt røde kanal. Eksponeringstid = 2.000 ms for hvert billede. Skalastænger = 10 μm. Denne figur er genoptrykt fra Flor og Kron23. Forkortelser: DDAO = 9H-(1,3-dichlor-9,9-dimethylacridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galactoside; X-Gal = 5-brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid; UNT = ubehandlet; ETO = etoposid; AF = autofluorescens; C12-FDG = 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranosid; SA-β-Gal = ældningsassocieret beta-galactosidase. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Opsætning af flowcytometerdataindsamling. (A) Repræsentativ spredningsplotfordeling af celler. FSC-A er en aflæsning af cellevolumen, og SSC-A indikerer cellulær granularitet. Venstre panel, behandling af A549-celler kun til køretøjer. Højre panel, ETO-behandling for at inducere ældning. Bemærk tendensen mod forstørret cellevolumen af ETO-behandlede celler i overensstemmelse med den forstørrede morfologi, der fremgår af mikroskopi. (B) Valgfri brug af 5-peak kommercielle "regnbue" fluorescerende kalibreringsmikrosfærer til indstilling af detektorspændinger på cytometeret. I hver fluorescenskanal, der anvendes, skal den maksimale top indstilles ≤1 x 105 relative fluorescerende enheder ved at justere cytometerdetektorspændingen, mens prøverne kører. Venstre panel, BV421 (violet) kanal; centrum, FITC (grøn) kanal; højre, APC (rød) kanal. De fem fluorescerende toppe skal udvise tydelig afstand som vist. (C-E) Repræsentative enkeltkanals fluorescensdata for (C) levedygtighedsfarvning ved hjælp af violet CV450-farvestof; D) grøn autofluorescens af celler (E) langt rødt signal fra DDAOG, der registrerer SA-β-Gal. Mørkere farvehistogram, behandling kun for køretøjer; lysere farvehistogram, ETO-behandling. Forældreporte er angivet over hvert plot. Forkortelser: FSC-A = fremad scatter-peak område; SSC-A = side scatter-peak område; ETO = etoposid; BV421-A = Strålende violet 421 kanal peak område; FITC-A = fluoresceinisothiocyanatkanalens topområde; APC-A = allofycocyanin kanal peak område; AF = autofluorescens; DDAO = 9H-(1,3-dichlor-9,9-dimethylacridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galactoside; VEH = køretøj. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Repræsentative data for flowcytometri ældningsanalyse . (A) B16-F10 murine melanomceller kun behandlet med (øverste venstre) køretøj, (øverst til højre) ETO, (nederst til venstre) ABT-263 (1 μM) eller (nederst til højre) ETO plus ABT-263. (B) A549 humane lungeadenocarcinomceller kun behandlet med (øverste venstre) køretøj, (øverst til højre) BLM, (nederst til venstre) kun ABT-263 eller (nederst til højre) BLM plus ABT-263. (A,B) Rektangulære porte i øverste højre kvadranter af alle plots definerer senescente celler (DDAOGHI AFHI). Procentdelen af senescentceller (af samlede levedygtige celler pr. prøve) er angivet på hvert område. Forkortelser: DDAO = 9H-(1,3-dichlor-9,9-dimethylacridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galactoside; ETO = etoposid; BLM = bleomycin; VEH = køretøj; TIS = terapiinduceret ældning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Samfarvning af et eksempel på celleoverflademarkør med ældningsassay. A) Immunodetektion af ældningsmarkør DPP4 på overfladen af levedygtige B16-F10-dyrkede celler mørk orange, kun køretøj; lys orange, ETO. (B,C) Midterste og højre paneler: celler co-farvet med DDAOG og anti-DPP4: PE. DDAOGHI DPP4HI-celler er indeholdt i rektangulære porte vist på plottene, og procentdelen af dobbeltpositive celler pr. Prøve er angivet. Vist: levedygtige celler. Forkortelser: DDAO = 9H-(1,3-dichlor-9,9-dimethylacridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galactoside; ETO = etoposid; VEH = køretøj; DPP4 = dipeptidylpeptidase 4. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Efterfarvningsfiksering og opbevaring af DDAOG-farvede celleprøver til senere analyse. (A) Kontrol, ikke-fikserede prøver af levende A549-celler, enten ubehandlede (venstre) eller behandlet med BLM (højre) for at inducere ældning, og derefter farvet og straks analyseret ved hjælp af DDAOG-protokollen (uden fiksering, dag 0). (B) Prøver fremstillet som i (A) og derefter straks fastgjort i 4% paraformaldehyd og analyseret (dag 0). C) Prøver fremstillet som i litra A), straks fastgjort i 4% paraformaldehyd og opbevaret natten over ved 4 °C inden analysen. (D) Prøver fremstillet som i (A), straks fastgjort og opbevaret i 7 dage før analysen. Rektangulære porte i øverste højre kvadranter af alle plots definerer senescente celler (DDAOGHI AFHI). Procentdelen af senescente celler er angivet på hvert plot. Forkortelser: TIS = terapiinduceret ældning; DDAO = 9H-(1,3-dichlor-9,9-dimethylacridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galactoside; BLM = bleomycin; AF = autofluorescens. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Flowcytometrisk sortering og validering af berigede senescentcellepopulationer . (A) Flowcytometriske sorteringsdata, der viser (venstre) den ubehandlede, DDAOG-farvede kontrol, der bruges til at indstille porten til senescent cellesortering (<5% senescente celler i gated region) og (højre) den BLM-behandlede, DDAOG-farvede prøve, der blev sorteret ved hjælp af sorteringsporten som vist. (B) Fluorescensmikroskopibilleder for (venstre kolonne) celler farvet med Phalloidin-Alexa Fluor 647 (orange pseudofarve) for at detektere F-actin og DAPI (blå) for at modfarve kerner, hvilket demonstrerer forstørret morfologi af senescente celler eller (højre kolonne) celler farvet med kanin Ki67 antistof og anti-kanin Alexa Fluor 594 for at detektere tab af proliferation i senescent celler. Øverste række, ubehandlede og usorterede celler. Centerrække, BLM-behandlede og usorterede celler. Nedre række, BLM-behandlede og sorterede celler. Skalastænger = 10 μm. Forkortelser: TIS = terapiinduceret ældning; DDAO = 9H-(1,3-dichlor-9,9-dimethylacridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galactoside; BLM = bleomycin; UNT = ubehandlet; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: Kvantificering af ældning i tumorer fra mus behandlet med kemoterapilægemidler. B16-F10 melanom tumorer blev etableret i flankerne af C67BL / 6 mus, som derefter blev behandlet med tre doser (A) saltvand, (B) DOX eller (C) PLD hver 5. dag plus 1 uge for at tillade begyndelsen af ældning. Tumorer blev udskåret og halveret; frosne vævsglas blev fremstillet fra den ene halvdel til X-Gal-farvning (øverste række), og den anden halvdel blev dissocieret til DDAOG-farvning (nederste række). I X-Gal-farvede billeder er blå celler SA-β-Gal HI-senescente celler, mens brune regioner skyldes melanin i tumorer. Repræsentative resultater er vist for DOX og PLD fra to tumorer pr. Gruppe, der udviste ældning. Alle saltvandstumorer udviste ubetydelig ældning. (D) Kvantificering af ældning i lægemiddelbehandlede tumorer fra mus. (*) p < 0,05 ved F varianstest, n = 5 mus pr. gruppe. Fejllinjer, middel ± SEM. Forkortelser: DDAO = 9H-(1,3-dichlor-9,9-dimethylacridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galactoside; DOX = doxorubicin; PLD = PEGyleret liposomal doxorubicin; X-Gal = 5-brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid; AF = autofluorescens. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur S1: DDAOG-sondens kemiske struktur. DDAOG er et konjugat af 7-hydroxy-9H-(1,3-dichlor-9,9-dimethylacridin-2-one) og beta-galactosid. Når det spaltes af beta-galactosidase, udviser det hydrolyserede spaltningsprodukt et 50 nm langt rødt fluorescensemsionsskift, hvilket muliggør dets specifikke detektion med excitation over 600 nm. Forkortelser: DDAO = 9H-(1,3-dichlor-9,9-dimethylacridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galactoside. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S2: Spektralscanning af DDAOG-krydstale med andre fluorescerende kanaler i flowcytometeret. For at identificere tilgængelige kanaler til påvisning af fluorescerende antistoffer blev der udført en spektralscanning på et 4-laser, 15-kanals flowcytometer ved hjælp af A549-celler behandlet med BLM og farvet med DDAOG (rød) eller ufarvet (sort). Data i hver kanal i flowcytometeret blev erhvervet for 10.000 celler. (A) Emissionskanaler for 405 nm laseren: fra venstre mod højre, BV421, BV510, BV605, BV660 og BV711. Krydstale, der observeres i BV605-, BV660- og BV711-kanaler, gør dem uegnede til co-farvning med DDAOG uden kompensation. BV421 og BV510 er velegnede til samfarvning (bemærk, at BV421 typisk bruges til levedygtighedsfarvning). (B) Emissionskanaler for 488 nm laseren: FITC og PerCP-Cy5. Høj krydstale blev observeret for PerCP-Cy5-kanalen. FITC er velegnet til samfarvning; Bemærk dog, at FITC-kanalen typisk bruges i DDAOG-analysen til evaluering af grøn emissions-AF. (C) Emissionskanaler for 561 nm laseren: PE, PE-Dazzle 594, PE-Cy5, PE-Cy5.5 og PE-Cy7. PE- og PE-Dazzle 594-kanalerne er egnede til påvisning af antistoffer mærket med disse fluorophorer (PE er demonstreret til påvisning af DPP4 i denne undersøgelse). (D) Emissionskanaler for 640 nm laseren: APC, APC-H700 og APC-Cy7. DDAOG-signalet for de senescente celler er synligt i APC-kanalen (47,8% senescent). Signalet overlapper ind i APC-H700- og APC-Cy7-kanalerne, hvilket gør dem uegnede til co-farvning uden væsentlig spektral kompensation. Forkortelser: BLM = bleomycin; BV = Strålende violet; FITC = fluoresceinisothiocyanat; PerCP = peridinin-chlorophyll protein; PE = phycoerythrin; DZ594 = Blænding 594; APC = allophyocyanin; AF = autofluorescens; DDAO = 9H-(1,3-dichlor-9,9-dimethylacridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galactoside. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S3: Cellegating strategi for FACS sortering af senescent celler. At føre en suspension af celler gennem et følsomt FACS-cytometer kan kræve yderligere gating for at sikre renheden af sortering og optimal instrumentfunktionalitet. Et eksempel på strategi er vist her. Andre strategier er mulige afhængigt af producentens anbefalinger for det FACS-cytometer, der anvendes. Venstre kolonne, kun behandlet cellekontrol kun med køretøjer. Højre kolonne, A549-celler behandlet med BLM for at inducere ældning, der skal sorteres. (A) FSC-A (cellevolumen) versus SSC-A (cellegranularitet) gating af intakte celler. Den intakte port fjerner celleaffald fra den sorterede prøve. (B) FSC-A versus FSC-H renhed gating; fjerner dubletter og snavs. (C) SSC-A versus SSC-H renhed gating; fjerner dubletter og snavs. D) Gating for den interesserede befolkning , der anvender APC-A-kanalen (637 nm excitation, 670 nm ± 30 nm emission, anvendt til DDAOG) versus FITC-A-kanalen (488 nm excitation, 530 nm ± 30 nm emission, anvendt til AF) fjerner mulige farvningsartefakter. (E) Senescent celle gating til endelig sortering. Forkortelser: FACS = fluorescensaktiveret cellesortering; BLM = bleomycin; FSC-A = fremad scatter-peak område; SSC-A = side scatter-peak område; FSC-H = fremadgående spredningshøjde; SSC-H = side scatter-peak højde. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S4: DDAOG senescence flow cytometri farvning af tumorer. Flowcytometridata for ≥50.000 levedygtige tumorceller. Senescent celleport, øverste højre kvadrant for hvert plot. Procentdelen af senescent (af levedygtige) tumorceller er vist inden for porten. Tumorbehandlinger omfattede (A) kun saltvand; (B) DOX; og (C) PLD. Mus blev behandlet tre gange, en gang hver 5. dag, med 7 dage til genopretning for at tillade begyndelsen af ældning før ofring. Fem tumorer pr. Tilstand blev analyseret. Forkortelser: AF = autofluorescens; DDAO = 9H-(1,3-dichlor-9,9-dimethylacridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galactoside; DOX = doxorubicin; PLD = PEGyleret liposomal doxorubicin. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I løbet af det sidste årti eller deromkring er flowcytometri blevet en mere almindelig analyseplatform inden for kræftforskning på grund af den nye popularitet af tumorimmunologi, udviklingen af billigere flowcytometre og forbedringen af delte instrumenteringsfaciliteter på akademiske institutioner. Flerfarvede assays er nu standard, da de fleste nyere instrumenter er udstyret med violette, blågrønne og røde til langt røde optiske arrays. Således vil denne DDAOG-protokol sandsynligvis være kompatibel med en lang række flowcytometre. Selvfølgelig skal ethvert flowcytometer være brugervurderet. Der skal udvises særlig forsigtighed, når der tilsættes yderligere fluorophorer (f.eks. fluorescerende, konjugerede antistoffer) til DDAOG-assayet. En evaluering af fluorophore krydstale mellem kanaler bør udføres ved hjælp af enkeltfarvede kontroller visualiseret i alle andre relevante kanaler. Hvis der observeres overlapning, kan spektralkompensation udføres20 til korrektion efter typiske metoder.

Resultaterne vist heri er primært beregnet til at demonstrere, at DDAOG-flowcytometrianalysen kan producere hurtige, kvantitative, letfortolkelige resultater for TIS induceret af kemoterapilægemidler i celler eller tumorer. De midler, der anvendes her, herunder ETO 23,24, DOX 7,25 og BLM 26,27, er dokumenteret at inducere TIS i forskellige kræftcellelinjer 24. For at demonstrere DDAOG-sondens specificitet blev det kendte senolytiske middel ABT-26321 demonstreret selektivt at eliminere senescente celler i kultur. Dette papir demonstrerer brugen af en murine (B16-F10) og en human (A549) dyrket kræftcellelinje samt B16-F10 tumorer etableret hos mus. Imidlertid kan alle celler, der udtrykker β-Gal og bevarer levedygtigheden gennem et standardflowcytometriprøvepræparat, anvendes. Visse celletyper kan være mere skrøbelige eller mindre tilbøjelige til TIS, og dette bør evalueres, inden man går i gang med en stor skærm eller undersøgelse. Hvis celler opløses under forberedelse, levedygtigheden er dårlig, eller TIS er meget lavere end forventet ved hjælp af positive agentkontroller, er celletypen muligvis ikke en ideel model til undersøgelser af ældning. De her viste midler og cellelinjer kan anvendes af andre grupper som kontroller i yderligere screening af potentielle TIS-inducerende midler eller nye senolytika, som fortsat er et aktivt mål på området.

Toksicitet induceret af kemoterapi lægemidler kan variere på tværs af celletyper og påvirke assay resultater. Hvis den primære observerede virkning af det anvendte middel og/eller koncentration er akut celledød, kan den samlede ældning være minimal. In vivo skal høj tumornekrose eller systemisk toksicitet hos dyr undgås ved at sænke middeldoseringen. Nøglen til analysesucces er testning af en række agenskoncentrationer med omhyggelig inspektion af levedygtighedsanalysedata (f.eks. som leveret af CV450 inden for DDAOG-analysen). In vitro, hvis mange døde celler løsner sig fra pladen under behandlingen, herunder kulturmediet i den analyserede prøve, er det vigtigt at evaluere celledød i alt. CV450 er ikke den eneste levedygtighedsplet, der er kompatibel med dette assay; Andre violette/blå emitterende fluorophorer kan anvendes. Levedygtighedssonder, der kan repareres, kan også bruges, hvis brugeren planlægger at fiksere de farvede prøver med PFA, forudsat at sondefluorescensen ikke overlapper signifikant med DDAOG eller AF (eller brugeren udfører spektralkompensation for at korrigere for overlapning). I nogle tilfælde, hvor agenttoksiciteten er lav, og cellerne er robuste, kan gating intakte celler ved lysspredning (FSC vs. SSC) være tilstrækkelige til at isolere "levedygtige" celler til analyse.

Et vigtigt skridt i denne in vitro-protokol er at pladeceller i det nedre område af logvæksttæthed (typisk 2 × 10 3-5 × 103 celler / cm2) for at muliggøre hurtig indledende proliferation, hvilket letter optagelsen af kemoterapilægemidlet af de fleste celler. Når det er behandlet, er det også vigtigt at give tid til begyndelsen af TIS: in vitro, 4 dage ± 1 dag i nærværelse af lægemidlet; in vivo, 7 dages bedring efter den endelige kemoterapibehandling. Efter farvning med DDAOG som beskrevet skal kvantitativ analyse af cytometriske data udføres som vist, dvs. gating DDAOG versus AF-celler i hver prøve for at bestemme procentdelen af senescente celler (af total levedygtig). Valgfrie trin inkluderer brugen af fluorescerende "regnbue" kalibreringsmikrosfærer til standardisering af flowcytometri, PFA-fiksering af farvede prøver, co-immunostaining til overflademarkører og flowsortering for at berige senescente celler til nedstrøms assays. Hvert af disse valgfrie trin giver dog vigtige fordele i visse applikationer. Kalibreringsmikrosfærerne standardiserer cytometriopsætningen på tværs af flere sessioner og giver brugeren mulighed for oprindeligt at indstille spændinger i et nyttigt interval til detektion af ældning og levedygtighed med minimale justeringer derefter. PFA-fiksering af prøver stabiliserer cellerne og muliggør batchanalyse af store sæt celler på et senere tidspunkt. Co-immunostaining for overflademarkører kan bruges til at screene for nye ældningsrelaterede proteiner og immuninteraktioner. I fremtidige undersøgelser planlægger vi at validere co-farvning af intracellulære ældningsmarkører med DDAOG.

Sortering af TIS-celler efter FACS giver mulighed for berigelse af levedygtige TIS-celler fra heterogene populationer, hvilket kan forvirre udlæsninger til nedstrøms assays såsom western blotting, proteomics eller transcriptomics. Efter sortering blev der ikke observeret nogen signifikant toksicitet af DDAOG i TIS-celler, der blev sat tilbage i kultur i op til 5 dage. Det skal dog tages i betragtning, at sorterede celler er blevet behandlet med Baf, internaliseret DDAOG (som spaltes af SA-β-Gal til DDAO, et acridinfarvestof) og har været udsat for mekanisk belastning, der passerer gennem FACS-instrumentet. Derfor kan visse biologiske ændringer, der ikke er relateret til ældning, være til stede i de sorterede celler. I denne undersøgelse bevarede de sorterede celler imidlertid stærke træk ved ældning og gav karakteristiske proteomics og transkriptomiske resultater28 sammenlignet med usorterede kontroller. På trods af den noget åbenlyse nytte af at bruge FACS til at indsamle og analysere senescente celler fra tumorer, er denne procedure sjældent blevet brugt i litteraturen. Nogle grupper har brugt p16Ink4a luciferase eller fluorescerende reportere til at identificere senescente celler i musevæv, med fluorescerende reportere, der muliggør FACS-sortering i nogle undersøgelser29,30. Resultaterne er generelt enige om, at uanset induktionsmiddel eller tumortype er TIS i tumorer en delvis til sjælden forekomst, der sjældent når 100% af tumorceller31. FACS-sortering af celler ved hjælp af DDAOG-metoden tillader let indsamling af sjældne TIS-celler fra tumorer uden behov for at udtrykke transgene konstruktioner.

I øjeblikket udføres det meste ældningsforskning i musemodeller ex vivo ved hjælp af en kombination af X-Gal og immunohistokemiske markører32,33. Alligevel kan vurdering af TIS ex vivo ved hjælp af tumorvæv være en langvarig proces, især når X-Gal anvendes. Denne procedure kræver tumorkryopræservering, kryosektion på dias, X-Gal-farvning, dækglasmontering, tørring, billeddannelse og scoring af "blå" celler - en flerdages tilgang som minimum. Immunohistokemi er ikke meget hurtigere eller lettere, og forskellige vævssektioner skal bruges og scores for hver markør plus X-Gal i hver tumor, medmindre den multipleksede analyse er optimeret, hvilket tilføjer mere tid i front-end af processen. Vævssektioner prøver kun et tyndt tværsnit af tumoren, mens senescente celler (som mange celletyper) kan fordeles ujævnt i 3D-rummet gennem tumorer29. Det er presserende nødvendigt i marken at bevæge sig væk fra langsomme, forældede histologimetoder mod et hurtigere og let kvantificerbart ældningsassay for tumorer. Ved hjælp af DDAOG-flowcytometri kunne et sæt af 15 tumorer dissocieres og farves for at opnå afgørende, kvantitative ældningsdata på mindre end 1 dags praktisk tid efter tumorhøst. Den ene halvdel af tumoren blev behandlet for hver prøve, hvilket forbedrede prøveudtagningen af 3D-rummet pr. Tumor. Denne DDAOG-flowcytometritilgang er signifikant hurtigere og mere pålidelig end vævsdiasbaserede metoder til evaluering af TIS i tumorer.

Med sine mange fordele i forhold til X-Gal og andre metoder går vi ind for, at DDAOG-protokollen bliver det nye guldstandard-ældningsassay. Den bruger både den konventionelt accepterede ældningsmarkør, SA-β-Gal, og etiketfri detektion af aldersassocieret AF som en anden markør. Disse fluorophorer er kompatible med de fleste standard flowcytometre. Analysen inkluderer en levedygtighedsplet for at udelukke døde celler og snavs ved hjælp af prøver, der let opnås fra lægemiddelbehandlede dyrkede cellelinjer eller tumorer. Levende celleprøver kan eventuelt være opløsningsmiddelfikserede eller kryopræserverede for at lette batchanalysen af store undersøgelser, f.eks. ved hjælp af tidspunkter til at evaluere starten på TIS over tid ved hjælp af flere midler Farvningsprocessen tager mindre end en halv dags laboratoriearbejde at gennemføre, og dataindsamling er typisk <5 minutter pr. Prøve. Dataanalyse er tilsvarende hurtig og ligetil og producerer kvantitative data om procentdelen af TIS-celler pr. prøve uden kedelig cellescoring og tælling. Prøver kan FACS-sorteres for at genvinde berigede populationer af TIS-celler, hvilket reducerer støj fra cellulær heterogenitet i downstream-analyser. Vi mener, at DDAOG-analysen i mange tilfælde kan erstatte X-Gal, hvilket letter screeningen af TIS-inducerende midler og senolytika in vitro og in vivo, hvilket fører til hurtigere og mere pålidelige opdagelser inden for ældningsforskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære for denne undersøgelse.

Acknowledgments

Vi takker cytometri og antistofkernefacilitet ved University of Chicago for støtte til flowcytometriinstrumentering. Animal Research Center ved University of Chicago leverede dyreboliger.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bafilomycin A1 Research Products International B40500
Bleomycin sulfate  Cayman 13877
Bovine serum albumin (BSA) US Biological A1380
Calcein Violet 450 AM viability dye ThermoFisher Scientific 65-0854-39 eBioscience
DPP4 antibody, PE conjugate Biolegend 137803 Clone H194-112
Cell line: A549 human lung adenocarcinoma American Type Culture Collection CCL-185
Cell line: B16-F10 mouse melanoma American Type Culture Collection CRL-6475
Cell scraper Corning 3008
Cell strainers, 100 µm Falcon 352360
DDAO-Galactoside Life Technologies D6488
DMEM medium 1x Life Technologies 11960-069
DMSO Sigma D2438
DNAse I Sigma DN25
Doxorubicin, hydrochloride injection (USP) Pfizer NDC 0069-3032-20
Doxorubicin, PEGylated liposomal (USP) Sun Pharmaceutical NDC 47335-049-40
EDTA 0.5 M Life Technologies 15575-038
Etoposide  Cayman 12092
FBS Omega  FB-11
Fc receptor blocking reagent Biolegend 101320 Anti-mouse CD16/32
Flow cytometer (cell analyzer) Becton Dickinson (BD) Various LSRFortessa
Flow cytometer (cell sorter) Becton Dickinson (BD) Various FACSAria
GlutaMax 100x Life Technologies 35050061
HEPES 1 M Lonza BW17737
Liberase TL Sigma 5401020001 Roche
Paraformaldehyde 16% Electron Microscopy Sciences 15710
Penicillin/Streptomycin 100x Life Technologies 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) 1x Corning MT21031CV Dulbecco's PBS (without calcium and magnesium)
Rainbow calibration particles, ultra kit SpheroTech UCRP-38-2K 3.5-3.9 µm, 2E6/mL
RPMI-1640 medium 1x Life Technologies 11875-119
Sodium chloride 0.9% (USP) Baxter Healthcare Corporation 2B1324
Software for cytometer data acquisition, "FACSDiva" Becton Dickinson (BD) n/a Contact BD for license
Software for cytometer data analysis, "FlowJo" TreeStar n/a Contact TreeStar for license
Trypsin-EDTA 0.25% Life Technologies 25200-114

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saleh, T., Tyutyunyk-Massey, L., Gewirtz, D. A. Tumor cell escape from therapy-induced senescence as a model of disease recurrence after dormancy. Cancer Research. 79 (6), 1044-1046 (2019).
  2. Wang, B., Kohli, J., Demaria, M. Senescent cells in cancer therapy: friends or foes. Trends in Cancer. 6 (10), 838-857 (2020).
  3. Prasanna, P. G., et al. Therapy-induced senescence: Opportunities to improve anticancer therapy. Journal of the National Cancer Institute. 113 (10), 1285-1298 (2021).
  4. Velarde, M. C., Demaria, M., Campisi, J. Senescent cells and their secretory phenotype as targets for cancer therapy. Interdisciplinary Topics in Gerontology and Geriatrics. 38, 17-27 (2013).
  5. Ou, H. L., et al. Cellular senescence in cancer: from mechanisms to detection. Molecular Oncology. 15 (10), 2634-2671 (2021).
  6. Hernandez-Segura, A., Nehme, J., Demaria, M. Hallmarks of cellular senescence. Trends in Cell Biology. 28 (6), 436-453 (2018).
  7. Bojko, A., Czarnecka-Herok, J., Charzynska, A., Dabrowski, M., Sikora, E. Diversity of the senescence phenotype of cancer cells treated with chemotherapeutic agents. Cells. 8 (12), 1501 (2019).
  8. Mikuła-Pietrasik, J., Niklas, A., Uruski, P., Tykarski, A., Książek, K. Mechanisms and significance of therapy-induced and spontaneous senescence of cancer cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (2), 213-229 (2020).
  9. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  10. Itahana, K., Itahana, Y., Dimri, G. P. Colorimetric detection of senescence-associated β galactosidase. Methods in Molecular Biology. 965, 143-156 (2013).
  11. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  12. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
  13. Noppe, G., et al. Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts. Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).
  14. Tung, C. -H., et al. In vivo imaging of β-galactosidase activity using far red fluorescent switch. Cancer Research. 64 (5), 1579-1583 (2004).
  15. Gong, H., et al. beta-Galactosidase activity assay using far-red-shifted fluorescent substrate DDAOG. Analytical Biochemistry. 386 (1), 59-64 (2009).
  16. Terman, A., Brunk, U. T. Lipofuscin: Mechanisms of formation and increase with age. APMIS. 106 (2), 265-276 (1998).
  17. Georgakopoulou, E. A., et al. Specific lipofuscin staining as a novel biomarker to detect replicative and stress-induced senescence. A method applicable in cryo-preserved and archival tissues. Aging. 5 (1), 37-50 (2013).
  18. Wang, B., Demaria, M. The quest to define and target cellular senescence in cancer. Cancer Research. 81 (24), 6087-6089 (2021).
  19. Appelbe, O. K., Zhang, Q., Pelizzari, C. A., Weichselbaum, R. R., Kron, S. J. Image-guided radiotherapy targets macromolecules through altering the tumor microenvironment. Molecular Pharmaceutics. 13 (10), 3457-3467 (2016).
  20. Maciorowski, Z., Chattopadhyay, P. K., Jain, P. Basic multicolor flow cytometry. Current Protocols in Immunology. 117, 1-38 (2017).
  21. Fan, Y., Cheng, J., Zeng, H., Shao, L. Senescent cell depletion through targeting BCL-family proteins and mitochondria. Frontiers in Physiology. 11, 593630 (2020).
  22. Kim, K. M., et al. Identification of senescent cell surface targetable protein DPP4. Genes and Development. 31 (15), 1529-1534 (2017).
  23. Flor, A. C., Kron, S. J. Lipid-derived reactive aldehydes link oxidative stress to cell senescence. Cell Death Discovery. 7 (9), 2366 (2016).
  24. Jochems, F., et al. The Cancer SENESCopedia: A delineation of cancer cell senescence. Cell reports. 36 (4), 109441 (2021).
  25. Fallah, M., et al. Doxorubicin and liposomal doxorubicin induce senescence by enhancing nuclear factor kappa B and mitochondrial membrane potential. Life Sciences. 232, 116677 (2019).
  26. Kasper, M., Barth, K. Bleomycin and its role in inducing apoptosis and senescence in lung cells - modulating effects of caveolin-1. Current Cancer Drug Targets. 9 (3), 341-353 (2009).
  27. Muthuramalingam, K., Cho, M., Kim, Y. Cellular senescence and EMT crosstalk in bleomycin-induced pathogenesis of pulmonary fibrosis-an in vitro analysis. Cell Biology International. 44 (2), 477-487 (2020).
  28. Flor, A. C., Wolfgeher, D., Wu, D., Kron, S. J. A signature of enhanced lipid metabolism, lipid peroxidation and aldehyde stress in therapy-induced senescence. Cell Death Discovery. 3, 17075 (2017).
  29. Burd, C. E., et al. Monitoring tumorigenesis and senescence in vivo with a p16(INK4a)-luciferase model. Cell. 152 (1-2), 340-351 (2013).
  30. Liu, J. Y., et al. Cells exhibiting strong p16 (INK4a) promoter activation in vivo display features of senescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2603-2611 (2019).
  31. Wang, L., Lankhorst, L., Bernards, R. Exploiting senescence for the treatment of cancer. Nature Reviews Cancer. 22 (6), 340-355 (2022).
  32. Baek, K. -H., Ryeom, S. Detection of oncogene-induced senescence in vivo. Methods in Molecular Biology. 1534, 185-198 (2017).
  33. González-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Muñoz-Espín, D. A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo. The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).

Tags

Kræftforskning udgave 187 ældning kræft kemoterapi flowcytometri fluorescerende sonde multiplex
Far-rød fluorescerende senescens-associeret β-galactosidase sonde til identifikation og berigelse af senescent tumorceller ved flow cytometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Flor, A., Pagacz, J., Thompson, D.,… More

Flor, A., Pagacz, J., Thompson, D., Kron, S. Far-Red Fluorescent Senescence-Associated β-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (187), e64176, doi:10.3791/64176 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter