Summary

Nachweis homologer Rekombinationszwischenprodukte mittels Proximityligation und quantitativer PCR in Saccharomyces cerevisiae

Published: September 11, 2022
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Summary

Die D-Loop Capture (DLC) und D-Loop Extension (DLE) Assays nutzen das Prinzip der Proximity-Ligation zusammen mit quantitativer PCR, um D-Loop-Bildung, D-Loop-Extension und Produktbildung am Ort eines induzierbaren doppelsträngigen Bruchs in Saccharomyces cerevisiae zu quantifizieren.

Abstract

DNA-Schäden, einschließlich DNA-Doppelstrangbrüche und Interstrang-Vernetzungen, die während der S- und G2-Phasen des Zellzyklus entstehen, können durch homologe Rekombination (HR) repariert werden. Darüber hinaus stellt HR einen wichtigen Mechanismus der Replikationsgabelrettung nach Strömungsabriss oder Zusammenbruch dar. Die Regulierung der vielen reversiblen und irreversiblen Schritte dieses komplexen Weges fördert seine Treue. Die physikalische Analyse der während der HR gebildeten Rekombinationszwischenprodukte ermöglicht die Charakterisierung dieser Kontrollen durch verschiedene Nukleoproteinfaktoren und deren Interaktoren. Obwohl es gut etablierte Methoden gibt, um spezifische Ereignisse und Zwischenprodukte im Rekombinationsweg zu untersuchen, hat sich der Nachweis der Bildung und Ausdehnung der D-Schleife, zwei kritische Schritte in diesem Signalweg, bis vor kurzem als schwierig erwiesen. Hier werden effiziente Methoden zum Nachweis von Schlüsselereignissen im HR-Signalweg beschrieben, nämlich DNA-Doppelstrang-Bruchbildung, D-Loop-Bildung, D-Loop-Extension und die Bildung von Produkten durch bruchinduzierte Replikation (BIR) in Saccharomyces cerevisiae . Diese Assays detektieren ihre relevanten Rekombinationszwischenprodukte und Produkte mit hoher Empfindlichkeit und sind unabhängig von der zellulären Lebensfähigkeit. Die Erkennung von D-Schleifen, D-Schleifenverlängerung und dem BIR-Produkt basiert auf der Proximity-Ligatur. Zusammen ermöglichen diese Assays die Untersuchung der Kinetik von HR auf Populationsebene, um die Funktionen von HR-Proteinen und Regulatoren in signifikanten Schritten des Signalwegs genau zu adressieren.

Introduction

Homologe Rekombination (HR) ist ein High-Fidelity-Mechanismus zur Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs), Interstrang-Vernetzungen und ssDNA-Lücken sowie ein Weg für die DNA-Schadenstoleranz. HR unterscheidet sich von fehleranfälligen Wegen für die Reparatur / Toleranz von DNA-Schäden, wie nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) und Transläsionssynthese, dadurch, dass es eine intakte, homologe Duplex-DNA als Spender verwendet, um das Reparaturereignis zu modellieren. Darüber hinaus sind viele der wichtigsten Zwischenprodukte im HR-Pfad reversibel, was eine exquisite Regulierung der einzelnen Pfadschritte ermöglicht. Während der S-, G2- und M-Phasen des Zellzyklus konkurriert HR mit NHEJ um die Reparatur der zweiseitigen DSBs1. Darüber hinaus ist HR essentiell für die DNA-Replikation für die Reparatur von replikationsassoziierten DNA-Schäden, einschließlich ssDNA-Lücken und einseitigen DSBs, und als Mechanismus des DNA-Läsionsbypasses2.

Ein kritisches Zwischenprodukt im HR-Pfad ist die Verdrängungsschleife oder D-Schleife (Abbildung 1). Nach der Endresektion lädt die zentrale Rekombinase in der Reaktion, Rad51, auf die neu resezierte ssDNA des gebrochenen Moleküls und bildet ein helikales Filament2. Rad51 führt dann eine Homologiesuche durch, um einen geeigneten homologen Spender zu identifizieren, typischerweise die Schwesterchromatide in somatischen Zellen. Die D-Schleife wird gebildet, wenn das Rad51-ssDNA-Filament in eine homologe Duplex-DNA eindringt, was zur Watson-Crick-Basenpaarung des gebrochenen Strangs mit dem komplementären Strang des Donors führt und den gegenüberliegenden Donorstrang verdrängt. Die Verlängerung des 3′-Endes des gebrochenen Strangs durch eine DNA-Polymerase ersetzt die Basen, die während des DNA-Schadensereignisses verloren gegangen sind, und fördert die Auflösung des verlängerten D-Loop-Zwischenprodukts in ein dsDNA-Produkt durch das syntheseabhängige Strangglühen (SDSA), das Doppel-Holliday-Diaphragma (dHJ) oder die Break-induzierten Replikationswege (BIR).

Assays, die die Zwischenprodukte im HR-Signalweg physisch überwachen, ermöglichen die Analyse der genetischen Anforderungen für jeden Schritt (d.h. Signalweganalyse). DSB-Bildung, Endresektion, dHJs, BIR-Replikationsblasen und HR-Produkte werden leicht durch Southern Blotting 3,4,5,6,7 beobachtet. Southern Blotting berichtet jedoch nicht über entstehende und ausgedehnte D-Schleifen, und daher ist eine alternative Methode zur zuverlässigen Messung dieser Gelenkmoleküle erforderlich 4,8,9. Eine weit verbreitete Strategie zur Analyse der entstehenden D-Loop-Bildung ist die Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) von Rad51 in Verbindung mit quantitativer PCR (qPCR)10,11. Die Rad51-Assoziation mit dsDNA, gemessen mittels ChIP-qPCR, ist jedoch unabhängig von der Sequenzhomologie und dem Rad51-Akzessorfaktor Rad5410,11. Im Gegensatz dazu hängt ein nennenswertes Signal mit der hier vorgestellten Methode der D-Loop-Analyse, dem sogenannten D-Loop Capture (DLC)-Assay, von der DSB-Bildung, der Sequenzhomologie, Rad51 und den Rad51-Akzessorproteinen Rad52 und Rad548 ab. Die Feststellung, dass die von Saccharomyces cerevisiae Rad51 geförderte D-Loop-Bildung von Rad54 in vivo abhängt, stimmt mit zahlreichen In-vitro-Rekonstitutionsexperimenten überein, die darauf hindeuten, dass Rad54 für die Homologiesuche und D-Loop-Bildung durch knospende Hefe Rad51 8,12,13,14,15 benötigt wird.

Ähnlich problematisch sind aktuelle Ansätze zur Messung der D-Loop-Extension, vor allem mittels semi-quantitativer PCR. Ein typischer PCR-basierter Assay zum Nachweis der D-Loop-Extension amplifiziert eine einzigartige Sequenz, die sich aus der Rekombination zwischen einer Bruchstelle und einem ektopischen Donor und der anschließenden rekombinationsassoziierten DNA-Synthese ergibt, über einen Primer stromaufwärts der Region der Homologie auf dem gebrochenen Strang und einen weiteren Primer stromabwärts der Region der Homologie auf dem Donorstrang. Mit dieser Methode erfordert der Nachweis der rekombinationsassoziierten DNA-Synthese den nicht-essentiellen Pol-δ-Prozessivitätsfaktor Pol3216. Dieser Befund steht im Widerspruch zu der Beobachtung, dass die POL32-Deletion nur einen geringen Einfluss auf die Genkonversion in vivohat 17. Darüber hinaus können diese PCR-basierten Assays die D-Loop-Erweiterung und die BIR-Produktbildung nicht zeitlich auflösen, was darauf hindeutet, dass das Signal von dsDNA-Produkten und nicht von ssDNA-Zwischenprodukten 17,18,19 stammt. Der D-loop Extension (DLE) Assay wurde kürzlich entwickelt, um diese Diskrepanzen zu beheben. Der DLE-Assay quantifiziert die rekombinationsassoziierte DNA-Synthese an einer Stelle ~400 Basenpaare (bp) stromabwärts des anfänglichen 3′-eindringenden Endes9. Bei dieser Methode ist die D-Schleifenverlängerung unabhängig von Pol32 und innerhalb von 4 h nach der DSB-Induktion nachweisbar, während BIR-Produkte zuerst nach 6 h beobachtet werden. In einer kürzlich veröffentlichten Veröffentlichung der Laboratorien Haber und Malkova wurde festgestellt, dass die Verwendung dieser Methode zur Herstellung genomischer DNA ausschließlich zur Erhaltung der ssDNA führt 9,20.

Hier werden die DLC- und DLE-Assays ausführlich beschrieben. Diese Assays beruhen auf der Proximity-Ligatur, um entstehende und ausgedehnte D-Schleifen in S. cerevisiae zu erkennen (Abbildung 2)8,9. BIR-Produkte können mit demselben Assay-System quantifiziert werden. Für beide Assays wird die DSB-Bildung an einer HO-Endonuklease-Schnittstelle am URA3-Locus auf Chromosom (Chr.) V durch die Expression der HO-Endonuklease unter der Kontrolle eines Galaktose-induzierbaren Promotors induziert. Rad51-vermittelte DNA-Stranginvasion führt zur entstehenden D-Schleifenbildung an der Stelle eines ektopischen Spenders, der sich am LYS2-Locus auf Chr. II befindet. Da die rechte Seite des DSB keine Homologie zum Spender aufweist, ist eine Reparatur über SDSA und dHJ-Bildung nicht möglich. Eine anfängliche Reparatur des DSB durch BIR ist möglich, aber die Bildung lebensfähiger Produkte wird durch das Vorhandensein desZentromers 21 gehemmt. Dieses bewusste Design verhindert eine produktive DSB-Reparatur und vermeidet so die Wiederaufnahme des Wachstums durch Zellen mit reparierten THSs, die sonst die Kultur während der Zeitverlaufsanalyse überholen könnten.

Im DLC-Assay bewahrt die psorale Vernetzung der beiden Stränge der Heteroduplex-DNA innerhalb der D-Schleife das Rekombinationszwischenprodukt. Nach der Wiederherstellung der Restriktionsenzymstelle am gebrochenen (resezierten) Strang und der Verdauung ermöglicht die Vernetzung die Ligation der einzigartigen Sequenzen stromaufwärts der homologen gebrochenen und Spender-DNAs. Mit Hilfe der qPCR wird der Gehalt an chimären DNA-Molekülen in jeder Probe quantifiziert. Im DLE-Assay ist keine Vernetzung erforderlich, und die Wiederherstellung und Verdauung der Restriktionsenzymstelle, gefolgt von einer intramolekularen Ligation, verbindet stattdessen das 5′-Ende des gebrochenen Moleküls mit dem neu verlängerten 3′-Ende. Auch hier wird qPCR verwendet, um die relativen Mengen dieses chimären Produkts in jeder Probe zu quantifizieren. In Abwesenheit einer Restriktionsenzymstellenwiederherstellung berichtet der DLE-Assay über die relativen Konzentrationen des BIR-Produkts (dsDNA), das nach der D-Schleifenverlängerung gebildet wird.

Repräsentative Ergebnisse für jeden Assay unter Verwendung eines Wildtypstamms werden gezeigt, und die Leser werden auf Piazza et al.8 und Piazza et al.9 verwiesen, um diese Assays für die Analyse von Rekombinationsmutanten 8,9 zu verwenden. Die Absicht dieses Beitrags ist es, anderen Laboratorien die Übernahme der DLC- und DLE-Assays zu ermöglichen, und Unterstützung für sie ist auf Anfrage erhältlich.

Protocol

1. Vorwachstum, DSB-Induktion und Probenentnahme HINWEIS: Die Ergänzung aller Medien mit 0,01% Adenin wird für Ade- Stämme empfohlen. Die entsprechenden haploiden Stämme (siehe Tabelle 1) auf Hefepeptondextroseadenin (YPDA) ( 1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Glucose, 2% Agar, 0,001% Adenin) ausstechen und 2 Tage bei 30 °C wachsen. Verwenden Sie eine einzelne Kolonie, um 5 ml YPDA in einem 15-ml-Glaskulturröhrchen zu impfen. Kulturen bis …

Representative Results

DLC-TestDer DLC-Assay erkennt sowohl entstehende als auch ausgedehnte D-Schleifen, die durch die Invasion eines standortspezifischen DSB in einen einzelnen Donor gebildet werden (Abbildung 2). Die Psoralenvernetzung verbindet den gebrochenen Strang und den Spender physikalisch über die heteroduplexe DNA innerhalb der D-Schleife. Die Wiederherstellung der Restriktionsenzymstelle mit einem langen, hybridisierenden Oligo auf dem resezierten Strang des Bruchs ermö…

Discussion

Die vorgestellten Assays ermöglichen den Nachweis von naszierenden und erweiterten D-Schleifen (DLC-Assay), D-Loop-Erweiterung (DLE-Assay) und BIR-Produktbildung (DLE-Assay ohne hybridisierende Oligonukleotide) mittels Proximity-Ligation und qPCR. Die ChIP-qPCR von Rad51 an vom DSB entfernte Stellen wurde zuvor als Proxy für die Rad51-vermittelte Homologiesuche und D-Schleifenbildung verwendet. Dieses ChIP-qPCR-Signal ist jedoch unabhängig von der Sequenzhomologie zwischen der Bruchstelle und einem potenziellen Donor …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Arbeiten im Heyer-Labor werden durch die Bewilligungen GM58015 und GM137751 an W.-D.H. Die Forschung im Piazza-Labor wird vom Europäischen Forschungsrat gefördert (ERC-StG 3D-loop, Grand Agreement 851006). D.R. wird von T32CA108459 und der A.P. Giannini Foundation unterstützt. Wir danken Shih-Hsun Hung (Heyer Lab) für die Weitergabe seiner DLC/DLE-Assay-Ergebnisse und für die zusätzliche Validierung der Änderungen an den Assays, die in diesem Protokoll detailliert beschrieben sind.

Materials

1. Pre-growth, DSB induction, and sample collection
Equipment
15 and 50 mL conical tubes
15 mL glass culture tubes
250 mL, 500 mL, or 1 L flasks
60 mm x 15 mm optically clear petri dishes with flat bottom Suggested: Corning, Catalog Number 430166; or Genesee Scientific, Catalog Number 32-150G
Benchtop centrifuge with 15 and 50 mL conical tube adapters
Benchtop orbital shaker or tube rotator/revolver
Rotator
UV crosslinker or light box with 365 nm UV bulbs set atop an orbital shaker Suggested: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) or Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Catalog Number 611110831
Materials
60% w/w sodium DL-lactate syrup Sigma-Aldrich L1375 For media preparation
Agar Fisher BP1423500 For media preparation
Bacto peptone BD Difco 211840 For media preparation
Bacto yeast extract BD Difco 212750 For media preparation
D-(+)-glucose BD Difco 0155-17-4 For media preparation
Trioxsalen Sigma-Aldrich T6137 For psoralen cross-linking
2. Spheroplasting, lysis, and restriction enzyme site restoration
Supplies
1.5 mL microcentrifuge tubes
Dry bath
Liquid nitrogen or dry ice/ethanol
Refrigerated microcentrifuge or microcentrifuge
Materials
10X restriction enzyme (CutSmart) buffer (500 mM potassium acetate, 200 mM Tris-acetate, 100 mM magnesium acetate, 1 mg/mL BSA, pH 7.8-8.0)
Zymolyase 100T US Biological Z1004 For spheroplasting
3. Restriction enzyme digest and intramolecular ligation
Supplies
Water bath
Materials
EcoRI-HF New England Biolabs R3101 Restriction enzyme digest for DLC assay
HindIII-HF New England Biolabs R3104 Restriction enzyme digest for DLE assay
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202 Intramolecular ligation
4. DNA purification
Supplies
1.5 and 2 mL microcentrifuge tubes
Materials
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (P/C/IA) at 25:24:1 Sigma-Aldrich P2069 DNA purification
5. Psoralen cross-link reversal
Supplies
Thermocycler/PCR machine
6. qPCR
Supplies
Lightcycler 480 Roche 5015278001 qPCR machine used by the authors
Lightcycler 96 Roche 5815916001 qPCR machine used by the authors
Materials
LightCycler 480 96-Well Plate, white Roche 4729692001 96-well plates for qPCR
SsoAdvanced Universal SYBR Green Super Mix BioRad 1725271 qPCR kit used by the authors
SYBR Green I Master Mix Roche 4707516001 qPCR kit used by the authors

References

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Cite This Article
Reitz, D., Savocco, J., Piazza, A., Heyer, W. Detection of Homologous Recombination Intermediates via Proximity Ligation and Quantitative PCR in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (187), e64240, doi:10.3791/64240 (2022).

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