出芽酵母における近接ライゲーションと定量PCRによる相同組換え中間体の検出
Summary
D-ループキャプチャー(DLC)およびD-ループ伸長(DLE)アッセイは、近接ライゲーションの原理と定量的PCRを利用して、 出芽酵母の誘導性二本鎖切断部位でのDループ形成、Dループ伸長、および産物形成を定量化します。
Abstract
細胞周期のS期およびG2期に発生したDNA二本鎖切断および鎖間架橋を含むDNA損傷は、相同組換え(HR)によって修復することができる。さらに、HRは、ストールまたは崩壊後のレプリケーションフォークレスキューの重要なメカニズムを表します。この複雑な経路の多くの可逆的および不可逆的なステップの調節は、その忠実度を促進します。HR中に形成される組換え中間体の物理的分析により、さまざまな核タンパク質因子とその相互作用因子によるこれらのコントロールの特性評価が可能になります。組換え経路の特定のイベントと中間体をアッセイする方法は十分に確立されていますが、この経路の2つの重要なステップであるDループの形成と伸長の検出は、最近まで困難であることが証明されていました。ここでは、HR経路における重要なイベント、すなわちDNA二本鎖切断形成、Dループ形成、Dループ伸長、およびサッカロミセス・セレビシエにおける切断誘導複製(BIR)を介した産物の形成を検出するための効率的な方法について説明しています。これらのアッセイは、関連する組換え中間体および生成物を高感度で検出し、細胞の生存率とは無関係です。Dループ、Dループ伸長、およびBIR製品の検出は、近接ライゲーションに基づいています。これらのアッセイを組み合わせることで、集団レベルでのHRの動態の研究が可能になり、経路の重要なステップでHRタンパク質と調節因子の機能に細かく対処できます。
Introduction
相同組換え(HR)は、DNA二本鎖切断(DSB)、鎖間クロスリンク、およびssDNAギャップの修復の忠実度の高いメカニズムであり、DNA損傷耐性の経路でもあります。HRは、非相同末端結合(NHEJ)やトランス病変合成などのDNA損傷修復/耐性のエラーが発生しやすい経路とは異なり、修復イベントをテンプレート化するためのドナーとして無傷の相同二重鎖DNAを利用します。さらに、HR経路の主要な中間体の多くは可逆的であり、個々の経路ステップの絶妙な調節を可能にします。細胞周期のS期、G2期、およびM期の間、HRは両末端DSBの修復をめぐってNHEJと競合します1。さらに、HRは、ssDNAギャップや片側DSBを含む複製関連DNA損傷の修復、およびDNA病変バイパスのメカニズムとして、DNA複製に不可欠です2。
HR経路の重要な中間体は、変位ループまたはDループです(図1)。末端切除後、反応の中心的なリコンビナーゼであるRad51が、壊れた分子の新しく切除されたssDNAに負荷をかけ、らせん状のフィラメント2を形成します。次に、Rad51は相同性検索を実行して、適切な相同ドナー、通常は体細胞内の姉妹染色分体を同定します。Dループは、Rad51-ssDNAフィラメントが相同二重鎖DNAに侵入すると形成され、切断された鎖とドナーの相補鎖とのワトソン-クリック塩基対形成をもたらし、反対側のドナー鎖を置換します。DNAポリメラーゼによる切断鎖の3’末端の伸長は、DNA損傷イベント中に失われた塩基を置き換え、合成依存性鎖アニーリング(SDSA)、ダブルホリデイジャンクション(dHJ)、または切断誘発複製(BIR)HRサブ経路を介して、拡張されたDループ中間体のdsDNA産物への分離を促進します。
HR経路の中間体を物理的にモニタリングするアッセイは、各ステップの遺伝的要件の分析(すなわち、パスウェイ解析)を可能にする。DSB形成、末端切除、dHJ、BIR複製バブル、およびHR産物は、サザンブロッティング3,4,5,6,7によって容易に観察されます。しかし、サザンブロッティングはDループの発生期および伸長について報告していないため、これらの関節分子を確実に測定するための代替方法が必要です4,8,9。新生Dループ形成を分析するために広く使用されている戦略の1つは、定量的PCR(qPCR)と組み合わせたRad51のクロマチン免疫沈降(ChIP)です10,11。しかしながら、ChIP-qPCRによって測定されるdsDNAとのRad51会合は、配列相同性およびRad51付属因子Rad5410、11とは無関係である。対照的に、ここで紹介するDループキャプチャ(DLC)アッセイと呼ばれるDループ分析の方法を使用したかなりのシグナルは、DSB形成、配列相同性、Rad51、およびRad51アクセサリータンパク質Rad52およびRad54に依存します8。サッカロマイセス・セレビシエRad51が促進したDループ形成がin vivoのRad54に依存するという発見は、Rad54が相同性検索と出芽酵母Rad51によるDループ形成に必要であることを示す多数のin vitro再構成実験と一致しています8,12,13,14,15。
主に半定量的PCRによるDループ伸長の測定に対する現在のアプローチも同様に問題があります。D-loop伸長を検出するための典型的なPCRベースのアッセイは、切断部位と異所性ドナーとの間の組換えおよびその後の組換え関連DNA合成から生じる固有の配列を、切断鎖上の相同性領域の上流のプライマーおよびドナー鎖上の相同性領域の下流にある別のプライマーを介して増幅する。この方法を使用する場合、組換え関連DNA合成の検出には、必須ではないPol δ処理性因子Pol32が必要です16。この発見は、POL32欠失がインビボでの遺伝子変換に軽度の影響を与えるという観察と矛盾する17。さらに、これらのPCRベースのアッセイは、Dループの伸長とBIR産物の形成を時間的に解決できず、シグナルがssDNA中間体ではなくdsDNA産物に起因することを示唆しています17,18,19。Dループ伸長(DLE)アッセイは、これらの不一致に対処するために最近開発されました。DLEアッセイは、最初の3’浸潤末端9の下流~400塩基対(bp)の部位での組換え関連DNA合成を定量します。この方法では、Dループの伸長はPol32とは無関係であり、DSB誘導後4時間以内に検出可能ですが、BIRプロダクトは6時間で最初に観察されます。実際、ハーバー研究所とマルコバ研究所からの最近の出版物は、ゲノムDNAの調製この方法を単独で使用すると、ssDNAの保存がもたらされることを指摘しています9,20。
ここでは、DLCおよびDLEアッセイについて詳細に説明する。これらのアッセイは、S. cerevisiaeの新生および伸長Dループを検出するために近接結紮に依存しています(図2)8,9。BIR製品は、これと同じアッセイシステムを使用して定量できます。両方のアッセイについて、染色体上のURA3遺伝子座に位置するHOエンドヌクレアーゼ切断部位でのDSB形成(Chr.V)は、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下でのHOエンドヌクレアーゼの発現によって誘導される。Rad51を介したDNA鎖の侵入は、Chr. IIのLYS2遺伝子座に位置する異所性ドナーの部位で新生Dループ形成を引き起こします。DSBの右側はドナーとの相同性を欠いているため、SDSAおよびdHJ形成による修復は実行不可能です。BIRによるDSBの初期修復は可能であるが、生存可能な生成物の形成はセントロメア21の存在によって阻害される。この意図的な設計により、生産的なDSB修復が妨げられ、それによって、時間経過分析中に培養物を追い越す可能性のある、修復されたDBSを持つ細胞による増殖の再開を回避します。
DLCアッセイでは、Dループ内のヘテロ二本鎖DNAの2本鎖のソラレン架橋は、組換え中間体を保存します。切断された(切除された)鎖上の制限酵素部位の修復および消化に続いて、架橋は相同な切断およびドナーDNAの上流のユニークな配列のライゲーションを可能にする。qPCRを使用して、各サンプルに存在するキメラDNA分子のレベルを定量します。DLEアッセイでは、架橋は不要であり、制限酵素部位の回復と消化に続いて分子内ライゲーションを行い、代わりに壊れた分子の5’末端を新しく伸長した3’末端に結合させます。ここでも、qPCRを使用して、各サンプル中のこのキメラ産物の相対量を定量します。制限酵素部位の修復がない場合、DLEアッセイは、Dループ伸長後に形成されるBIR(dsDNA)産物の相対レベルについて報告します。
野生型株を用いた各アッセイの代表的な結果が示され、組換え変異株の分析のためのこれらのアッセイの使用について、読者はPiazzaら8およびPiazzaら9に参照される8、9。この貢献の目的は、他のラボがDLCおよびDLEアッセイを採用できるようにすることであり、リクエストに応じてそれらのサポートを利用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
提示されたアッセイは、近接ライゲーションとqPCRを使用して、新生および伸長Dループ(DLCアッセイ)、Dループ延長(DLEアッセイ)、およびBIR産物形成(ハイブリダイズオリゴヌクレオチドを含まないDLEアッセイ)の検出を可能にします。DSBから離れた部位へのRad51のChIP-qPCRは、Rad51を介した相同性検索およびDループ形成のプロキシとして以前に使用されてきた。しかしながら、このChIP-qPCRシグナル?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Heyer研究所での作業は、GM58015およびGM137751からW.-D.H.への助成金によってサポートされています。ピアッツァ研究所での研究は、欧州研究会議(ERC-StG 3Dループ、グランドコングリーメント851006)によってサポートされています。D.R.はT32CA108459とA.P.ジャンニーニ財団の支援を受けています。Shih-Hsun Hung(Heyer Lab)がDLC/DLEアッセイの結果を共有し、このプロトコルに詳述されているアッセイの変更をさらに検証してくれたことに感謝します。
Materials
| 1. Pre-growth, DSB induction, and sample collection | |||
| Equipment | |||
| 15 and 50 mL conical tubes | |||
| 15 mL glass culture tubes | |||
| 250 mL, 500 mL, or 1 L flasks | |||
| 60 mm x 15 mm optically clear petri dishes with flat bottom | Suggested: Corning, Catalog Number 430166; or Genesee Scientific, Catalog Number 32-150G | ||
| Benchtop centrifuge with 15 and 50 mL conical tube adapters | |||
| Benchtop orbital shaker or tube rotator/revolver | |||
| Rotator | |||
| UV crosslinker or light box with 365 nm UV bulbs set atop an orbital shaker | Suggested: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) or Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Catalog Number 611110831 | ||
| Materials | |||
| 60% w/w sodium DL-lactate syrup | Sigma-Aldrich | L1375 | For media preparation |
| Agar | Fisher | BP1423500 | For media preparation |
| Bacto peptone | BD Difco | 211840 | For media preparation |
| Bacto yeast extract | BD Difco | 212750 | For media preparation |
| D-(+)-glucose | BD Difco | 0155-17-4 | For media preparation |
| Trioxsalen | Sigma-Aldrich | T6137 | For psoralen cross-linking |
| 2. Spheroplasting, lysis, and restriction enzyme site restoration | |||
| Supplies | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | |||
| Dry bath | |||
| Liquid nitrogen or dry ice/ethanol | |||
| Refrigerated microcentrifuge or microcentrifuge | |||
| Materials | |||
| 10X restriction enzyme (CutSmart) buffer (500 mM potassium acetate, 200 mM Tris-acetate, 100 mM magnesium acetate, 1 mg/mL BSA, pH 7.8-8.0) | |||
| Zymolyase 100T | US Biological | Z1004 | For spheroplasting |
| 3. Restriction enzyme digest and intramolecular ligation | |||
| Supplies | |||
| Water bath | |||
| Materials | |||
| EcoRI-HF | New England Biolabs | R3101 | Restriction enzyme digest for DLC assay |
| HindIII-HF | New England Biolabs | R3104 | Restriction enzyme digest for DLE assay |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | Intramolecular ligation |
| 4. DNA purification | |||
| Supplies | |||
| 1.5 and 2 mL microcentrifuge tubes | |||
| Materials | |||
| Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (P/C/IA) at 25:24:1 | Sigma-Aldrich | P2069 | DNA purification |
| 5. Psoralen cross-link reversal | |||
| Supplies | |||
| Thermocycler/PCR machine | |||
| 6. qPCR | |||
| Supplies | |||
| Lightcycler 480 | Roche | 5015278001 | qPCR machine used by the authors |
| Lightcycler 96 | Roche | 5815916001 | qPCR machine used by the authors |
| Materials | |||
| LightCycler 480 96-Well Plate, white | Roche | 4729692001 | 96-well plates for qPCR |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Super Mix | BioRad | 1725271 | qPCR kit used by the authors |
| SYBR Green I Master Mix | Roche | 4707516001 | qPCR kit used by the authors |
References
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