Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Обнаружение гомологичных промежуточных продуктов рекомбинации с помощью бесконтактного лигирования и количественной ПЦР в Saccharomyces cerevisiae

Published: September 11, 2022 doi: 10.3791/64240
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,3
1Department of Microbiology & Molecular Genetics, University of California, Davis, 2Laboratory of Biology & Modeling of the Cell, École Normale Supérieure de Lyon, 3Department of Molecular & Cellular Biology, University of California, Davis

Summary

Анализы захвата D-петли (DLC) и расширения D-петли (DLE) используют принцип бесконтактного лигирования вместе с количественной ПЦР для количественной оценки образования D-петли, расширения D-петли и образования продукта в месте индуцируемого двухцепочечного разрыва в Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

Повреждение ДНК, включая двухцепочечные разрывы ДНК и межцепочечные поперечные связи, возникающие во время фаз S и G2 клеточного цикла, могут быть восстановлены гомологичной рекомбинацией (HR). Кроме того, HR представляет собой важный механизм спасения репликационной вилки после остановки или коллапса. Регуляция многих обратимых и необратимых ступеней этого сложного пути способствует его верности. Физический анализ промежуточных рекомбинационных веществ, образующихся при ЧСС, позволяет охарактеризовать эти элементы управления различными нуклеопротеиновыми факторами и их интеракторами. Хотя существуют хорошо зарекомендовавшие себя методы анализа конкретных событий и промежуточных продуктов в пути рекомбинации, обнаружение образования и расширения D-петли, двух критических шагов в этом пути, до недавнего времени оказывалось сложной задачей. Здесь описаны эффективные методы обнаружения ключевых событий в пути HR, а именно формирование двухцепочечного разрыва ДНК, формирование D-петли, расширение D-петли и образование продуктов посредством индуцированной разрывом репликации (BIR) в Saccharomyces cerevisiae . Эти анализы обнаруживают соответствующие им промежуточные продукты рекомбинации и продукты с высокой чувствительностью и не зависят от клеточной жизнеспособности. Обнаружение D-контуров, расширения D-петли и продукта BIR основано на бесконтактном лигировании. Вместе эти анализы позволяют изучать кинетику ЧСС на уровне популяции, чтобы точно рассмотреть функции белков и регуляторов HR на значительных этапах пути.

Introduction

Гомологичная рекомбинация (HR) является высокоточным механизмом репарации двухцепочечных разрывов ДНК (DSB), межцепочечных поперечных связей и разрывов ssDNA, а также путем толерантности к повреждению ДНК. HR отличается от подверженных ошибкам путей восстановления / толерантности повреждения ДНК, таких как негомологичное конечное соединение (NHEJ) и синтез транслезии, тем, что он использует неповрежденную, гомологичную дуплексную ДНК в качестве донора для шаблона события восстановления. Кроме того, многие из ключевых промежуточных звеньев в пути HR являются обратимыми, что позволяет точно регулировать отдельные этапы пути. Во время фаз S, G2 и M клеточного цикла HR конкурирует с NHEJ за ремонт двухсторонних DSB1. Кроме того, HR имеет важное значение для репликации ДНК для восстановления повреждений ДНК, связанных с репликацией, включая пробелы ssDNA и односторонние DSB, а также в качестве механизма шунтирования поражения ДНК2.

Критическим промежуточным звеном в пути HR является петля смещения, или D-петля (рисунок 1). После концевой резекции центральная рекомбиназа в реакции, Rad51, загружается на вновь резецированную ssDNA разрушенной молекулы, образуя спиральную нить2. Затем Rad51 проводит гомологический поиск для идентификации подходящего гомологичного донора, обычно сестринской хроматиды в соматических клетках. D-петля образуется, когда нить Rad51-ssDNA вторгается в гомологичную дуплексную ДНК, что приводит к спариванию основания Уотсона-Крика сломанной нити с комплементарной нитью донора, вытесняя противоположную донорскую нить. Расширение 3'-го конца сломанной цепи ДНК-полимеразой заменяет основания, которые были потеряны во время события повреждения ДНК, и способствует разрешению расширенного промежуточного D-петли в продукт dsDNA посредством синтез-зависимого отжига цепи (SDSA), двойного соединения Холлидей (dHJ) или подпутей HR, индуцированной разрывом репликации (BIR).

Анализы, которые физически контролируют промежуточные продукты в пути HR, позволяют анализировать генетические требования для каждого этапа (т. Е. Анализ пути). Образование DSB, резекция конца, dHJ, пузырьки репликации BIR и продукты HR легко наблюдаются южным пятном 3,4,5,6,7. Тем не менее, Южное блоттинг не сообщает о зарождающихся и расширенных D-петлях, и, таким образом, альтернативный метод надежного измерения этих суставных молекул требует 4,8,9. Одной из широко используемых стратегий для анализа зарождающегося образования D-петли является хроматин-иммунопреципитация (ChIP) Rad51 в сочетании с количественной ПЦР (qPCR)10,11. Однако связь Rad51 с dsDNA, измеренная с помощью ChIP-qPCR, не зависит от гомологии последовательностей и фактора аксессуара Rad51 Rad5410,11. Напротив, заметный сигнал с использованием представленного здесь метода анализа D-петли, называемого анализом захвата D-петли (DLC), зависит от образования DSB, гомологии последовательности, Rad51 и вспомогательных белков Rad51 Rad52 и Rad548. Вывод о том, что образование D-петли Saccharomyces cerevisiae Rad51 зависит от Rad54 in vivo, согласуется с многочисленными экспериментами по восстановлению in vitro, указывающими на то, что Rad54 необходим для поиска гомологий и формирования D-петли почкованием дрожжей Rad51 8,12,13,14,15.

Современные подходы к измерению расширения D-контура, главным образом с помощью полуколичественной ПЦР, также проблематичны. Типичный анализ на основе ПЦР для обнаружения расширения D-петли усиливает уникальную последовательность, возникающую в результате рекомбинации между местом разрыва и эктопическим донором и последующего рекомбинационно-ассоциированного синтеза ДНК через праймер выше по течению от области гомологии на сломанной цепи и другой праймер ниже по течению от области гомологии на донорской цепи. Используя этот метод, для обнаружения рекомбинационно-ассоциированного синтеза ДНК требуется несущественный фактор процессности Pol δ Pol3216. Этот вывод противоречит наблюдению, что делеция POL32 оказывает лишь умеренное влияние на конверсию генов in vivo17. Более того, эти анализы на основе ПЦР не могут временно разрешить расширение D-петли и образование продукта BIR, предполагая, что сигнал является результатом продуктов dsDNA, а не промежуточных продуктов ssDNA 17,18,19. Недавно для устранения этих расхождений был разработан анализ расширения D-loop (DLE). Анализ DLE количественно оценивает рекомбинационно-ассоциированный синтез ДНК на участке ~ 400 пар оснований (bp) ниже начального 3' вторгающегося конца9. С помощью этого метода удлинение D-петли не зависит от Pol32 и обнаруживается в течение 4 ч после индукции DSB, тогда как продукты BIR впервые наблюдаются через 6 ч. Действительно, в недавней публикации из лабораторий Габера и Малковой отмечалось, что использование этого метода получения геномной ДНК исключительно приводит к сохранению сдНК 9,20.

Здесь подробно описаны анализы DLC и DLE. Эти анализы основаны на бесконтактном лигировании для обнаружения зарождающихся и расширенных D-петель у S. cerevisiae (рисунок 2)8,9. Продукты BIR могут быть количественно определены с использованием этой же системы анализа. Для обоих анализов образование DSB в месте разреза эндонуклеазы HO, расположенном в локусе URA3 на хромосоме (Chr.) V, индуцируется экспрессией эндонуклеазы HO под контролем галактозно-индуцируемого промотора. Rad51-опосредованная инвазия цепей ДНК приводит к зарождающемуся образованию D-петли на месте эктопического донора, расположенного в локусе LYS2 на Chr. II. Поскольку правая сторона DSB не имеет гомологии для донора, восстановление с помощью SDSA и формирования dHJ невозможно. Первоначальное восстановление DSB методом BIR возможно, но образование жизнеспособных продуктов тормозится присутствием центромеры21. Эта преднамеренная конструкция предотвращает продуктивное восстановление DSB, тем самым избегая возобновления роста клетками с восстановленными DBS, которые в противном случае могли бы обогнать культуру во время анализа курса времени.

В анализе DLC псораленовое сшивание двух нитей гетеродуплексной ДНК в D-петле сохраняет промежуточный рекомбинационный продукт. После восстановления сайта рестрикционного фермента на разрушенной (резецированной) цепи и пищеварения сшивание позволяет переливировать уникальные последовательности выше по течению от гомологичных разрушенных и донорских ДНК. Используя qPCR, уровень химерной молекулы ДНК, присутствующей в каждом образце, количественно оценивается. В анализе DLE сшивание не требуется, и восстановление сайта фермента рестрикции и пищеварение с последующим внутримолекулярным лигированием вместо этого связывают 5'-образный конец разрушенной молекулы с недавно расширенным 3'-концом. Опять же, qPCR используется для количественной оценки относительных количеств этого химерного продукта в каждом образце. При отсутствии восстановления сайта рестрикционного фермента анализ DLE сообщает об относительных уровнях продукта BIR (dsDNA), который образуется после расширения D-петли.

Показаны репрезентативные результаты для каждого анализа с использованием штамма дикого типа, и читатели ссылаются на Piazza et al.8 и Piazza et al.9 для использования этих анализов для анализа рекомбинационных мутантов 8,9. Цель этого вклада состоит в том, чтобы позволить другим лабораториям принять анализы DLC и DLE, и поддержка для них предоставляется по запросу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Предварительный рост, индукция DSB и сбор проб

ПРИМЕЧАНИЕ: Добавки всех сред с 0,01% аденина рекомендуются для штаммов Ade-.

  1. Удалите соответствующие гаплоидные штаммы (см. Таблицу 1) на дрожжевом пептоне декстрозы аденина (YPDA) (1% дрожжевого экстракта, 2% пептона, 2% глюкозы, 2% агара, 0,001% аденина) и расти в течение 2 дней при 30 °C.
  2. Используйте одну колонию для инокуляции 5 мл YPDA в стеклянной культуральной трубке объемом 15 мл. Выращивать культуры до насыщения при 30 °C с встряхиванием или ротацией для аэрации.
  3. Анализ DLC: Подготовьте 5-кратный раствор псоралена (0,5 мг/мл триокссалена в 200-стойком этаноле) в вытяжном шкафу, растворив псорален в конической трубке объемом 50 мл, обернутой в алюминиевую фольгу на ночь при комнатной температуре с непрерывным встряхиванием или инверсией. Запечатайте винтовую крышку прозрачной пленкой для предотвращения испарения. Не готовьте более 7 мл 5-кратного раствора псоралена на коническую трубку объемом 50 мл для обеспечения надлежащего растворения псоралена.
  4. На следующий день используйте 5 мл выращенной за ночь культуры YPDA для прививки 50-100 мл YEP-лактата (1% дрожжевого экстракта, 2% пептона, 2% мас./мас. лактата, 0,001% аденина) в колбе соответствующего размера (почкование дрожжей оптимально растет в колбе, которая составляет не менее 5x объема культуры) до OD600 ~ 0,03.
  5. Выращивайте культуру в течение ~16 ч при 30 °C с встряхиванием при 220 об/мин. Через ~16 ч измерьте OD600 культуры, и он должен быть ~0,5-0,8. Не используйте недоросли или заросшие культуры.
  6. Для каждой точки времени соберите соответствующий объем клеток в коническую трубку и поместите на лед. Как правило, это 1 х 108 клеток (приблизительно 7,5 мл культуры при OD600 1,0 для гаплоидного штамма дикого типа) для анализа DLC и 5 х 107 клеток (приблизительно 2,5 мл культуры при OD600 1,0) для анализа DLE.
  7. Для обеспечения точности значений OD600 подготовьте разбавления 1:5 для культур с OD600≥0,2, чтобы показания OD оставались на уровне 0,2 или ниже. Для штаммов дикого типа оптимальные временные точки для анализа DLC составляют от 2 ч до 6 ч, а оптимальные временные точки для анализа DLE - от 4 ч до 8 ч (см. Рисунок 3 и Рисунок 4).
  8. Анализ DLC
    1. Перед каждой временной точкой приготовьте достаточное количество 1x раствора псоралена (0,1 мг/мл триокссалена, 50 мМ Tris-HCl pH 8,0, 50 мМ ЭДТА рН 8,0, 20% этанола) в вытяжной вытяжке для всех образцов в конической трубке объемом 50 мл, обернутой в фольгу. Оставьте на RT.
    2. Центрифугируйте образцы при 2 500 х г в течение 5 мин при 4 °C. Повторно суспендировать гранулу в 2,5 мл 1x раствора псоралена в вытяжке и переложить на чашку Петри размером 60 мм x 15 мм. Альтернативно, повторно суспендировать гранулу в 2,5 мл раствора TE1 (50 мМ Tris-HCl pH 8,0, 50 мМ EDTA pH 8,0) для контроля без сшивания.
    3. Сшивайте образцы. Для Сшивки УФ-излучения с длинноволновыми (365 нм) лампами расположите чашки Петри на 1-2 см ниже источника ультрафиолетового света со снятой крышкой поверх пластиковой или плексигласовой пластины, которая была предварительно охлаждена при -20 °C. Для УФ-светового короба поместите чашки Петри непосредственно на источник ультрафиолетового света. Обжаривайте образцы в течение 10 мин с легким встряхиванием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется устанавливать источник ультрафиолетового света на орбитальный шейкер, установленный на ~50 об/мин.
    4. В вытяжном шкафу перенесите образец в новую пробирку объемом 15 мл. Промыть чашку Петри 2,5 мл раствора TE1 и добавить его в пробирку. Центрифугируйте образцы при 2 500 х г в течение 5 мин при 4 °C, правильно утилизируйте супернатант и храните гранулы при -20 °C. Образцы можно хранить до 1 недели, прежде чем перейти к следующему этапу.
  9. Анализ DLE
    1. Центрифугируйте образцы при 2 500 х г в течение 5 мин при 4 °C. Промыть ячейку гранулы в 2,5 мл холодного раствора TE1 перед повторением отжима и хранением гранул при −20 °C. Образцы могут храниться до 1 недели, прежде чем перейти к следующему шагу.
  10. Для отбора проб через 0 ч соберите образцы до добавления 20% галактозы. Для последующих временных точек индуцируют образование DSB путем добавления 20% галактозы в культуры до конечной концентрации 2%. Собрать оставшиеся образцы, как описано выше, гранулировать и заморозить относительно времени после индукции DSB (т.е. 4-часовой образец собирают через 4 ч после добавления 20% галактозы).

2. Клеточная сферопластировка, лизис и восстановление места рестрикции

  1. Разморозьте образцы на льду. Разогрейте сухую ванну до 30 °C.
  2. Повторно суспендировать образцы в 1 мл сферопластирующего буфера (0,4 М сорбита, 0,4 М ККл, 40 мМ буфера фосфата натрия рН 7,2, 0,5 мМ MgCl2) и перенести в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
  3. Добавьте 3,5 мкл раствора зимолиазы (2% глюкозы, 50 мМ Tris-HCl pH 7,5, 5 мг/мл зимолиазы 100T; 17,5 мкг/мл конечной концентрации зимолиазы). Аккуратно перемешайте постукиванием или инверсией. Инкубировать при 30 °C в течение 15 мин, а затем поместить на лед. Во время 15-минутной инкубации получают жидкий азот или сухой лед.
  4. Центрифуга в течение 3 мин при 2 500 х г при 4 °C и поместите образцы на лед. Промывайте образцы 3 раза в 1 мл буфера сферопластирования. Центрифугируйте образцы в течение 3 мин при 2 500 х г при 4 °C.
  5. Повторно суспендировать образцы в 1 мл холодного 1x рестрикционного ферментного буфера (50 мМ ацетата калия, 20 мМ трисацетата, 10 мМ ацетата магния, 100 мкг/мл BSA pH ~8,0 при RT) и центрифуги в течение 3 мин при 16 000 х г при 4 °C. Поместите образцы на лед. Повторите стирку 1x.
  6. Повторное суспендирование образцов в 1 мл холодного 1x рестрикционного ферментного буфера. Разделите образец (по 0,5 мл каждая) на две микроцентрифужные трубки по 1,5 мл. Центрифугируйте образцы в течение 3 мин при 16 000 х г при 4 °C.
  7. Повторно суспендировать одну пробирку из каждого образца в 180 мкл 1,4-кратного буфера фермента рестрикции с гибридизирующими олиго (см. Таблицу 2) и одну трубку в 180 мкл 1,4-кратного буфера фермента рестрикции без гибридизации олиго. Каждое гибридизирующее олиго повторно суспендируют в 1x TE (10 мМ Tris-HCl pH 8,0, 1 мМ ЭДТА рН 8,0) и используют в конечной концентрации 7 нМ. 1x TE заменяет гибридизирующиеся олиго в 1,4x рестрикционном ферментном буфере без гибридизации олиго.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гибридизирующие олиго должны храниться при температуре −20°С в небольших аликвотах при рабочем разбавлении. Концентрация гибридизирующих олиго может потребовать оптимизации; см. Обсуждение.
  8. Заморозьте образцы в жидком азоте или сухом льду/этаноле и храните при температуре −80 °C. Образцы могут храниться на этом этапе в течение нескольких месяцев.

3. Переваривание фермента рестрикции и внутримолекулярное лигирование

  1. Разморозьте образцы на льду. Разогрейте одну сухую ванну до 65 °C, а другую до 37 °C.
  2. Пипетка 36 мкл образца в новую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл на льду. Своевременно вернуть оставшийся образец на −80 °C на хранение.
  3. Добавьте 4 мкл 1% SDS (конечная концентрация 0,1%) и перемешайте, осторожно постукивая по боковой стороне трубки. Инкубировать при 65 °C в течение 15 мин с легким постукиванием каждые 5 мин. Поместите образцы на лед сразу после инкубации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это лечение SDS способствует денатурации ДНК-ассоциированных белков, солюбилизации ядерной оболочки и доступности хроматина до переваривания фермента рестрикции и внутримолекулярной стадии лигирования.
  4. Добавьте 4,5 мкл 10% тритона X-100 (1% конечной концентрации) и перемешайте путем пипетки. Добавляют 20-50 ЕД фермента рестрикции (EcoRI-HF или HindIII-HF) к каждому образцу и инкубируют при 37 °C в течение 1 ч с мягким перемешиванием каждые 20-30 мин. В течение этого времени разогрейте сухую ванну до 55 °C и установите водяную баню до 16 °C.
  5. Добавьте 8,6 мкл 10% SDS (1,5% конечной концентрации) к каждому образцу и перемешайте путем пипетки и нарезания резьбы. Инкубировать при 55 °C в течение 10 мин. Добавьте 80 мкл 10% тритона X-100 (6% конечной концентрации) к каждому образцу и перемешайте путем пипетки.
  6. Добавьте 660 мкл 1x лигационного буфера без АТФ (50 мМ Tris-HCl pH 8,0, 10 мМ MgCl2, 10 мМ DTT, 2,5 мкг/мл BSA) + 1 мМ АТФ рН 8,0 + T4 ДНК-лигазы (8 ЕД/образец) к каждому образцу и перемешайте путем мягкой инверсии. Инкубировать при 16 °C в течение 1,5 ч с инверсией каждые 30 мин. Поместите образцы на лед сразу после инкубации.

4. Очистка ДНК

  1. Разогрейте одну сухую ванну до 65 °C, а другую до 37 °C. Добавьте 1 мкл 10 мг/мл протеиназы K (приготовленной в 1x TE pH 8,0) к каждому образцу (конечная концентрация 12,5 мкг/мл). Инкубировать при 65 °C в течение 30 мин и помещать образцы на лед сразу после инкубации до тех пор, пока они не остынут.
  2. Перенесите образцы в пробирки по 2 мл. Работая в вытяжном шкафу, добавьте равный объем (~800 мкл) фенола/хлороформа/изоамилового спирта (P/C/IA; рН 8,0) к каждому образцу. Вращайте образцы в течение ~30 с и центрифугируйте образцы в течение 5-10 мин при 16 000 х г в микроцентрифуге.
  3. Осторожно удалите 600 мкл верхней фазы каждого образца в новую пробирку объемом 1,5 мл. Правильно утилизируйте нижнюю фазу и трубки по 2 мл.
  4. Осаждение ДНК путем добавления 1/10 объема 3 М ацетата натрия pH 5,2 (~ 60 мкл) к каждому образцу, а затем 1 объем изопропанола (~ 660 мкл). Инвертируйте образцы 5x-10x и инкубируйте на RT в течение 30 мин.
  5. Поместите образцы на лед в течение 2 мин, а затем центрифугируйте образцы при 16 500 х г в течение 15 мин при 4 °C в микроцентрифуге. Верните образцы в лед, вылейте супернатант и слейте трубку на бумажное полотенце.
  6. Промыть гранулу ДНК 200 мкл 70% этанола. Центрифугу при 16 500 х г в течение 3 мин при 4 °C, поместите образцы обратно на лед, вылейте супернатант и удалите остаточный спирт пипеткой. Высушите образцы с открытыми крышками трубок при 37 °C в течение 15-20 мин.
  7. Повторное суспендирование гранул ДНК в 50 мкл 1x TE путем вихря. Инкубировать при RT в течение 30 мин, вихрь, а затем инкубировать при 37 °C в сухой ванне в течение 30 мин. Снова вихрьте образцы, а затем поместите их на лед. Образцы могут храниться на этом этапе при температуре −20 °C в течение нескольких месяцев, но желательно немедленно приступить к этапу декроссинга (только DLC) и qPCR.

5. Разворот перекрестных ссылок Psoralen (только для анализа DLC)

  1. Пипетка 9 мкл очищенной ДНК в ПЦР-трубку на льду. Добавьте 1 мкл 1 М КОН (конечная концентрация 0,1 М). Инкубируйте образцы при 90 °C в течение 30 мин в термоциклере.
  2. Добавьте 19,73 мкл раствора ацетата натрия (0,1 М ацетата натрия, 9,6 мМ Tris-HCl pH 8,0, 1,0 мМ ЭДТА рН 8,0). Образцы могут храниться на этой стадии при −20 °C в течение нескольких месяцев, но желательно немедленно перейти к этапу qPCR.

6. Количественная ПЦР, контроль и анализ

  1. Используя 2 мкл очищенной ДНК, с сшиванием или без него, настраивают реакцию qPCR объемом 20 мкл в соответствии с инструкциями производителя. Настройте каждую реакцию в двух экземплярах. Для анализов DLC и DLE существует пять контрольных реакций и одна реакция количественной оценки DLC / DLE, или в общей сложности шесть реакций на образец, выполняемых в двух экземплярах. Дополнительная таблица S1 и дополнительная таблица S2 предоставляют шаблон для настройки этих реакций и анализа, а последовательности праймеров qPCR перечислены в таблице 3.
  2. Условия циклирования qPCR должны быть оптимизированы для каждого комплекта qPCR.
    1. Используйте следующие условия DLC qPCR, в зависимости от используемых комплектов qPCR: начальная денатурация (95 °C в течение 3 минут); 50 раундов усиления (95 °C за 15 с, 61 °C за 25 с, 72 °C за 15 с при однократном захвате); анализ кривой плавления (95 °C в течение 5 с, 65 °C в течение 1 мин, 97 °C с непрерывным сбором); и охлаждение (37 °C в течение 30 с).
    2. Используйте следующие условия qPCR для анализа DLE: начальная денатурация (95 °C в течение 5 мин); 50 раундов усиления (95 °C в течение 15 с, 60 °C в течение 30 с, 72 °C в течение 15 с при однократном захвате); анализ кривой плавления (95 °C в течение 5 с, 65 °C в течение 1 мин, 97 °C с непрерывным сбором); и охлаждение (37 °C в течение 30 с). Обратите внимание, что может потребоваться оптимизация для различных машин/комплектов qPCR.
  3. Анализ DLC
    1. Элементы управления: см. список букварей qPCR в таблице 3. Карта сайтов связывания грунтовки показана на рисунке S1. Для получения дополнительных файлов последовательностей для соответствующих геномных признаков и ампликонов проверьте файлы редактора плазмид (ApE); Дополнительные файлы последовательностей 1-5.
      1. Геномная ДНК в ARG4: Используйте olWDH1760/olWDH1761 для амплификации dsDNA, расположенной в ARG4. Используйте эту реакцию в качестве регулятора нагрузки и нормализуйте все другие реакции, кроме реакции сигнала DLC на этот контроль.
      2. Эффективность внутримолекулярного лигирования при DAP2: Используйте фрагмент 1,904 bp, созданный сбраживанием EcoRI для внутримолекулярной перевязки параллельно с DLC-лигированием. Усиление через этот лигационный переход сообщает об эффективности внутримолекулярного лигирования и служит контролем, для которого нормализуется сигнал DLC.
      3. Индукция DSB: используйте olWDH1766/olWDH1767 для усиления области, охватывающей индуцированный DSB.
      4. Сшивание и резекция Psoralen: используйте olWDH2019/olWDH2020 для усиления уникальной области PhiX после сайта распознавания EcoRI. Без разворота сшивки используйте отношение ssDNA (без сшивания) к ARG4 (сшитая dsDNA) для определения эффективности сшивания. При развороте сшивки резекция приведет к прогрессирующему снижению от 1 до 0,5 сигнала относительно ARG4.
      5. ЭкоР Восстановление и резка сайта распознавания I: используйте olWDH1768/olWDH1764 для усиления области, которая охватывает восстановленный сайт распознавания EcoRI выше по течению ОТ DSB на резецированной нити. olWDH1769/olWDH1763 усиливают область, которая охватывает сайт фермента рестрикции EcoRI в DAP2. Выполните расщепление EcoRI на этом участке для использования в качестве внутримолекулярного контроля лигирования.
    2. Сигнал DLC: Используйте olWDH1764/olWDH1765 для амплификации химерной молекулы ДНК, созданной внутримолекулярным перевязкой резецированной (вторгающейся) нити и донора.
    3. Анализ: Рассчитайте среднее и стандартное отклонение значений Cp для каждой из повторяющихся реакций. Используйте значения геномной ДНК ARG4 qPCR Cp в качестве ссылки для нормализации всех других контрольных qPCR. Нормализуйте сигнал DLC для внутримолекулярного контроля лигирования при DAP2. На рисунке 3 показаны типичные значения сигналов DLC через 2 ч.
  4. Анализ DLE
    1. Элементы управления: см. список букварей qPCR в таблице 3. Карта сайтов связывания грунтовки показана на рисунке S1. Для получения дополнительных файлов последовательностей для соответствующих геномных признаков и ампликонов проверьте файлы редактора плазмид (ApE) (Дополнительные файлы последовательностей 1-5).
      1. Геномная ДНК в ARG4: см. раздел 6.3.1.1.
      2. Эффективность внутримолекулярного лигирования при YLR050C: Используйте сбраживание HindIII для создания фрагмента 765 bp, который будет подвергаться внутримолекулярной перевязке параллельно с лигированием DLE. Амплификация через этот лигационный переход сообщает об эффективности внутримолекулярного лигирования и служит контролем, для которого нормализуется сигнал DLE.
      3. Вводный инструктаж ОРС: см. раздел 6.3.1.3.
      4. Задний Восстановление и резка сайта распознавания III: Используйте olWDH2010/olWDH2012 и olWDH2009/2011 для усиления области, которая охватывает участки фермента рестрикции HindIII на сломанной цепи, где она была резецирована и расширена, соответственно.
    2. Сигнал DLE: Используйте olWDH2009/olWDH2010 для амплификации химерной молекулы ДНК, созданной внутримолекулярным перевязкой резецированного конца вторгающейся нити вверх по течению от DSB до недавно расширенного конца вниз по течению DSB.
    3. Анализ: Рассчитайте среднее и стандартное отклонение значений Cp для каждой из повторяющихся реакций. Используйте значения геномной ДНК ARG4 qPCR Cp в качестве ссылки для нормализации всех других контрольных qPCR. Нормализуйте сигнал DLE для внутримолекулярного контроля лигирования при YLR050C. Типичные значения сигнала DLE через 6 ч указаны на рисунке 4 и в предыдущих публикациях9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Анализ DLC
Анализ DLC обнаруживает как зарождающиеся, так и расширенные D-петли, образованные вторжением специфического для сайта DSB в одного донора (рисунок 2). Сшивка псоралена физически связывает разорванную цепь и донора через гетеродуплексную ДНК в D-петле. Восстановление сайта фермента рестрикции с длинным гибридизирующим олиго на резецированной нити разрыва позволяет расщепление фермента рестрикции с последующим перевязкой сломанной нити к проксимальному донору с образованием химерного продукта, который количественно определяется qPCR. Примечательно, что сигнал DLC зависит от сшивки псоралена, гибридизирующего олиго, центральной рекомбиназы, Rad51 и факторов аксессуаров Rad51 Rad52 и Rad548. Делеция геликаз/топоизомераз ДНК Sgs1-Top3-Rmi1, Mph1 и Srs2 приводит к увеличению сигнала DLC.

На рисунке 3 показаны репрезентативные результаты для стандартной деформации дикого типа при 2 ч после индукции DSB в трех экземплярах с гибридизирующим олиго и без него. Образец, отсутствующий в ключевом шаге, сшивке псоралена, также показан в двух экземплярах.

Как показано на рисунке 3, сшивание псораленов является критическим шагом. Без него практически нет обнаруживаемого сигнала8. Эффективность сшивки измеряется на основе отношения сдНК к усилению дцДНК. В отличие от дцДНК, ssDNA испытывает минимальное сшивание псораленов, и, таким образом, высокий сигнал указывает на успешное сшивание. Эффективность сшивки варьируется в зависимости от времени между сбором проб и подготовкой к qPCR (рисунок 3, нижняя левая панель). Чем больше времени между сбором проб и подготовкой, тем меньше сигнала будет наблюдаться для контроля эффективности сшивания qPCR. Значительное межвыборочное изменение сигнала, наблюдаемое для контроля эффективности сшивки qPCR, является причиной для беспокойства, и временной ход должен быть отброшен.

АРГ4 Значения Cp аналогичны между образцами олиго с и без гибридизации (рисунок 3, верхняя левая панель). Низкое значение Cp указывает на то, что присутствует более амплируемая ДНК. Это объясняет, почему значения ARG4 Cp для образцов без сшивания значительно ниже: сшивание мешает усилению qPCR. Это различие между образцами с сшивкой и без нее относится ко всем qPCR, за исключением элемента управления расщеплением qPCR EcoRI, который будет усиливать ssDNA/несшитую dsDNA. Все элементы управления qPCR, но не сигнал DLC, нормализованы до сигнала ARG4 qPCR.

Для всех образцов элемент управления внутримолекулярной лигированием qPCR находится в соответствующем диапазоне (рисунок 3, верхняя средняя панель), и существует надежная индукция DSB, о чем свидетельствует низкий сигнал для элемента управления qPCR, который усиливается через сайт распознавания эндонуклеазы HO (рисунок 3, верхняя правая панель). В образцах олиго с гибридизацией наблюдается эффективная резка EcoRI, и это управление qPCR дает низкий сигнал (рисунок 3, нижняя средняя панель). И наоборот, образцы без гибридизации олиго со сшиванием дают высокий сигнал, аналогичный тому, который показан для контроля эффективности сшивания qPCR, поскольку в этом случае неразрезанная ssDNA усиливается и нормализуется до сигнала ARG4 qPCR (dsDNA).

В отличие от других qPCR, сигнал qPCR для анализа DLC нормализуется для внутримолекулярного контроля qPCR лигирования, поскольку химерная молекула, количественно определенная DLC qPCR, зависит от лигирования. Средний сигнал DLC через 2 ч с гибридизирующим олиго составляет 0,030 ± 0,0055 (рисунок 3, нижняя правая панель), в соответствии с ранее опубликованными результатами для этого анализа8. Как и ожидалось, этот сигнал зависит как от гибридизирующего олиго, так и от сшивки псоралена.

Анализ DLE
Анализ DLE позволяет точно контролировать расширение D-контура в ответ на DSB для конкретного сайта (рисунок 2). Ранее было продемонстрировано, что сигнал DLE зависит от Rad51, центральной рекомбиназы в реакции, которая опосредует цепную инвазию и, таким образом, необходима для рекомбинационно-ассоциированного синтеза ДНК9. Кроме того, сигнал DLE зависит от каталитической субъединицы Pol δ, Pol3 (DR, AP, WDH, неопубликованные данные), но не от несущественного коэффициента процессивности Pol32. В отличие от сигнала DLC, который сначала становится обнаруживаемым через 2 ч после индукции DSB, сигнал DLE сначала заметно увеличивается через 4 ч после индукции DSB, резко повышается между 4 ч и 6 ч и начинает плато после этого, причем большая часть увеличения сигнала между 6 ч и 8 ч связана с образованием продукта BIR8, См. 9.

Поскольку химерный продукт лигирования, количественно определенный в анализе DLE, является одноцепочечным, стадия сферопластирования и лизиса клеток имеет решающее значение. Снижение сигнала DLE может быть результатом проблем с этим шагом, которые могут высвобождать нуклеазы и приводить к деградации целевой ssDNA.

На рисунке 4 показаны репрезентативные результаты для стандартной деформации дикого типа при 6 ч после индукции DSB в трех экземплярах с гибридизирующимися олиго и без них. Образец дикого типа без гибридизации олиго представляет собой только продукт dsDNA BIR, тогда как сигнал с олиго получен как из ssDNA расширенной D-петли, так и из продукта dsDNA BIR. Третий образец включен в качестве примера неудачного эксперимента.

АРГ4 Значения Cp были одинаковыми между образцами олигоса с и без гибридизации (рисунок 4, верхняя левая панель). АРГ4 Значения Cp были заметно ниже для неудачного образца, что указывает на то, что этот образец имеет больше геномной ДНК, чем успешные образцы. Сигналы qPCR для элементов управления qPCR, но не сигнал DLE, были нормализованы до сигнала ARG4 qPCR. Внутримолекулярная лигированная контроль qPCR выявила приемлемый сигнал для образцов олигоса с и без гибридизации (между ~0,15-0,35), но значительно более низкий сигнал для неудачного образца (рисунок 4, верхняя средняя панель). В этом неудачном образце большое количество геномной ДНК, указанное контролем ARG4 qPCR, вероятно, привело к сбою внутримолекулярной перевязки, поскольку высокая концентрация геномной ДНК приведет к межмолекулярному лигированию.

Во всех трех образцах была надежная индукция DSB (рисунок 4, верхняя правая панель). Задний III расщепление как на резецированных, так и на расширенных нитях зависит от наличия гибридизирующих олиго. На удлиненной нити это дополнительно зависит от удлинения D-петли. Таким образом, наблюдалась значительная разница в усилении по всему участку расщепления HindIII на резецированной нити между образцами с и без олиго (рисунок 4, нижняя левая панель) и меньшая разница в усилении по всему участку распознавания HindIII на расширенной нити между этими образцами (рисунок 4, нижняя-средняя панель).

Поскольку сигнал DLE зависит от внутримолекулярной перевязки, он нормализуется для внутримолекулярной перевязки qPCR контроля. Медиана сигнала DLE через 6 ч с гибридизирующимися олиго составила 0,53 ± 0,17 (рисунок 4, нижняя правая панель), что согласуется с ранее опубликованными результатами этого анализа9. Сигнал DLE для образца дикого типа без гибридизации олиго была аналогично совместима с этой предыдущей публикацией. Сигнал DLE был ниже, чем ожидалось для неудачного образца, что, вероятно, отражает проблемы с этой выборкой, упомянутой выше.

Разворот перекрестных ссылок
Псорален, интеркалированный между парами оснований ApT/TpA в dsDNA, может стать ковалентно связанным через свои фурановые и пироновые кольца с одним или обоими противоположными тиминовыми основаниями при УФ-облучении, что приводит к образованию (преимущественно фурановых) моноаддуктов или межцепочечных диаддуктов (т.е. сшиваемых связей), соответственно22. Ожидается, что эти модификации будут блокировать прогрессирование ДНК-полимеразы, тем самым ингибируя реакцию синтеза ДНК, интегрированную в количественную ПЦР. Следовательно, большинство шаблонов dsDNA не могут быть усилены (рисунок 5A,B). Напротив, отсутствие пар оснований в ссДНК делает ее менее склонной к сшиванию псораленов. Таким образом, она усиливается легче, чем дцДНК, что искажает относительную количественную оценку сдНК по сравнению с дцДНК и ампликонами дцДНК различной длины и содержания ApT/TpA (рисунок 5A, B). Чтобы преодолеть эти ограничения, перед количественной ПЦР применялась базо- и тепло-катализируемая реверсивность псораленовой поперечной линии23. Этот метод оставляет только второстепенные виды пироновых моноаддуктов23,24. Это привело к 80-кратному восстановлению геномной дцДНК и контрольных ампликонов внутримолекулярного лигирования, что указывает на то, что подавляющее большинство шаблонных молекул имели по крайней мере один моноаддукт фурановой стороны или межцепочечное сшитое соединение (рисунок 5B, C). Сравнение значений Cp геномного контроля ДНК dsDNA до и после разворота сшивки дает оценку эффективности сшивания, которая должна находиться в диапазоне, показанном здесь. Помимо коротких ампликонов, эта процедура может восстанавливать шаблоны длиной до 3 кб (рисунок S2). Никаких изменений для ампликона сдНК не наблюдалось, что согласуется с отсутствием сшивки псоралена с сдНК (рисунок 5B-D). Это также показывает, что процедура реверсирования сшивки не повреждает ДНК23. Восстановление ампликона химеры DLC, который содержит сшитый сегмент dsDNA, лигированный к несшитому сегменту ds-ssDNA (50 bp и 118 bp/nt; Рисунок 5А) был промежуточным по сравнению с ампликонами дцДНК и сдДНК с 8-кратным улучшением восстановления (рисунок 5В,С). Разворот сшивки не влиял на относительные уровни двух ампликонов dsDNA, при этом контроль внутримолекулярной лигации оставался в диапазоне 0,2-0,25 относительно геномного контроля ДНК (рисунок 5E). Тем не менее, он изменил относительное количество ампликона ssDNA относительно контроля геномной ДНК dsDNA с 40-кратного превышения до 0,5-кратного, ожидаемого для ssDNA относительно шаблона dsDNA (рисунок 5D). Аналогичным образом, частично сигнал DLC ssDNA уменьшился с 6,6 x 10−2 до 6,6 x 10−3 относительно элементов управления внутримолекулярной перевязкой dsDNA (рисунок 5F). Это приводит нас к оценке количества молекул сустава D-петли у межхромосомного донора, обнаруженного этим подходом через 4 ч после индукции DSB, в среднем 1,3% от общего количества сломанных молекул в клеточной популяции. Такие абсолютные оценки не могут быть сделаны с помощью искажения дцДНК и усиления сдНК на основе псоралена, что подчеркивает ценность этого дополнительного шага разворота перекрестных ссылок.

Figure 1
Рисунок 1: Подпути гомологичной рекомбинации и разрешения. После повреждения ДНК, которое приводит к одно- или двухстороннему DSB (показано) или разрыву ssDNA, резекция концов ДНК от 5' до 3' выявляет 3''s ssDNA навесы, на которых образуется нить Rad51, чему способствуют ее вспомогательные факторы. Затем Rad51 ищет в геноме неповрежденную дуплексную ДНК (то есть донора), на которой можно создать шаблон события восстановления. Этот процесс завершается инвазией нитей ДНК, при которой сломанная нить основания Уотсона-Крика соединяется с комплементарной нитью двухцепочечного донора ДНК, вытесняя противоположную цепь и образуя зарождающуюся D-петлю. Эта D-петля может быть либо обращена вспять, чтобы позволить поиску гомологии Rad51 выбрать другого донора, либо расширена ДНК-полимеразой для замены оснований, потерянных во время события повреждения ДНК. Доступны три подпути HR для разрешения этого расширенного промежуточного D-цикла в продукт. Во-первых, расширенная D-петля может быть нарушена геликазой, что позволяет вновь расширенному концу разрыва отжигать до второго конца в процессе, называемом синтез-зависимым отжигом нитей (SDSA). Синтез и перевязка ДНК приводят к образованию продукта. Альтернативно, второй конец разрыва может отжигаться до смещенной донорской нити, образуя двойное соединение Холлидей (dHJ). Нуклеолитическое разрешение dHJ приводит либо к кроссоверу (CO), либо к непереходу (NCO), тогда как растворение dHJ (не показано) приводит только к продуктам NCO. Наконец, неспособность задействовать второй конец DSB приводит к репликации, вызванной разрывом (BIR), мутагенному процессу, в котором тысячи пар оснований копируются от донора на сломанную нить. Этот процесс может распространяться до сходящейся репликационной вилки или конца хромосомы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Предпосылка анализа формирования продукта D-loop capture (DLC), расширения D-loop (DLE) и индуцированной репликации (BIR). Образование DSB обусловлено сайт-специфической эндонуклеазой под контролем промотора GAL1 . Индукция DSB приводит к образованию зарождающейся D-петли. В анализе DLC межцепочечное сшивание ДНК сохраняет эту структуру, которая затем извлекается. Восстановление сайта фермента рестрикции достигается путем гибридизации с длинным олигонуклеотидом, а затем ДНК переваривается и лигируется с образованием продукта, который может быть количественно определен количественной ПЦР (qPCR). Анализ DLE отличается тем, что ДНК не является сшитой, и вместо этого внутримолекулярный продукт лигирования образуется между двумя концами сдНК на одной стороне разрыва, причем 3'-конец был расширен ДНК-полимеразой. qPCR снова используется для количественной оценки образования химерного продукта лигирования. Обнаружение расширения D-петли с помощью анализа DLE также требует восстановления сайта фермента рестрикции. Напротив, двухцепочечный продукт BIR обнаруживается с помощью праймеров для анализа DLE без гибридизирующих олигонуклеотидов. R указывает, что сайт фермента рестрикции компетентен для расщепления фермента; (R) указывает на участок фермента рестрикции, который не может быть разрезан. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Репрезентативные результаты анализа DLC-контуров через 2 ч после индукции DSB. Образцы были собраны, подготовлены и проанализированы с помощью qPCR, как описано в этом протоколе. Синие символы представляют результаты для стандартного штамма дикого типа с гибридизирующимися олиго для n = 3. Зеленые символы представляют результаты для штамма дикого типа без гибридизации олиго для n = 3. Толстая красная линия показывает медиану. Фиолетовые символы представляют собой образцы без сшивки псораленов, но с гибридизирующимися олиго для n = 2. Символы указывают на то, что образцы получены из одного и того же языка и региональных параметров. Межэкспериментальные различия в эффективности сшивки могут вводить изменчивость в определенные элементы управления qPCR, но не являются проблематичными до тех пор, пока в этих элементах управления qPCR в эксперименте нет вариабельности между выборками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Репрезентативные результаты анализа DLE через 6 ч после индукции DSB. Образцы были собраны, подготовлены и проанализированы с помощью qPCR, как описано в этом протоколе. Синие символы представляют результаты для стандартного штамма дикого типа с гибридизирующимися олиго для n = 3. Зеленые символы представляют результаты для штамма дикого типа без гибридизации олиго для n = 3. Толстая красная линия показывает медиану. Обратите внимание, что образцы олигоса с олиго и без них получены из одних и тех же культур. Фиолетовый алмаз представляет собой неудачный образец без гибридизации олиго для n = 1. Символы указывают на то, что образцы получены из одного и того же языка и региональных параметров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Репрезентативные результаты разворота сшивки псораленов. (A) Моноаддукты psoralen-DNA (*) и межцепочечные сшивки (X) специфически встречаются на dsDNA и предотвращают ее амплификацию ДНК-полимеразами, в отличие от шаблонов ssDNA. Это различие приводит к смещению в количественной оценке шаблонов, содержащих dsDNA и ssDNA, с помощью qPCR. Это смещение может быть преодолено при развороте сшивки псоралена. (B) Репрезентативные значения Cp ампликонов дцДНК (геномной, лигированной), ssDNA и смешанных ампликонов ds-ssDNA (DLC), полученные через 4 ч после индукции DSB. Данные представляют индивидуальные значения и медиану четырех биологических реплик. (C) Восстановление амплификации при развороте поперечного соединения, рассчитанное на основе значений Cp в (B). (D) Амплификация сдНК относительно контроля геномной дцДНК с разворотом сшивки псоралена и без него. При развороте ампликон ssDNA усиливается на ожидаемых 0,5 геномного контроля dsDNA. (E) Контроль внутримолекулярного лигирования дцДНК по отношению к контроле геномной дцДНК с разворотом поперечных связей псоралена и без него. (F) Сигнал DLC относительно контроля лигирования dsDNA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Текущая система анализа DLC/DLE и предлагаемые модификации. Выше: Показан текущий участок разрыва анализа DLC/DLE и донор. Ниже: Планируемые изменения в сайте разрыва анализа DLC/DLE и доноре. (I) Участок разреза эндонуклеазы 117 bp HO обозначен желтым цветом. Чтобы предотвратить смешанные эффекты при мониторинге нарушения D-петли, левая сторона HOcs (74 bp) будет введена донору, так что рекомбинация между ними создает идеально подобранную D-петлю, не имеющую 3''клапана. (II) Чтобы сделать систему ремонтопригодной и, таким образом, более физиологичной, ДНК, гомологичная донору (указанная в чирке и сирени), будет вставлена в правую сторону HOcs. (III) Вторжение и расширение нитью справа от HOcs будут контролироваться с использованием последовательностей, уникальных для этой стороны разрыва (обозначенных оранжевым цветом). (IV) Дополнительные равномерно расположенные участки и последовательности ферментов рестрикции, уникальные для донора, позволят контролировать расширение D-петли (через инвазию с левой стороны HOcs) в более отдаленных местах. В этой модифицированной системе синтез-зависимый отжиг нитей (SDSA) или образование двойного соединения Холлидей (dHJ) может происходить на участках, показанных в чирке или сирени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок S1: Карта грунтовок qPCR, используемых в анализах DLC и DLE. Карта геномных локусов, используемых для анализа в анализах DLC и DLE, их соответствующие особенности и примерные участки связывания праймеров (см. Таблицу 3 для списка праймеров qPCR). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S2: Качественная оценка разворота сшивки на больших ампликонах. Геномную ДНК получали из сшитых или несшитых образцов, где указано, как описано в протоколе, в разделах 1-5. Неколичественная ПЦР использовалась для усиления сегмента 3 кбит/с, охватывающего область гомологии, разделяемую между местом разрыва и донором. Обратите внимание, что из-за различий в эффективности амплификации между сшитой и несшитой ДНК и ограниченным количеством образца было невозможно стандартизировать входную ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Таблица 1: Штамм S. cerevisiae , используемый для анализа DLC и DLE. Генотип гаплоидного штамма почковых дрожжей, используемого в этом исследовании. Штамм предоставляется по запросу. Дополнительные штаммы, доступные для анализа DLC/DLE, можно найти в Piazza et al.8 и Piazza et al.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 2: Гибридизация олигонуклеотидов, используемых для анализа DLC и DLE. Последовательности длинных, гибридизирующих олигонуклеотидов, используемых в анализах DLC и DLE. Рекомендуется дополнительная очистка SDS-PAGE гибридизирующих олигонуклеотидов пользовательским поставщиком олигонуклеотидов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 3: Грунтовки qPCR, используемые для анализа DLC и DLE. Пары праймеров qPCR для анализов DLC и DLE и описания их назначения. Обратите внимание, что olWDH1764, olWDH2009 и olWDH2010 используются в двух qPCR. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительная таблица S1: Шаблон для настройки и анализа qPCR DLC-анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительная таблица S2: Шаблон для настройки и анализа QPCR анализа DLE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительные файлы последовательностей 1-5. Дополнительные файлы последовательностей для соответствующих геномных признаков и ампликонов. Файлы последовательностей находятся в формате ApE; ApE - это свободно доступное программное обеспечение для просмотра и редактирования последовательностей ДНК. Файлы ApE также совместимы со всеми основными программами для редактирования последовательностей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Представленные анализы позволяют обнаруживать зарождающиеся и расширенные D-петли (DLC-анализ), расширение D-петли (анализ DLE) и образование продукта BIR (анализ DLE без гибридизации олигонуклеотидов) с использованием бесконтактного лигирования и qPCR. ChIP-qPCR Rad51 для сайтов, удаленных от DSB, ранее использовался в качестве прокси для поиска гомологий, опосредованных Rad51, и формирования D-петли. Однако этот сигнал ChIP-qPCR не зависит от гомологии последовательности между местом разрыва и потенциальным донором, а также от rad51-ассоциированного фактора Rad54 и, таким образом, с большей вероятностью представляет собой переходную связь между нитью Rad51-ssDNA и dsDNA, а не промежуточнойD-петлей 10,11. Напротив, сигнал DLC зависит от формирования DSB, Rad51, Rad52, Rad54 и общей гомологии последовательности между DSB и донорским сайтом, проанализированным8. Кроме того, повышенные сигналы DLC наблюдаются в отсутствие геликаз Mph1 и Srs2 и комплекса геликазы-топоизомеразы Sgs1-Top3-Rmi1, что согласуется с предыдущими сообщениями о том, что эти три фактора могут разбирать зарождающиеся D-петли Rad51/Rad54 in vitro 8,25,26,27. Анализ DLE аналогичным образом представляет собой улучшение по сравнению с предыдущими методами следования за рекомбинационным синтезом ДНК, поскольку он может различать расширение D-петли и образование продукта BIR19.

Как обсуждалось выше, контроль qPCR, в том числе для геномной ДНК, индукции DSB, сшивки псоралена, внутримолекулярной лигации и гибридизации олигонуклеотидов, имеет решающее значение для успеха и воспроизводимости этих анализов. Необработанные значения геномной ДНК qPCR должны быть приблизительно эквивалентными по образцам. Низкие значения Cp для контроля геномной ДНК ARG4 указывают на избыток ДНК, и количество собранных клеток должно быть скорректировано. Высокие значения Cp для этого контроля указывают на недостаточное восстановление ДНК или загрязнение реагентами, которые мешают qPCR. После сферопластирования лизис клеток можно наблюдать с помощью стандартного светового микроскопа и равных объемов образца и стерильной воды. Если при добавлении воды наблюдается недостаточный лизис, раствор зимолизы необходимо переделать, либо продлить инкубацию при 30 °С. Образец также может быть потерян или загрязняющие вещества, введенные во время очистки ДНК экстракцией P / C / IA. Для эффективного восстановления ДНК следует убедиться, что рН P/C/IA скорректирован до ~8,0 и что нижняя фаза не нарушается при удалении верхней фазы. Наконец, неэффективная реуспензия гранул ДНК в 1x TE может привести к низким значениям Cp. Более длительная инкубация при 37 °C и вихрь улучшат повторное суспендирование гранулы ДНК.

В дополнение к контролю геномной ДНК геномной ДНК, реакции контроля деактивации и фермента рестрикции DSB также должны быть одинаковыми в разных образцах. Эндонуклеаза HO или резка фермента рестрикции в месте DSB или сайта распознавания фермента рестрикции предотвращает усиление в этой области; поэтому типичные нормализованные значения qPCR для этих элементов управления близки к нулю, а высокое значение qPCR указывает на недостаточное расщепление. Если наблюдается высокий сигнал в месте ОРСБ, раствор галактозы следует переделать. Для мутантов с известным дефектом клеточного цикла индукция DSB должна быть количественно определена путем покрытия равных количеств культуры, выращенной в соответствии с протоколом (см. раздел 1) на средах YPDA и YPA, дополненных галактозой. Колонии, которые растут на средах, содержащих галактозу, представляют собой дрожжи, в которых конечное соединение создало неочищенный HOcs. Если у интересующего мутанта значительно больше событий конечного соединения по сравнению с диким типом, необходимо применить коррекцию, чтобы компенсировать эту разницу в индукции DSB, которая повлияет на сигнал DLC/DLE.

Три пары праймеров (olWDH1764/olWDH1768, olWDH2010/olWDH2012 и olWDH2009/olWDH2011) оценивают восстановление сайта фермента рестрикции гибридизирующими олиго и разрезанием ферментами рестрикции EcoRI-HF и HindIII-HF. Кроме того, контроль внутримолекулярной перевязки также зависит от адекватного переваривания фермента рестрикции. Таким образом, образец с низкой эффективностью внутримолекулярного перевязки и высоким сигналом для одной из этих трех пар праймеров имеет недостаточную рестрикцию ферментного разрезания. В последующих препаратах должен быть предусмотрен дополнительный фермент рестрикции, а эффективность фермента рестрикции должна быть оценена по геномной ДНК. Пара праймеров olWDH1769/olWDH1763 представляет собой дополнительный контроль для анализа DLC, который измеряет расщепление EcoRI в DAP2, где также измеряется эффективность внутримолекулярного лигирования. Образец с адекватным внутримолекулярным сигналом лигирования, но высоким сигналом для одной из этих трех пар праймеров, имеет недостаточное восстановление сайта фермента рестрикции гибридизирующимися олиго. Для решения этой проблемы следует собирать дубликаты образцов и варьировать концентрацию пораженных гибридизирующих олиго(ов). Типичные значения qPCR, полученные для этих реакций с гибридизирующимися олиго и без них, можно найти на рисунке 3 и рисунке 4, а также в Piazza et al.8 и Piazza et al.9.

Как для DLC, так и для анализа DLE эффективность внутримолекулярного лигирования 0,15-0,35, нормализованная для контроля геномной ДНК, считается нормальной. Поскольку обнаружение зарождающихся и расширенных D-контуров и продукта BIR зависит от эффективного лигирования, образцы с сигналами низкого лигирования должны быть выброшены. 10-кратный буфер лигирования, в котором отсутствует АТФ, следует хранить при 4°С не более 6 месяцев. Сбор слишком большого количества клеток может привести к межмолекулярной перевязке, что приведет к низкой эффективности внутримолекулярного лигирования и сигналу DLC / DLE.

Хотя эти элементы управления для анализов DLC и DLE сообщают почти обо всех чувствительных шагах, все еще можно получить нефизиологические значения для сигнала DLC или DLE, когда эти элементы управления находятся в соответствующем диапазоне. Низкий сигнал DLC или DLE может быть результатом ошибок на этапе сферопластирования клеток, который является чрезвычайно чувствительным. Следует обрабатывать только несколько образцов параллельно и постоянно держать их при температуре 4 °C. Высокий / низкий сигнал DLC / DLE также может быть результатом сбора слишком большого / малого количества ячеек в каждый момент времени. Эта проблема может быть решена путем сбора нескольких OD600с клеток в каждый момент времени для каждого образца.

Существует несколько технических и концептуальных ограничений для анализов DLC и DLE в их нынешнем виде. Во-первых, псорален-опосредованная плотность межцепочечного поперечного соединения составляет ~1 к 500 bp8. Таким образом, повышенный сигнал DLC может либо указывать на то, что в популяции больше D-петель, что средняя длина D-петель в популяции увеличилась (предполагая, что D-петли могут быть меньше 500 bp), либо и то, и другое. Кроме того, вероятность того, что D-цикл будет захвачен анализом DLC, уменьшается с уменьшением длины D-петли. Учитывая, что очень короткие D-петли могут составлять значительную часть общей популяции D-петли в определенных мутантных фонах, это ограничение анализа необходимо учитывать при интерпретации результатов. Во-вторых, анализ DLC требует сшивания ДНК, в то время как анализ DLE этого не делает. Ранее для данного эксперимента это означало, что образцы DLC и DLE должны были собираться и анализироваться отдельно. Метод, показанный на рисунке 5 , обеспечивает надежную реверсирование сшивки, устраняя необходимость сбора нескольких образцов из одного и того же языка культуры. Введение второго сайта фермента рестрикции EcoRI на сломанной цепи, ниже по течению от сайта распознавания HindIII, позволит проводить последовательный анализ DLC и DLE.

В дополнение к этим техническим ограничениям, система анализа DLC и DLE в настоящее время не позволяет восстанавливать жизнеспособные hr-продукты, потому что правая сторона индуцируемого DSB не имеет гомологии для донора. Чтобы лучше понять кинетику и механизм вовлечения и синтеза второго конца, система может быть модифицирована таким образом, что репарация с использованием проксимальной или дистальной области гомологии, разделяемой между вторым концом разрыва и донором, осуществима (рисунок 6). Заглядывая вперед, может оказаться полезным объединить анализы DLC и DLE с другими технологиями, такими как ChIP-qPCR, высокопроизводительный захват конформации хромосом (Hi-C) и картирование D-петли in vivo , для достижения всестороннего анализа кинетики и регуляции этапов в пути HR, включая образование разрыва, резекцию конца, образование нити Rad51, зарождающееся образование D-петли, Расширение D-петли, разворот D-петли, вовлечение второго конца, синтез второго конца и разрешение28.

Таким образом, анализы DLC и DLE позволяют количественно оценить зарождающиеся и расширенные D-петли, расширение D-петли и образование продукта BIR с использованием принципа бесконтактного лигирования. Эти анализы представляют собой значительные достижения в этой области, поскольку они являются первыми, которые позволяют полуколичественное измерение образования и расширения D-петли независимо от клеточной жизнеспособности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Работа в лаборатории Хейера поддерживается грантами GM58015 и GM137751 W.-D.H. Исследования в лаборатории Piazza поддерживаются Европейским исследовательским советом (ERC-StG 3D-loop, большое соглашение 851006). D.R. поддерживается T32CA108459 и Фондом А.. Джаннини. Мы благодарим Shih-Hsun Hung (Heyer Lab) за то, что он поделился результатами анализа DLC / DLE и за дополнительную проверку изменений в анализах, которые подробно описаны в этом протоколе.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Pre-growth, DSB induction, and sample collection
Equipment
15 and 50 mL conical tubes
15 mL glass culture tubes
250 mL, 500 mL, or 1 L flasks
60 mm x 15 mm optically clear petri dishes with flat bottom Suggested: Corning, Catalog Number 430166; or Genesee Scientific, Catalog Number 32-150G
Benchtop centrifuge with 15 and 50 mL conical tube adapters
Benchtop orbital shaker or tube rotator/revolver
Rotator
UV crosslinker or light box with 365 nm UV bulbs set atop an orbital shaker Suggested: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) or Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Catalog Number 611110831
Materials
60% w/w sodium DL-lactate syrup Sigma-Aldrich L1375 For media preparation
Agar Fisher BP1423500 For media preparation
Bacto peptone BD Difco 211840 For media preparation
Bacto yeast extract BD Difco 212750 For media preparation
D-(+)-glucose BD Difco 0155-17-4 For media preparation
Trioxsalen Sigma-Aldrich T6137 For psoralen cross-linking
2. Spheroplasting, lysis, and restriction enzyme site restoration
Supplies
1.5 mL microcentrifuge tubes
Dry bath
Liquid nitrogen or dry ice/ethanol
Refrigerated microcentrifuge or microcentrifuge
Materials
10X restriction enzyme (CutSmart) buffer (500 mM potassium acetate, 200 mM Tris-acetate, 100 mM magnesium acetate, 1 mg/mL BSA, pH 7.8-8.0)
Zymolyase 100T US Biological Z1004 For spheroplasting
3. Restriction enzyme digest and intramolecular ligation
Supplies
Water bath
Materials
EcoRI-HF New England Biolabs R3101 Restriction enzyme digest for DLC assay
HindIII-HF New England Biolabs R3104 Restriction enzyme digest for DLE assay
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202 Intramolecular ligation
4. DNA purification
Supplies
1.5 and 2 mL microcentrifuge tubes
Materials
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (P/C/IA) at 25:24:1 Sigma-Aldrich P2069 DNA purification
5. Psoralen cross-link reversal
Supplies
Thermocycler/PCR machine
6. qPCR
Supplies
Lightcycler 480 Roche 5015278001 qPCR machine used by the authors
Lightcycler 96 Roche 5815916001 qPCR machine used by the authors
Materials
LightCycler 480 96-Well Plate, white Roche 4729692001 96-well plates for qPCR
SsoAdvanced Universal SYBR Green Super Mix BioRad 1725271 qPCR kit used by the authors
SYBR Green I Master Mix Roche 4707516001 qPCR kit used by the authors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual Review of Genetics. 45 (1), 247-271 (2011).
  2. Heyer, W. -D. Regulation of recombination and genomic maintenance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), 016501 (2015).
  3. Mimitou, E. P., Symington, L. S. Sae2, Exo1 and Sgs1 collaborate in DNA double-strand break processing. Nature. 455 (7214), 770-774 (2008).
  4. Bzymek, M., Thayer, N. H., Oh, S. D., Kleckner, N., Hunter, N. Double Holliday junctions are intermediates of DNA break repair. Nature. 464 (7290), 937-941 (2010).
  5. Chen, H., Lisby, M., Symington, L. S. RPA coordinates DNA end resection and prevents formation of DNA hairpins. Molecular Cell. 50 (4), 589-600 (2013).
  6. Mazón, G., Symington, L. S. Mph1 and Mus81-Mms4 prevent aberrant processing of mitotic recombination intermediates. Molecular Cell. 52 (1), 63-74 (2013).
  7. Saini, N., et al. Migrating bubble during break-induced replication drives conservative DNA synthesis. Nature. 502 (7471), 389-392 (2013).
  8. Piazza, A., et al. Dynamic processing of displacement loops during recombinational DNA repair. Molecular Cell. 73 (6), 1255-1266 (2019).
  9. Piazza, A., Koszul, R., Heyer, W. -D. A proximity ligation-based method for quantitative measurement of D-loop extension in S. cerevisiae. Methods in Enzymology. 601, 27-44 (2018).
  10. Sugawara, N., Wang, X., Haber, J. E. In vivo roles of Rad52, Rad54, and Rad55 proteins in Rad51-mediated recombination. Molecular Cell. 12 (1), 209-219 (2003).
  11. Renkawitz, J., Lademann, C. A., Kalocsay, M., Jentsch, S. Monitoring homology search during DNA double-strand break repair in vivo. Molecular Cell. 50 (2), 261-272 (2013).
  12. Petukhova, G., Stratton, S., Sung, P. Catalysis of homologous DNA pairing by yeast Rad51 and Rad54 proteins. Nature. 393 (6680), 91-94 (1998).
  13. Wright, W. D., Heyer, W. -D. Rad54 functions as a heteroduplex DNA pump modulated by its DNA substrates and Rad51 during D-loop formation. Molecular Cell. 53 (3), 420-432 (2014).
  14. Tavares, E. M., Wright, W. D., Heyer, W. -D., Cam, E. L., Dupaigne, P. In vitro role of Rad54 in Rad51-ssDNA filament-dependent homology search and synaptic complexes formation. Nature Communications. 10 (1), 4058 (2019).
  15. Crickard, J. B., Moevus, C. J., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. Rad54 drives ATP hydrolysis-dependent DNA sequence alignment during homologous recombination. Cell. 181 (6), 1380-1394 (2020).
  16. Lydeard, J. R., Jain, S., Yamaguchi, M., Haber, J. E. Break-induced replication and telomerase-independent telomere maintenance require Pol32. Nature. 448 (7155), 820-823 (2007).
  17. Jain, S., et al. A recombination execution checkpoint regulates the choice of homologous recombination pathway during DNA double-strand break repair. Genes & Development. 23 (3), 291-303 (2009).
  18. Donnianni, R. A., Symington, L. S. Break-induced replication occurs by conservative DNA synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13475-13480 (2013).
  19. Liu, L., et al. Tracking break-induced replication shows that it stalls at roadblocks. Nature. 590 (7847), 655-659 (2021).
  20. Liu, L., Sugawara, N., Malkova, A., Haber, J. E. Determining the kinetics of break-induced replication (BIR) by the assay for monitoring BIR elongation rate (AMBER). Methods in Enzymology. 661, 139-154 (2021).
  21. Pham, N., et al. Mechanisms restraining break-induced replication at two-ended DNA double-strand breaks. The EMBO Journal. 40 (10), 104847 (2021).
  22. Cimino, G. D., Gamper, H. B., Isaacs, S. T., Hearst, J. E. Psoralens as photoactive probes of nucleic acid structure and function: Organic chemistry, photochemistry, and biochemistry. Annual Review of Biochemistry. 54 (1), 1151-1193 (1985).
  23. Yeung, A. T., Dinehart, W. J., Jones, B. K. Alkali reversal of psoralen cross-link for the targeted delivery of psoralen monoadduct lesion. Biochemistry. 27 (17), 6332-6338 (1988).
  24. Shi, Y. B., Spielmann, H. P., Hearst, J. E. Base-catalyzed reversal of a psoralen-DNA cross-link. Biochemistry. 27 (14), 5174-5178 (1988).
  25. Prakash, R., et al. Yeast Mph1 helicase dissociates Rad51-made D-loops: Implications for crossover control in mitotic recombination. Genes & Development. 23 (1), 67-79 (2009).
  26. Liu, J., et al. Srs2 promotes synthesis-dependent strand annealing by disrupting DNA polymerase δ-extending D-loops. eLife. 6, 22195 (2017).
  27. Fasching, C. L., Cejka, P., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. -D. Top3-Rmi1 dissolve Rad51-mediated D loops by a topoisomerase-based mechanism. Molecular Cell. 57 (4), 595-606 (2015).
  28. Shah, S. S., Hartono, S. R., Chédin, F., Heyer, W. -D. Bisulfite treatment and single-molecule real-time sequencing reveal D-loop length, position, and distribution. eLife. 9, 59111 (2020).

Tags

Генетика выпуск 187 D-петля стабильность генома молекула сустава Rad51 репликация вызванная разрывом
Обнаружение гомологичных промежуточных продуктов рекомбинации <em>с помощью</em> бесконтактного лигирования и количественной ПЦР в <em>Saccharomyces cerevisiae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Reitz, D., Savocco, J., Piazza, A.,… More

Reitz, D., Savocco, J., Piazza, A., Heyer, W. D. Detection of Homologous Recombination Intermediates via Proximity Ligation and Quantitative PCR in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (187), e64240, doi:10.3791/64240 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter