Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Détection d’intermédiaires de recombinaison homologues par ligature de proximité et PCR quantitative chez Saccharomyces cerevisiae

Published: September 11, 2022 doi: 10.3791/64240
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,3
1Department of Microbiology & Molecular Genetics, University of California, Davis, 2Laboratory of Biology & Modeling of the Cell, École Normale Supérieure de Lyon, 3Department of Molecular & Cellular Biology, University of California, Davis

Summary

Les tests de capture de la boucle D (DLC) et d’extension de la boucle D (DLE) utilisent le principe de la ligature de proximité ainsi que la PCR quantitative pour quantifier la formation de la boucle D, l’extension de la boucle D et la formation de produits sur le site d’une rupture double brin inductible chez Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

Les dommages à l’ADN, y compris les cassures double brin de l’ADN et les liaisons croisées inter-brins, subis pendant les phases S et G2 du cycle cellulaire peuvent être réparés par recombinaison homologue (HR). En outre, HR représente un mécanisme important de sauvetage de la fourche de réplication après un décrochage ou un effondrement. La régulation des nombreuses étapes réversibles et irréversibles de ce parcours complexe favorise sa fidélité. L’analyse physique des intermédiaires de recombinaison formés au cours de la HR permet de caractériser ces contrôles par divers facteurs nucléoprotéiques et leurs interacteurs. Bien qu’il existe des méthodes bien établies pour tester des événements spécifiques et des intermédiaires dans la voie de recombinaison, la détection de la formation et de l’extension de la boucle D, deux étapes critiques de cette voie, s’est avérée difficile jusqu’à récemment. Ici, des méthodes efficaces pour détecter les événements clés dans la voie HR, à savoir la formation de cassures double brin d’ADN, la formation de boucles D, l’extension de boucle D et la formation de produits par réplication induite par rupture (BIR) chez Saccharomyces cerevisiae sont décrites. Ces tests détectent leurs intermédiaires de recombinaison pertinents et leurs produits avec une sensibilité élevée et sont indépendants de la viabilité cellulaire. La détection des boucles D, de l’extension de la boucle D et du produit BIR est basée sur la ligature de proximité. Ensemble, ces tests permettent d’étudier la cinétique de HR au niveau de la population pour aborder finement les fonctions des protéines HR et des régulateurs à des étapes significatives de la voie.

Introduction

La recombinaison homologue (HR) est un mécanisme haute fidélité de réparation des cassures double brin de l’ADN (DSB), des liaisons croisées inter-brins et des lacunes de l’ADNs, ainsi qu’une voie de tolérance aux dommages de l’ADN. HR diffère des voies sujettes aux erreurs pour la réparation / tolérance aux dommages de l’ADN, telles que la jonction terminale non homologue (NHEJ) et la synthèse de translésion, en ce sens qu’elle utilise un ADN duplex homologue intact comme donneur pour modéliser l’événement de réparation. De plus, bon nombre des intermédiaires clés de la voie RH sont réversibles, ce qui permet une régulation exquise des étapes individuelles de la voie. Pendant les phases S, G2 et M du cycle cellulaire, HR est en concurrence avec NHEJ pour la réparation des DSB1 à deux extrémités. En outre, la HR est essentielle à la réplication de l’ADN pour la réparation des dommages à l’ADN associés à la réplication, y compris les lacunes de l’ADNss et les DSB unilatérales, et en tant que mécanisme de pontage des lésions de l’ADN2.

Un intermédiaire critique dans la voie HR est la boucle de déplacement, ou boucle D (Figure 1). Après la résection finale, la recombinase centrale dans la réaction, Rad51, se charge sur l’ADNss nouvellement réséqué de la molécule brisée, formant un filament hélicoïdal2. Rad51 effectue ensuite une recherche d’homologie pour identifier un donneur homologue approprié, généralement la chromatide sœur dans les cellules somatiques. La boucle D est formée lorsque le filament Rad51-ssDNA envahit un ADN duplex homologue, ce qui conduit à l’appariement de la base Watson-Crick du brin brisé avec le brin complémentaire du donneur, déplaçant le brin donneur opposé. L’extension de l’extrémité 3' du brin brisé par une ADN polymérase remplace les bases qui ont été perdues lors de l’événement de dommages à l’ADN et favorise la résolution de l’intermédiaire de la boucle D étendue en un produit d’ADNds par le recuit du brin dépendant de la synthèse (SDSA), la jonction double Holliday (dHJ) ou les sous-voies HR de réplication induite par rupture (BIR).

Les tests qui surveillent physiquement les intermédiaires dans la voie HR permettent d’analyser les besoins génétiques pour chaque étape (c.-à-d. l’analyse de la voie). La formation de DSB, la résection terminale, les dHJ, les bulles de réplication BIR et les produits HR sont facilement observés par transfert de Southern 3,4,5,6,7. Pourtant, le transfert de Southern ne rend pas compte des boucles D naissantes et étendues et, par conséquent, une méthode alternative pour mesurer de manière fiable ces molécules articulaires est nécessaire 4,8,9. Une stratégie largement utilisée pour analyser la formation naissante de boucles D est l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) de Rad51 couplée à la PCR quantitative (qPCR)10,11. Cependant, l’association Rad51 avec l’ADNds telle que mesurée par ChIP-qPCR est indépendante de l’homologie de séquence et du facteur accessoire Rad51 Rad5410,11. En revanche, un signal appréciable utilisant la méthode d’analyse de boucle D présentée ici, appelée test de capture de boucle D (DLC), dépend de la formation de DSB, de l’homologie de séquence, de Rad51 et des protéines accessoires Rad51 Rad52 et Rad548. La découverte que la formation de la boucle D favorisée par Saccharomyces cerevisiae Rad51 dépend de Rad54 in vivo est en accord avec de nombreuses expériences de reconstitution in vitro indiquant que Rad54 est nécessaire pour la recherche d’homologie et la formation de boucles D par la levure bourgeonnante Rad51 8,12,13,14,15.

Les approches actuelles de mesure de l’extension de la boucle D, principalement par PCR semi-quantitative, sont tout aussi problématiques. Un test typique basé sur la PCR pour détecter l’extension de la boucle D amplifie une séquence unique, résultant de la recombinaison entre un site de rupture et un donneur ectopique et de la synthèse ultérieure de l’ADN associée à la recombinaison, via une amorce en amont de la région d’homologie sur le brin brisé et une autre amorce en aval de la région d’homologie sur le brin donneur. En utilisant cette méthode, la détection de la synthèse d’ADN associée à la recombinaison nécessite le facteur de processivité non essentiel Pol δ Pol3216. Cette découverte est en contradiction avec l’observation selon laquelle la délétion de POL32 n’a qu’un effet léger sur la conversion génique in vivo17. De plus, ces tests basés sur la PCR ne parviennent pas à résoudre temporellement l’extension de la boucle D et la formation de produits BIR, ce qui suggère que le signal résulte de produits ADNds plutôt que d’intermédiaires de l’ADNss17,18,19. Le test d’extension de la boucle D (DLE) a récemment été développé pour corriger ces divergences. Le test DLE quantifie la synthèse d’ADN associée à la recombinaison sur un site ~400 paires de bases (pb) en aval de l’extrémitéinitiale envahissante 3' 9. Par cette méthode, l’extension de la boucle D est indépendante de Pol32 et est détectable dans les 4 h suivant l’induction DSB, tandis que les produits BIR sont observés pour la première fois à 6 h. En effet, une publication récente des laboratoires Haber et Malkova a noté que l’utilisation de cette méthode de préparation de l’ADN génomique aboutit singulièrement à la préservation de l’ADNss 9,20.

Ici, les tests DLC et DLE sont décrits en détail. Ces tests reposent sur la ligature de proximité pour détecter les boucles D naissantes et étendues chez S. cerevisiae (Figure 2)8,9. Les produits BIR peuvent être quantifiés à l’aide de ce même système de dosage. Pour les deux essais, la formation de DSB à un site de coupe de l’endonucléase HO situé au locus URA3 sur le chromosome (Chr.) V est induite par l’expression de l’endonucléase HO sous le contrôle d’un promoteur inductible par le galactose. L’invasion de brins d’ADN médiée par Rad51 conduit à la formation naissante d’une boucle D sur le site d’un donneur ectopique situé au locus LYS2 sur Chr. II. Comme le côté droit du DSB n’a pas d’homologie avec le donneur, la réparation via SDSA et la formation de dHJ n’est pas réalisable. La réparation initiale du DSB par BIR est possible, mais la formation de produits viables est inhibée par la présence du centromère21. Cette conception délibérée empêche la réparation productive du DSB, évitant ainsi la reprise de la croissance par les cellules avec des DBS réparés, qui pourraient autrement dépasser la culture pendant l’analyse du cours du temps.

Dans le test DLC, la réticulation psoralène des deux brins de l’ADN hétéroduplex dans la boucle D préserve l’intermédiaire de recombinaison. Après la restauration du site enzymatique de restriction sur le brin brisé (réséqué) et la digestion, la réticulation permet la ligature des séquences uniques en amont de l’ADN homologue brisé et donneur. À l’aide de la qPCR, le niveau de molécule d’ADN chimérique présente dans chaque échantillon est quantifié. Dans le test DLE, la réticulation n’est pas nécessaire, et la restauration du site enzymatique de restriction et la digestion suivies d’une ligature intramoléculaire relient plutôt l’extrémité 5' de la molécule cassée à l’extrémité 3' nouvellement étendue. Encore une fois, la qPCR est utilisée pour quantifier les quantités relatives de ce produit chimérique dans chaque échantillon. En l’absence de restauration du site enzymatique de restriction, le test DLE rend compte des niveaux relatifs du produit BIR (ADNds) qui se forme après l’extension de la boucle D.

Des résultats représentatifs pour chaque essai utilisant une souche de type sauvage sont présentés, et les lecteurs sont invités à se reporter à Piazza et al.8 et Piazza et al.9 pour l’utilisation de ces essais pour l’analyse des mutants de recombinaison 8,9. L’objectif de cette contribution est de permettre à d’autres laboratoires d’adopter les tests DLC et DLE, et un soutien est disponible sur demande.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Pré-croissance, induction DSB et prélèvement d’échantillons

REMARQUE: La supplémentation de tous les milieux avec 0,01% d’adénine est recommandée pour les souches Ade-.

  1. Étaler les souches haploïdes appropriées (voir tableau 1) sur peptone de levure dextrose adénine (YPDA) (extrait de levure 1%, 2% peptone, 2% glucose, 2% agar-agar, 0,001% adénine) et cultiver pendant 2 jours à 30 ° C.
  2. Utiliser une seule colonie pour inoculer 5 mL de YPDA dans un tube de culture en verre de 15 mL. Cultiver les cultures jusqu’à saturation à 30 °C en agitant ou en rotation pour l’aération.
  3. Dosage DLC : Préparer la solution mère de psoralène 5x (0,5 mg/mL de trioxsalène dans de l’éthanol 200-proof) dans une hotte en dissolvant le psoralène dans un tube conique de 50 ml enveloppé dans une feuille d’aluminium pendant la nuit à température ambiante avec agitation ou inversion continue. Scellez le bouchon à vis avec un film transparent pour empêcher l’évaporation. Ne pas préparer plus de 7 mL de 5x solution mère de psoralène par tube conique de 50 ml pour assurer une dissolution adéquate du psoralène.
  4. Le lendemain, utiliser 5 mL de la culture de nuit du YPDA cultivé pour inoculer 50 à 100 mL de YEP-lactate (extrait de levure à 1 %, 2 % de peptone, 2 % p/p de lactate, 0,001 % d’adénine) dans une fiole de taille appropriée (la levure bourgeonnante pousse de façon optimale dans un flacon d’au moins 5 fois le volume de la culture) à une DO600 de ~0,03.
  5. Cultiver la culture pendant ~16 h à 30 °C en agitant à 220 tr/min. Après ~16 h, mesurez le OD600 de la culture et il devrait être ~0,5-0,8. N’utilisez pas de cultures sous-envahies ou envahies par la végétation.
  6. Pour chaque point temporel, recueillir le volume approprié de cellules dans un tube conique et placer sur de la glace. En règle générale, il s’agit de 1 x 108 cellules (environ 7,5 mL de culture à OD 600 1,0 pour une souche haploïde de type sauvage) pour le test DLC et de 5 x 107 cellules (environ 2,5 mL de culture à OD600 1,0) pour le test DLLE.
  7. Pour garantir l’exactitude des valeurs de DO 600, préparer des dilutions 1:5 pour les cultures ayant une DO600≥0,2 afin de maintenir la lecture de la DO à 0,2 ou moins. Pour les souches de type sauvage, les points de temps optimaux pour l’analyse DLC sont compris entre 2 h et 6 h, et les points de temps optimaux pour l’analyse DLE sont compris entre 4 h et 8 h (voir Figure 3 et Figure 4).
  8. Dosage DLC
    1. Avant chaque point temporel, préparer suffisamment de 1x solution de psoralène (0,1 mg/mL de trioxsalen, 50 mM de Tris-HCl pH 8,0, 50 mM d’EDTA pH 8,0, 20 % d’éthanol) dans une hotte pour tous les échantillons dans un tube conique de 50 ml enveloppé dans une feuille d’aluminium. Partir à RT.
    2. Centrifuger les échantillons à 2 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Remettez la pastille en suspension dans 2,5 mL de 1x solution de psoralène dans une hotte et transférez-la dans une boîte de Petri de 60 mm x 15 mm. Vous pouvez également remettre la pastille en suspension dans 2,5 mL de solution TE1 (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0) pour un contrôle sans réticulation.
    3. Réticulez les échantillons. Pour un agent de réticulation UV adapté aux ampoules à ondes longues (365 nm), placez les boîtes de Petri à 1-2 cm sous la source de lumière UV avec le couvercle retiré sur une plaque en plastique ou en plexiglas qui a été pré-refroidie à -20 ° C. Pour une boîte de lumière UV, placez les boîtes de Petri directement sur la source de lumière UV. Exposer les échantillons pendant 10 min en secouant doucement.
      REMARQUE: Il est recommandé de régler la source de lumière UV sur un agitateur orbital réglé à ~ 50 tr / min.
    4. Dans une hotte, transférer l’échantillon dans un nouveau tube de 15 mL. Rincer la boîte de Petri avec 2,5 ml de solution TE1 et l’ajouter au tube. Centrifuger les échantillons à 2 500 x g pendant 5 minutes à 4 °C, éliminer correctement le surnageant et conserver la pastille à −20 °C. Les échantillons peuvent être conservés jusqu’à 1 semaine avant de passer à l’étape suivante.
  9. Dosage DLE
    1. Centrifuger les échantillons à 2 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Laver la pastille de la cellule dans 2,5 mL de solution TE1 froide avant de répéter l’essorage et de stocker les pastilles à −20 °C. Les échantillons peuvent être conservés jusqu’à 1 semaine avant de passer à l’étape suivante.
  10. Pour le prélèvement d’échantillons à 0 h, prélever les échantillons avant l’ajout de 20% de galactose. Pour les points temporels suivants, induire la formation de DSB en ajoutant 20% de galactose aux cultures jusqu’à une concentration finale de 2%. Prélever les échantillons restants comme décrit ci-dessus, la pastille et la congeler par rapport au temps suivant l’induction du DSB (c.-à-d. que l’échantillon de 4 heures est prélevé 4 heures après l’ajout de 20 % de galactose).

2. Sphéroplastie cellulaire, lyse et restauration du site de restriction

  1. Décongeler les échantillons sur la glace. Préchauffer un bain sec à 30 °C.
  2. Resuspendre les échantillons dans 1 mL de tampon de sphérosablage (0,4 M de sorbitol, 0,4 M de KCl, 40 mM de tampon de phosphate de sodium pH 7,2, 0,5 mM de MgCl2) et transférer dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL.
  3. Ajouter 3,5 μL de solution de zymolyase (glucose à 2 %, 50 mM de Tris-HCl pH 7,5, 5 mg/mL de zymolyase 100T; concentration finale de 17,5 μg/mL de zymolyase). Mélanger doucement en tapotant ou en inversant. Incuber à 30 °C pendant 15 min, puis déposer sur la glace. Pendant les 15 minutes d’incubation, obtenir de l’azote liquide ou de la glace sèche.
  4. Centrifuger pendant 3 min à 2 500 x g à 4 °C et déposer les échantillons sur de la glace. Lavez les échantillons 3x dans 1 mL de tampon de pulvérisation. Centrifuger les échantillons pendant 3 min à 2 500 x g à 4 °C.
  5. Resuspendre les échantillons dans 1 mL de tampon enzymatique de restriction 1x froid (50 mM d’acétate de potassium, 20 mM de tris-acétate, 10 mM d’acétate de magnésium, 100 μg/mL de BSA pH ~8,0 à TA) et centrifuger pendant 3 min à 16 000 x g à 4 °C. Placez les échantillons sur de la glace. Répétez le lavage 1x.
  6. Remettez les échantillons en suspension dans 1 mL de tampon enzymatique de restriction 1x froid. Diviser l’échantillon (0,5 mL chacun) en deux tubes microcentrifugés de 1,5 mL. Centrifuger les échantillons pendant 3 min à 16 000 x g à 4 °C.
  7. Resuspendre un tube de chaque échantillon dans 180 μL de tampon enzymatique de restriction 1,4x avec oligos hybridants (voir tableau 2) et un tube dans 180 μL de tampon enzymatique de restriction 1,4x sans oligos hybridants. Chaque oligo hybridant est remis en suspension dans 1x TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0) et utilisé à une concentration finale de 7 nM. Le 1x TE remplace les oligos hybridants dans le tampon enzymatique de restriction 1.4x sans oligos hybridants.
    NOTA: Les oligos hybridants doivent être conservés à −20 °C dans de petites aliquotes à la dilution de travail. La concentration des oligos hybridants peut nécessiter une optimisation; voir Discussion.
  8. Congeler les échantillons dans de l’azote liquide ou de la glace sèche/éthanol et les conserver à −80 °C. Les échantillons peuvent être stockés à ce stade pendant plusieurs mois.

3. Digestion enzymatique de restriction et ligature intramoléculaire

  1. Décongeler les échantillons sur la glace. Préchauffer un bain sec à 65 °C et un autre à 37 °C.
  2. Pipet 36 μL de l’échantillon dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 mL sur glace. Remettre rapidement l’échantillon restant à −80 °C pour l’entreposage.
  3. Ajouter 4 μL de SDS à 1 % (concentration finale de 0,1 %) et mélanger en tapotant doucement le côté du tube. Incuber à 65 °C pendant 15 min en tapotant doucement toutes les 5 minutes. Placer les échantillons sur de la glace immédiatement après l’incubation.
    REMARQUE: Ce traitement SDS favorise la dénaturation des protéines associées à l’ADN, la solubilisation de l’enveloppe nucléaire et l’accessibilité de la chromatine avant les étapes de digestion enzymatique de restriction et de ligature intramoléculaire.
  4. Ajouter 4,5 μL de Triton X-100 à 10 % (concentration finale de 1 %) et mélanger par pipetage. Ajouter 20-50 U d’enzyme de restriction (EcoRI-HF ou HindIII-HF) à chaque échantillon et incuber à 37 °C pendant 1 h en agitant doucement toutes les 20-30 min. Pendant ce temps, préchauffez un bain sec à 55 °C et préréglez un bain-marie à 16 °C.
  5. Ajouter 8,6 μL de SDS à 10 % (concentration finale de 1,5 %) à chaque échantillon et mélanger par pipetage et taraudage. Incuber à 55 °C pendant 10 min. Ajouter 80 μL de Triton X-100 à 10 % (concentration finale de 6 %) à chaque échantillon et mélanger par pipetage.
  6. Ajouter 660 μL de tampon de ligature 1x sans ATP (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl 2, 10 mM DTT,2,5 μg/mL BSA) + 1 mM ATP pH 8,0 + T4 ADN ligase (8 U/échantillon) à chaque échantillon et mélanger par inversion douce. Incuber à 16 °C pendant 1,5 h avec inversion toutes les 30 min. Placez les échantillons sur de la glace immédiatement après l’incubation.

4. Purification de l’ADN

  1. Préchauffer un bain sec à 65 °C et un autre à 37 °C. Ajouter 1 μL de 10 mg/mL de protéinase K (préparée dans 1x TE pH 8,0) à chaque échantillon (concentration finale de 12,5 μg/mL). Incuber à 65 °C pendant 30 min et placer les échantillons sur de la glace immédiatement après l’incubation jusqu’à refroidissement.
  2. Transférer les échantillons dans des tubes de 2 mL. En travaillant dans une hotte, ajouter un volume égal (~800 μL) de phénol/chloroforme/alcool isoamylique (P/C/IA; PH 8,0) à chaque échantillon. Vortex les échantillons pendant ~30 s et centrifuger les échantillons pendant 5-10 min à 16 000 x g dans une microcentrifugeuse.
  3. Prélever délicatement 600 μL de la phase supérieure de chaque échantillon dans un nouveau tube de 1,5 mL. Éliminez correctement la phase inférieure et les tubes de 2 mL.
  4. Précipiter l’ADN en ajoutant un volume 1/10 d’acétate de sodium 3 M pH 5,2 (~60 μL) à chaque échantillon, suivi de 1 volume d’isopropanol (~660 μL). Retourner les échantillons 5x-10x et incuber à TA pendant 30 min.
  5. Placer les échantillons sur de la glace pendant 2 min, puis centrifuger les échantillons à 16 500 x g pendant 15 min à 4 °C dans une microcentrifugeuse. Remettre les échantillons dans la glace, verser le surnageant et égoutter le tube sur une serviette en papier.
  6. Lavez la pastille d’ADN avec 200 μL d’éthanol à 70%. Centrifuger à 16 500 x g pendant 3 min à 4 °C, remettre les échantillons sur de la glace, verser le surnageant et retirer l’alcool résiduel à l’aide d’une pipette. Sécher les échantillons avec les bouchons des tubes ouverts à 37 °C pendant 15-20 min.
  7. Remettez en suspension les pastilles d’ADN dans 50 μL de 1x TE par vortex. Incuber à TA pendant 30 min, vortex, puis incuber à 37 °C dans un bain sec pendant 30 min. Vortex les échantillons à nouveau, puis placez-les sur de la glace. Les échantillons peuvent être conservés à ce stade à -20 °C pendant plusieurs mois, mais il est conseillé de procéder immédiatement pour les étapes de réticulation (DLC uniquement) et de qPCR.

5. Inversion de réticulation du psoralène (pour le dosage DLC uniquement)

  1. Piper 9 μL d’ADN purifié dans un tube de PCR sur glace. Ajouter 1 μL de 1 M KOH (concentration finale de 0,1 M). Incuber les échantillons à 90 °C pendant 30 min dans un thermocycleur.
  2. Ajouter 19,73 μL de solution d’acétate de sodium (0,1 M d’acétate de sodium, 9,6 mM de Tris-HCl pH 8,0, 1,0 mM d’EDTA pH 8,0). Les échantillons peuvent être conservés à ce stade à -20 °C pendant plusieurs mois, mais il est conseillé de passer immédiatement à l’étape qPCR.

6. PCR quantitative, contrôles et analyse

  1. En utilisant 2 μL d’ADN purifié, avec ou sans réticulation, mettre en place une réaction qPCR de 20 μL selon les instructions du fabricant. Configurez chaque réaction en double. Pour les tests DLC et DLLE, il y a cinq réactions de contrôle et une réaction de quantification DLC/DLLE, soit un total de six réactions par échantillon, exécutées en double. Le tableau supplémentaire S1 et le tableau supplémentaire S2 fournissent un modèle pour la mise en place de ces réactions et analyses, et les séquences des amorces qPCR sont énumérées dans le tableau 3.
  2. Les conditions de cycle qPCR doivent être optimisées pour chaque kit qPCR.
    1. Utilisez les conditions de qPCR DLC suivantes, en fonction des kits qPCR utilisés : dénaturation initiale (95 °C pendant 3 min) ; 50 tours d’amplification (95 °C pendant 15 s, 61 °C pendant 25 s, 72 °C pendant 15 s avec une seule acquisition); analyse de la courbe de fusion (95 °C pendant 5 s, 65 °C pendant 1 min, 97 °C avec acquisition continue); et refroidissement (37 °C pendant 30 s).
    2. Utiliser les conditions qPCR suivantes pour le test DLE : dénaturation initiale (95 °C pendant 5 min) ; 50 tours d’amplification (95 °C pendant 15 s, 60 °C pendant 30 s, 72 °C pendant 15 s avec une seule acquisition); analyse de la courbe de fusion (95 °C pendant 5 s, 65 °C pendant 1 min, 97 °C avec acquisition continue); et refroidissement (37 °C pendant 30 s). Notez qu’une optimisation pour différents machines/kits qPCR peut être nécessaire.
  3. Dosage DLC
    1. Contrôles : Voir la liste des amorces qPCR dans le tableau 3. Une carte des sites de liaison de l’amorce est présentée à la figure S1. Pour les fichiers de séquence supplémentaires pour les caractéristiques génomiques et les amplicons pertinents, consultez les fichiers A plasmid Editor (ApE); Fichiers de séquences supplémentaires 1 à 5.
      1. ADN génomique à ARG4: Utilisez olWDH1760 / olWDH1761 pour amplifier l’ADNds situé à ARG4. Utilisez cette réaction comme contrôle de charge et normalisez toutes les autres réactions à l’exception de la réaction du signal DLC à ce contrôle.
      2. Efficacité de la ligature intramoléculaire au niveau DAP2 : Utilisez le fragment de 1 904 pb créé par la digestion EcoRI pour la ligature intramoléculaire en parallèle avec la ligature DLC. L’amplification à travers cette jonction de ligature rend compte de l’efficacité de la ligature intramoléculaire et sert de contrôle auquel le signal DLC est normalisé.
      3. Induction DSB : Utilisez olWDH1766/olWDH1767 pour amplifier une région qui couvre le DSB induit.
      4. Réticulation et résection du psoralène : Utilisez olWDH2019/olWDH2020 pour amplifier la région unique de PhiX en aval du site de reconnaissance EcoRI. Sans inversion de réticulation, utilisez le rapport de l’ADNss (pas de réticulation) sur ARG4 (ADNds réticulé) pour déterminer l’efficacité de réticulation. Avec l’inversion de la réticulation, la résection entraînera une diminution progressive de 1 à 0,5 du signal par rapport à ARG4.
      5. EcoR Restauration et découpe du site de reconnaissance I : Utiliser olWDH1768/olWDH1764 pour amplifier une région qui s’étend sur le site de reconnaissance EcoRI restauré en amont du DSB sur le brin réséqué. olWDH1769/olWDH1763 amplifient une région qui s’étend sur le site de l’enzyme de restriction EcoRI au niveau de DAP2. Effectuer le clivage EcoRI à ce site pour l’utiliser comme contrôle de ligature intramoléculaire.
    2. Signal DLC: Utilisez olWDH1764 / olWDH1765 pour amplifier la molécule d’ADN chimérique créée par ligature intramoléculaire du brin réséqué (envahissant) et du donneur.
    3. Analyse : Calculez la moyenne et l’écart-type des valeurs Cp pour chacune des réactions en double. Utilisez les valeurs de cp qPCR de l’ADN génomique ARG4 comme référence pour normaliser toutes les autres qPCR de contrôle. Normaliser le signal DLC au contrôle de ligature intramoléculaire au niveau DAP2. Voir la figure 3 pour connaître les valeurs typiques du signal DLC à 2 h.
  4. Dosage DLE
    1. Contrôles : Voir la liste des amorces qPCR dans le tableau 3. Une carte des sites de liaison de l’amorce est présentée à la figure S1. Pour les fichiers de séquences supplémentaires pour les caractéristiques génomiques et les amplicons pertinents, consultez les fichiers de l’éditeur de plasmide A (ApE) (fichiers de séquence supplémentaires 1 à 5).
      1. ADN génomique à ARG4 : Voir rubrique 6.3.1.1.
      2. Efficacité de la ligature intramoléculaire à YLR050C: Utilisez la digestion HindIII pour créer un fragment de 765 pb qui subira une ligature intramoléculaire parallèlement à la ligature DLE. L’amplification à travers cette jonction de ligature rend compte de l’efficacité de la ligature intramoléculaire et sert de contrôle auquel le signal DLE est normalisé.
      3. Induction DSB: Voir section 6.3.1.3.
      4. Biche Restauration et coupe du site de reconnaissance III : Utiliser olWDH2010/olWDH2012 et olWDH2009/2011 pour amplifier une région qui s’étend sur les sites de l’enzyme de restriction HindIII sur le brin brisé où elle a été réséquée et étendue, respectivement.
    2. Signal DLE: Utilisez olWDH2009 / olWDH2010 pour amplifier la molécule d’ADN chimérique créée par ligature intramoléculaire de l’extrémité réséquée du brin envahissant en amont du DSB jusqu’à l’extrémité nouvellement étendue en aval du DSB.
    3. Analyse : Calculez la moyenne et l’écart-type des valeurs Cp pour chacune des réactions en double. Utilisez les valeurs de cp qPCR de l’ADN génomique ARG4 comme référence pour normaliser toutes les autres qPCR de contrôle. Normaliser le signal DLE au contrôle de ligature intramoléculaire à YLR050C. Les valeurs typiques du signal DLE à 6 h sont rapportées dans la figure 4 et les publications précédentes9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dosage DLC
Le test DLC détecte à la fois les boucles D naissantes et étendues formées par l’invasion d’un DSB spécifique au site en un seul donneur (Figure 2). La réticulation psoralène relie physiquement le brin brisé et le donneur via l’ADN hétéroduplex dans la boucle D. La restauration du site enzymatique de restriction avec un long oligo hybridant sur le brin réséqué de la rupture permet un clivage de l’enzyme de restriction, suivi d’une ligature du brin brisé au donneur proximal pour former un produit chimérique quantifié par qPCR. Notamment, le signal DLC dépend de la réticulation du psoralène, de l’oligo hybridant, de la recombinase centrale, Rad51 et des facteurs accessoires Rad51 Rad52 et Rad548. La délétion des hélicases / topoisomérases ADN Sgs1-Top3-RMI1, Mph1 et Srs2 entraîne une augmentation du signal DLC.

La figure 3 montre les résultats représentatifs pour la souche type sauvage standard à 2 h après induction DSB en triple exemplaire avec et sans oligo hybridant. Un échantillon manquant dans une étape clé, la réticulation du psoralène, est également présenté en double.

Comme le montre la figure 3, la réticulation du psoralène est une étape critique. Il n’y a pratiquement pas de signal détectable sans elle8. L’efficacité de la réticulation est mesurée en fonction du rapport entre l’ADNss et l’amplification de l’ADNds. Contrairement à l’ADNds, l’ADNss subit une réticulation minimale du psoralène et, par conséquent, un signal élevé indique une réticulation réussie. L’efficacité de la réticulation varie en fonction du temps écoulé entre le prélèvement de l’échantillon et la préparation de la qPCR (Figure 3, panneau inférieur gauche). Plus il y a de temps entre le prélèvement et la préparation de l’échantillon, moins le signal sera observé pour le contrôle qPCR de l’efficacité de la réticulation. La variation significative entre les échantillons du signal observée pour le contrôle qPCR de l’efficacité de réticulation est une source de préoccupation, et le cours temporel doit être écarté.

ARG4 Les valeurs de Cp sont similaires entre les échantillons d’oligo avec et sans hybridation (Figure 3, panneau supérieur gauche). Une faible valeur de Cp indique que l’ADN plus amplifiable est présent. Cela explique pourquoi les valeurs de Cp ARG4 pour les échantillons sans réticulation sont significativement plus faibles : la réticulation interfère avec l’amplification qPCR. Cette différence entre les échantillons sans et sans réticulation s’applique à toutes les qPCR à l’exception du contrôle qPCR de clivage EcoRI, qui amplifiera l’ADNss/ADNdS non réticulé. Tous les contrôles qPCR, mais pas le signal DLC, sont normalisés au signal qPCR ARG4 .

Pour tous les échantillons, le contrôle qPCR de ligature intramoléculaire se situe dans la plage appropriée (Figure 3, panneau central supérieur), et il y a une induction DSB robuste, comme en témoigne le faible signal pour le contrôle qPCR qui s’amplifie à travers le site de reconnaissance de l’endonucléase HO (Figure 3, panneau supérieur droit). Dans les échantillons oligo hybridants, on observe une découpe EcoRI efficace, et ce contrôle qPCR donne un signal faible (Figure 3, panneau central inférieur). Inversement, les échantillons oligo sans oligo hybridant avec réticulation donnent un signal élevé, similaire à ce qui est montré pour le contrôle qPCR de l’efficacité de réticulation, puisque, dans ce cas, l’ADNs non coupé est amplifié et normalisé au signal qPCR ARG4 (dsDNA).

Contrairement aux autres qPCR, le signal qPCR pour le test DLC est normalisé au contrôle qPCR de ligature intramoléculaire, puisque la molécule chimérique quantifiée par le DLC qPCR dépend de la ligature. Le signal DLC médian à 2 h avec oligo hybridant est de 0,030 ± 0,0055 (Figure 3, panneau inférieur droit), conformément aux résultats précédemment publiés pour ce test8. Comme prévu, ce signal dépend à la fois de l’oligo hybridant et de la réticulation du psoralène.

Dosage DLE
Le test DLE permet de surveiller avec précision l’extension de la boucle D en réponse à un DSB spécifique au site (Figure 2). Il a été démontré précédemment que le signal DLE dépend de Rad51, la recombinase centrale dans la réaction, qui intervient dans l’invasion du brin et est donc nécessaire pour la synthèse de l’ADN associée à la recombinaison9. De plus, le signal DLE dépend de la sous-unité catalytique de Pol δ, Pol3 (DR, AP, WDH, données non publiées) mais pas du facteur de processivité non essentiel Pol32. Contrairement au signal DLC, qui devient détectable pour la première fois 2 h après l’induction DSB, le signal DLE augmente d’abord sensiblement à 4 h après l’induction DSB, augmente considérablement entre 4 h et 6 h et commence à se stabiliser par la suite, une grande partie de l’augmentation du signal entre 6 h et 8 h étant attribuable à la formation du produit BIR8, 9.

Comme le produit de ligature chimérique quantifié dans le test DLE est monocaténaire, l’étape de sphéroplastie cellulaire et de lyse est critique. Une diminution du signal DLE peut résulter de problèmes avec cette étape, ce qui peut libérer des nucléases et conduire à la dégradation de l’ADNs cible.

La figure 4 montre des résultats représentatifs pour la souche type sauvage standard 6 h après l’induction de la DSB en triple exemplaire avec et sans oligos hybridants. L’échantillon de type sauvage sans oligos hybridants représente le produit BIR dsDNA seul, tandis que le signal avec oligo est dérivé à la fois de l’ADNss de la boucle D étendue et du produit BIR dsDNA. Un troisième échantillon est inclus comme exemple d’expérience ratée.

ARG4 Les valeurs de Cp étaient similaires entre les échantillons d’oligos avec et sans hybridation (figure 4, panneau supérieur gauche). ARG4 Les valeurs de Cp étaient sensiblement plus faibles pour l’échantillon échoué, ce qui indique que cet échantillon contient plus d’ADN génomique que les échantillons réussis. Les signaux qPCR pour les contrôles qPCR, mais pas le signal DLE, ont été normalisés au signal qPCR ARG4 . Le contrôle qPCR de ligature intramoléculaire a révélé un signal acceptable pour les échantillons d’oligos avec et sans hybridation (entre ~0,15 et 0,35), mais un signal nettement inférieur pour l’échantillon échoué (Figure 4, panneau supérieur du milieu). Dans cet échantillon raté, la grande quantité d’ADN génomique indiquée par le contrôle qPCR ARG4 a probablement causé l’échec de la ligature intramoléculaire, car une concentration élevée d’ADN génomique entraînera une ligature intermoléculaire.

Dans les trois échantillons, il y avait une induction robuste du DSB (figure 4, panneau supérieur droit). Biche III clivage sur les brins réséqués et étendus dépend de la présence des oligos hybridants. Sur le brin étendu, il dépend en outre de l’extension de la boucle D. Ainsi, il y avait une différence significative d’amplification à travers le site de clivage Hind III sur le brin réséqué entre les échantillons sans et sans oligo (figure 4, panneau inférieur gauche) et une différence plus faible dans l’amplification à travers le site de reconnaissance HindIII sur le brin étendu entre ces échantillons (figure 4, panneau inférieur médian).

Comme le signal DLE dépend de la ligature intramoléculaire, il est normalisé au contrôle qPCR de ligature intramoléculaire. Le signal médian DLE à 6 h avec des oligos hybridants était de 0,53 ± 0,17 (Figure 4, panneau inférieur droit), ce qui correspond aux résultats publiés précédemment pour ce test9. Le signal DLE pour l’échantillon de type sauvage sans oligos hybridants était également compatible avec cette publication antérieure. Le signal DLE était plus faible que prévu pour l’échantillon échoué, ce qui reflète probablement les problèmes liés à cet échantillon mentionnés ci-dessus.

Inversion de réticulation
Le psoralène intercalé entre les paires de bases ApT/TpA dans l’ADNds peut être lié de manière covalente par ses cycles furane et pyrone à l’une ou aux deux bases de thymine opposées lors de l’irradiation UV, ce qui donne des mono-adduits (principalement furanes) ou des di-adduits inter-brins (c.-à-d. des liaisons croisées), respectivement22. Ces modifications devraient bloquer la progression de l’ADN polymérase, inhibant ainsi la réaction de synthèse de l’ADN faisant partie intégrante de la PCR quantitative. Par conséquent, la plupart des modèles dsDNA ne peuvent pas être amplifiés (Figure 5A,B). En revanche, l’absence de paires de bases dans l’ADNss le rend moins sujet à la réticulation du psoralène. Il est donc amplifié plus facilement que l’ADNds, ce qui fausse la quantification relative de l’ADNss par rapport à l’ADNds et des amplicons d’ADNds de différentes longueurs et teneurs en ApT/TpA (Figure 5A,B). Pour surmonter ces limitations, une inversion catalysée par la base et la chaleur de l’étape23 d’inversion de réticulation du psoralène a été appliquée avant la PCR quantitative. Cette méthode ne laisse que les espèces mineures de mono-adduits côté pyrone23,24. Cela a conduit à une récupération de 80 fois de l’ADNds génomique et des amplicons de contrôle de ligature intramoléculaire, indiquant que la grande majorité des molécules modèles avaient au moins un monoadduit côté furane ou une réticulation inter-brin (Figure 5B,C). La comparaison des valeurs de Cp du contrôle de l’ADN génomique dsDNA avant et après l’inversion de la réticulation fournit une estimation de l’efficacité de la réticulation, qui devrait se situer dans la plage indiquée ici. Au-delà des amplicons courts, cette procédure permet de restaurer des modèles d’une longueur maximale de 3 Ko (Figure S2). Aucun changement n’a été observé pour l’amplicon de l’ADNss, ce qui correspond à un manque de réticulation du psoralène avec l’ADNss (Figure 5B-D). Il montre également que la procédure d’inversion de réticulation n’endommage pas de manière détectable l’ADN23. La récupération de l’amplicon de chimère DLC, qui contient un segment d’ADNds réticulé ligaturé à un segment ds-ssDNA non réticulé (50 pb et 118 pb/nt ; Graphique 5A) était intermédiaire à celui des amplicons dsDNA et ssDNA, avec une amélioration de 8 fois de la récupération (Figure 5B,C). L’inversion de la réticulation n’a pas affecté les niveaux relatifs des deux amplicons d’ADNds, le contrôle de ligature intramoléculaire restant dans la plage de 0,2 à 0,25 par rapport au contrôle de l’ADN génomique (Figure 5E). Cependant, il a modifié la quantité relative de l’amplicon ssDNA par rapport au contrôle de l’ADN génomique dsDNA d’un excès de 40 fois à 0,5 fois attendu pour un ssDNA par rapport à un modèle dsDNA (Figure 5D). De même, le signal DLC partiellement ssDNA a diminué de 6,6 x 10−2 à 6,6 x 10−3 par rapport aux témoins de ligature intramoléculaire dsDNA (Figure 5F). Cela nous amène à estimer le nombre de molécules articulaires de la boucle D chez un donneur interchromosomique détecté par cette approche 4 h après l’induction DSB à une moyenne de 1,3% du total des molécules cassées dans la population cellulaire. De telles estimations absolues n’ont pas pu être faites avec une distorsion de l’ADNds basée sur le psoralène et l’amplification de l’ADNs, ce qui met en évidence la valeur de cette étape supplémentaire d’inversion de la réticulation.

Figure 1
Figure 1 : Sous-voies de recombinaison et de résolution homologues. Suite à des dommages à l’ADN qui entraînent un DSB à une ou deux extrémités (illustré) ou un écart d’ADNss, la résection de 5' à 3' des extrémités de l’ADN révèle des surplombs d’ADNss 3' sur lesquels le filament Rad51 se forme, aidé par ses facteurs accessoires. Rad51 recherche ensuite dans le génome un ADN duplex intact (c’est-à-dire le donneur) sur lequel modéliser l’événement de réparation. Ce processus aboutit à l’invasion de brins d’ADN, dans laquelle la base Watson-Crick brisée s’apparie avec le brin complémentaire du donneur d’ADN double brin, déplaçant le brin opposé et formant la boucle D naissante. Cette boucle D peut être inversée pour permettre à la recherche d’homologie Rad51 de sélectionner un donneur différent ou étendue par une ADN polymérase pour remplacer les bases perdues lors de l’événement de dommages à l’ADN. Trois sous-voies HR sont disponibles pour résoudre cet intermédiaire de boucle D étendu dans un produit. Tout d’abord, la boucle D étendue peut être perturbée par une hélicase, ce qui permet à l’extrémité nouvellement étendue de la rupture de recuit jusqu’à la deuxième extrémité dans un processus appelé recuit de brin dépendant de la synthèse (SDSA). La synthèse et la ligature de l’ADN de remplissage conduisent ensuite à la formation du produit. Alternativement, la deuxième extrémité de la rupture peut recuit le brin donneur déplacé, formant une jonction double Holliday (dHJ). La résolution nucléolytique du dHJ entraîne soit un croisement (CO) ou un non-croisement (NCO), tandis que la dissolution du dHJ (non représentée) n’aboutit qu’à des produits NCO. Enfin, le fait de ne pas engager la deuxième extrémité de l’ORD entraîne une réplication induite par rupture (BIR), un processus mutagène dans lequel des milliers de paires de bases sont copiées du donneur sur le brin brisé. Ce processus peut s’étendre jusqu’à la fourche de réplication convergente ou à l’extrémité du chromosome. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Prémisse des tests de capture de boucle D (DLC), d’extension de boucle D (DLE) et de formation de produit de réplication induite par rupture (BIR). La formation de DSB est entraînée par une endonucléase spécifique au site sous le contrôle du promoteur GAL1. L’induction DSB conduit à la formation d’une boucle D naissante. Dans le test DLC, la réticulation inter-brin de l’ADN préserve cette structure, qui est ensuite extraite. La restauration du site enzymatique de restriction est réalisée par hybridation avec un long oligonucléotide, puis l’ADN est digéré et ligaturé pour former un produit qui peut être quantifié par PCR quantitative (qPCR). Le test DLE diffère en ce que l’ADN n’est pas réticulé, et au lieu de cela, le produit de ligature intramoléculaire se forme entre les deux extrémités de l’ADNss d’un côté de la cassure, l’extrémité 3' ayant été prolongée par une ADN polymérase. La qPCR est à nouveau utilisée pour quantifier la formation du produit de ligature chimérique. La détection de l’extension de la boucle D via le test DLE nécessite également une restauration du site enzymatique de restriction. En revanche, le produit BIR double brin est détecté à l’aide des amorces du test DLE sans les oligonucléotides hybridants. R indique qu’un site enzymatique de restriction est compétent pour le clivage enzymatique; (R) indique un site enzymatique de restriction qui ne peut pas être coupé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Résultats représentatifs de l’analyse DLC des boucles D 2 h après l’induction DSB. Les échantillons ont été recueillis, préparés et analysés par qPCR comme décrit dans ce protocole. Les symboles bleus représentent les résultats pour la souche type sauvage standard avec oligos hybridants pour n = 3. Les symboles verts représentent les résultats pour la souche de type sauvage sans oligos hybridants pour n = 3. La ligne rouge épaisse montre la médiane. Les symboles violets représentent des échantillons sans réticulation psoralène mais avec oligos hybridants pour n = 2. Les symboles indiquent que les échantillons proviennent de la même culture. Les différences interexpérimentales dans l’efficacité de la réticulation peuvent introduire de la variabilité dans certains contrôles qPCR, mais ne sont pas problématiques tant qu’il n’y a pas de variabilité inter-échantillon dans ces contrôles qPCR au sein d’une expérience. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Résultats représentatifs de l’analyse du test DLE 6 h après l’induction DSB. Les échantillons ont été recueillis, préparés et analysés par qPCR comme décrit dans ce protocole. Les symboles bleus représentent les résultats pour la souche type sauvage standard avec oligos hybridants pour n = 3. Les symboles verts représentent les résultats pour la souche de type sauvage sans oligos hybridants pour n = 3. La ligne rouge épaisse montre la médiane. Notez que les échantillons d’oligos avec et sans hybridation proviennent des mêmes cultures. Le diamant violet représente un échantillon échoué sans oligos hybridants pour n = 1. Les symboles indiquent que les échantillons proviennent de la même culture. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Résultats représentatifs de l’inversion de la réticulation du psoralène. (A) Les mono-adduits psoralène-ADN (*) et les liaisons croisées inter-brins (X) se produisent spécifiquement sur l’ADNds et empêchent son amplification par les ADN polymérases, contrairement aux modèles d’ADNss. Cette différence introduit un biais dans la quantification des modèles contenant de l’ADNds et de l’ADNss par qPCR. Ce biais peut être surmonté lors de l’inversion de la réticulation psoralène. (B) Valeurs représentatives de Cp de l’ADNds (génomique, ligature), de l’ADNss et des amplicons mixtes d’ADNs-ss (DLC) obtenus 4 h après l’induction DSB. Les données représentent les valeurs individuelles et la médiane de quatre réplications biologiques. (C) Récupération par amplification lors de l’inversion de la réticulation, calculée à partir des valeurs Cp indiquées en (B). (D) L’amplification de l’ADNss par rapport au contrôle génomique de l’ADNds avec et sans inversion de réticulation du psoralène. Lors de l’inversion, l’amplicon ssDNA s’amplifie au 0,5 attendu du contrôle dsDNA génomique. (E) Le contrôle de ligature intramoléculaire de l’ADNdsd par rapport au contrôle génomique de l’ADNds avec et sans inversion de réticulation du psoralène. (F) Le signal DLC relatif au contrôle de la ligature de l’ADNds. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Système actuel d’essais DLC/DLE et modifications proposées. Ci-dessus : Le site actuel de rupture du test DLC/DLE et le donneur sont indiqués. Ci-dessous : Modifications prévues au site de rupture du test DLC/DLE et au donneur. (I) Le site de coupe de l’endonucléase HO de 117 pb est indiqué en jaune. Pour éviter les effets de confusion lors de la surveillance de la perturbation de la boucle D, le côté gauche du HOcs (74 pb) sera introduit dans le donneur, de sorte que la recombinaison entre les deux crée une boucle D parfaitement adaptée sans volet de 3'. (II) Pour rendre le système réparable et, par conséquent, plus physiologique, de l’ADN homologue au donneur (indiqué en sarcelle et lilas) sera inséré dans le côté droit des HOcs. (III) L’invasion et l’extension par le brin à droite des HOcs seront surveillées à l’aide de séquences uniques à ce côté de la cassure (indiquées en orange). (IV) Des sites et séquences enzymatiques de restriction supplémentaires uniformément espacés uniques au donneur permettront de surveiller l’extension de la boucle D (via l’invasion du côté gauche des HOcs) à des sites plus éloignés. Dans ce système modifié, le recuit de brins dépendant de la synthèse (SDSA) ou la formation de jonction de Holliday double (dHJ) peut se produire aux sites représentés en sarcelle ou en lilas. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire S1 : Carte des amorces qPCR utilisées dans les tests DLC et DLLE. Carte des loci génomiques utilisés pour l’analyse dans les tests DLC et DLLE, leurs caractéristiques pertinentes et les sites approximatifs de liaison de l’amorce (voir le tableau 3 pour une liste des amorces qPCR). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S2 : Évaluation qualitative de l’inversion de réticulation sur de grands amplicons. L’ADN génomique a été préparé à partir d’échantillons réticulés ou non réticulés, lorsque cela est indiqué, comme décrit dans les sections 1 à 5 du protocole. La PCR non quantitative a été utilisée pour amplifier le segment de 3 kbp couvrant la région d’homologie partagée entre le site de rupture et le donneur. Il convient de noter qu’en raison des différences d’efficacité d’amplification entre l’ADN réticulé et non réticulé et de la quantité limitée d’échantillon, il n’a pas été possible de normaliser l’ADN d’entrée. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau 1 : Souche de S. cerevisiae utilisée pour l’analyse des DLC et des DLE. Génotype de la souche de levure bourgeonnante haploïde utilisée dans cette étude. La souche est disponible sur demande. D’autres souches disponibles pour l’analyse DLC/DLE peuvent être trouvées dans Piazza et al.8 et Piazza et al.9. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Oligonucléotides hybridants utilisés pour l’analyse des DLC et des DLE. Les séquences des longs oligonucléotides hybridants utilisés dans les essais DLC et DLE. Une purification SDS-PAGE supplémentaire des oligonucléotides hybridants par le fournisseur d’oligonucléotides personnalisé est recommandée. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 3 : amorces qPCR utilisées pour l’analyse DLC et DLLE. Les paires d’amorces qPCR pour les tests DLC et DLE et les descriptions de leurs objectifs. Notez que olWDH1764, olWDH2009 et olWDH2010 sont utilisés dans deux qPCR. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire S1 : Modèle pour la configuration et l’analyse de la qPCR pour le dosage DLC. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire S2 : Modèle pour la configuration et l’analyse de la qPCR du test DLE. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Fichiers de séquences supplémentaires 1 à 5. Fichiers de séquences supplémentaires pour les caractéristiques génomiques et les amplicons pertinents. Les fichiers de séquence sont au format de fichier ApE; ApE est un logiciel disponible gratuitement pour visualiser et éditer des séquences d’ADN. Les fichiers ApE sont également compatibles avec tous les principaux logiciels d’édition de séquences. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Les tests présentés permettent de détecter les boucles D naissantes et étendues (test DLC), l’extension de la boucle D (test DLLE) et la formation de produits BIR (test DLE sans oligonucléotides hybridants) en utilisant la ligature de proximité et la qPCR. ChIP-qPCR de Rad51 vers des sites éloignés du DSB a déjà été utilisé comme proxy pour la recherche d’homologie médiée par Rad51 et la formation de boucles D. Cependant, ce signal ChIP-qPCR est indépendant de l’homologie de séquence entre le site de rupture et un donneur potentiel, ainsi que du facteur Rad54 associé à Rad51, et est donc plus susceptible de représenter une association transitoire entre le filament Rad51-ssDNA et l’ADNds plutôt qu’un intermédiaire de boucle D10,11. En revanche, le signal DLC dépend de la formation DSB, Rad51, Rad52, Rad54 et de l’homologie de séquence partagée entre le DSB et le site donneur testé8. De plus, une augmentation des signaux DLC est observée en l’absence des hélicases Mph1 et Srs2 et du complexe hélicas-topoisomérase Sgs1-Top3-Rmi1, ce qui concorde avec les rapports précédents selon lesquels ces trois facteurs peuvent désassembler les boucles D naissantes fabriquées par Rad51/Rad54 in vitro 8,25,26,27. Le test DLE représente également une amélioration par rapport aux méthodes précédentes pour suivre la synthèse d’ADN associée à la recombinaison, car il peut faire la distinction entre l’extension de la boucle D et la formation de produits BIR19.

Comme indiqué ci-dessus, les contrôles qPCR, y compris ceux de l’ADN génomique, de l’induction DSB, de la réticulation du psoralène, de la ligature intramoléculaire et de l’hybridation des oligonucléotides, sont essentiels au succès et à la reproductibilité de ces essais. Les valeurs qPCR de l’ADN génomique brut devraient être approximativement équivalentes d’un échantillon à l’autre. De faibles valeurs de Cp pour le contrôle de l’ADN génomique ARG4 indiquent un excès d’ADN, et le nombre de cellules collectées doit être ajusté. Des valeurs élevées de Cp pour ce contrôle indiquent une récupération insuffisante de l’ADN ou une contamination par des réactifs qui interfèrent avec la qPCR. Après le sphéroplasting, la lyse cellulaire peut être observée à l’aide d’un microscope optique standard et de volumes égaux d’échantillon et d’eau stérile. Si une lyse insuffisante est observée lors de l’ajout d’eau, la solution de zymolyase doit être refaite ou l’incubation à 30 °C doit être prolongée. L’échantillon peut également être perdu ou des contaminants introduits lors de la purification de l’ADN par extraction P/C/AI. Pour une récupération efficace de l’ADN, il faut s’assurer que le pH du P/C/IA a été ajusté à ~8,0 et que la phase inférieure n’est pas perturbée lors de l’élimination de la phase supérieure. Enfin, une remise en suspension inefficace de la pastille d’ADN dans 1x TE peut entraîner de faibles valeurs de Cp. Une incubation plus longue à 37 °C et un vortex amélioreront la remise en suspension de la pastille d’ADN.

En plus du contrôle de l’ADN génomique de l’ADN, les réactions de contrôle de l’induction et du clivage enzymatique de restriction DSB devraient également être similaires d’un échantillon à l’autre. L’endonucléase HO ou la coupe de l’enzyme de restriction au site du DSB ou du site de reconnaissance de l’enzyme de restriction empêche l’amplification dans cette région; par conséquent, les valeurs typiques de qPCR normalisées pour ces témoins sont proches de zéro, et une valeur de qPCR élevée indique un clivage insuffisant. Si un signal élevé est observé sur le site du DSB, la solution de galactose doit être refaite. Pour les mutants présentant un défaut connu du cycle cellulaire, l’induction du DSB doit être quantifiée en placant des quantités égales de culture cultivées conformément au protocole (voir rubrique 1) sur des milieux YPDA et YPA supplémentés en galactose. Les colonies qui se développent sur des milieux contenant du galactose représentent des levures dans lesquelles l’assemblage final a créé un HOcs onctutable. S’il y a significativement plus d’événements de jonction terminale dans un mutant d’intérêt par rapport au type sauvage, une correction doit être appliquée pour compenser cette différence dans l’induction DSB, ce qui affectera le signal DLC/DLLE.

Trois paires d’amorces (olWDH1764/olWDH1768, olWDH2010/olWDH2012 et olWDH2009/olWDH2011) évaluent la restauration du site enzymatique de restriction par les oligos hybridants et la coupe par les enzymes de restriction EcoRI-HF et HindIII-HF. De plus, les contrôles de ligature intramoléculaire dépendent également d’une digestion enzymatique de restriction adéquate. Ainsi, un échantillon avec une faible efficacité de ligature intramoléculaire et un signal élevé pour l’une de ces trois paires d’amorces a une coupe enzymatique de restriction insuffisante. Une enzyme de restriction supplémentaire doit être fournie dans les préparations ultérieures et l’efficacité de l’enzyme de restriction doit être évaluée sur l’ADN génomique. La paire d’amorces olWDH1769/olWDH1763 représente un contrôle supplémentaire pour le test DLC, qui mesure le clivage EcoRI à DAP2, où l’efficacité de la ligature intramoléculaire est également mesurée. Un échantillon avec un signal de ligature intramoléculaire adéquat mais un signal élevé pour l’une de ces trois paires d’amorces a une restauration inadéquate du site enzymatique de restriction par les oligos hybridants. Pour résoudre ce problème, des échantillons en double devraient être prélevés et la concentration de l’oligo ou des oligo-éléments hybridants touchés devrait varier. Les valeurs typiques de qPCR obtenues pour ces réactions avec et sans oligos hybridants peuvent être trouvées dans les figures 3 et 4 et dans Piazza et al.8 et Piazza et al.9.

Pour le DLC et le test DLLE, une efficacité de ligature intramoléculaire de 0,15-0,35 telle que normalisée au contrôle de l’ADN génomique est considérée comme normale. Comme la détection des boucles D naissantes et étendues et du produit BIR dépend d’une ligature efficace, les échantillons avec des signaux de ligature faibles doivent être jetés. Le tampon de ligature 10x dépourvu d’ATP doit être conservé à 4 °C pendant 6 mois au maximum. La collecte d’un trop grand nombre de cellules peut entraîner une ligature intermoléculaire, ce qui entraînera une faible efficacité de la ligature intramoléculaire et un signal DLC / DLLE.

Bien que ces contrôles pour les tests DLC et DLE rendent compte de presque toutes les étapes sensibles, il est toujours possible d’obtenir des valeurs non physiologiques pour le signal DLC ou DLE lorsque ces contrôles se situent dans la plage appropriée. Un faible signal DLC ou DLE peut résulter d’erreurs dans l’étape de sphéroplasting cellulaire, qui est extrêmement sensible. Il ne faut traiter que quelques échantillons en parallèle et les maintenir à 4 °C en tout temps. Un signal DLC/DLE élevé/faible peut également résulter de la collecte d’un trop grand nombre ou d’un petit nombre de cellules à chaque point temporel. Ce problème peut être résolu en collectant plusieurs OD600s de cellules à chaque point temporel pour chaque échantillon.

Il existe plusieurs limites techniques et conceptuelles aux tests DLC et DLE dans leur forme actuelle. Tout d’abord, la densité de réticulation interbrin médiée par le psoralène est de ~1 sur 500 pb8. Par conséquent, une augmentation du signal DLC peut soit indiquer qu’il y a plus de boucles D dans la population, que la longueur moyenne des boucles D dans la population a augmenté (en supposant que les boucles D peuvent être inférieures à 500 pb), ou les deux. De plus, la probabilité qu’une boucle D soit capturée par le test DLC diminue avec la diminution de la longueur de la boucle D. Étant donné que les boucles D très courtes peuvent représenter une fraction importante de la population totale de boucles D dans certains milieux mutants, cette limitation de l’essai doit être prise en compte lors de l’interprétation des résultats. Deuxièmement, le test DLC nécessite une réticulation de l’ADN, contrairement au test DLLE. Auparavant, pour une expérience donnée, cela signifiait que les échantillons DLC et DLE devaient être collectés et analysés séparément. La méthode illustrée à la figure 5 permet d’obtenir une inversion robuste de la réticulation, ce qui réduit le besoin de prélever plusieurs échantillons de la même culture. L’introduction d’un deuxième site enzymatique de restriction EcoRI sur le brin brisé, en aval du site de reconnaissance HindIII, permettra une analyse séquentielle DLC et DLLE.

En plus de ces limitations techniques, le système de dosage DLC et DLE ne permet actuellement pas la récupération de produits HR viables parce que le côté droit du DSB inductible n’a pas d’homologie avec le donneur. Pour mieux comprendre la cinétique et le mécanisme de l’engagement et de la synthèse de la deuxième extrémité, le système pourrait être modifié de manière à ce qu’une réparation à l’aide d’une région d’homologie proximale ou distale partagée entre la deuxième extrémité de la rupture et le donneur soit réalisable (Figure 6). À l’avenir, il pourrait s’avérer judicieux de combiner les tests DLC et DLE avec d’autres technologies, telles que ChIP-qPCR, la capture de conformation chromosomique à haut débit (Hi-C) et la cartographie in vivo de la boucle D, afin de réaliser une analyse complète de la cinétique et de la régulation des étapes de la voie HR, y compris la formation de cassures, la résection terminale, la formation de filaments Rad51, la formation naissante de boucles D, Extension de boucle D, inversion de boucle D, engagement de deuxième extrémité, synthèse de deuxième extrémité et résolution28.

En résumé, les tests DLC et DLE permettent de quantifier les boucles D naissantes et étendues, l’extension de la boucle D et la formation de produits BIR en utilisant le principe de la ligature de proximité. Ces tests représentent des avancées majeures dans le domaine, car ils sont les premiers à permettre la mesure semi-quantitative de la formation et de l’extension de la boucle D indépendamment de la viabilité cellulaire.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les travaux du laboratoire Heyer sont soutenus par les subventions GM58015 et GM137751 à W.-D.H. La recherche dans le laboratoire Piazza est soutenue par le Conseil européen de la recherche (ERC-StG 3D-loop, grand accord 851006). D.R. est soutenu par T32CA108459 et la Fondation A.P. Giannini. Nous remercions Shih-Hsun Hung (Heyer Lab) d’avoir partagé ses résultats de test DLC/DLE et d’avoir validé les modifications apportées aux tests détaillés dans ce protocole.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Pre-growth, DSB induction, and sample collection
Equipment
15 and 50 mL conical tubes
15 mL glass culture tubes
250 mL, 500 mL, or 1 L flasks
60 mm x 15 mm optically clear petri dishes with flat bottom Suggested: Corning, Catalog Number 430166; or Genesee Scientific, Catalog Number 32-150G
Benchtop centrifuge with 15 and 50 mL conical tube adapters
Benchtop orbital shaker or tube rotator/revolver
Rotator
UV crosslinker or light box with 365 nm UV bulbs set atop an orbital shaker Suggested: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) or Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Catalog Number 611110831
Materials
60% w/w sodium DL-lactate syrup Sigma-Aldrich L1375 For media preparation
Agar Fisher BP1423500 For media preparation
Bacto peptone BD Difco 211840 For media preparation
Bacto yeast extract BD Difco 212750 For media preparation
D-(+)-glucose BD Difco 0155-17-4 For media preparation
Trioxsalen Sigma-Aldrich T6137 For psoralen cross-linking
2. Spheroplasting, lysis, and restriction enzyme site restoration
Supplies
1.5 mL microcentrifuge tubes
Dry bath
Liquid nitrogen or dry ice/ethanol
Refrigerated microcentrifuge or microcentrifuge
Materials
10X restriction enzyme (CutSmart) buffer (500 mM potassium acetate, 200 mM Tris-acetate, 100 mM magnesium acetate, 1 mg/mL BSA, pH 7.8-8.0)
Zymolyase 100T US Biological Z1004 For spheroplasting
3. Restriction enzyme digest and intramolecular ligation
Supplies
Water bath
Materials
EcoRI-HF New England Biolabs R3101 Restriction enzyme digest for DLC assay
HindIII-HF New England Biolabs R3104 Restriction enzyme digest for DLE assay
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202 Intramolecular ligation
4. DNA purification
Supplies
1.5 and 2 mL microcentrifuge tubes
Materials
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (P/C/IA) at 25:24:1 Sigma-Aldrich P2069 DNA purification
5. Psoralen cross-link reversal
Supplies
Thermocycler/PCR machine
6. qPCR
Supplies
Lightcycler 480 Roche 5015278001 qPCR machine used by the authors
Lightcycler 96 Roche 5815916001 qPCR machine used by the authors
Materials
LightCycler 480 96-Well Plate, white Roche 4729692001 96-well plates for qPCR
SsoAdvanced Universal SYBR Green Super Mix BioRad 1725271 qPCR kit used by the authors
SYBR Green I Master Mix Roche 4707516001 qPCR kit used by the authors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual Review of Genetics. 45 (1), 247-271 (2011).
  2. Heyer, W. -D. Regulation of recombination and genomic maintenance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), 016501 (2015).
  3. Mimitou, E. P., Symington, L. S. Sae2, Exo1 and Sgs1 collaborate in DNA double-strand break processing. Nature. 455 (7214), 770-774 (2008).
  4. Bzymek, M., Thayer, N. H., Oh, S. D., Kleckner, N., Hunter, N. Double Holliday junctions are intermediates of DNA break repair. Nature. 464 (7290), 937-941 (2010).
  5. Chen, H., Lisby, M., Symington, L. S. RPA coordinates DNA end resection and prevents formation of DNA hairpins. Molecular Cell. 50 (4), 589-600 (2013).
  6. Mazón, G., Symington, L. S. Mph1 and Mus81-Mms4 prevent aberrant processing of mitotic recombination intermediates. Molecular Cell. 52 (1), 63-74 (2013).
  7. Saini, N., et al. Migrating bubble during break-induced replication drives conservative DNA synthesis. Nature. 502 (7471), 389-392 (2013).
  8. Piazza, A., et al. Dynamic processing of displacement loops during recombinational DNA repair. Molecular Cell. 73 (6), 1255-1266 (2019).
  9. Piazza, A., Koszul, R., Heyer, W. -D. A proximity ligation-based method for quantitative measurement of D-loop extension in S. cerevisiae. Methods in Enzymology. 601, 27-44 (2018).
  10. Sugawara, N., Wang, X., Haber, J. E. In vivo roles of Rad52, Rad54, and Rad55 proteins in Rad51-mediated recombination. Molecular Cell. 12 (1), 209-219 (2003).
  11. Renkawitz, J., Lademann, C. A., Kalocsay, M., Jentsch, S. Monitoring homology search during DNA double-strand break repair in vivo. Molecular Cell. 50 (2), 261-272 (2013).
  12. Petukhova, G., Stratton, S., Sung, P. Catalysis of homologous DNA pairing by yeast Rad51 and Rad54 proteins. Nature. 393 (6680), 91-94 (1998).
  13. Wright, W. D., Heyer, W. -D. Rad54 functions as a heteroduplex DNA pump modulated by its DNA substrates and Rad51 during D-loop formation. Molecular Cell. 53 (3), 420-432 (2014).
  14. Tavares, E. M., Wright, W. D., Heyer, W. -D., Cam, E. L., Dupaigne, P. In vitro role of Rad54 in Rad51-ssDNA filament-dependent homology search and synaptic complexes formation. Nature Communications. 10 (1), 4058 (2019).
  15. Crickard, J. B., Moevus, C. J., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. Rad54 drives ATP hydrolysis-dependent DNA sequence alignment during homologous recombination. Cell. 181 (6), 1380-1394 (2020).
  16. Lydeard, J. R., Jain, S., Yamaguchi, M., Haber, J. E. Break-induced replication and telomerase-independent telomere maintenance require Pol32. Nature. 448 (7155), 820-823 (2007).
  17. Jain, S., et al. A recombination execution checkpoint regulates the choice of homologous recombination pathway during DNA double-strand break repair. Genes & Development. 23 (3), 291-303 (2009).
  18. Donnianni, R. A., Symington, L. S. Break-induced replication occurs by conservative DNA synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13475-13480 (2013).
  19. Liu, L., et al. Tracking break-induced replication shows that it stalls at roadblocks. Nature. 590 (7847), 655-659 (2021).
  20. Liu, L., Sugawara, N., Malkova, A., Haber, J. E. Determining the kinetics of break-induced replication (BIR) by the assay for monitoring BIR elongation rate (AMBER). Methods in Enzymology. 661, 139-154 (2021).
  21. Pham, N., et al. Mechanisms restraining break-induced replication at two-ended DNA double-strand breaks. The EMBO Journal. 40 (10), 104847 (2021).
  22. Cimino, G. D., Gamper, H. B., Isaacs, S. T., Hearst, J. E. Psoralens as photoactive probes of nucleic acid structure and function: Organic chemistry, photochemistry, and biochemistry. Annual Review of Biochemistry. 54 (1), 1151-1193 (1985).
  23. Yeung, A. T., Dinehart, W. J., Jones, B. K. Alkali reversal of psoralen cross-link for the targeted delivery of psoralen monoadduct lesion. Biochemistry. 27 (17), 6332-6338 (1988).
  24. Shi, Y. B., Spielmann, H. P., Hearst, J. E. Base-catalyzed reversal of a psoralen-DNA cross-link. Biochemistry. 27 (14), 5174-5178 (1988).
  25. Prakash, R., et al. Yeast Mph1 helicase dissociates Rad51-made D-loops: Implications for crossover control in mitotic recombination. Genes & Development. 23 (1), 67-79 (2009).
  26. Liu, J., et al. Srs2 promotes synthesis-dependent strand annealing by disrupting DNA polymerase δ-extending D-loops. eLife. 6, 22195 (2017).
  27. Fasching, C. L., Cejka, P., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. -D. Top3-Rmi1 dissolve Rad51-mediated D loops by a topoisomerase-based mechanism. Molecular Cell. 57 (4), 595-606 (2015).
  28. Shah, S. S., Hartono, S. R., Chédin, F., Heyer, W. -D. Bisulfite treatment and single-molecule real-time sequencing reveal D-loop length, position, and distribution. eLife. 9, 59111 (2020).

Tags

Génétique numéro 187 boucle D stabilité du génome molécule articulaire Rad51 réplication induite par la rupture
Détection d’intermédiaires de recombinaison homologues <em>par</em> ligature de proximité et PCR quantitative chez <em>Saccharomyces cerevisiae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Reitz, D., Savocco, J., Piazza, A.,… More

Reitz, D., Savocco, J., Piazza, A., Heyer, W. D. Detection of Homologous Recombination Intermediates via Proximity Ligation and Quantitative PCR in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (187), e64240, doi:10.3791/64240 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter