Summary
D环捕获（DLC）和D环延伸（DLE）测定利用邻近连接原理与定量PCR一起量化酿 酒酵母中诱导双链断裂部位的D环形成，D环延伸和产物形成。
Abstract
在细胞周期的S期和G2期发生的DNA损伤，包括DNA双链断裂和链间交联，可以通过同源重组（HR）进行修复。此外，HR是停滞或崩溃后复制分叉救援的重要机制。对这种复杂途径的许多可逆和不可逆步骤的调节促进了其保真度。对HR期间形成的重组中间体的物理分析能够通过各种核蛋白因子及其相互作用物来表征这些对照。尽管有成熟的方法来分析重组途径中的特定事件和中间体，但直到最近，检测D环形成和延伸（该途径中的两个关键步骤）已被证明具有挑战性。本文描述了检测酿酒酵母中HR途径中关键事件的有效方法，即DNA双链断裂形成，D环形成，D环延伸以及通过断裂诱导复制（BIR）形成产物。这些检测以高灵敏度检测其相关的重组中间体和产物，并且与细胞活力无关。D 环、D 环延伸和 BIR 产物的检测基于邻近连接。总之，这些测定允许在群体水平上研究HR的动力学，以精细解决HR蛋白和调节因子在途径中重要步骤的功能。
Introduction
同源重组（HR）是修复DNA双链断裂（DSB）、链间交联和ssDNA间隙的高保真机制，也是DNA损伤耐受性的途径。HR不同于容易出错的DNA损伤修复/耐受途径，例如非同源末端连接（NHEJ）和跨病变合成，因为它利用完整的同源双链DNA作为供体来模板修复事件。此外，HR途径中的许多关键中间体是可逆的，可以对各个途径步骤进行精细调节。在细胞周期的S，G2和M阶段，HR与NHEJ竞争修复两端DSB1。此外，HR对于DNA复制至关重要，用于修复与复制相关的DNA损伤，包括ssDNA间隙和单侧DSB，以及作为DNA损伤旁路的机制2。
HR通路中的一个关键中间体是位移环或D环（图1）。末端切除后，反应中的中心重组酶Rad51加载到新切除的破碎分子的ssDNA上，形成螺旋丝2。然后，Rad51进行同源搜索以鉴定合适的同源供体，通常是体细胞中的姐妹染色单体。当Rad51-ssDNA细丝侵入同源双链DNA时，形成D环，这导致断裂链与供体互补链的Watson-Crick碱基配对，取代相反的供体链。通过DNA聚合酶延伸断裂链的3'端，取代在DNA损伤事件中丢失的碱基，并通过合成依赖性链退火（SDSA），双霍利迪连接（dHJ）或断裂诱导复制（BIR）HR亚途径促进延伸的D环中间体分解为dsDNA产物。
物理监测HR途径中间体的测定允许分析每个步骤的遗传要求（即途径分析）。通过 Southern 印迹3，4，5，6，7 很容易观察到 DSB 形成、末端切除、dHJ、BIR 复制气泡和 HR 产物。然而，Southern 印迹未能报告新生和扩展的 D 环，因此，需要一种可靠地测量这些关节分子的替代方法4，8，9。分析新生D环形成的一种广泛使用的策略是Rad51的染色质免疫沉淀（ChIP）与定量PCR（qPCR）10，11相结合。然而，通过 ChIP-qPCR 测量的 Rad51 与 dsDNA 的关联与序列同源性和 Rad51 附属因子 Rad5410，11 无关。相反，使用此处介绍的D环分析方法（称为D环捕获（DLC）测定）的可观信号取决于DSB形成，序列同源性，Rad51以及Rad51辅助蛋白Rad52和Rad548。酿酒酵母Rad51促进的D环形成依赖于体内Rad54的发现与许多体外重建实验一致，表明Rad54是出芽酵母Rad518，12，13，14，15的同源搜索和D环形成所必需的。
目前测量D环延伸的方法，主要是通过半定量PCR，也存在类似的问题。用于检测 D 环延伸的典型基于 PCR 的测定通过断裂链上同源区域上游的引物和供体链上同源区域下游的另一个引物扩增由断裂位点和异位供体供体之间的重组以及随后的重组相关 DNA 合成产生的独特序列。使用这种方法，重组相关DNA合成的检测需要非必需的Pol δ合成能力因子Pol3216。这一发现与POL32缺失对体内基因转化仅有轻微影响的观察结果相矛盾17。此外，这些基于PCR的测定无法暂时解析D环延伸和BIR产物形成，这表明信号来自dsDNA产物而不是ssDNA中间体17，18，19。最近开发了D环延伸（DLE）测定来解决这些差异。DLE测定定量了初始3'入侵端9下游~400个碱基对（bp）位点的重组相关DNA合成。通过这种方法，D环延伸与Pol32无关，并且在DSB诱导后4小时内可检测到，而BIR产物在6小时首次观察到。事实上，Haber和Malkova实验室最近的一篇出版物指出，使用这种方法制备基因组DNA可以单独导致ssDNA保存9，20。
在这里，详细介绍了DLC和DLE测定。这些测定依靠邻近连接来检测 酿酒酵母 中的新生和扩展的D环（图2）8，9。BIR产物可以使用相同的检测系统进行定量。对于这两种测定，位于染色体（Chr.） V上 URA3 位点的HO核酸内切酶切割位点的DSB形成是由半乳糖诱导启动子控制下的HO核酸内切酶表达诱导的。Rad51介导的DNA链侵袭导致位于Chr.II上 LYS2 位点的异位供体部位形成新生的D环。由于DSB的右侧与供体缺乏同源性，因此通过SDSA和dHJ形成 进行 修复是不可行的。通过BIR对DSB进行初始修复是可能的，但是着丝粒21的存在抑制了活产物的形成。这种故意的设计阻止了生产性的DSB修复，从而避免了具有修复DBS的细胞恢复生长，否则可能会在时间过程分析期间超过培养物。
在DLC测定中，补骨脂素交联D环内两条异质双链DNA的补骨脂素交联保留了重组中间体。在断裂（切除）链上的限制性内切酶位点恢复和消化后，交联允许连接同源断裂和供体DNA上游的独特序列。使用qPCR，可以量化每个样品中存在的嵌合DNA分子的水平。在DLE测定中，不需要交联，限制性内切酶位点恢复和消化，然后进行分子内连接，而是将破碎分子的5'端连接到新延伸的3'端。同样，qPCR用于量化每个样品中这种嵌合产物的相对量。在没有限制性内切酶位点恢复的情况下，DLE测定报告D环延伸后形成的BIR（dsDNA）产物的相对水平。
显示了使用野生型菌株的每种测定的代表性结果，并且读者参考Piazza等人8和Piazza等人9，以使用这些测定分析重组突变体8，9。这项贡献的目的是使其他实验室能够采用DLC和DLE检测，并可根据要求提供支持。
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Protocol
1. 预生长、DSB 诱导和样品采集
注意：建议所有培养基补充0.01%腺嘌呤用于腺苷菌株。
- 在酵母蛋白胨葡萄糖腺嘌呤（YPDA）（1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%琼脂，0.001%腺嘌呤）上划出适当的单倍体菌株（见 表1），并在30°C下生长2天。
- 使用单个菌落在 15 mL 玻璃培养管中接种 5 mL YPDA。将培养物培养至30°C饱和，振荡或旋转进行曝气。
- DLC 测定：将补骨脂素溶解在用铝箔包裹的 50 mL 锥形管中过夜，在室温下连续振荡或倒置，在通风橱中制备 5x 补骨脂素储备溶液（0.5 mg/mL 三氧杂素在 200 证明乙醇中）。用透明薄膜密封螺丝顶部以防止蒸发。每 50 mL 锥形管中不要制备超过 7 mL 的 5x 补骨脂素储备溶液，以确保补骨脂素正确溶解。
- 第二天，使用 5 mL 生长的过夜培养物将 50-100 mL YEP-乳酸（1% 酵母提取物、2% 蛋白胨、2% w/w 乳酸、0.001% 腺嘌呤）接种在适当大小的烧瓶中（出芽酵母在至少是培养物体积 5 倍的烧瓶中生长最佳）至 OD600 为 ~0.03。
- 在30°C下以220rpm振荡培养物~16小时。~16小时后，测量培养物的OD600 ，应为~0.5-0.8。不要使用生长不足或过度生长的培养物。
- 对于每个时间点，在锥形管中收集适当体积的细胞并放在冰上。通常，DLC 测定为 1 x 108 个细胞（对于单倍体野生型菌株，在 OD 600 1.0 下培养约 7.5 mL），对于 DLE 测定，这是 5 x 107 个细胞（在 OD600 1.0 下约 2.5 mL 培养）。
- 为确保OD 600值的准确性，请为OD600≥0.2的培养物准备1：5稀释液，以保持OD读数在0.2或更低。对于野生型菌株，DLC分析的最佳时间点在2小时至6小时之间，DLE分析的最佳时间点为4小时至8小时（见图3和图4）。
- 类金刚石检测
- 在每个时间点之前，在通风橱中制备足够的1x补骨脂素溶液（0.1mg / mL三氧杂草素，50 mM Tris-HCl pH 8.0，50 mM EDTA pH 8.0，20%乙醇）用于用箔纸包裹的50 mL锥形管中的所有样品。离开RT。
- 将样品在4°C下以2，500× g 离心5分钟。 将沉淀重悬于通风橱中的 2.5 mL 1x 补骨脂素溶液中，并转移到 60 mm x 15 mm 培养皿中。或者，将沉淀重悬于 2.5 mL TE1 溶液（50 mM Tris-HCl pH 8.0，50 mM EDTA pH 8.0）中，用于无交联对照。
- 交联样品。对于适合长波（365nm）灯泡的UV交联剂，将培养皿放置在UV光源下方1-2cm处，盖子取下在-20°C下预冷的塑料或有机玻璃板上。对于紫外线灯箱，将培养皿直接放在紫外线光源上。将样品暴露10分钟，轻轻摇动。
注意：建议将紫外光源设置在设置为 ~50 rpm 的轨道振动台上。 - 在通风橱中，将样品转移到新的 15 mL 管中。用 2.5 mL TE1 溶液冲洗培养皿并将其添加到试管中。将样品在4°C下以2，500× g 离心5分钟，妥善处理上清液，并将沉淀储存在-20°C.样品可以储存长达1周，然后再进行下一步。
- DLE 检测
- 将样品在4°C下以2，500× g 离心5分钟。 在2.5mL冷TE1溶液中洗涤细胞沉淀，然后重复旋转并将沉淀储存在-20°C。 样品可以储存长达 1 周，然后再进入下一步。
- 对于0小时的样品收集，在加入20%半乳糖之前收集样品。对于随后的时间点，通过在培养物中加入 20% 半乳糖至终浓度为 2% 来诱导 DSB 形成。如上所述收集剩余的样品，沉淀，并相对于DSB诱导后的时间冷冻（即，在加入20%半乳糖后4小时收集4小时样品）。
2. 细胞球体、裂解和限制性位点恢复
- 将样品在冰上解冻。将干浴预热至30°C。
- 将样品重悬于 1 mL 球状缓冲液（0.4 M 山梨糖醇、0.4 M KCl、40 mM 磷酸钠缓冲液 pH 7.2、0.5 mM MgCl2）中，并转移到 1.5 mL 微量离心管中。
- 加入 3.5 μL 酶解酶溶液（2% 葡萄糖，50 mM Tris-HCl pH 7.5，5 mg/mL 酶解酶 100T;17.5 μg/mL 酶解酶终浓度）。通过敲击或倒置轻轻混合。在30°C孵育15分钟，然后放在冰上。在15分钟孵育期间，获得液氮或干冰。
- 在4°C下以2，500× g 离心3分钟，并将样品放在冰上。在 1 mL 球状喷涂缓冲液中洗涤样品 3 次。将样品在4°C下以2，500× g 离心3分钟。
- 将样品重悬于1mL冷的1x限制性内切酶缓冲液（50mM乙酸钾，20mM乙酸三酯，10mM乙酸镁，室温下100μg/ mL BSA pH ~8.0）中，并在4°C下以16，000× g 离心3分钟。 将样品放在冰上。重复洗涤1次。
- 将样品重悬于 1 mL 冷 1x 限制性内切酶缓冲液中。将样品（每个 0.5 mL）拆分到两个 1.5 mL 微量离心管中。将样品在4°C下以16，000× g 离心3分钟。
- 将每个样品中的一根试管重悬于180 μL 1.4x限制性内切酶缓冲液中，含杂交寡核苷酸（见 表2），将一管重悬于180 μL 1.4x限制性内切酶缓冲液中，不杂交寡核苷酸。将每个杂交寡核苷酸重悬于1x TE（10mM Tris-HCl pH 8.0，1 mM EDTA pH 8.0）中，并以7 nM的终浓度使用。1x TE 取代 1.4x 限制性内切酶缓冲液中的杂交寡核苷酸，无需杂交寡核苷酸。
注意：杂交寡核苷酸必须在工作稀释液下以小等分试样储存在-20°C。杂交寡核苷酸的浓度可能需要优化;请参阅讨论。 - 将样品快速冷冻在液氮或干冰/乙醇中并储存在-80°C。 样品可以在此阶段储存数月。
3. 限制性内切酶消化和分子内连接
- 将样品在冰上解冻。将一个干浴预热至65°C，将另一个预热至37°C。
- 将 36 μL 样品移液到冰上新的 1.5 mL 微量离心管中。立即将剩余样品返回-80°C储存。
- 加入 4 μL 1% SDS（0.1% 终浓度），轻轻敲击试管侧面进行混合。在65°C孵育15分钟，每5分钟轻轻敲击一次。孵育后立即将样品放在冰上。
注意：这种SDS处理在限制性内切酶解和分子内连接步骤之前促进DNA相关蛋白的变性，核包膜的溶解以及染色质的可及性。 - 加入 4.5 μL 10% Triton X-100（1% 终浓度）并通过移液混合。向每个样品中加入20-50U限制性内切酶（EcoRI-HF或 HindIII-HF），并在37°C下孵育1小时，每20-30分钟轻轻搅拌一次。在此期间，将干浴预热至55°C，并将水浴预设为16°C。
- 向每个样品中加入 8.6 μL 10% SDS（1.5% 终浓度），并通过移液和敲击混合。在55°C孵育10分钟。向每个样品中加入 80 μL 10% Triton X-100（6% 终浓度），并通过移液混合。
- 向每个样品中加入 660 μL 不含 ATP 的 1x 连接缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 8.0、10 mM MgCl2、10 mM DTT、2.5 μg/mL BSA）+ 1 mM ATP pH 8.0 + T4 DNA 连接酶（8 U/样品），并通过温和倒置混合。在16°C孵育1.5小时，每30分钟倒置一次。孵育后立即将样品放在冰上。
4. 脱氧核糖核酸纯化
- 将一个干浴预热至65°C，将另一个预热至37°C。 向每个样品（12.5 μg/mL 终浓度）中加入 1 μL 10 mg/mL 蛋白酶 K（在 1x TE pH 8.0 中制备）。在65°C孵育30分钟，并在孵育后立即将样品置于冰上，直到它们冷却。
- 将样品转移到 2 mL 管中。在通风橱中工作，向每个样品中加入等体积（~800μL）的苯酚/氯仿/异戊醇（P/C/IA;PH 8.0）。涡旋样品~30秒，并在微量离心机中以16，000× g 离心样品5-10分钟。
- 小心地将每个样品的 600 μL 上相取出到新的 1.5 mL 管中。正确处理下相和 2 mL 管。
- 通过向每个样品中加入 1/10 体积的 3 M 乙酸钠 pH 5.2 （~60 μL），然后加入 1 体积的异丙醇 （~660 μL） 来沉淀 DNA。将样品倒置5x-10x并在室温下孵育30分钟。
- 将样品放在冰上2分钟，然后在微量离心机中以16，500× g 离心15分钟。将样品放回冰中，倒出上清液，然后用纸巾排干试管。
- 用 200 μL 70% 乙醇洗涤 DNA 沉淀。在4°C下以16，500× g 离心3分钟，将样品放回冰上，倒出上清液，然后用移液管除去残留的酒精。用管盖在37°C下打开15-20分钟干燥样品。
- 通过涡旋将 DNA 沉淀重悬于 50 μL 的 1x TE 中。在室温下孵育30分钟，涡旋，然后在37°C下在干浴中孵育30分钟。再次涡旋样品，然后将它们放在冰上。样品可以在该阶段在-20°C下储存数月，但建议立即进行去交联（仅限DLC）和qPCR步骤。
5. 补骨脂素交联逆转（仅适用于DLC测定）
- 将 9 μL 纯化的 DNA 移液到冰上的 PCR 管中。加入 1 μL 1 M KOH（0.1 M 终浓度）。将样品在90°C下在热循环仪中孵育30分钟。
- 加入 19.73 μL 乙酸钠溶液（0.1 M 乙酸钠、9.6 mM Tris-HCl pH 8.0、1.0 mM EDTA pH 8.0）。样品可以在该阶段在-20°C下储存数月，但建议立即进行qPCR步骤。
6. 定量 PCR、对照和分析
- 使用2 μL纯化的DNA，有或没有交联，根据制造商的说明建立20 μL qPCR反应。将每个反应一式两份设置。对于DLC和DLE测定，有五个对照反应和一个DLC/DLE定量反应，或每个样品总共六个反应，一式两份运行。补充表 S1和补充 表 S2 提供了设置这些反应和分析的模板，qPCR引物的序列列于 表3中。
- 需要针对每个 qPCR 试剂盒优化 qPCR 循环条件。
- 使用以下DLC qPCR条件，具体取决于所使用的qPCR试剂盒：初始变性（95°C3分钟）;50轮扩增（单次采集95°C15秒，61°C25秒，72°C15秒）;熔解曲线分析（95°C5秒，65°C1分钟，97°C连续采集）;和冷却（37°C30秒）。
- 使用以下qPCR条件进行DLE测定：初始变性（95°C5分钟）;50轮扩增（单次采集95°C15秒，60°C30秒，72°C15秒）;熔解曲线分析（95°C5秒，65°C1分钟，97°C连续采集）;和冷却（37°C30秒）。请注意，可能需要针对不同的qPCR机器/试剂盒进行优化。
- 类金刚石检测
- 对照：参见 表3中的qPCR引物列表。引物结合位点图如图 S1所示。有关相关基因组特征和扩增子的补充序列文件，请查看 A 质粒编辑器 （ApE） 文件; 补充序列文件 1-5。
- ARG4 的基因组 DNA：使用 olWDH1760/olWDH1761 扩增位于 ARG4 的 dsDNA。将此反应用作加载控件，并规范化除 DLC 信号对此控件的 DLC 信号反应之外的所有其他反应。
- DAP2 的分子内连接效率：使用 EcoRI 消化产生的 1，904 bp 片段与 DLC 连接并行进行分子内连接。该连接结的扩增报告分子内连接效率，并作为DLC信号归一化的控制。
- DSB 感应：使用 olWDH1766/olWDH1767 放大跨越感应 DSB 的区域。
- 补骨脂素交联和切除：使用 olWDH2019/olWDH2020 扩增 EcoRI 识别位点下游的独特 PhiX 区域。在没有交联逆转的情况下，使用ssDNA（无交联）与 ARG4 （交联dsDNA）的比率来确定交联效率。通过交联逆转，切除将导致相对于 ARG4的信号从1逐渐降低到0.5。
- 生态I 识别位点恢复和切割：使用 olWDH1768/olWDH1764 在切除的链上放大跨越 DSB 上游恢复的 EcoRI 识别位点的区域。olWDH1769/olWDH1763 扩增跨越 DAP2 处 EcoRI 限制性内切酶位点的区域。在该位点进行EcoRI切割以用作分子内连接对照。
- DLC 信号：使用 olWDH1764/olWDH1765 扩增由切除（入侵）链和供体的分子内连接产生的嵌合 DNA 分子。
- 分析：计算每个重复反应的Cp值的平均值和标准偏差。使用 ARG4 基因组 DNA qPCR Cp 值作为参考，对所有其他对照 qPCR 进行标准化。将 DLC 信号标准化为 DAP2 的分子内连接对照。有关 2 小时时的典型 DLC 信号值，请参见 图 3 。
- 对照：参见 表3中的qPCR引物列表。引物结合位点图如图 S1所示。有关相关基因组特征和扩增子的补充序列文件，请查看 A 质粒编辑器 （ApE） 文件; 补充序列文件 1-5。
- DLE 检测
- 对照：参见 表3中的qPCR引物列表。引物结合位点图如图 S1所示。有关相关基因组特征和扩增子的补充序列文件，请查看质粒编辑器（ApE）文件（补充序列文件1-5）。
- ARG4的基因组DNA：见第6.3.1.1节。
- YLR050C的分子内连接效率：使用HindIII酶切产生765 bp片段，该片段将与DLE连接平行进行分子内连接。该连接结的扩增报告分子内连接效率，并用作 DLE 信号归一化的对照。
- DSB感应：见第6.3.1.3节。
- 后III识别位点恢复和切割：使用olWDH2010 / olWDH2012和olWDH2009/2011扩增跨越断裂链上 HindIII限制性内切酶位点的区域，该区域分别被切除和延伸。
- DLE信号：使用olWDH2009 / olWDH2010扩增由DSB上游入侵链的切除端的分子内连接到DSB下游新延伸端产生的嵌合DNA分子。
- 分析：计算每个重复反应的Cp值的平均值和标准偏差。使用 ARG4 基因组 DNA qPCR Cp 值作为参考，对所有其他对照 qPCR 进行标准化。将 DLE 信号标准化为 YLR050C 的分子内连接对照。6 小时时的典型 DLE 信号值如图 4 和之前的出版物9 中报告。
- 对照：参见 表3中的qPCR引物列表。引物结合位点图如图 S1所示。有关相关基因组特征和扩增子的补充序列文件，请查看质粒编辑器（ApE）文件（补充序列文件1-5）。
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Representative Results
类金刚石检测
DLC测定可检测由位点特异性DSB侵入单个供体而形成的新生和扩展D环（图2）。补骨脂素交联通过D环内的异质双链DNA 物理 连接断裂的链和供体。在断裂的切除链上使用长杂交寡核苷酸进行限制性内切酶位点恢复，允许限制性内切酶切割，然后将断裂链连接到近端供体以形成通过qPCR定量的嵌合产物。值得注意的是，DLC 信号取决于补骨脂素交联、杂交寡核苷酸、中心重组酶 Rad51 和 Rad51 附属因子 Rad52 和 Rad548。DNA解旋酶/拓扑异构酶Sgs1-Top3-Rmi1、Mph1和Srs2的缺失导致DLC信号增加。
图3 显示了标准野生型菌株在DSB诱导后2小时在有和没有杂交寡核苷酸的情况下一式三份的代表性结果。关键步骤（补骨脂素交联）中缺少的样品也一式两份。
如图 3所示，补骨脂素交联是一个关键步骤。没有它，几乎没有可检测到的信号8。交联效率是根据ssDNA与dsDNA扩增的比例来测量的。与dsDNA不同，ssDNA经历最少的补骨脂素交联，因此，高信号表示交联成功。交联效率取决于样品收集和qPCR制备之间的时间（图3，左下图）。样品收集和制备之间的时间越长，观察到的交联效率qPCR对照信号就越少。在交联效率qPCR控制中观察到的信号的显着样品间变化令人担忧，应丢弃时间过程。
ARG4 有和没有杂交寡核苷酸样品之间的Cp值相似（图3，左上图）。低Cp值表明存在更多可扩增的DNA。这就解释了为什么没有交联的样品的 ARG4 Cp值明显较低：交联会干扰qPCR扩增。有交联和无交联样品之间的这种差异适用于所有qPCR，但 EcoRI切割qPCR对照除外，该对照将扩增ssDNA/非交联dsDNA。所有 qPCR 对照（但不包括 DLC 信号）都归一化为 ARG4 qPCR 信号。
对于所有样品，分子内连接qPCR对照都在适当的范围内（图3，顶部中图），并且具有强大的DSB诱导，如qPCR对照的低信号所证明的那样，该信号在HO核酸内切酶识别位点上扩增（图3，右上图）。在杂交寡核苷酸样品中，观察到有效的 EcoRI切割，并且该qPCR对照给出低信号（图3，底部中间图）。相反，未杂交的寡核苷酸与交联样品产生高信号，类似于交联效率qPCR对照显示的信号，因为在这种情况下，未切割的ssDNA被扩增并归一化为 ARG4 qPCR信号（dsDNA）。
与其他qPCR相比，DLC测定的qPCR信号归一化为分子内连接qPCR对照，因为DLC qPCR定量的嵌合分子依赖于连接。与杂交寡核苷酸2小时的中位DLC信号为0.030±0.0055（图3，右下图），与该测定8先前发表的结果一致。正如预期的那样，该信号取决于杂交寡核苷酸和补骨脂素交联。
DLE 检测
DLE测定允许准确监测D环延伸，以响应特定位点的DSB（图2）。先前已经证明，DLE信号依赖于Rad51，这是反应中的中心重组酶，它介导链侵袭，因此是重组相关DNA合成所必需的9。此外，DLE信号取决于Pol δ的催化亚基Pol3（DR，AP，WDH，未发表的数据），而不是非必需的合成因子Pol32。与在DSB诱导后2小时首次检测到的DLC信号相反，DLE信号在DSB诱导后4小时首先明显增加，在4小时至6小时之间急剧上升，此后开始趋于平稳，6小时至8小时之间信号增加的大部分归因于BIR产物形成8，9.
由于在DLE测定中定量的嵌合连接产物是单链的，因此细胞球化和裂解步骤至关重要。DLE信号降低可能是由于此步骤的问题引起的，这可能会释放核酸酶并导致靶ssDNA降解。
图4 显示了标准野生型菌株在DSB诱导后6小时在有和没有杂交寡核苷酸的情况下一式三份的代表性结果。没有杂交寡核苷酸的野生型样品仅代表dsDNA BIR产物，而寡核苷酸信号来自扩展D环的ssDNA和dsDNA BIR产物。第三个样本作为失败实验的示例包括在内。
ARG4 有和没有杂交寡核苷酸样品之间的Cp值相似（图4，左上图）。 ARG4 失败样本的Cp值明显较低，表明该样本比成功样本具有更多的基因组DNA。qPCR对照的qPCR信号（而不是DLE信号）被归一化为 ARG4 qPCR信号。分子内连接qPCR对照显示，有和没有杂交寡核苷酸样品的信号是可接受的（在~0.15-0.35之间），但失败样品的信号要低得多（图4，上中图）。在这个失败的样品中， ARG4 qPCR对照指示的大量基因组DNA可能导致分子内连接失败，因为高浓度的基因组DNA会导致分子间连接。
在所有三个样品中，都有强大的DSB感应（图4，右上图）。后切除链和延伸链上的III切割取决于杂交寡核苷酸的存在。在延伸股上，它还取决于D环延伸。因此，有寡核苷酸和无寡核苷酸样品之间切除链上Hind III切割位点的扩增存在显着差异（图4，左下图），而这些样品之间延伸链上HindIII识别位点的扩增差异较小（图4，底部-中图）。
由于DLE信号取决于分子内连接，因此将其标准化为分子内连接qPCR对照。使用杂交寡核苷酸6小时的中位DLE信号为0.53±0.17（图4，右下图），与先前发表的该测定9的结果一致。未杂交寡核苷酸的野生型样品的DLE信号与先前的出版物类似。失败样品的DLE信号低于预期，可能反映了上述样品的问题。
交联反转
在dsDNA中嵌入ApT/TpA碱基对之间的补骨脂素可以通过其呋喃环和吡喃环在紫外线照射下与一个或两个相反的胸腺嘧啶碱基共价连接，分别导致（主要是呋喃）单加合物或链间二加合物（即交联）22。这些修饰有望阻断DNA聚合酶的进展，从而抑制定量PCR不可或缺的DNA合成反应。因此，大多数dsDNA模板无法扩增（图5A，B）。相比之下，ssDNA中缺乏碱基对使其不易发生补骨脂素交联。因此，它比dsDNA更容易扩增，这扭曲了ssDNA与dsDNA以及不同长度和ApT/TpA含量的dsDNA扩增子的相对定量（图5A，B）。为了克服这些限制，在定量PCR之前应用补骨脂素交联逆转步骤23的碱和热催化逆转。这种方法只留下次要种类的吡喃酮侧单加合物23，24。它导致基因组dsDNA和分子内连接控制扩增子的80倍回收率，表明绝大多数模板分子至少具有一个呋喃侧单加合物或链间交联（图5B，C）。交联逆转前后dsDNA基因组DNA对照的Cp值的比较提供了交联效率的估计值，该效率应在此处显示的范围内。除了短扩增子之外，此过程还可以恢复长达 3 kb 的模板（图 S2）。ssDNA扩增子没有观察到变化，这与缺乏补骨脂素与ssDNA的交联一致（图5B-D）。它还表明交联反转程序不会检测到损坏DNA23。DLC嵌合体扩增子的回收，其中包含与非交联ds-ssDNA片段（50 bp和118 bp/nt;图5A）与dsDNA和ssDNA扩增子相比处于中间水平，回收率提高了8倍（图5B，C）。交联逆转不影响两个dsDNA扩增子的相对水平，分子内连接对照相对于基因组DNA对照保持在0.2-0.25范围内（图5E）。然而，它将ssDNA扩增子相对于dsDNA基因组DNA对照的相对量从40倍的过量变为相对于dsDNA模板的ssDNA预期的0.5倍（图5D）。同样，相对于dsDNA分子内连接对照，部分ssDNA DLC信号从6.6 x 10−2降低到6.6 x 10−3（图5F）。这导致我们估计在DSB诱导后4小时通过这种方法检测到的染色体间供体的D环关节分子数量平均为细胞群中总断裂分子的1.3%。这种绝对估计无法通过基于补骨脂素的dsDNA扭曲和ssDNA扩增做出，这突出了这个额外的交联逆转步骤的价值。
图 1：同源重组和消退亚途径。 在DNA损伤导致单端或两端DSB（如图所示）或ssDNA间隙后，DNA末端的5'至3'切除揭示了3'ssDNA突出，在其辅助因素的帮助下，Rad51丝在其上形成。然后，Rad51在基因组中搜索完整的双链DNA（即供体），以模板修复事件。这个过程在DNA链侵袭中达到高潮，其中断裂的Watson-Crick碱基与双链DNA供体的互补链配对，取代相反的链并形成新生的D环。该D环可以反转以允许Rad51同源搜索选择不同的供体，也可以通过DNA聚合酶扩展以替换DNA损伤事件期间丢失的碱基。三种HR子途径可用于将这种扩展的D环中间体分解为产品。首先，扩展的D环可以被解旋酶破坏，允许新延长的断裂端退火到第二端，该过程称为合成依赖链退火（SDSA）。填充DNA合成和连接然后导致产物形成。或者，断裂的第二端可以退火到移位的供体链，形成双霍利迪结（dHJ）。dHJ的核解分离产生交叉（CO）或非交叉（NCO），而dHJ溶解（未显示）仅产生NCO产物。最后，未能接合DSB的第二端会导致断裂诱导复制（BIR），这是一个诱变过程，其中数千个碱基对从供体复制到断裂链上。这个过程可以延伸到收敛的复制叉或染色体的末端。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：D 环捕获 （DLC）、D 环延伸 （DLE） 和断裂诱导复制 （BIR） 产物形成测定的前提。DSB的形成由位点特异性核酸内切酶在GAL1启动子的控制下驱动。DSB诱导导致新生D环的形成。在DLC测定中，DNA的链间交联保留了这种结构，然后将其提取。限制性内切酶位点恢复是通过与长寡核苷酸杂交实现的，然后将DNA消化并连接以形成可通过定量PCR（qPCR）定量的产物。DLE测定的不同之处在于DNA不是交联的，相反，分子内连接产物在断裂一侧的ssDNA两端之间形成，3'端已被DNA聚合酶延伸。qPCR再次用于定量嵌合连接产物的形成。通过DLE测定检测D环延伸同样需要限制性内切酶位点恢复。相反，使用DLE测定引物检测双链BIR产物，而不使用杂交寡核苷酸。R表示限制性内切酶位点能够进行酶切割;（R）表示不能切割的限制性内切酶位点。请点击此处查看此图的大图。
图 3：DSB 诱导后 2 小时 D 环的 DLC 测定分析的代表性结果。 如本协议所述，通过qPCR收集，制备和分析样品。蓝色符号表示标准野生型菌株的结果，其中杂交寡核苷酸为 n = 3。绿色符号表示野生型菌株的结果，没有杂交寡核苷酸，n = 3。粗红线表示中位数。紫色符号表示没有补骨脂素交联但具有杂交寡核苷酸的样品，n = 2。符号表示样品来自同一培养性。交联效率的实验间差异可能会给某些qPCR对照带来变异性，但只要实验中这些qPCR对照中没有样品间变异性，就不会有问题。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：DSB 诱导后 6 小时 DLE 测定分析的代表性结果。 如本协议所述，通过qPCR收集，制备和分析样品。蓝色符号表示标准野生型菌株的结果，其中杂交寡核苷酸为 n = 3。绿色符号表示野生型菌株的结果，没有杂交寡核苷酸，n = 3。粗红线表示中位数。请注意，有和没有杂交寡核苷酸样品来自相同的培养物。紫色钻石表示未杂交寡核苷酸的失败样品，n = 1。符号表示样品来自同一区域性。 请点击此处查看此图的大图。
图5：补骨脂素交联逆转的代表性结果。 （A）补骨脂素-DNA单加合物（*）和链间交联（X）特异性地发生在dsDNA上，并阻止其被DNA聚合酶扩增，这与ssDNA模板不同。这种差异在通过qPCR定量含有dsDNA和ssDNA的模板时引入了偏差。这种偏差可以在补骨脂素交联逆转时克服。（B）在DSB诱导后4小时获得的dsDNA（基因组，连接），ssDNA和混合ds-ssDNA（DLC）扩增子的代表性Cp值。数据代表个体值和四个生物学重复的中位数。（C）交联逆转后的扩增恢复，根据（B）中的Cp值计算。（D）相对于基因组dsDNA对照的ssDNA扩增，有和没有补骨脂素交联逆转。逆转后，ssDNA扩增子扩增在基因组dsDNA对照的预期0.5处扩增。（E）dsDNA分子内连接对照相对于基因组dsDNA对照，有和没有补骨脂素交联逆转。（F）相对于dsDNA连接对照的DLC信号。请点击此处查看此图的大图。
图 6：当前的 DLC/DLE 检测系统和拟议的修改。 上图：显示了当前的DLC/DLE检测断裂位点和供体。下图：对DLC/DLE检测中断位点和供体的计划修改。（I）117 bp HO核酸内切酶切割位点以黄色表示。为了防止在监测D环中断时产生混杂效应，HOcs的左侧（74 bp）将被引入供体中，这样两者之间的重组就会产生一个完美匹配的D环，缺少3'的襟翼。（II）为了使系统可修复，从而更具生理性，将与供体同源的DNA（以蓝绿色和淡紫色表示）插入HOcs的右侧。（III）HOcs右侧的链的入侵和延伸将使用断裂侧特有的序列（橙色表示）进行监测。（IV）供体特有的其他均匀分布的限制性内切酶位点和序列将允许在更远的位点监测D环延伸（通过 HOcs左侧的侵袭）。在这种改进的系统中，合成依赖链退火（SDSA）或双霍利迪结（dHJ）的形成可能发生在蓝绿色或淡紫色显示的位点。 请点击此处查看此图的大图。
补充图S1：DLC和DLE测定中使用的qPCR引物图。 DLC和DLE测定中用于分析的基因组位点图，其相关特征以及近似引物结合位点（有关qPCR引物列表，请参见 表3 ）。 请点击此处下载此文件。
补充图S2：大扩增子交联反转的定性评估。 基因组DNA由交联或非交联样品制备，如协议第1-5节所述。使用非定量PCR扩增跨越断裂位点和供体之间共享的同源区域的3 kbp片段。请注意，由于交联和非交联DNA之间的扩增效率差异以及样品量有限，因此无法标准化输入DNA。 请点击此处下载此文件。
表1：用于DLC和DLE测定分析的 酿酒酵母 菌株。 本研究中使用的单倍体出芽酵母菌株的基因型。该菌株可根据要求提供。可用于DLC / DLE测定分析的其他菌株可以在Piazza等人8和 Piazza等人9中找到。 请按此下载此表格。
表 2：用于 DLC 和 DLE 测定分析的杂交寡核苷酸。 DLC 和 DLE 测定中使用的长杂交寡核苷酸序列。建议由定制寡核苷酸提供者对杂交寡核苷酸进行额外的SDS-PAGE纯化。 请按此下载此表格。
表 3：用于 DLC 和 DLE 测定分析的 qPCR 引物。 用于DLC和DLE检测的qPCR引物对及其用途的描述。请注意，olWDH1764、olWDH2009 和 olWDH2010 用于两种 qPCR。 请按此下载此表格。
补充表 S1：DLC 测定 qPCR 设置和分析的模板。请按此下载此表格。
补充表S2：DLE测定qPCR设置和分析的模板。请按此下载此表格。
补充序列文件 1-5。 相关基因组特征和扩增子的补充序列文件。序列文件采用 ApE 文件格式;ApE是一款免费提供的软件，用于查看和编辑DNA序列。ApE文件还与所有主要的序列编辑软件兼容。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
所提供的检测方法允许使用邻近连接和qPCR检测新生和扩展的D环（DLC测定），D环延伸（DLE测定）和BIR产物形成（无杂交寡核苷酸的DLE测定）。Rad51 的 ChIP-qPCR 到远离 DSB 的位点之前已被用作 Rad51 介导的同源搜索和 D 环形成的代理。然而，该 ChIP-qPCR 信号与断裂位点和潜在供体之间的序列同源性以及 Rad51 相关因子 Rad54 无关，因此更可能代表 Rad51-ssDNA 细丝与 dsDNA 之间的瞬时关联，而不是 D 环中间体10，11。相反，DLC信号取决于DSB形成，Rad51，Rad52，Rad54以及DSB和供体位点之间的共享序列同源性8。此外，在没有Mph1和Srs2解旋酶以及Sgs1-Top3-Rmi1解旋酶-拓扑异构酶复合物的情况下观察到DLC信号增加，这与先前的报道一致，即这三个因素可以在体外8，25，26，27中拆卸Rad51 / Rad54制造的新生D环。DLE测定同样代表了对以前跟踪重组相关DNA合成的方法的改进，因为它可以区分D环延伸和BIR产物形成19。
如上所述，qPCR 对照，包括用于基因组 DNA、DSB 诱导、补骨脂素交联、分子内连接和寡核苷酸杂交的对照，对于这些测定的成功和可重复性至关重要。原始基因组 DNA qPCR 值在样品之间应大致相等。 ARG4 基因组DNA对照的低Cp值表明DNA过量，应调整收集的细胞数量。该对照的高Cp值表明DNA回收率不足或扰qPCR的试剂污染。球状成形后，可以使用标准光学显微镜和等体积的样品和无菌水观察细胞裂解。如果在加入水时观察到裂解不足，则必须重新制备酶解酶溶液，或者应延长在30°C下的孵育时间。在通过P/C/IA提取纯化DNA的过程中，样品也可能丢失或引入污染物。为了有效地回收DNA，应确保P/C/IA的pH值已调节到~8.0，并且在去除上层相时不会干扰底相。最后，DNA沉淀在1x TE中的低效重悬会导致低Cp值。在37°C下长时间孵育和涡旋将改善DNA沉淀的重悬。
除了基因组DNA基因组DNA对照外，DSB诱导和限制性内切酶切割对照反应在样品之间也应相似。在DSB或限制性内切酶识别位点切割HO核酸内切酶或限制性内切酶可防止该区域扩增;因此，这些对照的典型归一化qPCR值接近于零，高qPCR值表明切割不足。如果在DSB部位观察到高信号，则应重新制备半乳糖溶液。对于具有已知细胞周期缺陷的突变体，DSB诱导应通过在补充半乳糖的YPDA和YPA培养基上接种根据方案（见第1节）生长的等量培养物来量化。在含有半乳糖的培养基上生长的菌落代表酵母，其中末端连接产生了不可切割的HOcs。如果感兴趣的突变体相对于野生型存在明显更多的末端连接事件，则必须进行校正以补偿DSB诱导的这种差异，这将影响DLC / DLE信号。
三对引物（olWDH1764/olWDH1768、olWDH2010/olWDH2012和olWDH2009/olWDH2011）通过杂交寡核苷酸和EcoRI-HF和HindIII-HF限制性内切酶评估限制性内切酶位点恢复。此外，分子内连接对照还取决于充分的限制性内切酶消化。因此，对于这三个引物对之一，具有低分子内连接效率和高信号的样品没有足够的限制性内切酶切割。在后续制备中应提供额外的限制性内切酶，并应评估限制性内切酶对基因组DNA的疗效。olWDH1769/olWDH1763引物对代表了DLC测定的附加对照，该测定可测量DAP2处的EcoRI切割，其中还测量分子内连接效率。具有足够分子内连接信号但这三个引物对之一信号高的样品通过杂交寡核苷酸的限制性内切酶位点恢复不足。为了解决这个问题，应收集重复样品，并改变受影响的杂交寡核苷酸的浓度。在有和没有杂交寡核苷酸的情况下，这些反应获得的典型qPCR值可以在图3和图4以及Piazza等人8和Piazza等人9中找到。
对于DLC和DLE测定，基因组DNA对照标准化的分子内连接效率为0.15-0.35被认为是正常的。由于新生和扩展的D环以及BIR产物的检测依赖于有效的连接，因此必须丢弃连接信号低的样品。缺乏ATP的10x连接缓冲液应在4°C下储存不超过6个月。收集过多的细胞会导致分子间连接，从而导致分子内连接效率和DLC/DLE信号低下。
尽管这些用于DLC和DLE测定的对照报告了几乎所有的敏感步骤，但当这些对照在适当范围内时，仍然可以获得DLC或DLE信号的非生理值。低DLC或DLE信号可能是由细胞球状喷射步骤中的错误引起的，这是非常敏感的。应仅并行处理几个样品，并始终将其保持在4°C。高/低DLC/DLE信号也可能是由于在每个时间点收集太多/很少的细胞而导致的。这个问题可以通过在每个时间点为每个样品收集多个OD600s细胞来解决。
目前形式的DLC和DLE检测存在一些技术和概念上的局限性。首先，补骨脂素介导的链间交联密度为~1/500 bp8。因此，增加的DLC信号可以表明总体中有更多的D环路，或者总体中D环路的平均长度增加了（假设D环可以小于500 bp），或者两者兼而有之。此外，DLC测定捕获D环的可能性随着D环长度的减小而降低。鉴于在某些突变背景中，非常短的D环可能占总D环群的很大一部分，因此在解释结果时必须考虑测定的这种局限性。其次，DLC测定需要DNA交联，而DLE测定不需要。以前，对于给定的实验，这意味着必须分别收集和分析DLC和DLE样品。图5所示的方法实现了稳健的交联逆转，从而减轻了从同一培养物中收集多个样品的需要。在HindIII识别位点下游的断链上引入第二个EcoRI限制性内切酶位点，将使顺序DLC和DLE分析成为可能。
除了这些技术限制之外，DLC和DLE测定系统目前不允许回收可行的HR产物，因为诱导DSB的右侧缺乏与供体的同源性。为了更好地了解第二端接合和合成的动力学和机制，可以修改该系统，以便使用断裂的第二端和供体之间共享的近端或远端同源区域进行修复是可行的（图6）。展望未来，将DLC和DLE检测与其他技术相结合，如ChIP-qPCR、高通量染色体构象捕获（Hi-C）和 体内 D环图，以实现对HR途径中步骤的动力学和调节的全面分析，包括断裂形成，末端切除，Rad51丝形成，新生D环形成， D 环延伸、D 环反转、第二端啮合、第二端合成和分辨率28。
总之，DLC 和 DLE 测定允许使用邻近连接原理定量新生和扩展的 D 环、D 环延伸和 BIR 产物形成。这些测定代表了该领域的重大进步，因为它们是第一个允许独立于细胞活力的D环形成和延伸的半定量测量。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
Heyer实验室的工作得到了W.-D.H.的GM58015和GM137751赠款的支持。Piazza实验室的研究得到了欧洲研究委员会（ERC-StG 3D-loop，大协议851006）的支持。D.R.得到了T32CA108459和AP Giannini基金会的支持。我们感谢Shih-Hsun Hung（Heyer实验室）分享他的DLC / DLE检测结果，并额外验证了本协议中详述的检测更改。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Pre-growth, DSB induction, and sample collection | |||
| Equipment | |||
| 15 and 50 mL conical tubes | |||
| 15 mL glass culture tubes | |||
| 250 mL, 500 mL, or 1 L flasks | |||
| 60 mm x 15 mm optically clear petri dishes with flat bottom | Suggested: Corning, Catalog Number 430166; or Genesee Scientific, Catalog Number 32-150G | ||
| Benchtop centrifuge with 15 and 50 mL conical tube adapters | |||
| Benchtop orbital shaker or tube rotator/revolver | |||
| Rotator | |||
| UV crosslinker or light box with 365 nm UV bulbs set atop an orbital shaker | Suggested: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) or Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Catalog Number 611110831 | ||
| Materials | |||
| 60% w/w sodium DL-lactate syrup | Sigma-Aldrich | L1375 | For media preparation |
| Agar | Fisher | BP1423500 | For media preparation |
| Bacto peptone | BD Difco | 211840 | For media preparation |
| Bacto yeast extract | BD Difco | 212750 | For media preparation |
| D-(+)-glucose | BD Difco | 0155-17-4 | For media preparation |
| Trioxsalen | Sigma-Aldrich | T6137 | For psoralen cross-linking |
| 2. Spheroplasting, lysis, and restriction enzyme site restoration | |||
| Supplies | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | |||
| Dry bath | |||
| Liquid nitrogen or dry ice/ethanol | |||
| Refrigerated microcentrifuge or microcentrifuge | |||
| Materials | |||
| 10X restriction enzyme (CutSmart) buffer (500 mM potassium acetate, 200 mM Tris-acetate, 100 mM magnesium acetate, 1 mg/mL BSA, pH 7.8-8.0) | |||
| Zymolyase 100T | US Biological | Z1004 | For spheroplasting |
| 3. Restriction enzyme digest and intramolecular ligation | |||
| Supplies | |||
| Water bath | |||
| Materials | |||
| EcoRI-HF | New England Biolabs | R3101 | Restriction enzyme digest for DLC assay |
| HindIII-HF | New England Biolabs | R3104 | Restriction enzyme digest for DLE assay |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | Intramolecular ligation |
| 4. DNA purification | |||
| Supplies | |||
| 1.5 and 2 mL microcentrifuge tubes | |||
| Materials | |||
| Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (P/C/IA) at 25:24:1 | Sigma-Aldrich | P2069 | DNA purification |
| 5. Psoralen cross-link reversal | |||
| Supplies | |||
| Thermocycler/PCR machine | |||
| 6. qPCR | |||
| Supplies | |||
| Lightcycler 480 | Roche | 5015278001 | qPCR machine used by the authors |
| Lightcycler 96 | Roche | 5815916001 | qPCR machine used by the authors |
| Materials | |||
| LightCycler 480 96-Well Plate, white | Roche | 4729692001 | 96-well plates for qPCR |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Super Mix | BioRad | 1725271 | qPCR kit used by the authors |
| SYBR Green I Master Mix | Roche | 4707516001 | qPCR kit used by the authors |
References
- Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual Review of Genetics. 45 (1), 247-271 (2011).
- Heyer, W. -D. Regulation of recombination and genomic maintenance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), 016501 (2015).
- Mimitou, E. P., Symington, L. S. Sae2, Exo1 and Sgs1 collaborate in DNA double-strand break processing. Nature. 455 (7214), 770-774 (2008).
- Bzymek, M., Thayer, N. H., Oh, S. D., Kleckner, N., Hunter, N. Double Holliday junctions are intermediates of DNA break repair. Nature. 464 (7290), 937-941 (2010).
- Chen, H., Lisby, M., Symington, L. S. RPA coordinates DNA end resection and prevents formation of DNA hairpins. Molecular Cell. 50 (4), 589-600 (2013).
- Mazón, G., Symington, L. S. Mph1 and Mus81-Mms4 prevent aberrant processing of mitotic recombination intermediates. Molecular Cell. 52 (1), 63-74 (2013).
- Saini, N., et al. Migrating bubble during break-induced replication drives conservative DNA synthesis. Nature. 502 (7471), 389-392 (2013).
- Piazza, A., et al. Dynamic processing of displacement loops during recombinational DNA repair. Molecular Cell. 73 (6), 1255-1266 (2019).
- Piazza, A., Koszul, R., Heyer, W. -D. A proximity ligation-based method for quantitative measurement of D-loop extension in S. cerevisiae. Methods in Enzymology. 601, 27-44 (2018).
- Sugawara, N., Wang, X., Haber, J. E. In vivo roles of Rad52, Rad54, and Rad55 proteins in Rad51-mediated recombination. Molecular Cell. 12 (1), 209-219 (2003).
- Renkawitz, J., Lademann, C. A., Kalocsay, M., Jentsch, S. Monitoring homology search during DNA double-strand break repair in vivo. Molecular Cell. 50 (2), 261-272 (2013).
- Petukhova, G., Stratton, S., Sung, P. Catalysis of homologous DNA pairing by yeast Rad51 and Rad54 proteins. Nature. 393 (6680), 91-94 (1998).
- Wright, W. D., Heyer, W. -D. Rad54 functions as a heteroduplex DNA pump modulated by its DNA substrates and Rad51 during D-loop formation. Molecular Cell. 53 (3), 420-432 (2014).
- Tavares, E. M., Wright, W. D., Heyer, W. -D., Cam, E. L., Dupaigne, P. In vitro role of Rad54 in Rad51-ssDNA filament-dependent homology search and synaptic complexes formation. Nature Communications. 10 (1), 4058 (2019).
- Crickard, J. B., Moevus, C. J., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. Rad54 drives ATP hydrolysis-dependent DNA sequence alignment during homologous recombination. Cell. 181 (6), 1380-1394 (2020).
- Lydeard, J. R., Jain, S., Yamaguchi, M., Haber, J. E. Break-induced replication and telomerase-independent telomere maintenance require Pol32. Nature. 448 (7155), 820-823 (2007).
- Jain, S., et al. A recombination execution checkpoint regulates the choice of homologous recombination pathway during DNA double-strand break repair. Genes & Development. 23 (3), 291-303 (2009).
- Donnianni, R. A., Symington, L. S. Break-induced replication occurs by conservative DNA synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13475-13480 (2013).
- Liu, L., et al. Tracking break-induced replication shows that it stalls at roadblocks. Nature. 590 (7847), 655-659 (2021).
- Liu, L., Sugawara, N., Malkova, A., Haber, J. E. Determining the kinetics of break-induced replication (BIR) by the assay for monitoring BIR elongation rate (AMBER). Methods in Enzymology. 661, 139-154 (2021).
- Pham, N., et al. Mechanisms restraining break-induced replication at two-ended DNA double-strand breaks. The EMBO Journal. 40 (10), 104847 (2021).
- Cimino, G. D., Gamper, H. B., Isaacs, S. T., Hearst, J. E. Psoralens as photoactive probes of nucleic acid structure and function: Organic chemistry, photochemistry, and biochemistry. Annual Review of Biochemistry. 54 (1), 1151-1193 (1985).
- Yeung, A. T., Dinehart, W. J., Jones, B. K. Alkali reversal of psoralen cross-link for the targeted delivery of psoralen monoadduct lesion. Biochemistry. 27 (17), 6332-6338 (1988).
- Shi, Y. B., Spielmann, H. P., Hearst, J. E. Base-catalyzed reversal of a psoralen-DNA cross-link. Biochemistry. 27 (14), 5174-5178 (1988).
- Prakash, R., et al. Yeast Mph1 helicase dissociates Rad51-made D-loops: Implications for crossover control in mitotic recombination. Genes & Development. 23 (1), 67-79 (2009).
- Liu, J., et al. Srs2 promotes synthesis-dependent strand annealing by disrupting DNA polymerase δ-extending D-loops. eLife. 6, 22195 (2017).
- Fasching, C. L., Cejka, P., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. -D. Top3-Rmi1 dissolve Rad51-mediated D loops by a topoisomerase-based mechanism. Molecular Cell. 57 (4), 595-606 (2015).
- Shah, S. S., Hartono, S. R., Chédin, F., Heyer, W. -D. Bisulfite treatment and single-molecule real-time sequencing reveal D-loop length, position, and distribution. eLife. 9, 59111 (2020).
