Detektion av homologa rekombinationsintermediärer via närhetsligering och kvantitativ PCR i Saccharomyces cerevisiae
Summary
D-loop capture (DLC) och D-loop extension (DLE) analyser använder principen om närhetsligering tillsammans med kvantitativ PCR för att kvantifiera D-loop-bildning, D-loop-förlängning och produktbildning på platsen för en inducerbar dubbelsträngad brytning i Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
DNA-skador, inklusive DNA-dubbelsträngade brott och tvärbindningar mellan strängar, som uppstår under S- och G2-faserna i cellcykeln kan repareras genom homolog rekombination (HR). Dessutom representerar HR en viktig mekanism för replikeringsgaffelräddning efter stopp eller kollaps. Regleringen av de många reversibla och irreversibla stegen i denna komplexa väg främjar dess trohet. Den fysiska analysen av rekombinationsintermediärerna som bildas under HR möjliggör karakterisering av dessa kontroller av olika nukleoproteinfaktorer och deras interagerare. Även om det finns väletablerade metoder för att analysera specifika händelser och intermediärer i rekombinationsvägen, har detektionen av D-loopbildning och förlängning, två kritiska steg i denna väg, visat sig vara utmanande tills nyligen. Här beskrivs effektiva metoder för att detektera viktiga händelser i HR-vägen, nämligen DNA-dubbelsträngad brytbildning, D-loopbildning, D-loopförlängning och bildandet av produkter via break-induced replication (BIR) i Saccharomyces cerevisiae . Dessa analyser detekterar deras relevanta rekombinationsintermediärer och produkter med hög känslighet och är oberoende av cellulär livskraft. Detekteringen av D-slingor, D-loopförlängning och BIR-produkten baseras på närhetsligering. Tillsammans möjliggör dessa analyser studier av kinetiken för HR på befolkningsnivå för att fint ta itu med funktionerna hos HR-proteiner och regulatorer vid betydande steg i vägen.
Introduction
Homolog rekombination (HR) är en högkvalitativ mekanism för reparation av DNA-dubbelsträngade brott (DSB), tvärbindningar mellan strängar och ssDNA-luckor, samt en väg för DNA-skadetolerans. HR skiljer sig från felbenägna vägar för reparation/tolerans av DNA-skador, såsom icke-homolog ändfogning (NHEJ) och translesionssyntes, genom att den använder ett intakt, homologt duplex-DNA som givare för att malla reparationshändelsen. Dessutom är många av de viktigaste intermediärerna i HR-vägen reversibla, vilket möjliggör utsökt reglering av de enskilda vägstegen. Under S-, G2- och M-faserna i cellcykeln konkurrerar HR med NHEJ om reparation av de tvåändade DSB: erna1. Dessutom är HR avgörande för DNA-replikation för reparation av replikationsassocierade DNA-skador, inklusive ssDNA-luckor och ensidiga DSB: er, och som en mekanism för DNA-lesionsbypass2.
En kritisk mellanprodukt i HR-vägen är förskjutningsslingan eller D-slingan (figur 1). Efter ändresektion laddas det centrala rekombinaset i reaktionen, Rad51, på den nyligen resekterade ssDNA av den trasiga molekylen och bildar ett spiralformat filament2. Rad51 utför sedan en homologisökning för att identifiera en lämplig homolog donator, vanligtvis systerkromatiden i somatiska celler. D-slingan bildas när Rad51-ssDNA-filamentet invaderar ett homologt duplex-DNA, vilket leder till Watson-Crick-basparningen av den trasiga strängen med givarens komplementära sträng och förskjuter den motsatta givarsträngen. Förlängning av 3′-änden av den trasiga strängen med ett DNA-polymeras ersätter baserna som förlorades under DNA-skadehändelsen och främjar upplösningen av den utökade D-loop-mellanprodukten till en dsDNA-produkt genom syntesberoende strängglödgning (SDSA), dubbel-Holliday-korsningen (dHJ) eller den brytinducerade replikationen (BIR) HR-undervägar.
Analyser som fysiskt övervakar intermediärerna i HR-vägen möjliggör analys av de genetiska kraven för varje steg (dvs. väganalys). DSB-bildning, ändresektion, dHJs, BIR-replikationsbubblor och HR-produkter observeras lätt av Southern blotting 3,4,5,6,7. Ändå misslyckas Southern blotting med att rapportera om begynnande och utökade D-slingor, och därför krävs en alternativ metod för att på ett tillförlitligt sätt mäta dessa ledmolekyler 4,8,9. En allmänt använd strategi för att analysera begynnande D-loopbildning är kromatin-immunoprecipitation (ChIP) av Rad51 i kombination med kvantitativ PCR (qPCR)10,11. Rad51-associationen med dsDNA mätt med ChIP-qPCR är dock oberoende av sekvenshomologi och Rad51-tillbehörsfaktorn Rad5410,11. Däremot beror en märkbar signal med hjälp av metoden för D-loop-analys som presenteras här, kallad D-loop capture (DLC) -analysen, på DSB-bildning, sekvenshomologi, Rad51 och Rad51-tillbehörsproteinerna Rad52 och Rad548. Slutsatsen att Saccharomyces cerevisiae Rad51-främjad D-loopbildning beror på Rad54 in vivo överensstämmer med många in vitro-rekonstitueringsexperiment som indikerar att Rad54 krävs för homologisökning och D-loopbildning av spirande jäst Rad518,12,13,14,15.
Nuvarande metoder för att mäta D-loop-förlängning, främst genom semikvantitativ PCR, är lika problematiska. En typisk PCR-baserad analys för att detektera D-loopförlängning förstärker en unik sekvens, som härrör från rekombination mellan ett brytställe och en ektopisk givare och den efterföljande rekombinationsassocierade DNA-syntesen, via en primer uppströms homologiområdet på den trasiga strängen och en annan primer nedströms homologiområdet på donatorsträngen. Med hjälp av denna metod kräver detektion av rekombinationsassocierad DNA-syntes den icke-väsentliga Pol δ processivitetsfaktorn Pol3216. Detta fynd strider mot observationen att POL32-radering endast har en mild effekt på genomvandling in vivo17. Dessutom misslyckas dessa PCR-baserade analyser med att tidsmässigt lösa D-loop-förlängning och BIR-produktbildning, vilket tyder på att signalen är resultatet av dsDNA-produkter snarare än ssDNA-mellanprodukter17,18,19. D-loop-tillägget (DLE) har nyligen utvecklats för att åtgärda dessa avvikelser. DLE-analysen kvantifierar rekombinationsassocierad DNA-syntes på en plats ~ 400 baspar (bp) nedströms den initiala 3 ‘invaderande änden9. Med denna metod är D-loopförlängning oberoende av Pol32 och kan detekteras inom 4 timmar efter DSB-induktion, medan BIR-produkter först observeras vid 6 timmar. Faktum är att en ny publikation från Haber- och Malkova-laboratorierna noterade att användning av denna metod för beredning av genomiskt DNA singulärt resulterar i ssDNA-bevarande 9,20.
Här beskrivs DLC- och DLE-analyserna i detalj. Dessa analyser förlitar sig på närhetsligering för att detektera begynnande och utökade D-slingor i S. cerevisiae (figur 2)8,9. BIR-produkter kan kvantifieras med samma analyssystem. För båda analyserna induceras DSB-bildning vid en HO-endonukleasskärningsplats belägen vid URA3-locus på kromosom (Chr.) V genom uttrycket av HO-endonukleas under kontroll av en galaktosinducerbar promotor. Rad51-medierad DNA-stränginvasion leder till begynnande D-loopbildning på platsen för en ektopisk givare belägen vid LYS2-locus på Chr. II. Eftersom den högra sidan av DSB saknar homologi till givaren är reparation via SDSA och dHJ-bildning inte möjlig. Initial reparation av DSB av BIR är möjlig, men bildandet av livskraftiga produkter hämmas av närvaron av centromeren21. Denna avsiktliga design förhindrar produktiv DSB-reparation och undviker därmed återupptagande av tillväxt av celler med reparerade DBS, som annars skulle kunna ta över kulturen under tidsförloppsanalysen.
I DLC-analysen bevarar psoralen-tvärbindningen av de två strängarna i heteroduplex-DNA i D-slingan rekombinationsmellanprodukten. Efter restaurering av restriktionsenzymstället på den trasiga (resekterade) strängen och matsmältningen möjliggör tvärbindningen ligering av de unika sekvenserna uppströms de homologa trasiga och donator-DNA: erna. Med hjälp av qPCR kvantifieras nivån av chimär DNA-molekyl som finns i varje prov. I DLE-analysen krävs inte tvärbindning, och restriktionsenzymets återställande och matsmältning följt av intramolekylär ligering länkar istället 5′-änden av den trasiga molekylen till den nyligen utökade 3′-änden. Återigen används qPCR för att kvantifiera de relativa mängderna av denna chimära produkt i varje prov. I avsaknad av restaurering av restriktionsenzymstället rapporterar DLE-analysen om de relativa nivåerna av BIR-produkten (dsDNA) som bildas efter D-loopförlängning.
Representativa resultat för varje analys med en vild stam visas, och läsarna hänvisas till Piazza et al.8 och Piazza et al.9 för användning av dessa analyser för analys av rekombinationsmutanter 8,9. Avsikten med detta bidrag är att göra det möjligt för andra laboratorier att anta DLC- och DLE-analyserna, och stöd för dem är tillgängligt på begäran.
Protocol
Representative Results
Discussion
De presenterade analyserna möjliggör detektion av begynnande och utökade D-slingor (DLC-analys), D-loopförlängning (DLE-analys) och BIR-produktbildning (DLE-analys utan hybridiserande oligonukleotider) med hjälp av närhetsligering och qPCR. ChIP-qPCR av Rad51 till platser långt från DSB har tidigare använts som proxy för Rad51-medierad homologisökning och D-loop-bildning. Denna ChIP-qPCR-signal är emellertid oberoende av sekvenshomologin mellan brytplatsen och en potentiell givare, liksom den Rad51-associera…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbetet i Heyer-laboratoriet stöds av bidrag GM58015 och GM137751 till W.-D.H. Forskningen i Piazza-laboratoriet stöds av Europeiska forskningsrådet (ERC-StG 3D-loop, grand agreement 851006). D.R. stöds av T32CA108459 och A.P. Giannini Foundation. Vi tackar Shih-Hsun Hung (Heyer Lab) för att ha delat sina DLC/DLE-analysresultat och för att han dessutom validerade ändringarna i analyserna som beskrivs i detta protokoll.
Materials
| 1. Pre-growth, DSB induction, and sample collection | |||
| Equipment | |||
| 15 and 50 mL conical tubes | |||
| 15 mL glass culture tubes | |||
| 250 mL, 500 mL, or 1 L flasks | |||
| 60 mm x 15 mm optically clear petri dishes with flat bottom | Suggested: Corning, Catalog Number 430166; or Genesee Scientific, Catalog Number 32-150G | ||
| Benchtop centrifuge with 15 and 50 mL conical tube adapters | |||
| Benchtop orbital shaker or tube rotator/revolver | |||
| Rotator | |||
| UV crosslinker or light box with 365 nm UV bulbs set atop an orbital shaker | Suggested: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) or Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Catalog Number 611110831 | ||
| Materials | |||
| 60% w/w sodium DL-lactate syrup | Sigma-Aldrich | L1375 | For media preparation |
| Agar | Fisher | BP1423500 | For media preparation |
| Bacto peptone | BD Difco | 211840 | For media preparation |
| Bacto yeast extract | BD Difco | 212750 | For media preparation |
| D-(+)-glucose | BD Difco | 0155-17-4 | For media preparation |
| Trioxsalen | Sigma-Aldrich | T6137 | For psoralen cross-linking |
| 2. Spheroplasting, lysis, and restriction enzyme site restoration | |||
| Supplies | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | |||
| Dry bath | |||
| Liquid nitrogen or dry ice/ethanol | |||
| Refrigerated microcentrifuge or microcentrifuge | |||
| Materials | |||
| 10X restriction enzyme (CutSmart) buffer (500 mM potassium acetate, 200 mM Tris-acetate, 100 mM magnesium acetate, 1 mg/mL BSA, pH 7.8-8.0) | |||
| Zymolyase 100T | US Biological | Z1004 | For spheroplasting |
| 3. Restriction enzyme digest and intramolecular ligation | |||
| Supplies | |||
| Water bath | |||
| Materials | |||
| EcoRI-HF | New England Biolabs | R3101 | Restriction enzyme digest for DLC assay |
| HindIII-HF | New England Biolabs | R3104 | Restriction enzyme digest for DLE assay |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | Intramolecular ligation |
| 4. DNA purification | |||
| Supplies | |||
| 1.5 and 2 mL microcentrifuge tubes | |||
| Materials | |||
| Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (P/C/IA) at 25:24:1 | Sigma-Aldrich | P2069 | DNA purification |
| 5. Psoralen cross-link reversal | |||
| Supplies | |||
| Thermocycler/PCR machine | |||
| 6. qPCR | |||
| Supplies | |||
| Lightcycler 480 | Roche | 5015278001 | qPCR machine used by the authors |
| Lightcycler 96 | Roche | 5815916001 | qPCR machine used by the authors |
| Materials | |||
| LightCycler 480 96-Well Plate, white | Roche | 4729692001 | 96-well plates for qPCR |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Super Mix | BioRad | 1725271 | qPCR kit used by the authors |
| SYBR Green I Master Mix | Roche | 4707516001 | qPCR kit used by the authors |
References
- Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual Review of Genetics. 45 (1), 247-271 (2011).
- Heyer, W. -. D. Regulation of recombination and genomic maintenance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), 016501 (2015).
- Mimitou, E. P., Symington, L. S. Sae2, Exo1 and Sgs1 collaborate in DNA double-strand break processing. Nature. 455 (7214), 770-774 (2008).
- Bzymek, M., Thayer, N. H., Oh, S. D., Kleckner, N., Hunter, N. Double Holliday junctions are intermediates of DNA break repair. Nature. 464 (7290), 937-941 (2010).
- Chen, H., Lisby, M., Symington, L. S. RPA coordinates DNA end resection and prevents formation of DNA hairpins. Molecular Cell. 50 (4), 589-600 (2013).
- Mazón, G., Symington, L. S. Mph1 and Mus81-Mms4 prevent aberrant processing of mitotic recombination intermediates. Molecular Cell. 52 (1), 63-74 (2013).
- Saini, N., et al. Migrating bubble during break-induced replication drives conservative DNA synthesis. Nature. 502 (7471), 389-392 (2013).
- Piazza, A., et al. Dynamic processing of displacement loops during recombinational DNA repair. Molecular Cell. 73 (6), 1255-1266 (2019).
- Piazza, A., Koszul, R., Heyer, W. -. D. A proximity ligation-based method for quantitative measurement of D-loop extension in S. cerevisiae. Methods in Enzymology. 601, 27-44 (2018).
- Sugawara, N., Wang, X., Haber, J. E. In vivo roles of Rad52, Rad54, and Rad55 proteins in Rad51-mediated recombination. Molecular Cell. 12 (1), 209-219 (2003).
- Renkawitz, J., Lademann, C. A., Kalocsay, M., Jentsch, S. Monitoring homology search during DNA double-strand break repair in vivo. Molecular Cell. 50 (2), 261-272 (2013).
- Petukhova, G., Stratton, S., Sung, P. Catalysis of homologous DNA pairing by yeast Rad51 and Rad54 proteins. Nature. 393 (6680), 91-94 (1998).
- Wright, W. D., Heyer, W. -. D. Rad54 functions as a heteroduplex DNA pump modulated by its DNA substrates and Rad51 during D-loop formation. Molecular Cell. 53 (3), 420-432 (2014).
- Tavares, E. M., Wright, W. D., Heyer, W. -. D., Cam, E. L., Dupaigne, P. In vitro role of Rad54 in Rad51-ssDNA filament-dependent homology search and synaptic complexes formation. Nature Communications. 10 (1), 4058 (2019).
- Crickard, J. B., Moevus, C. J., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. Rad54 drives ATP hydrolysis-dependent DNA sequence alignment during homologous recombination. Cell. 181 (6), 1380-1394 (2020).
- Lydeard, J. R., Jain, S., Yamaguchi, M., Haber, J. E. Break-induced replication and telomerase-independent telomere maintenance require Pol32. Nature. 448 (7155), 820-823 (2007).
- Jain, S., et al. A recombination execution checkpoint regulates the choice of homologous recombination pathway during DNA double-strand break repair. Genes & Development. 23 (3), 291-303 (2009).
- Donnianni, R. A., Symington, L. S. Break-induced replication occurs by conservative DNA synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13475-13480 (2013).
- Liu, L., et al. Tracking break-induced replication shows that it stalls at roadblocks. Nature. 590 (7847), 655-659 (2021).
- Liu, L., Sugawara, N., Malkova, A., Haber, J. E. Determining the kinetics of break-induced replication (BIR) by the assay for monitoring BIR elongation rate (AMBER). Methods in Enzymology. 661, 139-154 (2021).
- Pham, N., et al. Mechanisms restraining break-induced replication at two-ended DNA double-strand breaks. The EMBO Journal. 40 (10), 104847 (2021).
- Cimino, G. D., Gamper, H. B., Isaacs, S. T., Hearst, J. E. Psoralens as photoactive probes of nucleic acid structure and function: Organic chemistry, photochemistry, and biochemistry. Annual Review of Biochemistry. 54 (1), 1151-1193 (1985).
- Yeung, A. T., Dinehart, W. J., Jones, B. K. Alkali reversal of psoralen cross-link for the targeted delivery of psoralen monoadduct lesion. Biochemistry. 27 (17), 6332-6338 (1988).
- Shi, Y. B., Spielmann, H. P., Hearst, J. E. Base-catalyzed reversal of a psoralen-DNA cross-link. Biochemistry. 27 (14), 5174-5178 (1988).
- Prakash, R., et al. Yeast Mph1 helicase dissociates Rad51-made D-loops: Implications for crossover control in mitotic recombination. Genes & Development. 23 (1), 67-79 (2009).
- Liu, J., et al. Srs2 promotes synthesis-dependent strand annealing by disrupting DNA polymerase δ-extending D-loops. eLife. 6, 22195 (2017).
- Fasching, C. L., Cejka, P., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. -. D. Top3-Rmi1 dissolve Rad51-mediated D loops by a topoisomerase-based mechanism. Molecular Cell. 57 (4), 595-606 (2015).
- Shah, S. S., Hartono, S. R., Chédin, F., Heyer, W. -. D. Bisulfite treatment and single-molecule real-time sequencing reveal D-loop length, position, and distribution. eLife. 9, 59111 (2020).
