JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biochemistry

Enkeltmolekylediffusion og samling på polymeroverfyldte lipidmembraner

Published: July 19, 2022
doi:
10.3791/64243
, , , , ,
1Department of Chemical Engineering,Indian Institute of Science, 2Holonyak Micro & Nanotechnology Lab,University of Illinois, Urbana-Champaign, 3Center for BioSystems Science and Engineering,Indian Institute of Science

Summary

Her præsenteres en protokol til at udføre og analysere binding, mobilitet og samling af enkeltmolekyler på kunstige overfyldte lipidmembraner ved hjælp af enkeltmolekyle total intern refleksionsfluorescens (smTIRF) mikroskopi.

Abstract

Cellulære membraner er meget overfyldte miljøer til biomolekylære reaktioner og signalering. Alligevel anvender de fleste in vitro-eksperimenter , der undersøger proteininteraktion med lipider, nøgne dobbeltlagsmembraner. Sådanne systemer mangler kompleksiteten af trængsel af membranindlejrede proteiner og glycaner og udelukker de tilknyttede volumeneffekter, der opstår på cellulære membranoverflader. Den negativt ladede glasoverflade, hvorpå lipiddobbeltlagene dannes, forhindrer også fri diffusion af transmembranbiomolekyler. Her præsenterer vi en velkarakteriseret polymer-lipidmembran som en efterligning for overfyldte lipidmembraner. Denne protokol anvender polyethylenglycol (PEG) -konjugerede lipider som en generaliseret tilgang til inkorporering af crowders i det understøttede lipiddobbeltlag (SLB). For det første præsenteres en rengøringsprocedure for de mikroskopiske dias og dækslips til udførelse af enkeltmolekyleeksperimenter. Dernæst diskuteres metoder til karakterisering af PEG-SLB’erne og udførelse af enkeltmolekyleeksperimenter af binding, diffusion og samling af biomolekyler ved hjælp af enkeltmolekylesporing og fotoblegning. Endelig viser denne protokol, hvordan man overvåger nanoporesamlingen af bakterielt poredannende toksin cytolysin A (ClyA) på overfyldte lipidmembraner med enkeltmolekylefotoblegningsanalyse. MATLAB-koder med eksempeldatasæt er også inkluderet for at udføre nogle af de almindelige analyser såsom partikelsporing, ekstraktion af diffusiv adfærd og underenhedstælling.

Introduction

Cellulære membraner er meget overfyldte og komplekse systemer1. Molekylær trængsel kan have en betydelig indvirkning på diffusionen af membranbundne enheder som protein og lipider 2,3,4. Tilsvarende påvirkes bimolekylære reaktioner på lipidmembraner som receptordimerisering eller oligomerisering af membrankomplekser af trængsel 5,6,7. Arten, konfigurationen og koncentrationen af crowders kan styre membranbindingen, diffusiviteten og protein-protein-interaktionen på flere måder 8,9. Da det er udfordrende at kontrollere membrantrængsel på cellulære membraner og fortolke dens indflydelse på indlejrede biomolekyler, har forskere forsøgt at etablere alternative in vitro-systemer 10.

En populær tilgang til kunstige overfyldte membraner er doping af dobbeltlagsmembranerne med polymer (såsom polyethylenglycol, PEG)-podede lipider11,12. Under visualiseringen af protein- og lipiddynamik på understøttede lipiddobbeltlag (SLB’er) beskytter disse polymerer desuden de membranindlejrede komponenter fra det underliggende negativt ladede substrat (såsom glas) ved effektivt at løfte dobbeltlaget væk fra den underliggende understøtning. Ved at variere polymerens størrelse og koncentration kan man kontrollere omfanget af molekylær trængsel samt dens adskillelse fra den underliggende faste støtte13,14. Dette er klart en fordel i forhold til lipid dobbeltlag understøttet på faste substrater uden polymerpuder15,16, hvor transmembranbiomolekyler kan miste deres aktivitet17,18,19. Endnu vigtigere giver det os mulighed for at rekapitulere det overfyldte miljø i cellemembranen in vitro, hvilket er kritisk for mange membranprocesser.

Overfladetransplanterede polymerer på membraner gennemgår også ændringer i deres konfiguration afhængigt af deres podningstæthed12. Ved lave koncentrationer forbliver de i en entropisk oprullet konfiguration, kendt som en svamp, over membranoverfladen. Med stigende koncentration begynder de at interagere og har tendens til at løsne og strække sig, hvilket til sidst giver en tæt børstelignende formation på membranen21. Da overgangen fra svampen til børsteregimet er meget heterogen og manifesterer sig under dårligt karakteriserede forhold i polymeren, er det vigtigt at anvende velkarakteriserede betingelser for trængsel på polymertransplanterede membraner. Sammenlignet med en nylig undersøgelse20 identificerer og rapporterer vi overfyldte membransammensætninger, der opretholder den diffusive transport og aktivitet af transmembranbiomolekyler.

I denne protokol diskuterer vi, hvordan man genererer PEGylated lipidmembraner og giver anbefalinger til PEG-tætheder, der efterligner trængsel i to forskellige regimer af polymerkonfiguration (nemlig svamp og børste). Protokollen beskriver også enkeltmolekylebinding, partikelsporing og fotobleaching dataindsamling og analyse for molekyler indlejret i disse overfyldte membraner. Først beskriver vi de grundige rengøringstrin, samlingen af billedkammeret og genereringen af PEG-SLB’er. For det andet giver vi detaljer om enkeltmolekylebinding, partikelsporing og fotobleaching eksperimenter. For det tredje diskuterer vi i) ekstraktion af de relative bindingsaffiniteter, ii) karakterisering af molekylær diffusion og iii) tælling af underenheder i en proteinsamling fra film af enkeltmolekyler på membranen.

Mens vi karakteriserede dette system med enkeltmolekylebilleddannelse, er protokollen nyttig for alle membranbiofysikere, der er interesserede i at forstå effekten af trængsel på biomolekylære reaktioner på lipidmembraner. Samlet set præsenterer vi en robust pipeline til fremstilling af overfyldte og understøttede lipiddobbeltlag sammen med forskellige enkeltmolekyleassays udført på dem og de tilsvarende analyserutiner.

Protocol

1. Rengøring af dias og coverslip til enkeltmolekyleeksperimenter Før samlingen af billedkammeret skal du rengøre og forberede både dækslikker og dias. Bor flere par huller på glasrutsjebanerne ved hjælp af en boremaskine med diamantbelagte bor (0,5-1 mm i diameter). Hvis der anvendes akrylplader, skal du bruge en laserskærer til at lave præcise huller (0,5 mm), som vist i figur 1.BEMÆRK: Hvert par huller fungerer som et indløb og udløb til flowudve…

Representative Results

Overvågning af bindingen af ClyA-protein på PEGylated membranerEfter trin 4.5 estimeres bindingskinetikken ved at plotte antallet af partikler, der binder til membranoverfladen over tid (Video 1). Da ClyA-protein binder til en membran med 5 mol% PEG2000 lipider, øges partikeltætheden og når mætning (figur 5). Et eksponentielt henfald, der passer til de bundne partikler (cyancirkler), giver tidskonstanten (τb) for membranbindingen (især…

Discussion

Her demonstrerer vi enkeltmolekyleeksperimenter på understøttede lipiddobbeltlag (SLB’er), der manifesterer et overfyldt miljø for membranindlejrede biomolekyler. Det overfyldte miljø genererer en ekskluderet volumeneffekt, hvilket fører til forbedring af biomolekylære reaktioner 1,2,39,40. For PEG-lipidsystemet, hvor polymeren primært optager volumenet uden for dobbeltlaget, er denne ef…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne anerkender professor Benjamin Schuler for at dele udtrykket plasmid for ClyA-protein. Dette arbejde blev støttet af Human Frontier Science Program (RGP0047-2020).

Materials

2.5 ml Syringes HMD Healthcare Dispo Van, 2.5 ml Tuberculin Plastic syringe
Acetone Finar Chemicals 10020LL025
Acrylic Sheet 2 mm thick
Acrylic Sheet BigiMall 2 mm, Clear
Bath Sonicator Branson CPX-1800
Calcium Chloride
Chloroform Sigma 528730  HPLC grade
Cholesterol Avanti 700100
Coplin Jar Duran Wheaton Kimble S6016 8 Slide Jar with Glass Cover
Coverslips VWR 631-1574 24 mm X 50 mm
Cy3-DNA Strand IDT GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT
GGTGTGGTTGG-Cy3
Cyanine Dye (Cy3) Cytiva Life Sciences PA23001
DiI Invitrogen D3911 Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))
DNA Connector Strand 1 Sigma Aldrich GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT
GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC
T
DNA Connector Strand 2 Sigma Aldrich CGGACGCAATAGCAGCTCACAG
TCGGTCACAT
DNA Tocopherol Strand Biomers Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA
DOPE-PEG2000 Avanti 880130 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)
Double Sided Tape 3M LF93010LE
Drill Bits (Diamond Coated) 0.5 – 1 mm
Drilling Machine Dremel 220 Workstation
EMCCD Andor DU-897U-CS0-#BV
Fluorescence Beads Invitrogen F10720
Glass Slides Blue Star Micro Slides, PIC-1
Glass Vials Sigma 854190
Hydrogen Peroxide Lobachemie 00182 30% Solution, AR Grade
Labolene Thermo-Fischer Scientific  Detergent
Laser 532 nm Coherent Sapphire
Laser Cutter Universal Laser Systems ILS12.75
Lissamine Rhodamine DOPE Avanti 810150 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)
Methanol Finar Chemicals 30932LL025
Microscope Olympus IX81
Phosphate Buffer Saline (PBS) 1X
Plasma Cleaner Harrick Plasma Inc PDC-002
POPC Avanti 850457 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine
Programmable Syringe Pump New Era Pump Systems NE1010 High Pressure Syringe Pump
PTFE Caps Sigma 27141
PTFE Tubing Cole-Parmer WW-06417-21 Masterflex, 0.022" ID x 0.042" OD
Sulphuric Acid SD Fine Chemicals 98%, AR Grade
TIRF Objective Olympus UPLAPO100XOHR
Vacuum Desiccator Tarsons
Vortex Mixer Tarsons
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Löwe, M., Kalacheva, M., Boersma, A. J., Kedrov, A. The more the merrier: Effects of macromolecular crowding on the structure and dynamics of biological membranes. The FEBS Journal. 287 (23), 5039-5067 (2020).
  2. Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
  3. Horton, M. R., Höfling, F., Rädler, J. O., Franosch, T. Development of anomalous diffusion among crowding proteins. Soft Matter. 6 (12), 2648-2656 (2010).
  4. Jeon, J. H., Javanainen, M., Martinez-Seara, H., Metzler, R., Vattulainen, I. Protein crowding in lipid bilayers gives rise to non-Gaussian anomalous lateral diffusion of phospholipids and proteins. Physical Review X. 6 (2), 021006 (2016).
  5. Zhang, Y., et al. The influence of molecular reach and diffusivity on the efficacy of membrane-confined reactions. Biophysical Journal. 117 (7), 1189-1201 (2019).
  6. Loverdo, C., Bénichou, O., Moreau, M., Voituriez, R. Enhanced reaction kinetics in biological cells. Nature Physics. 4 (2), 134-137 (2008).
  7. Monine, M. I., Haugh, J. M. Reactions on cell membranes: Comparison of continuum theory and Brownian dynamics simulations. Journal of Chemical Physics. 123 (7), 074908 (2005).
  8. Berry, H. Anomalous diffusion due to hindering by mobile obstacles undergoing Brownian motion or Orstein-Ulhenbeck processes. Physical Review E. 89 (2), 22708 (2014).
  9. Saxton, M. J. Anomalous diffusion due to obstacles: A Monte Carlo study. Biophysical Journal. 66 (2), 394-401 (1994).
  10. Andersson, J., Fuller, M. A., Wood, K., Holt, S. A., Köper, I. A tethered bilayer lipid membrane that mimics microbial membranes. Physical Chemistry Chemical Physics. 20 (18), 12958-12969 (2018).
  11. Kaufmann, S., Papastavrou, G., Kumar, K., Textor, M., Reimhult, E. A detailed investigation of the formation kinetics and layer structure of poly(ethylene glycol) tether supported lipid bilayers. Soft Matter. 5 (14), 2804-2814 (2009).
  12. Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
  13. Labouta, H. I., et al. Surface-grafted polyethylene glycol conformation impacts the transport of PEG-functionalized liposomes through a tumour extracellular matrix model. RSC Advances. 8 (14), 7697-7708 (2018).
  14. Lee, H., Larson, R. G. Adsorption of plasma proteins onto PEGylated lipid bilayers: The effect of PEG size and grafting density. Biomacromolecules. 17 (5), 1757-1765 (2016).
  15. Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. Formation of solid-supported lipid bilayers: An integrated view. Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).
  16. Andersson, J., et al. Solid-supported lipid bilayers – A versatile tool for the structural and functional characterization of membrane proteins. Methods. 180, 56-68 (2020).
  17. Duncan, A. L., et al. Protein crowding and lipid complexity influence the nanoscale dynamic organization of ion channels in cell membranes. Scientific Reports. 7 (1), 1-15 (2017).
  18. Garenne, D., Libchaber, A., Noireaux, V. Membrane molecular crowding enhances MreB polymerization to shape synthetic cells from spheres to rods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 1902-1909 (2020).
  19. Pollock, N. L., Lee, S. C., Patel, J. H., Gulamhussein, A. A., Rothnie, A. J. Structure and function of membrane proteins encapsulated in a polymer-bound lipid bilayer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1860 (4), 809-817 (2018).
  20. Coker, H. L. E., et al. Controlling anomalous diffusion in lipid membranes. Biophysical Journal. 116 (6), 1085-1094 (2019).
  21. Rex, S., Zuckermann, M. J., Lafleur, M., Silvius, J. R. Experimental and Monte Carlo simulation studies of the thermodynamics of polyethyleneglycol chains grafted to lipid bilayers. Biophysical Journal. 75 (6), 2900-2914 (1998).
  22. Hallett, F. R., Watton, J., Krygsman, P. Vesicle sizing number distributions by dynamic light scattering. Biophysical Journal. 59 (2), 357-362 (1991).
  23. Jin, A. J., Huster, D., Gawrisch, K., Nossal, R. Light scattering characterization of extruded lipid vesicles. European Biophysics Journal. 28 (3), 187-199 (1999).
  24. Axelrod, D. Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).
  25. Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. 50 (1), 1-13 (2009).
  26. Fiolka, R., Belyaev, Y., Ewers, H., Stemmer, A. Even illumination in total internal reflection fluorescence microscopy using laser light. Microscopy Research and Technique. 71 (1), 45-50 (2008).
  27. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  28. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
  29. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  30. Jarmoskaite, I., Alsadhan, I., Vaidyanathan, P. P., Herschlag, D. How to measure and evaluate binding affinities. eLife. 9, 57264 (2020).
  31. Sathyanarayana, P., et al. Cholesterol promotes Cytolysin A activity by stabilizing the intermediates during pore formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7323-7330 (2018).
  32. Mueller, M., Grauschopf, U., Maier, T., Glockshuber, R., Ban, N. The structure of a cytolytic alpha-helical toxin pore reveals its assembly mechanism. Nature. 459 (7247), 726-730 (2009).
  33. Hubicka, K., Janczura, J. Time-dependent classification of protein diffusion types: A statistical detection of mean-squared-displacement exponent transitions. Physical Review E. 101 (2), 1-13 (2020).
  34. Kepten, E., Weron, A., Sikora, G., Burnecki, K., Garini, Y. Guidelines for the fitting of anomalous diffusion mean square displacement graphs from single particle tracking experiments. PLoS ONE. 10 (2), 0117722 (2015).
  35. Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nature Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
  36. McGuire, H., Aurousseau, M. R. P., Bowie, D., Blunck, R. Automating single subunit counting of membrane proteins in mammalian cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35912-35921 (2012).
  37. Hines, K. E. Inferring subunit stoichiometry from single molecule photobleaching. The Journal of General Physiology. 141 (6), 737-746 (2013).
  38. Zhang, H., Guo, P. Single molecule photobleaching (SMPB) technology for counting of RNA, DNA, protein and other molecules in nanoparticles and biological complexes by TIRF instrumentation. Methods. 67 (2), 169-176 (2014).
  39. Phillip, Y., Schreiber, G. Formation of protein complexes in crowded environments-From in vitro to in vivo. FEBS Letters. 587 (8), 1046-1052 (2013).
  40. Mittal, S., Chowhan, R. K., Singh, L. R. Macromolecular crowding: Macromolecules friend or foe. Biochimica et Biophysica Acta – General Subjects. 1850 (9), 1822-1831 (2015).
  41. Mashaghi, S., van Oijen, A. M. A versatile approach to the generation of fluid supported lipid bilayers and its applications. Biotechnology and Bioengineering. 111 (10), 2076-2081 (2014).
  42. Wong, W. C., et al. Characterization of single-protein dynamics in polymer-cushioned lipid bilayers derived from cell plasma membranes. The Journal of Physical Chemistry B. 123 (30), 6492-6504 (2019).
  43. Shashkova, S. S., Leake, M. C. Single-molecule fluorescence microscopy review: Shedding new light on old problems. Bioscience Reports. 37 (4), 20170031 (2017).
  44. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced fluorescence microscopy techniques-FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047 (2012).
  45. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  46. Carter, B. C., Vershinin, M., Gross, S. P. A comparison of step-detection methods: How well can you do. Biophysical Journal. 94 (1), 306-319 (2008).
  47. Otsuka, S., Ellenberg, J. Mechanisms of nuclear pore complex assembly – Two different ways of building one molecular machine. FEBS Letters. 592 (4), 475 (2018).
  48. Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Pressé, S. A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).
  49. Bryan, J. S., Sgouralis, I., Pressé, S. Enumerating high numbers of fluorophores from photobleaching experiments: A Bayesian nonparametrics approach. bioRxiv. , (2020).
  50. Bryan, J. S., Sgouralis, I., Pressé, S. Diffraction-limited molecular cluster quantification with Bayesian nonparametrics. Nature Computational Science. 2 (2), 102-111 (2022).
  51. Kim, Y., et al. Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines. Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).

Tags

Single-molecule ImagingPolymer-crowded Lipid MembranesSupported Lipid BilayersMembrane Biomolecular ReactionsDiffusionAssemblyPOPCDOPE-PEG(2000)Small Unilamellar VesiclesSonicationMicrofluidic Imaging Chambers

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Maurya, S., Rai, V. H., Upasani, A., Umrao, S., Parwana, D., Roy, R. Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes. J. Vis. Exp. (185), e64243, doi:10.3791/64243 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image