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Biochemistry

高分子密集脂質膜上での1分子拡散と集合

Published: July 19, 2022 doi: 10.3791/64243
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1, 1,3
1Department of Chemical Engineering, Indian Institute of Science, 2Holonyak Micro & Nanotechnology Lab, University of Illinois, Urbana-Champaign, 3Center for BioSystems Science and Engineering, Indian Institute of Science

Summary

ここでは、単一分子全反射蛍光(smTIRF)顕微鏡を使用して、人工混雑した脂質膜上の単一分子の結合、移動度、および組み立てを実行および分析するためのプロトコルが提示されます。

Abstract

細胞膜は、生体分子反応とシグナル伝達のための非常に混雑した環境です。それでも、タンパク質と脂質との相互作用を調べる ほとんどのin vitro 実験では、裸の二重膜を使用しています。このようなシステムは、膜に埋め込まれたタンパク質や糖鎖によるクラウディングの複雑さを欠いており、細胞膜表面に遭遇する関連する体積効果を排除しています。また、脂質二重層が形成される負に帯電したガラス表面は、膜貫通生体分子の自由な拡散を妨げる。ここでは、混雑した脂質膜の模倣物として十分に特徴付けられたポリマー脂質膜を紹介します。このプロトコルは、クラウダーを支持脂質二重層(SLB)に組み込むための一般化されたアプローチとして、ポリエチレングリコール(PEG)結合脂質を利用します。まず、単一分子実験を行うための顕微鏡スライドとカバーガラスの洗浄手順を紹介します。次に、PEG-SLBの特性評価と、単一分子トラッキングとフォトブリーチングを使用した生体分子の結合、拡散、および組み立ての単一分子実験を実行する方法について説明します。最後に、このプロトコルは、単一分子光退色分析を使用して、混雑した脂質膜上の細菌の細孔形成毒素Cytolysin A(ClyA)のナノポアアセンブリを監視する方法を示しています。サンプルデータセットを含むMATLABコードも含まれており、粒子追跡、拡散挙動の抽出、サブユニットカウントなどの一般的な分析の一部を実行します。

Introduction

細胞膜は非常に混雑した複雑なシステムです1。分子クラウディングは、タンパク質や脂質などの膜結合エンティティの拡散に大きな影響を与える可能性があります2,3,4。同様に、受容体二量体化や膜複合体のオリゴマー化のような脂質膜上の二分子反応は、クラウディングの影響を受けます5,6,7。クラウダーの性質、配置、および濃度は、いくつかの方法で膜結合、拡散性、およびタンパク質間相互作用を制御することができます8,9。細胞膜上の膜クラウディングを制御し、埋め込まれた生体分子への影響を解釈することは困難であるため、研究者は代替のin vitroシステムを確立しようと試みてきました10。

人工混雑膜の一般的なアプローチは、二重膜にポリマー(ポリエチレングリコール、PEGなど)グラフト脂質をドープすることです11,12。支持された脂質二重層(SLB)上のタンパク質と脂質のダイナミクスを視覚化する際に、これらのポリマーは、二重層を下にある支持体から効果的に持ち上げることにより、膜に埋め込まれた成分を下にある負に帯電した基板(ガラスなど)からさらに保護します。ポリマーのサイズおよび濃度を変化させることによって、分子クラウディングの程度、ならびに下にある固体支持体からのその分離を制御することができる13、14。これは明らかに、膜貫通生体分子がその活性を失う可能性があるポリマークッション15,16のない固体基質上に支持された脂質二重層よりも有利である17,18,19。さらに重要なことに、それは私たちが多くの膜プロセスにとって重要であるin vitroで細胞膜の混雑した環境を再現することを可能にします。

膜上に表面グラフトされたポリマーも、そのグラフト密度に応じてそれらの配置の変化を受ける12。低濃度では、それらは膜表面の上にキノコとして知られるエントロピーコイル状の配置のままである。濃度が増加するにつれて、それらは相互作用し始め、ほどけて伸びる傾向があり、最終的に膜21上に緻密なブラシ様の形成をもたらす。キノコからブラシレジームへの移行は非常に不均一であり、ポリマーの特性が不十分な条件で現れるため、ポリマーグラフト膜上の混雑には十分に特徴付けられた条件を使用することが重要です。最近の研究20と比較して、膜貫通生体分子の拡散輸送と活性を維持する混雑した膜組成を特定し、報告しています。

このプロトコルでは、PEG化脂質膜を生成する方法について説明し、ポリマー配置の2つの異なるレジーム(つまり、キノコとブラシ)での混雑を模倣するPEG密度の推奨事項を提供します。このプロトコルでは、これらの混雑した膜に埋め込まれた分子の単一分子結合、粒子追跡、および光退色データの取得と分析についても説明します。まず、徹底的な洗浄手順、イメージングチャンバーの組み立て、およびPEG-SLBの生成について説明します。次に、単一分子結合、粒子追跡、および光退色実験の詳細を提供します。第三に、i)相対的な結合親和性の抽出、ii)分子拡散の特徴付け、およびiii)膜上の単一分子の動画からのタンパク質集合体のサブユニットのカウントについて説明します。

このシステムを単一分子イメージングで特徴付けましたが、このプロトコルは、脂質膜に対する生体分子反応に対するクラウディングの影響を理解することに関心のあるすべての膜生物物理学者にとって有用です。全体として、混雑して支持された脂質二重層を作成するための堅牢なパイプラインと、それらに対して実施されるさまざまな単一分子アッセイ、および対応する分析ルーチンを紹介します。

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Protocol

1. 1分子実験用スライド・カバーガラスの洗浄

  1. イメージングチャンバーを組み立てる前に、カバーガラスとスライドの両方を清掃して準備します。ダイヤモンドコーティングされたドリルビット(直径0.5〜1 mm)を備えたボール盤を使用して、スライドガラスに複数のペアの穴を開けます。アクリル板を使用する場合は、 図1に示すように、レーザーカッターを使用して正確な穴(0.5mm)を開けます。
    注:穴の各ペアは、個々のマイクロ流体チャンバーのフロー交換の入口と出口として機能します。アクリルスライドの穴の代表的なCADファイルは、 補足コーディングファイル1にあります。スライドガラスに開けられた穴は、通常、ドリルビットサイズの1.5倍から2倍大きくなります。
  2. スライドとカバーガラスを洗剤で拭きます。脱イオン水でよくすすいでください。スライドとカバーガラスを水で別のスライド染色(コプリン)ジャーに入れ、バス超音波処理器で30分間超音波処理します。すべての超音波処理手順では、70 Wの電力設定を使用します。
  3. 水を取り除き、スライドガラスとカバーガラスを含むコプリンジャーにアセトンをつばまで満たします(ジャーの容量に応じて50〜100 mL)。アクリルシートの場合、同じ量の予備混合された50%(v / v)アセトン溶液を使用すると、スライドが冷ややかになります。すべてのスライドとカバーガラスが完全に溶液に浸されていることを確認するためにCoplinジャーを振って、30分間バス超音波処理器で超音波処理します。
  4. アセトンを取り除き、廃棄物容器に捨て、メタノールをコプリンジャー(50%、アクリルスライドの場合はv / v)に注ぎ、30分間超音波処理します。アセトンとメタノールの両方を使用して、スライド上の有機粒子を除去します。
  5. スライドとカバーガラスを大量のタイプ1水ですすぎ、ガラスのコプリンジャーに入れます。1 M KOH溶液を瓶に注ぎ、1時間超音波処理します。アクリルスライドには、0.5MのKOHを使用してください。
  6. KOHは無機廃棄物容器に廃棄してください。瓶を多量の水ですすぎ、ピラニア治療のためにコプリン瓶をヒュームフードに入れます。アクリルスライドのピラニア処理を行わないでください。手順1.9に直接進みます。
    注意: ピラニア治療は、適切な手袋、安全メガネ、および酸を取り扱うためのエプロンを備えたヒュームフードで行う必要があります。ピラニア溶液は強力な酸化剤であり、スライドやカバーガラスから残った有機粒子を取り除きます。
  7. ピラニア溶液を調製するには、2/3容量の硫酸(98%、v / v)をガラスビーカーにそっと注ぎ、残りを過酸化水素(30%、v / v)で満たします。溶液をガラス棒で注意深く混合し、それをコプリンジャーに注ぎ、コプリンジャーをヒュームフードに少なくとも1時間放置します。
  8. コプリンジャーからピラニア溶液をデカントし、ヒュームフード内に保管されている酸廃棄物の廃棄容器に入れます。コプリンジャーを大量のタイプ1水ですすいでください。
  9. スライドとカバーガラスを窒素ガスの穏やかな流れで乾かし、きれいなコプリンジャーに入れます。乾燥したスライドとカバーガラスは、プラズマ処理の準備が整いました。スライドとカバーガラスのペアを取り、プラズママシンに置きます。
  10. チャンバー内に真空を作ります。ノブを8〜12MHzの無線周波数に回して、チャンバー内でプラズマを生成します。チャンバー内の紫色の輝きは、チャンバー内にプラズマが形成されたことを示します。
  11. プラズマ処理を8〜10分間行います。プラズマをオフにした後、真空を静かに解放し、マイクロ流体イメージングチャンバーを組み立てるための手順2に進みます。

2. マイクロ流体チャンバーの組み立て

注意: イメージングチャンバーは、以下に説明するように、前の手順で事前にクリーニングされたカバーガラスとスライドの間に両面テープを挟むことによって作成されます。

  1. 図1に示すように、プラズマ処理後のスライドとカバーガラスを組み立てます。スライドガラスを清潔なティッシュペーパーの上に置きます。両面テープを幅2~3 mmのストリップにカットし、スライドガラスの穴の両側に置きます。ピペットチップを使用してテープを平らにしないと、あるチャネルから別のチャネルに漏れが発生します。
    メモ: または、レーザーまたは自動プロッタカッターを使用して、スライド全体のテープをカットします(図1)。
  2. プラズマ処理されたカバーガラスをテープで留めたスライドの上に置き、チャンバーを閉じます。ピペットチップを使用してカバーガラスをテープ領域にそっと押し付け、チャネルを水密にします。
  3. スライドガラスを使用する場合は、エポキシ樹脂を使用して端をシールします。最後に、スライドとカバーガラスから作られた各イメージングチャンバーは、10 mm x 2 mm x 0.1 mm(長さx幅x奥行き)の寸法を持っています。調製したマイクロ流体イメージングチャンバーを乾燥条件(好ましくは10〜25°C)で1〜2週間保存する。
    注意: アクリルスライドで使用されるレーザーカットテープの場合、テープの端がしっかりと漏れ防止シールを形成するため、エポキシを使用する必要はありません。

3. ベシクル融合によるガラス基板上の担持二重膜作製

注:ドープされたPEG脂質で調製された脂質小胞の融合により、イメージングチャンバーの壁に混雑した支持脂質二重層が生成されます。

  1. 清潔なガラスバイアル、できればピラニア溶液を使用して事前に洗浄してください。1-パルミトイル-2-オレオイル-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC)および1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[アミノ(ポリエチレングリコール)-2000](DOPE-PEG2000)のクロロホルム溶液を、バッファー添加後の最終濃度がステップ3.4で3 mM脂質になるようにPEG2000脂質の所望のモル分率で加えます。脂質の他の膜組成物も同様に調製する。
  2. 乾燥した脂質がバイアルの表面に均一にコーティングされるように、小さな渦巻きを伴う穏やかな窒素流を使用してバイアルからクロロホルムを乾燥させます。バイアルを真空デシケーターに1時間入れます。これにより、ガラスバイアル内の残留クロロホルムが除去されます。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)1 mLを加え、37°Cで一晩インキュベートします。
  3. 以下に説明するように、小さな単層小胞(SUV)を準備します。
    1. 一晩インキュベートした後、溶液が濁って乳白色になるまで1〜2分間穏やかにボルテックスします。
    2. 小さな500μLの遠沈管にこの溶液100μLを取り、バス超音波処理器(70Wの電力設定に設定)で約1時間超音波処理します。解決策が明らかになります。そうでない場合は、さらに30分間超音波処理します。このステップにより、直径50〜100nmのSUVが生成されます。
      注意: 初めて準備する場合は、動的光散乱22,23(DLS)または同等の方法を使用してSUVの特性評価を行います。
  4. 塩化カルシウム(CaCl 2、3Mストック)を超音波処理された小胞に加え、 その最終濃度が脂質溶液中で30mMになるようにする。
  5. 穴にしっかりと収まるようにサンプル溶液を注入するためのマイクロピペットチップを切ります。脂質溶液を混合し、ステップ2で作ったイメージングチャンバーの穴の1つから注入します。隣接するチャネルの汚染を防ぐために、出口からチャンバーから出てくる余分な溶液をきれいなティッシュで拭きます。
  6. このアセンブリを加湿チャンバーに90分間放置します。50 mLの遠沈管の端にウェットティッシュを配置して加湿チャンバーを準備します。チューブキャップを閉じた状態で、スライドをチューブの内側に横向きに置きます。小胞は融合し、ガラス表面に均一な二重層を生成します。
  7. チャンバーを大量のPBSバッファー(イメージングチャンバーの容量の約5倍)で十分に洗浄します。洗浄中に気泡がチャンバー内に侵入すると、膜に欠陥が発生する可能性があるため、防止してください。

4. 顕微鏡のセットアップと単粒子イメージング測定

注:単一分子実験は、対物レンズベースの全反射蛍光24、25、26 (TIRF)顕微鏡セットアップで実行されます(図2)。TIRFイメージングは、1分子イメージングにおいてより優れたS/N比を提供しますが、落射蛍光顕微鏡は特定の条件下でも使用できます(特に、蛍光生体分子を洗浄によってバルク溶液から除去できる場合)。プリズム型TIRFを用いてもよいが、マイクロフルイディクス27のセットアップを容易にするため対物型が好ましい。対物レンズタイプのTIRFには、開口数の高い対物レンズ(倍率100倍、通常はTIRF対物レンズとして市販)を推奨します。

  1. 移動度と組み立てに関する実験を行う前に、TIRF顕微鏡の位置を合わせて、エバネッセント場による照明による最適な信号対雑音比を確保します。アライメント中は、レーザー出力を100μWから1mWの間で低く保ちます。
    注意: レーザービームの位置合わせ中は、レーザー安全メガネを使用する必要があります。
    1. 顕微鏡の位置合わせをするには、単一のビーズの蛍光スポットが画像内で重ならないように、低濃度(~100 pM)でマイクロ流体チャネルに蛍光ビーズサンプルを添加して蛍光ビーズサンプルを調製します。
    2. まず、落射蛍光モードでビーズを視覚化します。照明が落射蛍光モードのときに、M5ミラー平行移動ステージ(レーザーをダイクロイックに反射するミラー)を移動して、対物レンズから出てくるビームが最終的に全内部反射構成になるまで曲がるようにします。
    3. TIR照明が実現されたかどうかを確認します。TIRエバネッセントフィールドがビーズサンプルを照らしているときは、表面のビーズのみが見え、表面から離れた自由に浮遊するビーズが観察されないことを確認してください。
  2. 実験の開始時に、対物レンズの背面焦点面のレーザー出力を5〜10 mWに設定して、蛍光色素の光破壊(光退色)を防ぎます。
  3. スライドを顕微鏡ステージに置き、最初に裸のメンブレン(蛍光色素なし)に焦点を合わせます。通常、これを行うには、脂質膜中の微量の不純物で十分です。オプション:ステップ3.1の間に少数の蛍光ビーズまたは量子ドット(サブピコモル範囲)を組み込み、正しい焦点の識別を容易にするために、視野内に2〜5個の蛍光粒子のみが存在するようにします。
  4. ステップ3.7で作製したPEG-SLBコートイメージングチャンバーにマイクロピペットを用いてサンプル(膜タンパク質等)を注入します。
  5. 単一分子結合動態を測定するには、シリンジポンプを使用して、標識された生体分子を入口孔からマイクロ流体チャンバーに流します(図3)。50〜500μL/分の流量を使用してください。
    1. イメージングチャンバーに溶液を追加する前に、動画取得を開始してください。膜表面に新しいスポットの出現がさらに増加しなくなるまで、連続フロー下で25〜50フレーム/秒のフレームレートで>5,000フレームを取得します(ビデオ1)。結合速度論の分析については、6.1の手順に従ってください。
  6. 単一粒子追跡の場合は、マイクロピペットを使用して、低濃度(結合定数と比較して)で標識された生体分子をチャネルに追加します。濃度を<0.1粒子/μm 2の密度に最適化して、個々の粒子が経路を横切ることがめったにないようにします(ビデオ2)。これにより、データセットから復元されたトラックの忠実度が高まります。必要に応じて加湿環境でインキュベートし(生体分子による膜結合が不十分な場合は~10分)、チャンバーをバッファーで洗浄します。
    注:メンブレン上の結合が不十分で、ほとんどの蛍光分子が溶液に残っている場合は、洗浄が必要です。そうしないと、イメージングに干渉し、信号対雑音比が低下する可能性があります。
  7. 単粒子軌道解析では、10-100フレーム/秒で200-500フレームを取得します。対物レンズを二層平面に焦点を合わせ、取得間隔中のステージドリフトを最小限に抑えます。

5. タンパク質集合体のサブユニットをカウントするための画像取得

注:化学量論を推定するための画像取得では、蛍光色素を継続的に漂白し、蛍光を発する蛍光色素がなくなるまでステップ数を検出する必要があります。

  1. サブユニットを測定するには、標識された生体分子の関連する濃度を追加します(例:結果を参照;ClyAを25nM濃度で添加した)をマイクロ流体イメージングチャンバーに添加し、インキュベートする(必要に応じて洗浄する)。スライドを加湿チャンバー内で希望の温度で必要な時間インキュベートします(例:ClyAの組み立ての場合は37°Cと60分)。
  2. 以下に説明するように、単一分子光退色の画像取得を実行します。
    1. イメージングの前に、イメージングチャンバーをバッファーで洗浄します(必要な場合)。スライドを顕微鏡に置き、焦点を調整して標識分子を視覚化します。
    2. レーザー出力を、蛍光色素の漂白が徐々に起こるレベル(~1-5分)に設定します。理想的には、組み立てられた生体分子ごとに、フォトブリーチングステップレートを>10〜20イメージングフレーム離して維持します。すべての分子が完全に光退色するまで画像を取得します (ビデオ3)。
      注意: 必要な光退色軌道の合計持続時間を決定するには、個々のスポットの平均強度をイメージングフレーム数でプロットし、指数関数を当てはめて時定数を決定します。取得の合計期間は、時定数の5〜10倍に設定できます。
  3. サンプルがチャンバーに導入されたらすぐにフィルム取得を開始し、PEG-SLBの異なるセグメントから膜結合後に一定の時間間隔で新しい光退色フィルムを取得することにより、時間依存アセンブリ測定を実行します。

6.画像とデータの分析

  1. 以下に説明するように、単一粒子結合および追跡を実行する。
    1. 図4に示すように、上記で取得した動画から単粒子の軌跡を抽出します。単一粒子を検出して追跡するには、MATLAB パッケージ u-track28、または堅牢な単一粒子追跡アルゴリズムも提供する ImageJ のプラグインである Trackmate29 を使用します。補足ファイル 1 に示すように、u-track 解析を設定する手順に従います。
      注:単一粒子追跡の重要なパラメータは、粒子サイズの標準偏差(ピクセル単位)とギャップ閉鎖長です。これらのパラメーターには、追跡の最も厳しい基準として、それぞれ 1 と 0 を使用します。
    2. 結合速度定数を計算するには、まず、時間の経過に伴う膜表面に結合する粒子の数を推定します。u-track出力フォルダーを含むMATLABファイルbinding_SPT(補足コーディングファイル2)を使用して、ステップ6.1で取得したメンブレンに現れる粒子の数を特定してプロットします。観測された動力学を適切な動力学モデルに適合させます(例:時定数を決定するための単一指数適合、その逆数を見かけの速度定数に割り当てることができます)30 速度定数を抽出します(結果を参照、 図5)。
    3. 拡散粒子の平均二乗変位(MSD)(PEG-SLBのDNAトレーサーなど、 図6)は拡散の性質を示しています。MATLABパッケージMSD_ISD(補足コーディングファイル2)をu-track出力フォルダとともに使用して、ラグタイムの関数としてMSDプロットを取得します(図6B)。
    4. 異種拡散種を特定するには、図6Cに示すように瞬間二乗変位(ISD)分布を計算します。ISD2は、(X t+τ - X t)2 + (Yt+τ− Yt)2と定義され、ラグタイムτ = 2はノイズを低減するため好まれます。ノイズを減らすために、3フレーム未満の短い軌道を除外します。
    5. u-track出力とともにMATLABのISD_analyzer(補足コーディングファイル2)を使用して、追跡された粒子のISDをプロットします(図6C)。
  2. 以下に説明するように、単一分子の光退色分析を実行します。
    1. 膜複合体の化学量論を推定するために、蛍光複合体の時間依存強度についてフォトブリーチング分析を実行します(ビデオ3)。このためには、動画フレームの自己相関に基づくドリフト補正アルゴリズム(drift_correct_images、 補足コーディングファイル2)を適用して、平行移動ドリフトを抽出します。これは、組み立てられた構造が画像取得中にほとんど動かないことを前提としています。MATLAB パッケージ Extract_traces_1C (補足コーディング ファイル 2) を実行して、ムービーから粒子強度のタイム トレースを検出します。
    2. MATLABコードStepcount_immobile(補足コーディングファイル2)を使用して、強度タイムトレースのステップ検出を実行します。パーティクルが動かない場合は、u-trackパッケージを使用して移動するパーティクルの位置を抽出します。このxy座標のセットを生の映画にマッピングして、膜上を横方向に拡散する移動粒子の強度値を抽出できます。このオプションの U-Track 解析の出力と共に、MATLAB パッケージ utrack_Int (補足コーディング ファイル 2) を使用します。
    3. 蛍光色素タグによる生体分子の不完全な標識の補正を行い、正しいタンパク質複合体の化学量論を推定します。UV-VIS分光光度計で色素とタンパク質の吸収を測定して標識効率を決定し、濃度を推定します。標識効率は、タンパク質に対する色素のモル比として算出する。
      注:一部の色素は280nmに近い波長でも吸収するため、色素によるこの吸収寄与は濃度計算中に考慮する必要があります。
    4. MATLABコードStep_correction(補足コーディングファイル2)とステップ6.2.2のステップカウントから得られたデータを使用して、蛍光色素の不完全な標識効率を説明するために二項補正を実行します。たとえば、ドデカマーリング様構造を形成するサイトリシンAのような細孔形成毒素の場合、次の式を使用して二項補正を適用します。
      エヌkEquation 1
      ここで Equation 2 、=ラベリング効率、n =光退色ステップの数、s =実際のカウント。MATLABルーチンStepcount_immobileを使用して、修正されたオリゴマー種を回復します。オリゴマーの周波数(si)を質量分率に変換します(図7C; 補足コーディング・ファイル 2)。
      注: U-Track 解析ファイルのセットは、補足コーディング ファイル 3 に含まれています。 補足コーディング・ファイル 2 の MATLAB コードは、これらのデータ・セットを使用して実行できます。

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Representative Results

PEG化メンブレンへのClyAタンパク質の結合のモニタリング
ステップ4.5の後、結合速度論は、膜表面に結合する粒子の数を経時的にプロットすることによって推定される(ビデオ1)。ClyAタンパク質が5mol%のPEG2000脂質を含む膜に結合すると、粒子密度が増加し、飽和に達します(図5)。結合粒子(シアンの円)への指数関数的減衰適合は、膜結合の時定数(τb)を与える(特に、この場合、初期時点[赤い円]は適合しない)。

混雑した膜上でのDNAトレーサーの移動度
私たちは一般的に、DNAトレーサー(トコフェロールで膜に固定されたDNA)、親油性トレーサー色素(DiIなど)、または膜タンパク質(ClyAなど)を使用して、PEGを介した混雑下で膜を特徴付けます。標識トレーサー分子の横方向拡散(25〜100 pM)は、粒子結合時に膜をイメージングすることによって監視できます。膜にPEGポリマーがない場合、ほとんどのトレーサー(特に二重層の外側に伸びているトレーサー)は、SLB上での拡散が制限されています(図6A)。膜中のPEG2000のレベルが少ない(0.5〜2モル%)と、二重層は下の表面から持ち上げられ、トレーサー分子は制約なしに拡散できます。一方、高濃度のPEG(20モル%)では、PEG分子が高密度のブラシ領域にあり、その間にさまざまな挙動が見られる極端な閉じ込めが観察されます。これら3つの条件のMSDプロットを 図6Bに示します。POPC/DOPE-PEG2000二分子膜の特性評価に基づいて、キノコレジームに混雑を誘発する1〜3モル%のDOPE-PEG2000画分をお勧めします。7.5 mol%PEG2000-脂質を超えると、ブラシレジームの開始を観察し、25 mol%PEG2000-脂質までの組成物を使用して、混雑と閉じ込めを誘発することができます。2つのレジーム間の移行に対応する介在する4〜7%のPEG2000脂質状態は、特徴が不十分であり、避ける必要があります。

混雑した膜へのClyAの組み立て
混雑した膜上でインキュベートした後のClyAタンパク質の個々の回折限界スポットの強度軌跡(図7A、B)は、多数の異なる光退色ステップを示し、様々な集合中間体の形成を示唆している31。膜貫通タンパク質であるClyAは、PEGの非存在下で負に帯電したガラス表面と相互作用し、非常に貧弱に組み立てます。7.5モル%PEG2000脂質で、組み立てられた複合体を測定し、図7Cにプロットした。標識効率(この場合は0.9)を補正した後、オリゴマーの最終分布は、ドデカマーClyA種を優勢構造として表示し、構造データ32と一致する。

Figure 1
図1:洗浄ステップとマイクロ流体チャンバーアセンブリの概略図。 (A)スライドガラスとカバーガラスは、洗剤、アセトン、メタノール、KOH、およびピラニア溶液中の連続超音波処理で洗浄され、各ステップの間にタイプ1超純水による複数のすすぎが行われます。スライドとカバーガラスは、プラズマ処理の前に窒素ガスで乾燥されます。(B)次に、マイクロ流体イメージングチャンバーは、スライドをカバーガラスに結合する事前にカットされた両面粘着テープを使用して組み立てられます。※アクリルスライドはピラニア溶液で処理せず、アセトン、メタノール、KOHはカバーガラス洗浄用濃度の50%(v/v)濃度で使用しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:TIRF顕微鏡のセットアップ。 倒立顕微鏡に適合した典型的な対物レンズタイプのTIRF顕微鏡のセットアップは、必須の光学系が強調表示されて示されています。M1〜M5は、レーザービームを操縦するためのミラーです。レンズL1とL2はレーザービームを拡大するために使用され、L3レンズはレーザービームを対物レンズの後焦点面に集束させます。I1とI2は、レーザービームを整列させるために使用されるアイリス絞りです。シャッターは、蛍光分子の不要な光退色を防ぐために重要なレーザービーム照明を制御するために使用されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:膜結合速度論フローのセットアップ。 結合実験を行うために、薄いPTFEチューブ(IDで0.022 x ODで0.042)を使用して、シリンジポンプの助けを借りてサンプルを流動させます(画像はスケーリングされません)。チューブの端部は、マイクロピペットチップの助けを借りてイメージングチャンバー出口に接続される。廃棄物は、出口に差し込まれた小さなマイクロチップリザーバーに集められ、導入される体積は常にイメージングチャンバーの容積の10倍以上である。撮像室の断面を示す挿入図。(画像は拡大縮小されません)この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:単一粒子軌道と光退色動画からの分析のためのパイプライン。 (A)取得した動画をMATLABのu-trackを使用して分析し、軌道を(x、y)として、各粒子の強度(i)をフレームごとに取得しました。次に、これらの軌道を使用して、瞬間二乗変位(ISD)、ISD1、およびISD2を計算しました。次に、ISDをヒストグラムとしてプロットして、移動種を識別できます。または、平均二乗変位(MSD)プロットは、運動がガウス分布、閉じ込め、または超拡散性のいずれであるかを示します33,34。隠れマルコフモデル35(HMM)解析は、単一の粒子の異なる拡散状態を区別するために使用できます。(B)光退色分析では、最初にシステム内のドリフトを動画で補正し(必要な場合)、次に粒子検出またはUトラックを使用した追跡を行いました。強度分布23(および他の粒子の特徴)を推定することとは別に、強度軌跡は、ステップファインディングアルゴリズム36、37、38を使用して、光退色ステップの数について分析することができる。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:5 mol%DOPE-PEG2000による担持脂質膜へのClyAの結合。典型的な結合曲線は、u-trackによって識別された各フレーム内の粒子の数を数えた後に得られる。イメージングは、膜結合性ClyAタンパク質の流れの前に開始されます。粒子番号(シアンの円)に適合する指数関数(黒い線)を使用して、ClyAの膜への結合の時定数を回復します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6:PEG脂質二重膜上の親油性DNAの移動度 。 (A)POPC/DOPE-PEG2000メンブレンにおける親油性DNAトレーサーの概略図を示す。(B)異なるPEG-SLBの単一粒子追跡から計算された平均二乗変位を示します。2 mol%DOPE-PEG2000では、DNAトレーサーは、ポリマーの非存在下での妨げられた移動度と比較して、純粋なブラウン挙動を示します(破線は参照用に含まれています)。一方、同じDNAトレーサーは純粋なブラウン拡散から逸脱し、20 mol%DOPE-PEG2000の存在下で移動度が低下したサブ拡散運動を示します。(C)2つの異なるPEG2000脂質膜における親油性DNAトレーサーの拡散のためのISD2分布を裸のSLBと比較します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 7
図7:脂質二重膜上の光退色痕跡とClyAの集合 。 (A,B)代表的なタイムトレースは、ステップ6.2.1で検出されたClyAナノポア複合体のフォトブリーチングステップを示す。組み立てられたClyA複合体の場合、それぞれ7ステップと5ステップがあります。(C)64.7%POPCでインキュベートしたClyA(25nM)の光退色ステップ分布(灰色):27.8%コレステロール:7.5%DOPE-PEG2000メンブレンを37°Cで60分間インキュベートします。不完全な標識効率を補正した後、様々なオリゴマー種(マゼンタ)の推定質量分率が示されている。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ビデオ1:膜へのClyAの結合。 5mol%DOPE-PEG2000を含むSLBメンブレンに結合するCy3標識ClyAタンパク質をモニタリングする。結合した粒子はu-trackによって検出され(シアンの円)、トラックは軌道内の後続の5つの位置にプロットされます。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ビデオ2:2 mol%PEGメンブレン上のDNAトレーサーの拡散。 2 mol%PEG2000膜のトコフェロールを介して脂質膜に固定されたCy3標識DNAの動画。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ビデオ3:フォトブリーチングムービー。 7.5mol%DOPE-PEG2000を含む膜上にCy3標識ClyA分子のオリゴマーを組み立てた動画である。より大きな複合体は、単一のタンパク質と比較して数倍高い強度、および連続照明下で粒子強度が経時的に観察される場合の複数の光退色ステップから明らかです。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:ステップ6でu-trackおよび異なるMATLABコードを使用する方法に関する情報。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足コーディングファイル1:アクリルスライドに穴を開け、スライド全体のテープをカットするための代表的なコンピューター支援設計(CAD)ファイル。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足コーディングファイル2:手順6の画像およびデータ分析に必要な関連するMATLABコードを含む圧縮フォルダー。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足コーディング ファイル 3: 手順 6 の画像およびデータ解析用のサンプル データ。MATLABコードは https://github.com/sgmaurya/SMTrack_Analysis でも入手できます。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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Discussion

ここでは、膜埋め込み生体分子の混雑した環境を示す支持脂質二重層(SLB)の単一分子実験を示します。混雑した環境は排除された体積効果を生成し、生体分子反応の増強につながります1,2,39,40。ポリマーが主に二重層の外側の体積を占めるPEG脂質系の場合、この効果は大きなエクトドメインを持つ分子種で特に顕著です。したがって、親油性色素と比較して、受容体、糖タンパク質、糖脂質などの膜に埋め込まれた大きな親水性分子の拡散を大幅に低減することができる。トコフェロールを介して膜に固定された蛍光トレーサーDNAを用いて(図5)、このようなクラウディング効果を特定することができます。

これとは別に、下部のリーフレット中のPEGの存在はまた、SLBを持ち上げ、生体分子と支持基板との相互作用を減少させる14、41。通常、イメージングガラス表面の負に帯電した表面は、移動度や分子反応を妨げることがよくあります。したがって、膜をガラスから持ち上げるためにPEG脂質を使用することは、混雑を目的としない場合であっても有利である。ただし、そのような場合に分子クラウディングを示さない濃度レジームを特定するように注意する必要があります。二重層の外側により大きなドメインを延長するタンパク質の場合、PEG5000などのより高分子量のPEG脂質の使用が必要な場合があります42。

SLBシステムでの単一分子イメージングには、いくつかの重要なポイントが重要です。スライドとカバーガラスの厳密な洗浄は、単一分子実験(ステップ1)において重要です。不純物を含む表面をイメージングすると、脂質膜に欠陥が生じます。これにより、膜表面に蛍光標識された生体分子のパッチが生じる可能性があります。形成されたSLBの被覆率と均一性は、脂質色素(DiIまたはリッサミンローダミンDOPE)を二重層にドープし、蛍光顕微鏡でイメージングすることにより、別の調製で検証できます。FRAP分析は、拡散挙動のベンチマークにも使用することができる43,44。

メンブレン結合実験(ステップ4)では、チャンバーへの気泡の侵入を防ぐために、チューブのフローセットアップをバッファーでプライミングする必要があります。より高い流量または気泡の存在は膜を破裂させ、分子はカバーガラスに直接結合します。一部の分子がチューブから拡散してメンブレンに結合するため、フローが始まる前に画像取得を開始する必要があります。イメージング中に二層に対物レンズを集中させることは、金ナノ粒子、量子ドット、または蛍光ビーズを低濃度で二層にドープすることによって促進することができる。

単一粒子追跡実験では、粒子軌道の過度の重なりのために追跡が困難なシナリオを回避するために、膜上の粒子の数を制御する必要があります。イメージング中に考慮すべきもう一つの重要な要素は、レーザー出力です。レーザー出力が高いと蛍光色素が素早く退色しますが、低強度で画像取得速度が遅いとぼやけが生じます。最適なレーザー出力は、粒子の対称的で回折制限に近い画像を維持しながら、かなりの軌道長(平均で少なくとも>5)を生成する必要があります。酸素消去システムは、蛍光色素45の光退色を延長するためにも使用できます。ここで提示される光退色分析の制限は、核孔複合体47のような大きな分子集合体(~20サブユニットを超える)の場合に生じる37,46。そのような場合、ベイジアンベースのアプローチを利用して、サブユニット集団48、49、50を推測することができる。

ほとんどの場合、蛍光色素による生体分子の標識は完全ではありません51。これは、ラベルのない種を持つクラスター内のサブユニットをカウントする際に課題をもたらします。標準以下の標識効率の二項補正は、通常、分子種の化学量論が固定されている場合の妥当な近似値です。多くの場合、オリゴマー化プロセスのように、オリゴマー種は不均一または動的に変化する可能性があり、光退色データから基礎となる分布を抽出するための新しいツールの開発が必要です。

全体として、このプロトコルは、PEG-SLBを生成するためのパイプラインを提供し、単一分子結合を使用、実行、分析するための条件、および膜生体分子の光退色分析の追跡と実行に関する推奨事項を提供します。

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Disclosures

著者は開示するものは何もありません。

Acknowledgments

著者らは、ClyAタンパク質の発現プラスミドを共有したベンジャミン・シューラー教授を認めています。本研究は、ヒューマンフロンティアサイエンスプログラム(RGP0047-2020)の支援を受けて行われました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.5 ml Syringes HMD Healthcare Dispo Van, 2.5 ml Tuberculin Plastic syringe
Acetone Finar Chemicals 10020LL025
Acrylic Sheet 2 mm thick
Acrylic Sheet BigiMall 2 mm, Clear
Bath Sonicator Branson CPX-1800
Calcium Chloride
Chloroform Sigma 528730  HPLC grade
Cholesterol Avanti 700100
Coplin Jar Duran Wheaton Kimble S6016 8 Slide Jar with Glass Cover
Coverslips VWR 631-1574 24 mm X 50 mm
Cy3-DNA Strand IDT GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT
GGTGTGGTTGG-Cy3
Cyanine Dye (Cy3) Cytiva Life Sciences PA23001
DiI Invitrogen D3911 Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))
DNA Connector Strand 1 Sigma Aldrich GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT
GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC
T
DNA Connector Strand 2 Sigma Aldrich CGGACGCAATAGCAGCTCACAG
TCGGTCACAT
DNA Tocopherol Strand Biomers Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA
DOPE-PEG2000 Avanti 880130 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)
Double Sided Tape 3M LF93010LE
Drill Bits (Diamond Coated) 0.5 - 1 mm
Drilling Machine Dremel 220 Workstation
EMCCD Andor DU-897U-CS0-#BV
Fluorescence Beads Invitrogen F10720
Glass Slides Blue Star Micro Slides, PIC-1
Glass Vials Sigma 854190
Hydrogen Peroxide Lobachemie 00182 30% Solution, AR Grade
Labolene Thermo-Fischer Scientific  Detergent
Laser 532 nm Coherent Sapphire
Laser Cutter Universal Laser Systems ILS12.75
Lissamine Rhodamine DOPE Avanti 810150 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)
Methanol Finar Chemicals 30932LL025
Microscope Olympus IX81
Phosphate Buffer Saline (PBS) 1X
Plasma Cleaner Harrick Plasma Inc PDC-002
POPC Avanti 850457 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine
Programmable Syringe Pump New Era Pump Systems NE1010 High Pressure Syringe Pump
PTFE Caps Sigma 27141
PTFE Tubing Cole-Parmer WW-06417-21 Masterflex, 0.022" ID x 0.042" OD
Sulphuric Acid SD Fine Chemicals 98%, AR Grade
TIRF Objective Olympus UPLAPO100XOHR
Vacuum Desiccator Tarsons
Vortex Mixer Tarsons

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高分子密集脂質膜上での1分子拡散と集合
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Maurya, S., Rai, V. H., Upasani, A., Umrao, S., Parwana, D., Roy, R. Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes. J. Vis. Exp. (185), e64243, doi:10.3791/64243 (2022).… More

Maurya, S., Rai, V. H., Upasani, A., Umrao, S., Parwana, D., Roy, R. Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes. J. Vis. Exp. (185), e64243, doi:10.3791/64243 (2022).

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