Här presenteras ett protokoll för att utföra och analysera bindning, rörlighet och sammansättning av enskilda molekyler på artificiella trånga lipidmembran med hjälp av enmolekylär total intern reflektionsfluorescens (smTIRF) mikroskopi.
Cellmembran är mycket trånga miljöer för biomolekylära reaktioner och signalering. Ändå använder de flesta in vitro-experiment som undersöker proteininteraktion med lipider nakna dubbelskiktsmembran. Sådana system saknar komplexiteten i trängsel av membraninbäddade proteiner och glykaner och utesluter de associerade volymeffekterna som uppstår på cellulära membranytor. Den negativt laddade glasytan på vilken lipid-dubbelskikten bildas förhindrar också fri diffusion av transmembranbiomolekyler. Här presenterar vi ett väl karakteriserat polymer-lipidmembran som en efterlikning för trånga lipidmembran. Detta protokoll använder polyetylenglykol (PEG) -konjugerade lipider som ett generaliserat tillvägagångssätt för att införliva crowders i det stödda lipid-dubbelskiktet (SLB). Först presenteras en rengöringsprocedur av mikroskopiska glidbanor och täckglas för att utföra enmolekylära experiment. Därefter diskuteras metoder för att karakterisera PEG-SLB: erna och utföra enmolekylära experiment av bindning, diffusion och sammansättning av biomolekyler med hjälp av enmolekylspårning och fotoblekning. Slutligen visar detta protokoll hur man övervakar nanoporsammansättningen av bakteriellt porbildande toxin Cytolysin A (ClyA) på trånga lipidmembran med enmolekylär fotoblekningsanalys. MATLAB-koder med exempeldatauppsättningar ingår också för att utföra några av de vanliga analyserna, till exempel partikelspårning, extrahering av diffusivt beteende och räkning av underenheter.
Cellmembran är mycket trånga och komplexa system1. Molekylär trängsel kan ha en betydande inverkan på diffusionen av membranbundna enheter som protein och lipider 2,3,4. På liknande sätt påverkas bimolekylära reaktioner på lipidmembran som receptordimerisering eller oligomerisering av membrankomplex av trängsel 5,6,7. Crowders natur, konfiguration och koncentration kan styra membranbindningen, diffusiviteten och protein-proteininteraktionen på flera sätt 8,9. Eftersom det är utmanande att kontrollera membranträngsel på cellmembran och tolka dess påverkan på inbäddade biomolekyler, har forskare försökt etablera alternativa in vitro-system 10.
Ett populärt tillvägagångssätt för konstgjorda trånga membran är dopning av dubbelskiktsmembranen med polymer (såsom polyetylenglykol, PEG) -ympade lipider11,12. Under visualiseringen av protein- och lipiddynamik på stödda lipid-dubbelskikt (SLB) skyddar dessa polymerer dessutom de membraninbäddade komponenterna från det underliggande negativt laddade substratet (såsom glas) genom att effektivt lyfta dubbelskiktet bort från det underliggande stödet. Genom att variera polymerens storlek och koncentration kan man kontrollera omfattningen av molekylär trängsel, liksom dess separation från det underliggande fasta stödet13,14. Detta är helt klart en fördel jämfört med lipid-dubbelskikt som stöds på fasta substrat utan polymerkuddar15,16, där transmembranbiomolekyler kan förlora sin aktivitet17,18,19. Ännu viktigare är att det gör det möjligt för oss att rekapitulera den trånga miljön i cellmembranet in vitro, vilket är avgörande för många membranprocesser.
Ytympade polymerer på membran genomgår också förändringar i deras konfiguration beroende på deras ympningstäthet12. Vid låga koncentrationer förblir de i en entropiskt lindad konfiguration, känd som en svamp, ovanför membranytan. Med ökande koncentration börjar de interagera och tenderar att lossa och sträcka sig, vilket slutligen ger en tät borstliknande bildning på membranet21. Eftersom övergången från svampen till borstregimen är mycket heterogen och manifesterar sig i dåligt karakteriserade förhållanden hos polymeren, är det viktigt att använda väl karakteriserade förhållanden för trängsel på polymerympade membran. Jämfört med en nyligen genomförd studie20 identifierar och rapporterar vi trånga membrankompositioner som upprätthåller diffusiv transport och aktivitet av transmembranbiomolekyler.
I detta protokoll diskuterar vi hur man genererar PEGylerade lipidmembran och ger rekommendationer för PEG-densiteter som efterliknar trängsel i två olika regimer av polymerkonfiguration (nämligen svamp och borste). Protokollet beskriver också enmolekylbindning, partikelspårning och fotoblekning av datainsamling och analys för molekyler inbäddade i dessa trånga membran. Först beskriver vi de grundliga rengöringsstegen, monteringen av bildkammaren och genereringen av PEG-SLB. För det andra tillhandahåller vi detaljer för enmolekylbindnings-, partikelspårnings- och fotoblekningsexperiment. För det tredje diskuterar vi i) extrahering av de relativa bindningsaffiniteterna, ii) karakteriserande molekylär diffusion och iii) räkning av underenheter i en proteinsammansättning från filmer av enstaka molekyler på membranet.
Medan vi karakteriserade detta system med enmolekylavbildning, är protokollet användbart för alla membranbiofysiker som är intresserade av att förstå effekten av trängsel på biomolekylära reaktioner på lipidmembran. Sammantaget presenterar vi en robust pipeline för att göra trånga och stödda lipid-dubbelskikt, tillsammans med olika enmolekylära analyser som utförs på dem och motsvarande analysrutiner.
Här demonstrerar vi enmolekylära experiment på stödda lipid-dubbelskikt (SLB) som manifesterar en trång miljö för membraninbäddade biomolekyler. Den trånga miljön genererar en utesluten volymeffekt, vilket leder till förbättring av biomolekylära reaktioner 1,2,39,40. För PEG-lipidsystemet, där polymeren primärt upptar volymen utanför dubbelskiktet, är denna effekt särskilt ut…
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner professor Benjamin Schuler för att ha delat uttrycket plasmid för ClyA-protein. Detta arbete stöddes av Human Frontier Science Program (RGP0047-2020).
2.5 ml Syringes | HMD Healthcare | Dispo Van, 2.5 ml Tuberculin | Plastic syringe |
Acetone | Finar Chemicals | 10020LL025 | |
Acrylic Sheet | 2 mm thick | ||
Acrylic Sheet | BigiMall | 2 mm, Clear | |
Bath Sonicator | Branson | CPX-1800 | |
Calcium Chloride | |||
Chloroform | Sigma | 528730 | HPLC grade |
Cholesterol | Avanti | 700100 | |
Coplin Jar | Duran Wheaton Kimble | S6016 | 8 Slide Jar with Glass Cover |
Coverslips | VWR | 631-1574 | 24 mm X 50 mm |
Cy3-DNA Strand | IDT | GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT GGTGTGGTTGG-Cy3 |
|
Cyanine Dye (Cy3) | Cytiva Life Sciences | PA23001 | |
DiI | Invitrogen | D3911 | Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) |
DNA Connector Strand 1 | Sigma Aldrich | GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC T |
|
DNA Connector Strand 2 | Sigma Aldrich | CGGACGCAATAGCAGCTCACAG TCGGTCACAT |
|
DNA Tocopherol Strand | Biomers | Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA | |
DOPE-PEG2000 | Avanti | 880130 | 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) |
Double Sided Tape | 3M | LF93010LE | |
Drill Bits (Diamond Coated) | 0.5 – 1 mm | ||
Drilling Machine | Dremel | 220 | Workstation |
EMCCD | Andor | DU-897U-CS0-#BV | |
Fluorescence Beads | Invitrogen | F10720 | |
Glass Slides | Blue Star | Micro Slides, PIC-1 | |
Glass Vials | Sigma | 854190 | |
Hydrogen Peroxide | Lobachemie | 00182 | 30% Solution, AR Grade |
Labolene | Thermo-Fischer Scientific | Detergent | |
Laser 532 nm | Coherent | Sapphire | |
Laser Cutter | Universal Laser Systems | ILS12.75 | |
Lissamine Rhodamine DOPE | Avanti | 810150 | 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) |
Methanol | Finar Chemicals | 30932LL025 | |
Microscope | Olympus | IX81 | |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | 1X | ||
Plasma Cleaner | Harrick Plasma Inc | PDC-002 | |
POPC | Avanti | 850457 | 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine |
Programmable Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE1010 | High Pressure Syringe Pump |
PTFE Caps | Sigma | 27141 | |
PTFE Tubing | Cole-Parmer | WW-06417-21 | Masterflex, 0.022" ID x 0.042" OD |
Sulphuric Acid | SD Fine Chemicals | 98%, AR Grade | |
TIRF Objective | Olympus | UPLAPO100XOHR | |
Vacuum Desiccator | Tarsons | ||
Vortex Mixer | Tarsons |