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Biochemistry

Visualisation de la dynamique conformationnelle des récepteurs membranaires à l’aide d’une seule molécule FRET

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/64254
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Molecular Biosciences, Northwestern University

Summary

Cette étude présente une procédure détaillée pour effectuer des expériences de transfert d’énergie par résonance de fluorescence à molécule unique (smFRET) sur des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) en utilisant un marquage spécifique au site via l’incorporation d’acides aminés non naturels (UAA). Le protocole fournit un guide étape par étape pour la préparation des échantillons smFRET, les expériences et l’analyse des données.

Abstract

La capacité des cellules à répondre aux signaux externes est essentielle au développement, à la croissance et à la survie cellulaires. Pour répondre à un signal de l’environnement, une cellule doit être capable de le reconnaître et de le traiter. Cette tâche repose principalement sur la fonction des récepteurs membranaires, dont le rôle est de convertir les signaux dans le langage biochimique de la cellule. Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) constituent la plus grande famille de protéines réceptrices membranaires chez l’homme. Parmi les RCPG, les récepteurs métabotropiques du glutamate (mGluR) sont une sous-classe unique qui fonctionne comme dimères obligatoires et possède un grand domaine extracellulaire qui contient le site de liaison au ligand. Les progrès récents dans les études structurelles des mGluR ont amélioré la compréhension de leur processus d’activation. Cependant, la propagation de changements conformationnels à grande échelle par mGluR pendant l’activation et la modulation est mal comprise. Le transfert d’énergie par résonance de fluorescence à molécule unique (smFRET) est une technique puissante pour visualiser et quantifier la dynamique structurelle des biomolécules au niveau de la protéine unique. Pour visualiser le processus dynamique d’activation de mGluR2, des capteurs conformationnels fluorescents basés sur l’incorporation d’acides aminés non naturels (UAA) ont été développés qui ont permis le marquage des protéines spécifiques au site sans perturbation de la structure native des récepteurs. Le protocole décrit ici explique comment effectuer ces expériences, y compris la nouvelle approche d’étiquetage UAA, la préparation des échantillons et l’acquisition et l’analyse des données smFRET. Ces stratégies sont généralisables et peuvent être étendues pour étudier la dynamique conformationnelle d’une variété de protéines membranaires.

Introduction

Le transfert d’informations à travers la membrane plasmique dépend fortement de la fonction des récepteurs membranaires1. La liaison du ligand à un récepteur entraîne un changement conformationnel et l’activation du récepteur. Ce processus est souvent de nature allostérique2. Avec plus de 800 membres, les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) constituent la plus grande famille de récepteurs membranaires chez l’homme3. En raison de leur rôle dans presque tous les processus cellulaires, les RCPG sont devenus des cibles importantes pour le développement thérapeutique. Dans le modèle canonique de signalisation GPCR, l’activation agoniste entraîne des changements conformationnels du récepteur qui activent ensuite le complexe protéique G hétérotrimérique via l’échange de GDP contre GTP à la poche de liaison nucléotidique de Gα. Les sous-unités Gα-GTP et Gβγ activées contrôlent alors l’activité des protéines effectrices en aval et propagent la cascade de signalisation 4,5. Ce processus de signalisation dépend essentiellement de la capacité des ligands à modifier la forme tridimensionnelle du récepteur. Une compréhension mécaniste de la façon dont les ligands y parviennent est essentielle pour développer de nouvelles thérapies et concevoir des récepteurs et des capteurs synthétiques.

Les récepteurs métabotropiques du glutamate (mGluR) font partie de la famille des RCPG de classe C et sont importants pour les effets neuromodulateurs lents du glutamate et le réglage de l’excitabilité neuronale 6,7. Parmi tous les RCPG, les RCPG de classe C sont structurellement uniques en ce sens qu’ils fonctionnent comme des dimères obligatoires. Les mGluR contiennent trois domaines structuraux : le domaine du piège à mouches de Vénus (VFT), le domaine riche en cystéine (CRD) et le domaine transmembranaire (TMD)8. Les changements conformationnels au cours du processus d’activation sont complexes et impliquent un couplage conformationnel local et global qui se propage sur une distance de 12 nm, ainsi que la coopérativité des dimères. Les conformations intermédiaires, l’ordre temporel des états et le taux de transition entre les états sont inconnus. En suivant la conformation des récepteurs individuels en temps réel, il est possible d’identifier les états intermédiaires transitoires et la séquence des changements conformationnels lors de l’activation. Ceci peut être réalisé en appliquant le transfert d’énergie de résonance de fluorescenceà molécule unique 9,10 (smFRET), comme cela a été récemment appliqué pour visualiser la propagation des changements conformationnels lors de l’activation de mGluR2 11. Une étape clé dans les expériences FRET est la génération de capteurs FRET par insertion spécifique au site des fluorophores donneurs et accepteurs dans la protéine d’intérêt. Une stratégie d’incorporation d’acides aminés non naturels (UAA) a été adoptée12,13,14,15 pour surmonter les limites des technologies typiques de marquage fluorescent spécifiques au site qui nécessitent la création de mutants sans cystéine ou l’insertion d’une grande étiquette génétiquement codée. Cela a permis d’observer le réarrangement conformationnel de l’essentiel liant allostérique, qui a rejoint les domaines de liaison et de signalisation du ligand de mGluR2. Dans ce protocole, un guide étape par étape pour effectuer des expériences smFRET sur mGluR2 est présenté, y compris l’approche pour le marquage spécifique au site de mGluR2 avec UAA pour fixer des fluorophores en utilisant la réaction de cyclisation de l’azoture catalysée par le cuivre. De plus, ce protocole décrit la méthodologie pour la capture directe des protéines membranaires et l’analyse des données. Le protocole décrit ici est également applicable à l’étude de la dynamique conformationnelle d’autres protéines membranaires.

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Protocol

Le flux de travail global du protocole est décrit à la figure 1.

1. Préparation de la chambre d’échantillonnage

  1. Nettoyage des glissières et des lamelles de couverture
    NOTE: Ces étapes visent à nettoyer les surfaces des lames ainsi que les lames de recouvrement et à les préparer à l’aminosilanisation. Une exigence critique pour mener des expériences de fluorescence à molécule unique sur des molécules attachées à la surface est une surface passivée. La technique de passivation la plus fiable et la plus reproductible consiste à attacher de manière covalente des chaînes polymères inertes à la surface du verre sous forme de couche dense. Le polyéthylèneglycol (PEG) est le polymère le plus efficace utilisé pour la passivation de surface16. Les détails de la procédure de passivation à l’aide de PEG (PEGylation) sont décrits ci-dessous:
    1. Marquez les trous à percer sur les glissières à l’aide d’un marqueur (~6 mm d’écart et éloigné du bord). Utilisez un Dremel pour percer de petits trous (1 mm de diamètre) sur la lame de verre. Immergez les lames dans l’eau pendant le processus de forage.
    2. Lavez les lames avec de l’acétone pour enlever l’encre résiduelle du marqueur.
    3. Retirer de l’acétone et rincer les lames à l’eau, puis les cuire au micro-ondes pendant 5 min dans de l’eau à haute puissance (700 W).
    4. Nettoyez les lames avec de l’eau avant de les placer dans un bocal à colorer en verre à sonifier. Placez les lamelles dans un pot de coloration différent.
    5. Sonifier les lames et les lames de couverture dans de l’acétone pendant 30 min dans un sonicateur de bain à 23 °C.
    6. En attendant, nettoyez une fiole en verre pour préparer la solution d’aminosilanisation utilisée lors de l’étape suivante. Remplir la fiole avec 1 M KOH, sonifier la fiole pendant 30 min, rincer soigneusement le KOH avec de l’eau, puis sonifier pendant 30 minutes supplémentaires dans du méthanol. Laisser la fiole dans le méthanol jusqu’au moment de l’étape d’aminosilanisation.
    7. En attendant, retirez l’aminosilane, le mPEG et la biotine-PEG du congélateur (-20 °C) et laissez-les atteindre la température ambiante (RT) dans l’obscurité.
    8. Éliminer l’acétone des bocaux à lames et à couvercles dans le récipient à déchets chimiques approprié, rincer abondamment à l’eau, puis sonifier les lames dans 5 M KOH pendant 30 min.
    9. Rincer les lames et les lames de couverture avec de l’eau, puis soniquer dans le méthanol pendant 2 minutes (répéter deux fois). Laissez les pots remplis de méthanol jusqu’à l’étape d’aminosilanisation.
      NOTE: Dans cette étude, l’eau désionisée est utilisée, sauf indication contraire. Un sonicateur de bain fonctionnant à 23 °C est utilisé.
  2. Aminosilanisation
    REMARQUE: Cette étape vise à lier de manière covalente l’aminosilane à la surface propre de la lame et du couvre-couvercle. Le mPEG fonctionnalisé et la biotine-PEG se lieront de manière covalente à cette surface à l’étape suivante.
    1. Préparer un mélange d’aminosilanisation dans une fiole propre (étape 1.6). Préparer la solution en mélangeant du méthanol (150 mL), de l’acide acétique (7,5 mL, utiliser une pipette en verre) et de l’aminosilane (2,5 mL).
    2. Mélangez doucement la solution dans la hotte chimique, puis versez-la dans les bocaux à glissière et à couvercle. Utilisez 50 mL pour les lames et 100 mL pour les lames. Assurez-vous que les lames et les lames de couverture sont complètement immergées dans la solution.
    3. Incuber pendant 10 min, puis sonifier les pots pendant 1 min (la sonication élimine les impuretés de la surface) et incuber pendant encore 10 min.
    4. Éliminer la solution d’aminosilanisation dans le conteneur de collecte des déchets. Ajouter du méthanol dans les bocaux, fermer les bocaux avec des couvercles et secouer doucement à la main. Jetez le méthanol et remplissez les bocaux avec de l’eau.
    5. Remettre le flacon d’aminosilane au congélateur (−20 °C).
  3. PEGylation
    Remarque : Ces étapes décrivent la procédure PEGylation.
    1. Pendant l’aminosilanisation, préparer le tampon de pégylation. Peser 84 mg de bicarbonate de sodium (NaHCO3) et l’ajouter à 10 mL d’eau (10 mM). De plus, pesez le mPEG et la biotine-PEG et mettez-les de côté. Pour six lames et lames de couverture, utilisez 96 mg de mPEG et 1,2-2,4 mg de biotine-PEG.
      REMARQUE: Il est important de ne pas ajouter trop de biotine-PEG car cela peut augmenter le nombre de taches de fond. Ne dissoudre le mélange de PEG que juste avant l’application sur les lames.
    2. Rincez les lames avec de l’eau, séchez-les avec un léger souffle d’air, puis placez-les dans les boîtes de montage humidifiées.
      REMARQUE: Il est essentiel d’utiliser une compagnie aérienne propre. Évitez d’utiliser de l’air comprimé en conserve, qui peut laisser des résidus sur le verre.
    3. Ajouter le tampon de pégylation au mélange de poudre PEG et pipeter doucement de haut en bas plusieurs fois pour dissoudre. Ajouter 55 μL de tampon de pégylation par lame (pour six lames, ajouter 330 μL de tampon de pégylation).
    4. Centrifuger à 9 600 x g pendant 1 min à 23 °C pour précipiter les particules non dissoutes. Récupérez le surnageant à utiliser à l’étape suivante.
      REMARQUE: La biotine-PEG s’hydrolyse rapidement en raison de la présence du groupe NHS. Il est important de faire les étapes de mélange et de centrifugation rapidement.
    5. Appliquez 60 μL de solution de PEGylation sur chaque lame, puis placez la lamelle de couverture sur le dessus de sorte que la solution de PEGylation soit prise en sandwich entre la lame et la lame.
      REMARQUE: Évitez d’introduire des bulles entre la glissière et la lame, car cela réduirait l’efficacité de la passivation. Enlevez les bulles en ajustant la lamelle de couverture et la glissière à l’aide d’un embout de pipette.
    6. Placez les diapositives dans un tiroir plat et sombre. Les diapositives peuvent être stockées pendant la nuit; Cependant, l’incubation pendant 4 à 6 h entraîne une passivation optimale.
      REMARQUE: Il est essentiel de se rappeler quel côté est pégylé.
    7. Marquez le côté non pégylé avant le stockage. Après l’incubation, démonter délicatement et rincer soigneusement les lames et les lames de couverture avec de l’eau
    8. Sécher les lames et les lames de couverture en soufflant de l’air. Conservez les lames et les lames de recouvrement dans un tube stérile (50 mL), la surface PEGylée étant tournée l’une vers l’autre. Conserver à −20 °C jusqu’au jour de l’expérience.
      REMARQUE: Il est préférable d’utiliser des lames et des feuillets de couverture dans les 4 semaines suivant la préparation. Les surfaces PEGylées doivent être éloignées les unes des autres. Le stockage des lames et des lames de couverture PEGylated dans des sacs scellés sous vide peut augmenter leur durée de conservation.

2. Expression de mGluR2 avec acide aminé non naturel incorporé, marquage fluorescent et extraction

NOTE: Ce protocole décrit la préparation, les réactifs et le traitement des cellules pour exprimer mGluR2 contenant la 4-azido-L-phénylalanine (AZP) de la SAU. La procédure concerne les cellules HEK293T cultivées sur des lamelles de verre de 18 mm. La procédure peut être étendue si nécessaire.

  1. Semis
    REMARQUE : Maintenir les cellules HEK293T dans le DMEM supplémentées en 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin, 100 unités·mL−1 pénicilline-streptomycine et 15 mM de tampon HEPES (dossier supplémentaire 1) (pH 7,4) à 37 °C sous 5 % de CO2.
    1. Passage des cellules avec 0,05% de trypsine-EDTA. Ensemencez les cellules HEK293T sur des lamelles de verre en poly-L/D-lysine (PLL/PDL) afin qu’elles atteignent ≥80% de confluence au moment de la transfection.
  2. Transfection
    1. Préparer une solution mère de 40 mM d’AZP dans 0,1 M de NaOH.
    2. Préparer les milieux supplémentés en AZP pour la croissance des cellules et l’expression de mGluR2. Compléter le support standard (+ FBS, stylo/streptocoque, HEPES 15 mM) en utilisant une solution mère AZP 40 mM. Porter la concentration finale d’AZP à 0,6 mM. Ajouter 1 M de solution HEPES (la moitié du volume de 40 mM de solution mère AZP ajoutée). Par exemple, pour préparer 10 mL de milieux supplémentés en AZP, combiner 9,775 mL de milieu standard, 150 μL de solution mère d’AZP 40 mM et 75 μL de solution mère HEPES 1 M.
    3. Filtrer (stériliser) le média à l’aide d’un filtre à seringue (0,2 μm, PES).
    4. Remplacer le support standard par un support contenant des supports supplémentés en AZP avant la transfection.
      REMARQUE: Veillez à ne pas sécher les cellules lors du remplacement du support.
    5. Transfecter les cellules avec le réactif de transfection (Tableau des matériaux) en suivant le manuel du fabricant. Transfect de cellules HEK293T sur une lamelle de couverture de 18 mm en utilisant un total de 2 μg d’ADN (1000 ng d’ARNt/synthétase + 1000 ng de plasmide protéique contenant du codon ambré). Se reporter au tableau 1 pour connaître la concentration et le volume des composants utilisés.
    6. Changez le milieu 24 h après la transfection dans un milieu frais supplémenté en AZP et laissez les cellules se développer pendant 24 heures supplémentaires.
  3. Marquage avec des colorants alcyne cyanine
    1. 20 min avant l’étiquetage, laver deux fois les lamelles de couverture avec un tampon d’enregistrement chaud (RB) (fichier supplémentaire 1) et les déplacer sur un support standard chaud (37 °C) sans AZP (+ FBS, stylo/Strep, HEPES 15 mM).
    2. Préparer la solution d’étiquetage contenant du Cy3-alcyne, du Cy5-alcyne, du BTTES, du sulfate de cuivre (II) (CuSO4), du (+) L-ascorbate de sodium et de l’aminoguanidine.
    3. Suivez l’ordre de fabrication et d’ajout des solutions (Tableau 2) :
      1. Préparez 50 mM de BTTES.
      2. Préparer 100 mM d’aminoguanidine.
      3. Préparer 100 mM Na-ascorbate.
      4. Préparer 655,5 μL de RB.
      5. Ajouter le colorant alcyne Cy3/Cy5 (10 mM en stock de DMSO) au RB.
        REMARQUE: Ajouter l’aminoguanidine au RB.
      6. Préparer 20 mM CuSO4.
      7. Mélanger CuSO4 et BTTES dans un nouveau tube (la solution deviendra bleue).
      8. Ajouter le mélange CuSO4 et BTTES au RB (2.3.3.6.)
      9. Ajouter le Na-Ascorbate.
      10. Suivre le volume indiqué dans le tableau 2 ci-dessous pour obtenir un capset de 18 mm.
    4. Bien mélanger la solution et incuber sur de la glace et dans l’obscurité pendant 10 minutes avant de marquer les cellules.
    5. Avant d’ajouter la solution d’étiquetage aux lamelles de couverture, retirez le support et lavez-les avec RB. Ajouter la solution d’étiquetage et incuber pendant 15 min à 37 °C dans l’obscurité.
    6. REMARQUE: Pour améliorer l’étiquetage, ajoutez du glutamate (concentration finale ~ 0,5 mM) après 10 min et incuber pendant 5 minutes supplémentaires. Le cuivre est très toxique pour les cellules et la réaction de marquage ne doit pas se poursuivre plus de 15 minutes in vivo. Préparez tous les composants frais. Ajouter Na-Ascorbate en dernier. Maintenir la réaction à 4°C pendant la préparation. Cependant, lors de l’ajout de la solution de marquage, les cellules doivent être stockées à 37 ° C à l’intérieur de l’incubateur.
  4. Récolte des cellules et extraction des protéines (lyse cellulaire)
    1. Retirez la solution d’étiquetage et lavez deux fois avec le RB la lamelle de couverture (18 mm) contenant les cellules transfectées mGluR2.
    2. À l’aide d’une pipette, laver les cellules de la lamelle de couverture et les remettre en suspension dans RB (1 mL).
      REMARQUE: Minimiser l’exposition de l’échantillon à la lumière autant que possible après ce point.
    3. Enduire les cellules en tournant à 1 000 x g à 4 °C pendant 5 min et retirer le surnageant. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans 80-130 μL de la solution de lyse.
      REMARQUE: La pastille de cellule doit être visible à l’œil. Le volume de lyse dépend de la quantité d’échantillon perdue pendant le processus d’étiquetage et de lavage.
    4. Mélanger doucement par pipetage pour briser le granulé. Envelopper dans du papier d’aluminium et placer sur la bascule à 4 °C pendant 0,5-1 h pour lyser les cellules.
    5. Enduit la fraction insoluble par centrifugation à 20 000 x g et 4 °C pendant 20 min. Transférez le surnageant dans un tube froid frais (la protéine lysée qui contient la protéine marquée par fluorescence d’intérêt) et stockez-le sur de la glace pour des expériences.

3. Assemblage et fonctionnalisation de la chambre d’écoulement à molécule unique

  1. Retirez la lame et le couvercle du congélateur et laissez-les chauffer à TA dans l’obscurité (~30 min).
  2. Assemblez la chambre à l’aide de ruban adhésif double face en prenant en sandwich des bandes de ruban adhésif double face entre la glissière et la lamelle de couverture. Assurez-vous que les surfaces PEGylées forment l’intérieur de la chambre d’écoulement.
  3. À l’aide d’une pointe de pipette, appuyez sur le couvercle pour vous assurer que le ruban entre en contact complet avec le couvercle et la glissière; Veillez à ne pas casser le bordereau. Appliquez de l’époxy sur les bords des lames.
    REMARQUE: N’ajoutez pas trop que l’époxy remplit les trous percés.
  4. Placez la chambre d’écoulement avec le côté couvercle orienté vers le bas dans une boîte sombre humidifiée pour permettre à l’époxy de sécher (~30 min).
    REMARQUE : Ajouter un tampon T50 (dossier supplémentaire 1) à travers les trous percés pour empêcher l’époxy de recouvrir les trous (10-15 μL) pendant la période de séchage.
  5. Incuber chaque voie de chambre avec 500 nM de Neutravidin (diluée dans T50) en appliquant lentement ~40 μL sur chaque voie.
  6. Incuber à TA pendant 2 min dans une boîte sombre humidifiée. Laver avec ~100 μL de tampon T50 par voie.
  7. Incuber chaque voie de chambre avec un anticorps biotinylé20 nM 11. Le choix de l’anticorps dépend de l’étiquette sur la protéine.
    REMARQUE: Si l’anticorps primaire n’est pas biotinylé, incuber d’abord avec l’anticorps secondaire biotinylé pendant 30 minutes, puis incuber avec l’anticorps primaire.
  8. Incuber à TA pendant 30 minutes dans une boîte sombre humidifiée. Laver avec ~200 μL de T50 par voie.
    REMARQUE: Assurez-vous que les voies ne sèchent jamais pendant le processus de préparation.

4. Tampons monomoléculaires

  1. Tampon Trolox
    REMARQUE: Trolox buffer est le tampon de départ pour créer un tampon d’imagerie. Les composants du tampon dépendent de l’expérience et peuvent varier en fonction de la protéine d’intérêt. Le tampon utilisé dans le protocole décrit ici comprend les sels (NaCl, KCl, CaCl 2, MgCl2), l’agent tampon (HEPES) et le Trolox (pH ~ 7,35).
    1. Dissoudre 9 à 10 mg de Trolox dans 10 mL de tampon d’enregistrement à molécule unique (SRB, dossier supplémentaire 1)
      REMARQUE: Trolox rend le tampon légèrement acide. Ajuster le pH à ce stade en utilisant une solution d’hydroxyde de sodium (NaOH), 10 M (pH 7,35). L’ajustement fin du pH sera effectué après la dissolution complète du Trolox; cependant, l’augmentation du pH à ce stade augmente la solubilité du Trolox.
    2. Mélanger la solution à TA à l’aide d’une bascule de paillasse pendant 4 à 8 h (enveloppée dans du papier d’aluminium) pour dissoudre complètement le Trolox.
    3. Vérifiez le pH et ajustez-le si nécessaire.
    4. Assurez-vous que le Trolox est complètement dissous. Stériliser la solution avec un filtre à seringue et la conserver à 4 °C.
      REMARQUE: Le tampon doit être utilisé après 2-10 jours de vieillissement. Trolox aide à supprimer le clignement des yeux et est couramment utilisé dans les études sur une seule molécule17. Les propriétés anti-clignotement proviennent d’un dérivé oxydé de Trolox18; par conséquent, il est recommandé de le garder à RT pendant au moins quelques heures pour mûrir. De plus, le rayonnement UV de la solution fraîche de Trolox accélère le processus d’oxydation et peut être utilisé pour accélérer le « vieillissement » du tampon Trolox18.
  2. Recette du tampon d’imagerie: Mélanger tampon Trolox + détergent (~2 fois la valeur CMC du détergent) + 4 mM d’acide protocatéchuique (PCA).
    REMARQUE: La concentration de détergent est maintenue près de CMC car des concentrations élevées de détergent peuvent entraîner une dénaturation accrue des protéines. Par exemple, le mélange suivant peut être utilisé 955 μL Trolox + 5 μL 10% DDM + cholestérol (W%, 10:1) + 40 μL de solution mère de PCA 100 mM. Ici, le PCA agit comme un agent antioxydant et était auparavant utilisé dans les études smFRET19. Le DDM est non ionique, est couramment utilisé pour solubiliser les protéines membranaires20,21 et a été utilisé dans des études sur une seule molécule. DDM est un bon détergent de premier choix; Cependant, nous recommandons de tester plusieurs détergents et de vous assurer que les résultats sont cohérents.

5. Configuration du microscope et acquisition de données smFRET

  1. Allumez l’ordinateur et le microscope. Allumez les lasers pour vous réchauffer (532 nm pour l’excitation Cy3 et 640 nm pour l’excitation Cy5).
    REMARQUE: Ici, un microscope inversé équipé d’un objectif TIRF 100x (N.A. 1.49), d’un séparateur d’image et d’une caméra EMCCD a été utilisé. L’installation est équipée d’un combinateur laser à quatre lignes, d’un miroir dichroïque, d’un filtre d’émission passe-long, d’un filtre dichroïque à émission et d’un filtre à encoche.
  2. Allumez la caméra EMCCD et ouvrez le logiciel de l’appareil photo. Attendez 20 minutes pour que la caméra atteigne −69 °C et se stabilise.
  3. Montez la chambre d’échantillonnage sur la platine du microscope. Ajouter l’échantillon de protéines progressivement pour obtenir ~400 molécules par champ de vision (étape 2.4.5). Lavez la chambre avec 100 μL de tampon d’imagerie.
  4. Ajustez le gain, le taux d’acquisition et les puissances laser de manière à ce que les signaux de fluorescence d’une seule molécule soient détectés dans les canaux donneur et accepteur. Ajustez la concentration des protéines à l’intérieur de la chambre d’échantillonnage si nécessaire.
    REMARQUE: Avec plus de 400 molécules dans le champ de vision, la distinction des molécules individuelles devient plus difficile et le bruit de fond sera plus élevé.
  5. Excitez le donneur et acquérez des traces de temps jusqu’à ce qu’au moins 80% des molécules donneuses dans le champ de vision soient photoblanchies.
  6. À la fin du film, allumez le laser 640 nm pour exciter directement l’accepteur jusqu’à ce que certaines des molécules acceptrices photoblanchissent, facilitant ainsi la discrimination d’une seule molécule à partir de multimères.
  7. Passez à un autre champ de vision et répétez les étapes ci-dessus pour collecter au moins trois films (répliques techniques) par condition.
    REMARQUE: Utilisez la puissance laser la plus faible possible lors de la sélection d’une nouvelle région d’intérêt (ROI) et de la mise au point pour minimiser le photoblanchiment. Faites attention à la dérive de scène lors de l’acquisition. Si une dérive notable est observée après le passage à un nouveau retour sur investissement, attendez 3 minutes avant de commencer l’acquisition.

6. Analyse des données

  1. Alignement des canaux donneur et accepteur (mappage vidéo)
    1. Enregistrez les images des billes fluorescentes dans les canaux donneur et accepteur.
    2. Générer le fichier de cartographie en utilisant les données de billes pour corréler la fluorescence donneuse et acceptrice de chaque molécule22,23.
      REMARQUE: Le signal d’émission d’une seule molécule est divisé en signaux donneur et accepteur par le filtre dichroïque d’émission à l’intérieur du séparateur d’image. Les images du donneur et de l’accepteur sont projetées côte à côte sur la caméra. Pour associer avec précision les intensités donneuse et acceptrice d’une seule molécule entre les deux zones, un fichier de cartographie est souvent généré à l’aide d’échantillons de billes fluorescentes. À l’aide de ce fichier de mappage, toutes les molécules détectées dans les canaux donneur et accepteur sont mappées les unes sur les autres. L’analyse génère ensuite les traces temporelles, qui sont les intensités donneuse et acceptrice dans le temps, pour chaque molécule.
  2. Sélection de traces FRET monomoléculaires (prélèvement de particules)
    REMARQUE : les traces de particules individuelles sont examinées et sélectionnées pour une analyse en aval à l’aide de MATLAB. Les critères de sélection exacts dépendent du système. Des lignes directrices générales sur ce qui constitue une particule de qualité sont décrites ici. Tous les codes personnalisés sont disponibles sur GitHub (https://github.com/vafabakhsh-lab).
    1. Sélectionnez les traces où l’intensité totale des traces (donneur + accepteur) est stable dans le temps. Sélectionnez les traces avec des changements anti-corrélés dans les intensités donneur et accepteur.
    2. Sélectionnez les molécules donneuses et acceptrices qui présentent un photoblanchiment en une seule étape. Sélectionnez les traces de >5 s.
      REMARQUE: Le fond de fond dans chaque canal après blanchiment doit aller à zéro. Les traces ne doivent pas avoir beaucoup d’événements clignotants; Cela augmentera la difficulté de l’analyse.
    3. Calculer l’efficacité FRET à l’aide de l’équation E = (I A− 0,088 × I D)/(I D + [I A− 0,088 × I D])24,25,26, où I D et I A sont respectivement des intensités donneuses brutes et acceptrices.
      REMARQUE: La fuite de l’émission du donneur dans le canal accepteur est déterminée à l’aide d’un échantillon marqué uniquement par un donneur excité à l’aide d’un laser26 de 532 nm. Le facteur de correction des fuites, 0,088, peut varier selon les configurations en fonction des jeux de filtres utilisés. Il est important de noter que la conversion quantitative et robuste des rendements FRET en distances absolues nécessite la correction des intensités donneur et accepteur pour de multiples facteurs et a été largement discutée avant27.
  3. Identifier l’état conformationnel par modélisation de Markov cachée (HMM)
    1. Exécutez le programme vbFRET28 dans MATLAB et importez les traces sélectionnées pour une condition donnée. Définissez les contraintes relatives au nombre d’états potentiels et d’itérations à exécuter.
      REMARQUE: Sur la base des données brutes des résultats représentatifs, on a émis l’hypothèse qu’il y avait jusqu’à quatre états FRET discrets occupés par le capteur conformationnel; Ainsi, une fourchette de un à quatre États a été désignée. Il a été précédemment déterminé que les améliorations apportées au montage augmentaient de façon négligeable avec >25 itérations; Ainsi, 25 itérations ont été utilisées pour ajuster les données représentatives.
    2. Analysez les traces smFRET et exportez les traces idéalisées et la session d’analyse. Enregistrez les traces idéalisées dans un dossier séparé pour une analyse en aval.
      NOTE: Les programmes utilisés pour extraire les données de transition d’état et de temps de séjour à partir de traces idéalisées ont été mis à disposition dans des travaux publiés précédemment29.
    3. À l’aide des programmes MATLAB, extrayez les transitions d’état et tracez-les sous forme de carte thermique avec la coordonnée X indiquant la conformation de départ et la coordonnée Y indiquant la conformation finale.
      REMARQUE : Les transitions sont définies comme des changements de la valeur FRET >0,1 dans les résultats représentatifs discutés ici. Le seuil pour les transitions dépend des états conformationnels hypothétiques qu’une protéine d’intérêt occupe (le seuil de transition fixé pour être inférieur à la différence entre les états FRET les plus proches), ainsi que de la résolution autorisée par la configuration expérimentale. L’examen des cartes thermiques pour de multiples conditions permet d’identifier les états conformationnels les plus courants qu’un capteur traverse et, par conséquent, occupe. Quatre états FRET ont été identifiés pour les résultats représentatifs (FRET = 0,31, 0,51, 0,71 et 0,89).
    4. À l’aide des programmes MATLAB, extrayez les temps de séjour pour chaque état conformationnel identifié. Désignez une plage de valeurs FRET délimitant chaque état et résolution temporelle lors de l’acquisition des données. Les plages FRET sont également divisées par des états FRET adjacents. Exporter les temps de séjour pour des conditions de traitement données.
      REMARQUE : Dans la plupart des cas, les données sur le temps de séjour peuvent être bien estimées par une seule fonction de décroissance exponentielle. Cette analyse peut être effectuée dans un logiciel d’analyse de données et de représentation graphique.
  4. Ajustement gaussien d’histogrammes de population smFRET pour quantifier l’occupation de l’état
    1. Importez des histogrammes FRET de population pour les conditions d’intérêt dans le logiciel d’analyse de données et de représentation graphique pour l’analyse de plusieurs pics d’ajustement.
    2. Indiquez le nombre de pics présents (quatre pics ou états basés sur l’analyse HMM). L’ajustement a été effectué en utilisant plusieurs distributions gaussiennes30 définies par Equation 1, où A est l’aire du pic, xc est le centre du pic et w est la largeur du pic pour chaque pic.
    3. Contraignez les paramètres d’ajustement comme A > 0, xc = FRET ± 0,02 et 0,1 ≤w≤ 0,24. Quatre pics FRET pour les histogrammes FRET de population individuelle ont été ajustés simultanément. Appliquer les contraintes définies pour les raccords de toutes les conditions.
    4. Calculez l’état d’occupation (pourcentage) comme la zone de pointe d’intérêt divisée par la superficie totale, définie comme la somme de tous les pics.

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Representative Results

Expression et marquage fluorescent d’un capteur FRET à base de SAU
Ici, des résultats exemplaires de l’insertion et du marquage fluorescent d’un SAU (AZP) dans le CRD de mGluR2 (548UAA) sont discutés11. Comme mentionné précédemment, pour insérer AZP dans mGluR2, la co-expression de la machinerie translationnelle modifiée, qui comprend une synthétase d’ARNt modifiée et un ARNt complémentaire (pIRE4-Azi), et mGluR2 contenant un codon ambre en position 548, créé par mutagénèse, est nécessaire (Figure 2A,B). Le marquage de l’AZP par les colorants cyanine est réalisé par une réaction de cycloaddition catalysée par le cuivre (Figure 2C) et aboutit à un marquage efficace de la membrane plasmique de 548UAA (Figure 2D). Pour vérifier la traduction du 548UAA pleine longueur et l’intégrité du récepteur dimérique, une électrophorèse SDS-PAGE a été réalisée sur le lysat cellulaire à partir de cellules HEK293T exprimant 548UAA marqué avec Cy5. Une seule bande à 250KDa a été observée, ce qui coïncidait avec le dimère mGluR2 sur toute la longueur (Figure 2E).

Acquisition et analyse de données
Les cellules exprimant 548UAA avec le marqueur C-terminal FLAG ont été marquées avec Cy3 (donneur) et Cy5 (accepteur), puis lysées avec du détergent31 en présence d’un inhibiteur de protéase pour une étude in vitro. Une fois la lyse cellulaire terminée et l’élimination de la fraction insoluble par centrifugation, le surnageant a été appliqué sur une lamelle de couverture passivée en polyéthylèneglycol (PEG) fonctionnalisée avec un anticorps anti-FLAG-tag pour l’imagerie par fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) (Figure 3). L’échantillon a été éclairé à l’aide d’un laser de 532 nm et les particules ont été sélectionnées pour l’analyse en aval à l’aide du logiciel smCamera. Des traces brutes de donneur, d’accepteur et de FRET ont été générées pour toutes les molécules sélectionnées dans smCamera et sélectionnées à l’aide de MATLAB (section 6 ; Graphique 4). Une correction de 8,8 % du saignement du donneur a été appliquée aux intensités de l’accepteur pour la configuration expérimentale utilisée ici. Ce facteur de correction variera en fonction de la configuration expérimentale, des filtres dichroïques et des filtres d’émission utilisés et devrait être déterminé en mesurant les signaux donneurs et accepteurs dans des conditions expérimentales standard en utilisant des cellules marquées uniquement avec du fluorophore donneur et en calculant le saignement ([intensité accepteur]/[intensité donneuse]). La figure 4 montre plusieurs traces FRET représentatives et les signaux donneurs et accepteurs correspondants. Ces traces ont été sélectionnées à l’aide de critères décrits précédemment dans le protocole (section 6). Des traces sélectionnées représentatives qui montrent des transitions entre plusieurs états et des événements de blanchiment donneur et accepteur sont montrées à la figure 4B-D.

Identification des états conformationnels
Pour identifier les états conformationnels occupés par 548UAA et la relation de ces états les uns par rapport aux autres, une analyse de modélisation de Markov cachée (HMM) a été menée. L’analyse HMM a été réalisée à l’aide du programme vbFRET exécuté sur MATLAB28 (Figure 5A). La figure 5 utilise des données provenant d’une concentration intermédiaire de glutamate (5μM) pour illustrer le processus d’identification de l’état. Sur la base des traces brutes de smFRET, on a émis l’hypothèse qu’il existait jusqu’à quatre états FRET potentiels pour le CRD. Ainsi, le nombre d’États a été limité à un à quatre. Au total, 25 itérations d’ajustement ont été effectuées pour chaque trace afin de déterminer le nombre d’états présents. À partir de ces ajustements idéalisés, les transitions entre les états FRET discrets peuvent être extraites et tracées sous la forme d’une carte thermique de densité de transition (Figure 5B). La carte thermique met en évidence quatre états FRET discrets à 0,31, 0,51, 0,71 et 0,89, indiqués par des lignes pointillées. Les transitions ont été définies comme des changements dans FRET >0,1. Les traces FRET idéalisées fournissent également des informations sur le temps de séjour pour chaque conformation identifiée (Figure 5C).

Génération d’histogramme FRET de population et ajustement des pics
Des traces de molécules uniques représentatives pour 548UAA en présence de concentrations variables de glutamate qui ont été sélectionnées manuellement pour une analyse plus approfondie sont présentées à la figure 6A, B. Une analyse générale pour les expériences smFRET consiste à générer des histogrammes de population à partir de centaines de traces smFRET pour chaque condition expérimentale (Figure 6C). Les histogrammes FRET de population sont créés à partir du segment de traces avant blanchiment. Pour éviter de biaiser l’histogramme vers le comportement des traces plus longues, il est nécessaire de générer un histogramme FRET normalisé à partir de chaque trace avant de faire la moyenne. Cela garantit que chaque trace contribue également à l’histogramme final. Dans ce système, les histogrammes FRET montrent un déplacement général vers un FRET plus élevé avec une augmentation de la concentration de glutamate, indiquant une réduction de la distance entre les CRD et un déplacement vers la conformation active. Cependant, quelle que soit la concentration en glutamate, le signal FRET reste assez sporadique, indiquant un degré élevé de dynamique intrinsèque pour le CRD. En plus du déplacement général vers des FRET plus élevés, une redistribution de l’ensemble conformationnel devient apparente dans l’histogramme (courbes de couleur). Des molécules individuelles peuvent également être vues visitant ces états conformationnels (lignes pointillées) (Figure 6B). Pour déterminer la probabilité d’occupation par l’État, il faut diviser la superficie du pic par la superficie totale, définie comme la somme des quatre zones de pic individuelles. L’histogramme smFRET généré à partir de l’expérience smFRET du CRD de mGluR2 affichait quatre états dynamiques avec des pics de 0,31, 0,51, 0,71 et 0,89 (marqués aux états 1-4), respectivement.

Figure 1
Figure 1 : Organigramme du protocole de travail et analyse des données. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Marquage spécifique au site de mGluR2 par chimie de clic. (A) Schéma du processus d’incorporation de 4-azido-L-phénylalanine d’acide aminé non naturel dans les cellules. (B) Schéma montrant le marquage fluorescent spécifique au site de mGluR2, avec l’acide aminé non naturel en position 548, par réaction de clic azote-alcyne catalysée par le cuivre. (C) Structure tridimensionnelle de mGluR2 marquée par fluorescence (molécule donneuse en vert, molécule acceptrice en rouge) avec des molécules Cy3 et Cy5 amarrées. (D) Image représentative au microscope confocal de cellules HEK293T exprimant 548UAA avec la population de surface cellulaire marquée avec des fluorophores donneurs (vert: Cy3) et accepteurs (rouge: Cy5) par chimie de clic. Barres d’échelle = 10 μm. (E) Image d’électrophorèse sur gel de polyacrylamide non réducteur à 4%-20% de lysat cellulaire à partir de cellules HEK293T exprimant 548UAA et marqué par Cy5-alcyne. Le gel est imagé avec une longueur d’onde d’excitation de 633 nm et un filtre d’émission de 670-BP30-Lane a: échelle de protéines; Voie B : Lysat cellulaire; voie c : colorant cy5-alcyne. Les résultats sont représentatifs d’une expérience individuelle. Les panneaux B, D et E sont réutilisés à partir de Liauw et al.11. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Représentation schématique des expériences smFRET et de la configuration du microscope (TIRF). L’image de fluorescence monomoléculaire du donneur est représentée en vert (barre d’échelle = 1000 nm) et l’accepteur en rouge. Le donneur a été excité à 532 nm à l’aide d’un laser. L’accepteur est enthousiasmé par FRET du donneur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Traces d’intensité du donneur (vert) et de l’accepteur (rouge) marqués mGluR2. (A) Dessin montrant la dynamique du récepteur et le changement de distance entre les sondes FRET. (B) État FRET élevé de longue durée. (C) États FRET multiples avec photoblanchiment accepteur d’abord, suivi du photoblanchiment du donneur. (D) État FRET de courte durée avec photoblanchiment accepteur. (E) État FRET stable à longue durée de vie avec photoblanchiment accepteur. Cette figure est reproduite avec une modification minimale de Liauw et al.11. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Identification de l’état conformationnel. (A) Trace FRET représentative avec ajustement idéalisé superposé (rouge) avec le signal donneur et accepteur correspondant. (B) Carte thermique de densité de transition mettant en évidence les transitions conformationnelles les plus fréquentes subies par 548UAA. Les lignes pointillées indiquent les états FRET. (C) Temps de séjour moyens de chaque état conformationnel. Cette figure est reproduite avec une modification minimale de Liauw et al.11. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : FRET monomoléculaire révèle quatre états conformationnels de mGluR2 CRD. (A) Image représentative d’un film à molécule unique avec le canal donneur (Cy3) à gauche et le canal accepteur (Cy5) à droite. Les molécules sélectionnées par un logiciel d’analyse pour le traitement en aval sont indiquées par des cercles verts. Barre d’échelle = 3 μm. (B) Exemple de traces temporelles d’une molécule unique du 548UAA à différentes concentrations de glutamate. Les intensités donneuse (vert) et accepteur (rouge) et le FRET correspondant (bleu) sont indiqués. Les lignes pointillées représentent quatre états FRET distincts. (C) histogrammes de population smFRET dans une gamme de concentrations de glutamate. Les données représentent la moyenne ± SEM. de N = 3 expériences indépendantes. Cette figure est reproduite avec une modification minimale de Liauw et al.11. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Résumé du protocole global. (A) Flux de travail pour la croissance et le marquage des cellules exprimant une protéine contenant un acide aminé non naturel. (B) Flux de travail expérimental et d’analyse FRET à molécule unique utilisé pour identifier les états conformationnels et caractériser les propriétés dynamiques du domaine CRD dans mGluR2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Composant Volume/Réaction (μL)
Milieu sérique réduit 100
Réactif de transfection 4.4
Composant Volume/Réaction (μL)
Milieu sérique réduit 100
P3000 4
Nom de la construction/du composant Concentration (ng/μL) Volume/puits (12 puits) (μL) Puits (#) ADN ajouté (μL)
ARNt/synthétase 1000 1 1 1
Codon ambré contenant des protéines 1000 1 1 1

Tableau 1 : Réactifs pour la transfection de la cellule T HEK 293.

Réactifs Volume à ajouter (μL) Conc stock (mM) Conc final (mM)
1x RB 655.5
BTTES 10.5 50 0.75
CuSO4 5.25 20 0.15
NaAsc 17.5 100 2.5
AminoG 8.75 100 1.25
Cy3-Alcyne (10 mM) 1.25 10 0.018
Cy5-Alcyne (10 mM) 1.25 10 0.018

Tableau 2 : Composition de la solution d’étiquetage (chimie du clic).

Fichier supplémentaire 1 : Composition des divers tampons utilisés dans cette étude. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Les RCPG sont des protéines qui agissent sur la membrane cellulaire pour initier la transduction du signal. De nombreux RCPG se composent de plusieurs domaines, la signalisation dépendant de l’interaction coopérative entre les domaines. Pour moduler les propriétés de ces récepteurs membranaires, il est essentiel de comprendre le comportement dynamique des multiples domaines. Le transfert d’énergie par résonance de fluorescence à molécule unique (smFRET) est une technique de fluorescence qui permet de mesurer la conformation et la dynamique des protéines en temps réel11,32. Ici, une approche combinant la microscopie smFRET, la microscopie à extraction d’une molécule unique (SiMPull) et la fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) pour visualiser directement le réarrangement de protéines individuelles immobilisées sur une surface passivée est décrite 5,11,33. FRET est très sensible à la distance et fonctionne efficacement comme une règle à l’échelle nanométrique qui est appropriée pour sonder les changements intramoléculaires (3-8 nm). Par rapport aux approches biophysiques traditionnelles, smFRET est particulièrement bien adapté à l’étude de la grande dynamique conformationnelle à une échelle de temps de ~10 ms et nécessite un petit volume d’échantillon (environ 1 fmole par expérience). De plus, contrairement aux mesures d’ensemble de la dynamique conformationnelle, telles que celles fournies par la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN)34 ou par résonance double électron-électronique (DEER)35, smFRET permet l’attribution explicite des deux états conformationnels et leur ordre temporel, ainsi que la détection directe d’états intermédiaires rares et transitoires.

Actuellement, les limites du marquage fluorescent spécifique au site posent un défi technique qui empêche l’application plus large du smFRET pour étudier la dynamique de conformation des protéines. De plus, il est difficile de purifier les protéines membranaires en grande quantité et de préserver leur activité. Les stratégies de marquage courantes utilisent de grandes étiquettes de protéines ou nécessitent la génération de mutants minimaux de cystéine, limitant souvent la conjugaison fluorophore aux terminus des protéines sans résidus de cystéine exposés. Pour contourner ces limitations, une stratégie d’incorporation d’acides aminés non naturels (UAA) a été adaptée et optimisée, permettant un marquage non perturbatif spécifique aux résidus à l’aide d’une réaction de clic catalysée par le cuivre11,12,14. Cette stratégie permet de conjuguer les fluorophores dans les régions exposées au solvant du récepteur membranaire et permet de générer un plus large éventail de capteurs conformationnels. Dans ce protocole, un seul type de chimie de conjugaison est utilisé. Il en résulte des populations donneuses-donneuses et acceptantes-acceptrices seulement, qui sont omises lors de l’analyse en aval. Alternativement, deux stratégies de marquage orthogonal peuvent être utilisées pour éviter cela ou surmonter une éventuelle hétérogénéité lorsque la protéine d’intérêt n’est pas symétrique.

La capture directe des protéines permet de contourner les étapes de purification traditionnelles qui prennent du temps et sont techniquement difficiles. En raison de la cytotoxicité du cuivre, une chimie Click sans cuivre à base de transcyclooctane36 ou de méthyl-tétrazine37 est également utilisée. Cependant, ces réactifs sont coûteux et la nature non régiospécifique38 de la réaction entraîne un faible rendement en protéine d’intérêt marquée par fluorescence.

Des lignes directrices détaillées pour les expériences in vitro smFRET, de la préparation de la chambre d’écoulement à l’analyse des données, ont été présentées ici. Les données smFRET ont été collectées à l’aide d’une configuration TIRF et l’analyse a été effectuée à l’aide d’un code MATLAB écrit sur mesure.

Quelques considérations clés doivent être notées. Tout d’abord, il faut préparer la surface passivée du PEG pour qu’elle soit homogène et moins dense en biotine-PEG. L’excès de biotine-PEG peut entraîner une réduction excessive des protéines, ce qui rend difficile la résolution des signaux fluorescents provenant de molécules individuelles. Deuxièmement, l’échantillon de protéines (surnageant de lysat cellulaire) doit être soigneusement dilué avant d’être ajouté à la chambre d’échantillonnage pour éviter la saturation de la surface. Le rendement en protéines dépend de la densité cellulaire, du détergent de choix et de la concentration de détergent. Pour optimiser le nombre de paires donneur et accepteur unique, il faut cibler une densité de ~400 molécules dans un champ de vision de 256 x 512 pixels. Troisièmement, le tampon Trolox doit être stocké à -20 °C pour une utilisation à long terme (mois). Le tampon Trolox reste stable pendant 2 semaines lorsqu’il est stocké à 4 °C. Enfin, il faut veiller à ne pas introduire de bulles d’air dans la chambre d’écoulement après fonctionnalisation avec l’anticorps. Le séchage de la chambre d’écoulement entraînera une réduction de l’efficacité de l’immobilisation des protéines et de la dénaturation des protéines de l’échantillon.

La dynamique conformationnelle du capteur mGluR2 décrite ici a été examinée avec succès au niveau du récepteur individuel à l’aide de smFRET et a permis de mieux comprendre le mécanisme d’activation du récepteur. Le CRD a démontré un niveau élevé de dynamique intrinsèque, existant dans un équilibre entre quatre états FRET conformationnels, indépendamment de la présence ou de l’absence de glutamate. Il a été démontré qu’un changement vers des états FRET plus élevés ou un récepteur plus compact se produisait d’une manière dépendante de la concentration de glutamate (Figure 6). Fait intéressant, même à des niveaux saturés de glutamate, le CRD est resté dynamique. La méthode présentée ici (résumée à la figure 7) pour comprendre la dynamique conformationnelle est applicable à d’autres RCPG de classe C, ainsi qu’à d’autres protéines membranaires telles que les canaux ioniques, les récepteurs ionotropes et les récepteurs tyrosine kinases (RTK)32,39.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Acknowledgments

Nous remercions les membres du laboratoire Reza Vafabakhsh pour leurs discussions. Ce travail a été soutenu par la subvention R01GM140272 des National Institutes of Health (à R.V.), par le Searle Leadership Fund for the Life Sciences de la Northwestern University et par le Chicago Biomedical Consortium avec le soutien des Searle Funds du Chicago Community Trust (à R.V.). B.W.L. a été soutenu par la subvention de formation T32GM-008061 du National Institute of General Medical Sciences (NIGMS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(+)-Sodium L-Ascorbate Sigma Aldrich Cat # 11140-250G
4-azido-L-phenylalanine Chem-Impex International Cat # 06162
548UAA Liauw et al. 2021 Transfected construct
Acetic Acid Fisher Chemical 64-19-7
Acetone Fisher Chemical 67-64-1
Adobe Illustrator (2022) https://www.adobe.com/ RRID:SCR_010279 Software, algorithm
Aminoguanidine (hydrochloride) Cayman Chemical 81530
Aminosilane Aldrich 919-30-2
Bath Sonicator 2.8 L Fisher Scientific Ultrasonic Bath 2.8 L
Biotin-PEG Laysan Bio Inc Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg
BTTES Click Chemistry Tools 1237-500
Copper (II) sulfate Sigma Aldrich Cat # 451657-10G
Cover slip VWR 16004-306 Sample chamber
Cy3 Alkyne Click Chemistry Tools TA117-5
Cy5 Alkyne Click Chemistry Tools TA116-5
DDM Anatrace Part# D310 1 GM Detergent
DDM-CHS (10:1) Anatrace Part# D310-CH210 1 ML Detergent with cholecterol
Defined Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific SH30070.03
Di01-R405/488/561/635 Semrock Notch filter
DMEM Corning 10-013-CV
EMCCD Andor DU-897U Camera
ET542lp Chroma Long pass emission filter
FF640-FDi01 Semrock Emission dichroic filter
FLAG-tag antibody Genscript A01429
Fluorescent bead Invitrogen T7279 TetraSpeck microspheres Spherical bead
Glass slides Fisherfinest 12-544-4 sample chamber
Glutamate Sigma Aldrich Cat # 6106-04-3
HEK 293T Sigma Aldrich Cat # 12022001 Cell line
HEPES FisherBioReagents 7365-45-9
Image splitter OptoSplit II
KOH Fluka 1310-58-3
Laser Oxxius 4-line laser combiner
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific L3000015 Transfection Reagent
Methanol Fisher Chemical 67-56-1
Microscope Olympus Olympus IX83
Milli-Q water Barnstead Water Deionizer
m-PEG Laysan Bio Inc Item# MPEG-SIL-5000-1g
NF03-405/488/532/635 Semrock Dichroic mirror
OptiMEM Thermo Fisher Scientific 51985091 Reduced Serum Medium
OptiMEM/Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific
OriginPro (2020b) https://www.originlab.com/ RRID:SCR_014212 Data analysis and graphing software
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
pIRE4-Azi Addgene Plasmid # 105829 Transfected construct
Poly-L-lysine hydrobromide Sigma Aldrich Cat # P2636
Protocatechuic acid (PCA) HWI group 99-50-3
smCamera (Version 1.0) http://ha.med.jhmi.edu/resources/ Camera software
Sodium bicarbonate FisherBioReagents 144-55-8
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma 1310-73-2
Syringe filter Whatman UNIFLO Cat#9914-2502 Liquid filtration
Trolox Sigma 53188-07

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Biochimie numéro 186 récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) dynamique conformationnelle récepteurs membranaires acides aminés non naturels smFRET
Visualisation de la dynamique conformationnelle des récepteurs membranaires à l’aide d’une seule molécule FRET
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Banerjee, C., Liauw, B. W. H.,… More

Banerjee, C., Liauw, B. W. H., Vafabakhsh, R. Visualizing the Conformational Dynamics of Membrane Receptors Using Single-Molecule FRET. J. Vis. Exp. (186), e64254, doi:10.3791/64254 (2022).

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