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Biochemistry

एकल-अणु फ्रेट का उपयोग करके झिल्ली रिसेप्टर्स के विरूपण गतिशीलता की कल्पना करना

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/64254
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Molecular Biosciences, Northwestern University

Summary

यह अध्ययन अप्राकृतिक अमीनो एसिड (यूएए) निगमन के माध्यम से साइट-विशिष्ट लेबलिंग का उपयोग करके जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआर) पर एकल-अणु प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (एसएमफ्रेट) प्रयोगों को करने के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया प्रस्तुत करता है। प्रोटोकॉल एसएमफ्रेट नमूना तैयारी, प्रयोगों और डेटा विश्लेषण के लिए एक चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका प्रदान करता है।

Abstract

बाहरी संकेतों का जवाब देने के लिए कोशिकाओं की क्षमता सेलुलर विकास, विकास और अस्तित्व के लिए आवश्यक है। पर्यावरण से संकेत का जवाब देने के लिए, एक सेल को इसे पहचानने और संसाधित करने में सक्षम होना चाहिए। यह कार्य मुख्य रूप से झिल्ली रिसेप्टर्स के कार्य पर निर्भर करता है, जिसकी भूमिका सिग्नल को कोशिका की जैव रासायनिक भाषा में परिवर्तित करना है। जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआर) मनुष्यों में झिल्ली रिसेप्टर प्रोटीन के सबसे बड़े परिवार का गठन करते हैं। जीपीसीआर के बीच, मेटाबोट्रोपिक ग्लूटामेट रिसेप्टर्स (एमग्लूआर) एक अद्वितीय उपवर्ग है जो डिमर के रूप में कार्य करता है और एक बड़ा बाह्य डोमेन रखता है जिसमें लिगैंड-बाइंडिंग साइट होती है। mGluRs के संरचनात्मक अध्ययन में हालिया प्रगति ने उनकी सक्रियण प्रक्रिया की समझ में सुधार किया है। हालांकि, सक्रियण और मॉड्यूलेशन के दौरान एमग्लूआर के माध्यम से बड़े पैमाने पर संवहन परिवर्तनों का प्रसार खराब समझा जाता है। एकल-अणु प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (एसएमफ्रेट) एकल-प्रोटीन स्तर पर बायोमोलेक्यूल्स की संरचनात्मक गतिशीलता की कल्पना और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है। mGluR2 सक्रियण की गतिशील प्रक्रिया की कल्पना करने के लिए, अप्राकृतिक अमीनो एसिड (यूएए) निगमन के आधार पर फ्लोरोसेंट विरूपण सेंसर विकसित किए गए थे जो रिसेप्टर्स की मूल संरचना के गड़बड़ी के बिना साइट-विशिष्ट प्रोटीन लेबलिंग की अनुमति देते थे। यहां वर्णित प्रोटोकॉल बताता है कि इन प्रयोगों को कैसे किया जाए, जिसमें उपन्यास यूएए लेबलिंग दृष्टिकोण, नमूना तैयारी और एसएमफ्रेट डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण शामिल हैं। ये रणनीतियाँ सामान्य हैं और विभिन्न प्रकार के झिल्ली प्रोटीन की संवहन गतिशीलता की जांच करने के लिए विस्तारित की जा सकती हैं।

Introduction

प्लाज्मा झिल्ली में जानकारी का हस्तांतरण झिल्ली रिसेप्टर्स1 के कार्य पर बहुत अधिक निर्भर है। एक रिसेप्टर के लिए लिगैंड बाइंडिंग एक संवहन परिवर्तन और रिसेप्टर सक्रियण की ओर जाता है। यह प्रक्रिया अक्सर प्रकृति में एलोस्टेरिक होती है। 800 से अधिक सदस्यों के साथ, जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआर) मनुष्यों में झिल्ली रिसेप्टर्स का सबसे बड़ा परिवार है। लगभग सभी सेलुलर प्रक्रियाओं में उनकी भूमिका के कारण, जीपीसीआर चिकित्सीय विकास के लिए महत्वपूर्ण लक्ष्य बन गए हैं। जीपीसीआर सिग्नलिंग के कैननिकल मॉडल में, एगोनिस्ट सक्रियण के परिणामस्वरूप रिसेप्टर के विरूपण परिवर्तन होते हैं जो बाद में जीα के न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग पॉकेट पर जीटीपी के लिए जीडीपी के आदान-प्रदान के माध्यम से हेटरोट्रीमेरिक जी प्रोटीन कॉम्प्लेक्स को सक्रिय करते हैं। सक्रिय जीα-जीटीपी और जी ए सबयूनिट्स फिर डाउनस्ट्रीम प्रभावक प्रोटीन की गतिविधिको नियंत्रित करते हैं और सिग्नलिंग कैस्केड 4,5 का प्रचार करते हैं। यह सिग्नलिंग प्रक्रिया अनिवार्य रूप से रिसेप्टर के त्रि-आयामी आकार को बदलने के लिए लिगेंड की क्षमता पर निर्भर करती है। लिगेंड इसे कैसे प्राप्त करते हैं, इसकी एक यंत्रवत समझ नए चिकित्सीय विकसित करने और सिंथेटिक रिसेप्टर्स और सेंसर डिजाइन करने के लिए महत्वपूर्ण है।

मेटाबोट्रोपिक ग्लूटामेट रिसेप्टर्स (एमग्लूआर) वर्ग सी जीपीसीआर परिवार के सदस्य हैं और ग्लूटामेट के धीमे न्यूरोमॉड्यूलेटरी प्रभावों और न्यूरोनल उत्तेजना 6,7 को ट्यून करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। सभी जीपीसीआर में, क्लास सी जीपीसीआर संरचनात्मक रूप से अद्वितीय हैं कि वे बाध्यकारी डिमर के रूप में कार्य करते हैं। mGluRs में तीन संरचनात्मक डोमेन होते हैं: वीनस फ्लाईट्रैप (VFT) डोमेन, सिस्टीन-रिच डोमेन (CRD), और ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन (TMD)8। सक्रियण प्रक्रिया के दौरान विरूपण परिवर्तन जटिल होते हैं और इसमें स्थानीय और वैश्विक विरूपण युग्मन शामिल होता है जो 12 एनएम की दूरी पर फैलता है, साथ ही डिमर सहक्रियाशीलता भी होती है। मध्यवर्ती अनुरूपता, राज्यों का अस्थायी क्रम, और राज्यों के बीच संक्रमण की दर अज्ञात हैं। वास्तविक समय में व्यक्तिगत रिसेप्टर्स की रचना का पालन करके, सक्रियण के दौरान क्षणिक मध्यवर्ती अवस्थाओं और संवहन परिवर्तनों के अनुक्रम की पहचान करना संभव है। यह एकल-अणु प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण 9,10 (एसएमफ्रेट) को लागू करके प्राप्त किया जा सकता है, जैसा कि हाल ही में mGluR211 के सक्रियण के दौरान विरूपण परिवर्तनों के प्रसार की कल्पना करने के लिए लागू किया गया था। फ्रेट प्रयोगों में एक महत्वपूर्ण कदम दाता और स्वीकर्ता फ्लोरोफोरेस के साइट-विशिष्ट सम्मिलन द्वारा फ्रेट सेंसर की पीढ़ी है। एक अप्राकृतिक अमीनो एसिड (यूएए) निगमन रणनीति को विशिष्ट साइट-विशिष्ट फ्लोरोसेंट लेबलिंग प्रौद्योगिकियों की सीमाओं को दूर करने के लिए 12,13,14,15 अपनाया गया था, जिसके लिए सिस्टीन-कम उत्परिवर्ती के निर्माण या एक बड़े आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड टैग के सम्मिलन की आवश्यकता होती है। इसने आवश्यक कॉम्पैक्ट एलोस्टेरिक लिंकर के विरूपण पुनर्व्यवस्था की अनुमति दी, जो mGluR2 के लिगैंड-बाइंडिंग और सिग्नलिंग डोमेन में शामिल हो गया, को देखा जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, mGluR2 पर smFRET प्रयोगों को करने के लिए एक चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका प्रस्तुत की गई है, जिसमें कॉपर-उत्प्रेरित एज़ाइड साइक्लाइजेशन प्रतिक्रिया का उपयोग करके फ्लोरोफोर को संलग्न करने के लिए UAA के साथ mGluR2 के साइट-विशिष्ट लेबलिंग के लिए दृष्टिकोण शामिल है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल झिल्ली प्रोटीन और डेटा विश्लेषण के प्रत्यक्ष कैप्चर के लिए पद्धति का वर्णन करता है। यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल अन्य झिल्ली प्रोटीन की संवहन गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए भी लागू होता है।

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Protocol

प्रोटोकॉल का समग्र वर्कफ़्लो चित्रा 1 में वर्णित है।

1. नमूना कक्ष की तैयारी

  1. स्लाइड और कवरस्लिप सफाई
    नोट: इन चरणों का उद्देश्य स्लाइड्स की सतहों के साथ-साथ कवरलिप्स को साफ करना और उन्हें एमिनोसिलनाइजेशन के लिए तैयार करना है। सतह-टेथर्ड अणुओं पर एकल-अणु प्रतिदीप्ति प्रयोगों के संचालन के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता एक पासीवेटेड सतह है। सबसे विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य निष्क्रिय तकनीक में एक घनी परत के रूप में कांच की सतह पर अक्रिय बहुलक श्रृंखलाओं को सहसंयोजक रूप से संलग्न करना शामिल है। पॉलीथीन ग्लाइकोल (पीईजी) सतह निष्क्रिय16 के लिए उपयोग किया जाने वाला सबसे कुशल बहुलक है। पीईजी (पीईजीनाइलेशन) का उपयोग करके निष्क्रिय प्रक्रिया का विवरण नीचे वर्णित है:
    1. मार्कर के साथ स्लाइड पर ड्रिल किए जाने वाले छेद (~ 6 मिमी अलग और किनारे से दूर)। ग्लास स्लाइड पर छोटे छेद (1 मिमी व्यास) ड्रिल करने के लिए ड्रेमेल का उपयोग करें। ड्रिलिंग प्रक्रिया के दौरान स्लाइड्स को पानी में डुबोएं।
    2. मार्कर से अवशिष्ट स्याही को हटाने के लिए स्लाइड्स को एसीटोन से धोएं।
    3. एसीटोन से निकालें और स्लाइड्स को पानी से धो लें, फिर उन्हें उच्च शक्ति (700 डब्ल्यू) पर पानी में 5 मिनट के लिए माइक्रोवेव करें।
    4. स्लाइड्स को कांच के दाग वाले जार में रखने से पहले पानी से साफ करें। कवरलिप्स को एक अलग धुंधला जार में रखें।
    5. स्लाइड्स और कवरलिप्स को एसीटोन में 30 मिनट के लिए 23 डिग्री सेल्सियस पर स्नान सोनिकेटर में रखें।
    6. इस बीच, अगले चरण के दौरान उपयोग किए जाने वाले एमिनोसिलनाइजेशन समाधान को तैयार करने के लिए एक ग्लास फ्लास्क साफ करें। फ्लास्क को 1 एम केओएच से भरें, फ्लास्क को 30 मिनट के लिए सोनिकेट करें, कोह को पानी से अच्छी तरह से धो लें, और फिर मेथनॉल में अतिरिक्त 30 मिनट के लिए सोनिकेट करें। एमिनोसिलनाइजेशन चरण के समय तक फ्लास्क को मेथनॉल में छोड़ दें।
    7. इस बीच, फ्रीजर (−20 डिग्री सेल्सियस) से एमिनोसिलेन, एमपीईजी और बायोटिन-पीईजी को हटा दें और उन्हें अंधेरे में कमरे के तापमान (आरटी) पर आने की अनुमति दें।
    8. स्लाइड से एसीटोन का निपटान करें और उपयुक्त रासायनिक अपशिष्ट कंटेनर में कवरस्लिप जार को कवर करें, पानी से अच्छी तरह से कुल्ला करें, और फिर स्लाइड को 30 मिनट के लिए 5 एम कोएच में सोनिकेट करें।
    9. स्लाइड और कवरलिप को पानी से धोएं, और फिर 2 मिनट के लिए मेथनॉल में सोनिकेट करें (दो बार दोहराएं)। मेथनॉल से भरे जार को एमिनोसिलनाइजेशन चरण तक छोड़ दें।
      नोट: इस अध्ययन में, विआयनीकृत पानी का उपयोग तब तक किया जाता है जब तक कि अन्यथा उल्लेख न किया गया हो। 23 डिग्री सेल्सियस पर काम करने वाले एक स्नान सोनिकेटर का उपयोग किया जाता है।
  2. Aminosilanization
    नोट: इस कदम का उद्देश्य एमिनोसिलेन को साफ स्लाइड और कवरस्लिप सतह से सहसंयोजक रूप से जोड़ना है। कार्यात्मक एमपीईजी और बायोटिन-पीईजी अगले चरण में इस सतह से सहसंयोजक रूप से जुड़ेंगे।
    1. एक साफ फ्लास्क (चरण 1.6) में एक एमिनोसिलनाइजेशन मिश्रण तैयार करें। मेथनॉल (150 एमएल), एसिटिक एसिड (7.5 एमएल, ग्लास पिपेट का उपयोग करें), और एमिनोसिलेन (2.5 एमएल) को मिलाकर समाधान तैयार करें।
    2. रासायनिक फ्यूम हुड में घोल को धीरे से मिलाएं, फिर इसे स्लाइड और कवरस्लिप जार में डालें। कवरलिप्स के लिए 50 एमएल और स्लाइड्स के लिए 100 एमएल का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि स्लाइड और कवरलिप पूरी तरह से समाधान में डूबे हुए हैं।
    3. 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, फिर जार को 1 मिनट के लिए सोनिकेट करें (सोनिकेशन सतह से अशुद्धियों को हटा देता है), और एक और 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. अपशिष्ट संग्रह कंटेनर में एमिनोसिलनाइजेशन समाधान का निपटान करें। जार में मेथनॉल जोड़ें, ढक्कन के साथ जार बंद करें, और हाथ से धीरे से हिलाएं। मेथनॉल का निपटान करें, और पानी के साथ जार भरें।
    5. एमिनोसिलेन बोतल को फ्रीजर (−20 डिग्री सेल्सियस) में वापस करें।
  3. PEGylation
    नोट: ये चरण PEGylation प्रक्रिया का वर्णन करते हैं।
    1. एमिनोसिलनाइजेशन के दौरान, पेगिलेशन बफर तैयार करें। 84 मिलीग्राम सोडियम बाइकार्बोनेट (NaHCO3) का वजन करें और इसे 10 mL पानी (10 mM) में जोड़ें। इसके अलावा, एमपीईजी और बायोटिन-पीईजी का वजन करें और उन्हें अलग रखें। छह स्लाइड और कवरलिप्स के लिए, 96 मिलीग्राम एमपीईजी और 1.2-2.4 मिलीग्राम बायोटिन-पीईजी का उपयोग करें।
      नोट: बहुत अधिक बायोटिन-पीईजी जोड़ना महत्वपूर्ण नहीं है क्योंकि यह पृष्ठभूमि स्पॉट की संख्या बढ़ा सकता है। स्लाइड पर आवेदन से ठीक पहले पीईजी मिश्रण को भंग न करें।
    2. स्लाइड्स को पानी से धोएं, उन्हें एक कोमल हवा के झटके से सुखाएं, और फिर उन्हें ह्यूमिडिफ़ायर असेंबली बॉक्स में रखें।
      नोट: एक स्वच्छ एयरलाइन का उपयोग करना आवश्यक है। संपीड़ित डिब्बाबंद हवा का उपयोग करने से बचें, जो कांच पर अवशेष छोड़ सकता है।
    3. पीईजी पाउडर मिश्रण में पेजिनाइलेशन बफर जोड़ें और घुलने के लिए कई बार धीरे-धीरे ऊपर और नीचे करें। प्रति स्लाइड 55 μL पेजिनाइलेशन बफर जोड़ें (छह स्लाइडों के लिए, 330 μL पेगिलेशन बफर जोड़ें)।
    4. 23 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 9,600 x g पर सेंट्रीफ्यूज अविघटित कणों को अवक्षेपित करने के लिए। अगले चरण में उपयोग करने के लिए सतह पर तैरने वाला एकत्र करें।
      नोट: एनएचएस समूह की उपस्थिति के कारण बायोटिन-पीईजी जल्दी से हाइड्रोलाइज होता है। मिश्रण और सेंट्रीफ्यूजेशन चरणों को जल्दी से करना महत्वपूर्ण है।
    5. प्रत्येक स्लाइड पर 60 μL PEGylation समाधान लागू करें और फिर कवरस्लिप को शीर्ष पर रखें ताकि PEGylation समाधान स्लाइड और कवरस्लिप के बीच सैंडविच हो।
      नोट: स्लाइड और कवरस्लिप के बीच बुलबुले पेश करने से बचें, क्योंकि इससे निष्क्रिय दक्षता कम हो जाएगी। कवरस्लिप और स्लाइड को पिपेट टिप के साथ समायोजित करके किसी भी बुलबुले को हटा दें।
    6. स्लाइड्स को एक दराज में रखें जो सपाट और अंधेरा है। स्लाइड्स को रात भर संग्रहीत किया जा सकता है; हालांकि, 4-6 घंटे के लिए इनक्यूबेशन के परिणामस्वरूप इष्टतम निष्क्रियता होती है।
      नोट: यह याद रखना आवश्यक है कि किस तरफ पेगिलेटेड है।
    7. भंडारण से पहले गैर-पेगिलेटेड साइड को चिह्नित करें। इनक्यूबेशन बाद, धीरे से अलग करें और स्लाइड और कवरलिप को पानी से अच्छी तरह से धो लें
    8. स्लाइड्स और कवरलिप्स को हवा उड़ाकर सुखाएं। स्लाइड्स और कवरलिप्स को एक बाँझ ट्यूब (50 एमएल) में रखें, जिसमें PEGylated सतह एक दूसरे से दूर हो। प्रयोग के दिन तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: तैयारी के 4 सप्ताह के भीतर स्लाइड और कवरलिप का उपयोग करना सबसे अच्छा है। PEGylated सतहों को एक दूसरे से दूर होना चाहिए। वैक्यूम-सील बैग में PEGylated स्लाइड और कवरलिप्स को संग्रहीत करने से उनकी शेल्फ लाइफ बढ़ सकती है।

2. अप्राकृतिक अमीनो एसिड, फ्लोरोसेंट लेबलिंग और निष्कर्षण के साथ mGluR2 अभिव्यक्ति

नोट: यह प्रोटोकॉल यूएए 4-एज़िडो-एल-फेनिलएलनिन (एजेडपी) युक्त एमग्लूआर 2 को व्यक्त करने के लिए कोशिकाओं की तैयारी, अभिकर्मकों और उपचार को रेखांकित करता है। प्रक्रिया 18 मिमी ग्लास कवरलिप्स पर उगाए गए एचईके 293 टी कोशिकाओं के लिए है। प्रक्रिया को आवश्यकतानुसार बढ़ाया जा सकता है।

  1. बोने
    नोट: डीएमईएम में एचईके 293 टी कोशिकाओं को 10% (वी / वी) भ्रूण गोजातीय सीरम, 100 यूनिट-एमएल -1 पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 15 एमएम एचईपीईएस बफर (पूरक फ़ाइल 1) (पीएच 7.4) के साथ 5% सीओ2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।
    1. 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के साथ कोशिकाओं को पारित करें। पॉली-एल/डी-लाइसिन (पीएलएल/पीडीएल) ग्लास कवरलिप्स पर बीज एचईके293टी कोशिकाएं ताकि वे अभिकर्मक के समय ≥80% कन्फ्लुएंसी तक पहुंच जाएं।
  2. अभिकर्मक
    1. 0.1 एम एनएओएच में एजेडपी का 40 एमएम स्टॉक समाधान तैयार करें।
    2. बढ़ती कोशिकाओं और mGluR2 अभिव्यक्ति के लिए AZP-पूरक मीडिया तैयार करें। 40 एमएम एजेडपी स्टॉक समाधान का उपयोग करके मानक मीडिया (+ एफबीएस, पेन / स्ट्रेप, 15 एमएम एचईपीईएस) को पूरक करें। अंतिम एजेडपी एकाग्रता को 0.6 एमएम तक लाएं। 1 एम एचईपीईएस समाधान जोड़ें (40 एमएम एजेडपी स्टॉक समाधान की आधी मात्रा जोड़ी गई)। उदाहरण के लिए, 10 एमएल एजेडपी पूरक मीडिया तैयार करने के लिए, मानक मीडिया के 9.775 एमएल, 40 एमएम एजेडपी स्टॉक समाधान के 150 μL और 1 M HEPES समाधान के 75 μL को संयोजित करें।
    3. सिरिंज फ़िल्टर (0.2 μm, PES) का उपयोग करके मीडिया को फ़िल्टर (निष्फल करें)।
    4. अभिकर्मक से पहले एजेडपी-पूरक मीडिया युक्त मीडिया के साथ मानक मीडिया को बदलें।
      नोट: मीडिया के प्रतिस्थापन के दौरान कोशिकाओं को सूखने के लिए सावधान रहें।
    5. निर्माता के मैनुअल का पालन करते हुए अभिकर्मक अभिकर्मक (सामग्री की तालिका) के साथ कोशिकाओं को स्थानांतरित करें। कुल 2 μg DNA (1000 ng tRNA/ सिंथेटेस + 1000 ng amber कोडन युक्त प्रोटीन प्लास्मिड) का उपयोग करके 18 मिमी कवरस्लिप पर ट्रांसफेक्ट HEK293T कोशिकाएं। उपयोग किए गए घटकों की एकाग्रता और मात्रा के लिए तालिका 1 देखें।
    6. ताजा एजेडपी-पूरक मीडिया में अभिकर्मक के 24 घंटे बाद मीडिया को बदलें और कोशिकाओं को अतिरिक्त 24 घंटे तक बढ़ने की अनुमति दें।
  3. एल्काइन साइनिन रंगों के साथ लेबलिंग
    1. लेबलिंग से 20 मिनट पहले, कवरलिप्स को गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) रिकॉर्डिंग बफर (आरबी) (पूरक फ़ाइल 1) के साथ दो बार धोएं, और उन्हें बिना एजेडपी (+ एफबीएस, पेन / स्ट्रेप, 15 एमएम एचईपीईएस) के साथ गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) मानक मीडिया में ले जाएं।
    2. Cy3-alkyne, Cy5-alkyne, BTTES, कॉपर (II) सल्फेट (CuSO4), (+) सोडियम L-ascorbate, और एमिनोगुआनिडाइन युक्त लेबलिंग समाधान तैयार करें।
    3. समाधान बनाने और जोड़ने के क्रम का पालन करें (तालिका 2):
      1. 50 mM BTTES तैयार करें।
      2. 100 mM एमिनोग्वानिडाइन तैयार करें।
      3. 100 mM Na-ascorbate तैयार करें।
      4. आरबी के 655.5 μL तैयार करें।
      5. Cy3/Cy5 alkyne डाई (DMSO स्टॉक में 10 mM) को RB में जोड़ें।
        नोट: आरबी में एमिनोग्वानिडाइन जोड़ें।
      6. 20 mM CuSO 4 तैयार करें।
      7. एक नई ट्यूब में CuSO4 और BTTES मिलाएं (समाधान नीला हो जाएगा)।
      8. CuSO4 और BTTES मिश्रण को RB में जोड़ें (2.3.3.6.)
      9. Na-Ascorbate जोड़ें।
      10. 18 मिमी कवरस्लिप के लिए नीचे दी गई तालिका 2 में दिए गए वॉल्यूम का पालन करें।
    4. घोल को अच्छी तरह से मिलाएं और कोशिकाओं को लेबल करने से पहले बर्फ पर और अंधेरे में 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. कवरलिप्स में लेबलिंग समाधान जोड़ने से पहले, मीडिया को हटा दें और उन्हें आरबी के साथ धो लें। लेबलिंग समाधान जोड़ें और अंधेरे परिस्थितियों में 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    6. नोट: लेबलिंग में सुधार करने के लिए, 10 मिनट के बाद ग्लूटामेट (अंतिम एकाग्रता ~ 0.5 एमएम) जोड़ें और अतिरिक्त 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। कॉपर कोशिकाओं के लिए बहुत विषाक्त है, और लेबलिंग प्रतिक्रिया विवो में 15 मिनट से अधिक समय तक जारी नहीं रहनी चाहिए। सभी घटकों को ताजा तैयार करें। ना-एस्कॉर्बेट को अंतिम रूप दें। तैयारी करते समय प्रतिक्रिया को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें। हालांकि, लेबलिंग समाधान के अलावा, कोशिकाओं को इनक्यूबेटर के अंदर 37 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना है।
  4. कोशिकाओं की कटाई और प्रोटीन निकालना (सेल लाइसिस)
    1. लेबलिंग समाधान को हटा दें और आरबी के साथ दो बार mGluR2 संक्रमित कोशिकाओं वाले कवरस्लिप (18 मिमी) को धोएं।
    2. एक पिपेट का उपयोग करके, कोशिकाओं को कवरस्लिप से धोएं और आरबी (1 एमएल) में फिर से निलंबित करें।
      नोट: इस बिंदु के बाद जितना संभव हो सके प्रकाश के लिए नमूना जोखिम को कम करें।
    3. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,000 x g पर घूमकर कोशिकाओं को छर्रों से हटा दें और सतह पर तैरने वाले को हटा दें। लाइसिस समाधान के 80-130 μL में सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
      नोट: सेल गोली आंख से दिखाई देनी चाहिए। लाइसिस वॉल्यूम लेबलिंग और धोने की प्रक्रिया के दौरान खोए गए नमूने की मात्रा पर निर्भर करता है।
    4. गोली को तोड़ने के लिए पाइपिंग द्वारा धीरे से मिलाएं। पन्नी में लपेटें और कोशिकाओं को अलग करने के लिए 0.5-1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रॉकर पर रखें।
    5. 20 मिनट के लिए 20,000 x g और 4 °C पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अघुलनशील अंश को छर्रों से हटा दें। सुपरनैटेंट को एक ताजा ठंडी ट्यूब (लाइस्ड प्रोटीन जिसमें फ्लोरोसेंटली टैग किए गए प्रोटीन होते हैं) में स्थानांतरित करें और प्रयोगों के लिए इसे बर्फ पर स्टोर करें।

3. एकल-अणु प्रवाह कक्ष विधानसभा और कार्यात्मकता

  1. फ्रीजर से स्लाइड और कवरस्लिप को हटा दें और उन्हें अंधेरे में आरटी पर गर्म करने की अनुमति दें (~ 30 मिनट)।
  2. स्लाइड और कवरस्लिप के बीच डबल-साइडेड टेप की स्ट्रिप्स को सैंडविच करके डबल-साइडेड टेप का उपयोग करके चैंबर को इकट्ठा करें। सुनिश्चित करें कि PEGylated सतहें प्रवाह कक्ष के इंटीरियर का निर्माण करती हैं।
  3. एक पिपेट टिप का उपयोग करके, यह सुनिश्चित करने के लिए कवरस्लिप दबाएं कि टेप कवरस्लिप और स्लाइड दोनों के साथ पूर्ण संपर्क बना रहा है; इस बात का ध्यान रखें कि कवरस्लिप को तोड़ा न जाए। स्लाइड के किनारों पर एपॉक्सी लागू करें।
    नोट: इतना न जोड़ें कि ड्रिल किए गए छेदों में एपॉक्सी भर जाए।
  4. एपॉक्सी को सूखने की अनुमति देने के लिए एक ह्यूमिडिफाइड डार्क बॉक्स में कवरस्लिप साइड को नीचे की ओर रखें (~ 30 मिनट)।
    नोट: सुखाने की अवधि के दौरान एपॉक्सी को छेद (10-15 μL) को कवर करने से रोकने के लिए ड्रिल किए गए छेद के माध्यम से T50 बफर (पूरक फ़ाइल 1) जोड़ें।
  5. प्रत्येक लेन पर धीरे-धीरे ~ 40 μL लागू करके 500 nM न्यूट्रैविडिन (T50 में पतला) के साथ प्रत्येक कक्ष लेन को इनक्यूबेट करें।
  6. एक ह्यूमिडिफाइड डार्क बॉक्स के अंदर 2 मिनट के लिए आरटी में इनक्यूबेट करें। प्रति लेन ~ 100 μL T50 बफर के साथ धोएं।
  7. प्रत्येक कक्ष लेन को 20 एनएम बायोटिनिलेटेड एंटीबॉडी11 के साथ इनक्यूबेट करें। एंटीबॉडी की पसंद प्रोटीन पर टैग पर निर्भर करती है।
    नोट: यदि प्राथमिक एंटीबॉडी बायोटिनाइलेटेड नहीं है, तो पहले 30 मिनट के लिए बायोटिनिलेटेड द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करें और फिर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करें।
  8. एक ह्यूमिडिफाइड डार्क बॉक्स के अंदर 30 मिनट के लिए आरटी में इनक्यूबेट करें। ~ 200 μL T50 प्रति लेन के साथ धोएं।
    नोट: सुनिश्चित करें कि तैयारी प्रक्रिया के दौरान लेन कभी सूख न जाएं।

4. एकल-अणु बफर

  1. ट्रोलॉक्स बफर
    नोट: ट्रोलॉक्स बफर इमेजिंग बफर बनाने के लिए शुरुआती बफर है। बफर के घटक प्रयोग पर निर्भर हैं और रुचि के प्रोटीन के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। यहां वर्णित प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले बफर में लवण (NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2), बफरिंग एजेंट (HEPES), और ट्रोलॉक्स (pH ~ 7.35) शामिल हैं।
    1. एकल-अणु रिकॉर्डिंग बफर के 10 एमएल में 9-10 मिलीग्राम ट्रोलॉक्स को भंग करें (एसआरबी, पूरक फ़ाइल 1)
      नोट: ट्रोलॉक्स बफर को थोड़ा अम्लीय बनाता है। सोडियम हाइड्रॉक्साइड (एनएओएच) समाधान, 10 एम (पीएच 7.35) का उपयोग करके इस स्तर पर पीएच समायोजित करें। ट्रोलॉक्स के पूरी तरह से भंग होने के बाद ठीक पीएच समायोजन किया जाएगा; हालांकि, इस बिंदु पर पीएच बढ़ाने से ट्रोलॉक्स की घुलनशीलता बढ़ जाती है।
    2. ट्रोलॉक्स को पूरी तरह से भंग करने के लिए 4-8 घंटे (एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटा गया) के लिए बेंचटॉप रॉकर का उपयोग करके आरटी पर घोल मिलाएं।
    3. पीएच की जांच करें और यदि आवश्यक हो तो समायोजित करें।
    4. सुनिश्चित करें कि ट्रोलॉक्स पूरी तरह से भंग हो गया है। एक सिरिंज फिल्टर के साथ घोल को निष्फल करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: बफर का उपयोग उम्र बढ़ने के 2-10 दिनों के बाद किया जाना चाहिए। ट्रोलॉक्स पलक झपकने को दबाने में मदद करता है और आमतौर पर एकल-अणु अध्ययन17 में उपयोग किया जाता है। एंटी-ब्लिंकिंग गुण ट्रोलॉक्स18 के ऑक्सीकृत व्युत्पन्न से आते हैं; इसलिए, इसे परिपक्व होने के लिए कम से कम कुछ घंटों के लिए आरटी में रखने की सिफारिश की जाती है। इसके अतिरिक्त, ताजा ट्रोलॉक्स समाधान का यूवी विकिरण ऑक्सीकरण प्रक्रिया को गति देता है और इसका उपयोग ट्रोलॉक्स बफर18 की "उम्र बढ़ने" में तेजी लाने के लिए किया जा सकता है।
  2. इमेजिंग बफर रेसिपी: मिक्स ट्रोलॉक्स बफर + डिटर्जेंट (डिटर्जेंट के सीएमसी मान का ~ 2 गुना) + 4 एमएम प्रोटोकेटचुइक एसिड (पीसीए)।
    नोट: डिटर्जेंट एकाग्रता सीएमसी के पास रखी जाती है क्योंकि उच्च डिटर्जेंट सांद्रता के परिणामस्वरूप प्रोटीन विकृतीकरण बढ़ सकता है। उदाहरण के लिए, निम्नलिखित मिश्रण का उपयोग 955 μL Trolox + 5 μL 10% DDM + कोलेस्ट्रॉल (W%, 10: 1) + 40 μL 100 mM PCA स्टॉक समाधान के लिए किया जा सकता है। यहां, पीसीए एक एंटीऑक्सिडेंट एजेंट के रूप में कार्य करता है और पहले एसएमफ्रेट अध्ययन19 में उपयोग किया गया था। डीडीएम गैर-आयनिक है, आमतौर पर झिल्ली प्रोटीन20,21 को घुलनशील करने के लिए उपयोग किया जाता है, और इसका उपयोग एकल-अणु अध्ययनों में किया गया है। डीडीएम एक अच्छी पहली पसंद डिटर्जेंट है; हालांकि, हम कई डिटर्जेंट का परीक्षण करने और परिणाम सुसंगत सुनिश्चित करने की सलाह देते हैं।

5. माइक्रोस्कोप सेटअप और एसएमफ्रेट डेटा अधिग्रहण

  1. कंप्यूटर और माइक्रोस्कोप चालू करें। गर्म करने के लिए लेजर चालू करें (Cy3 उत्तेजना के लिए 532 nm और Cy5 उत्तेजना के लिए 640 nm)।
    नोट: यहां, 100x TIRF उद्देश्य (N.A. 1.49), छवि स्प्लिटर और EMCCD कैमरा से लैस एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग किया गया था। सेटअप चार-लाइन लेजर कंबाइनर, एक डाइक्रोइक मिरर, एक लॉन्ग पास उत्सर्जन फिल्टर, एक उत्सर्जन डाइक्रोइक फिल्टर और एक नॉच फिल्टर से लैस है।
  2. EMCCD कैमरा चालू करें और कैमरा सॉफ़्टवेयर खोलें। कैमरे को -69 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने और स्थिर करने के लिए 20 मिनट प्रतीक्षा करें।
  3. माइक्रोस्कोप मंच पर नमूना कक्ष माउंट करें। प्रति क्षेत्र (चरण 2.4.5) में ~ 400 अणु प्राप्त करने के लिए धीरे-धीरे प्रोटीन का नमूना जोड़ें। इमेजिंग बफर के 100 μL के साथ कक्ष को धोएं।
  4. लाभ, अधिग्रहण दर और लेजर शक्तियों को समायोजित करें जैसे कि दाता और स्वीकर्ता चैनल दोनों में एकल-अणु प्रतिदीप्ति संकेतों का पता लगाया जाता है। यदि आवश्यक हो तो नमूना कक्ष के अंदर प्रोटीन की एकाग्रता को समायोजित करें।
    नोट: दृश्य के क्षेत्र में 400 से अधिक अणुओं के साथ, व्यक्तिगत अणुओं को अलग करना अधिक कठिन हो जाता है, और पृष्ठभूमि शोर अधिक होगा।
  5. दाता को उत्तेजित करें और समय के निशान प्राप्त करें जब तक कि दृश्य के क्षेत्र में दाता अणुओं का कम से कम 80% फोटोब्लीच नहीं हो जाता।
  6. फिल्म के अंत में, स्वीकर्ता को सीधे उत्तेजित करने के लिए 640 एनएम लेजर चालू करें जब तक कि कुछ स्वीकर्ता अणु फोटोब्लीच न हों, जिससे मल्टीमर भेदभाव से एकल-अणु की सुविधा मिलती है।
  7. दृश्य के एक अलग क्षेत्र में जाएं और प्रति शर्त कम से कम तीन फिल्में (तकनीकी प्रतिकृतियां) एकत्र करने के लिए ऊपर दिए गए चरणों को दोहराएं।
    नोट: रुचि के एक नए क्षेत्र (आरओआई) का चयन करते समय और फोटोब्लीचिंग को कम करने पर ध्यान केंद्रित करते समय संभव सबसे कम लेजर शक्ति का उपयोग करें। अधिग्रहण के दौरान मंच बहाव पर ध्यान दें। यदि एक नए आरओआई पर जाने के बाद ध्यान देने योग्य बहाव देखा जाता है, तो अधिग्रहण शुरू करने से पहले 3 मिनट तक प्रतीक्षा करें।

6. डेटा विश्लेषण

  1. दाता और स्वीकर्ता चैनल संरेखण (मूवी मैपिंग)
    1. दाता और स्वीकर्ता चैनलों में फ्लोरोसेंट मोती छवियों को रिकॉर्ड करें।
    2. प्रत्येक अणु22,23 से दाता और स्वीकर्ता प्रतिदीप्ति को सहसंबंधित करने के लिए बीड डेटा का उपयोग करके मैपिंग फ़ाइल उत्पन्न करें।
      नोट: एक एकल अणु से उत्सर्जन संकेत को छवि स्प्लिटर के अंदर उत्सर्जन डाइक्रोइक फिल्टर द्वारा दाता और स्वीकर्ता संकेतों में विभाजित किया जाता है। दाता और स्वीकर्ता छवियों को कैमरे पर साथ-साथ प्रक्षेपित किया जाता है। दो क्षेत्रों के बीच एक एकल अणु के दाता और स्वीकर्ता तीव्रता को सटीक रूप से जोड़ने के लिए, फ्लोरोसेंट मोती के नमूनों का उपयोग करके एक मैपिंग फ़ाइल अक्सर उत्पन्न होती है। इस मैपिंग फ़ाइल का उपयोग करके, दाता और स्वीकर्ता चैनलों में पाए जाने वाले सभी अणुओं को एक दूसरे पर मैप किया जाता है। विश्लेषण तब समय के निशान उत्पन्न करता है, जो प्रत्येक अणु के लिए समय के साथ दाता और स्वीकर्ता तीव्रता हैं।
  2. एकल-अणु फ्रेट निशान का चयन (कण पिकिंग)
    नोट: MATLAB का उपयोग करके डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए व्यक्तिगत कण निशान की जांच और चयन किया जाता है। सटीक चयन मानदंड सिस्टम पर निर्भर करता है। एक गुणवत्ता कण का गठन करने पर सामान्य दिशानिर्देश यहां उल्लिखित हैं। सभी कस्टम-संशोधित कोड GitHub (https://github.com/vafabakhsh-lab) पर उपलब्ध हैं।
    1. उन निशानों का चयन करें जहां निशान (दाता + स्वीकर्ता) की कुल तीव्रता समय के साथ स्थिर है। दाता और स्वीकर्ता तीव्रता में विरोधी सहसंबद्ध परिवर्तनों के साथ निशान का चयन करें।
    2. दाता और स्वीकर्ता अणुओं का चयन करें जो एकल-चरण फोटोब्लीचिंग दिखाते हैं। उन निशानों का चयन करें जो >5 सेकंड लंबे हैं।
      नोट: ब्लीचिंग के बाद प्रत्येक चैनल में पृष्ठभूमि शून्य पर जाना चाहिए। निशान में कई पलकें झपकने वाली घटनाएं नहीं होनी चाहिए; इससे विश्लेषण की कठिनाई बढ़ जाएगी।
    3. समीकरण E = (IA− 0.088 × ID)/(ID + [IA− 0.088 × ID]) 24,25,26 का उपयोग करके फ्रेट दक्षता की गणना करें, जहां ID और IA क्रमशः कच्चे दाता और स्वीकर्ता तीव्रता हैं।
      नोट: स्वीकर्ता चैनल में दाता उत्सर्जन का रिसाव 532 एनएम लेजर26 का उपयोग करके उत्साहित दाता-केवल लेबल नमूना का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है। रिसाव सुधार कारक, 0.088, उपयोग किए गए फ़िल्टर सेट के आधार पर विभिन्न सेटअपों के लिए भिन्न हो सकता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि फ्रेट क्षमता के मात्रात्मक और मजबूत रूपांतरण को पूर्ण दूरी तक कई कारकों के लिए दाता और स्वीकर्ता तीव्रता के सुधार की आवश्यकता होती है और27 से पहले बड़े पैमाने पर चर्चा की गई है।
  3. हिडन मार्कोव मॉडलिंग (एचएमएम) द्वारा संवहन स्थिति की पहचान करें
    1. MATLAB में vbFRET28 प्रोग्राम निष्पादित करें और किसी दी गई स्थिति के लिए चयनित निशान आयात करें। निष्पादित किए जाने वाले संभावित राज्यों और पुनरावृत्तियों की संख्या के लिए बाधाएं निर्धारित करें।
      नोट: प्रतिनिधि परिणामों से कच्चे डेटा के आधार पर, यह अनुमान लगाया गया था कि विरूपण सेंसर द्वारा कब्जा किए गए चार असतत फ्रेट राज्य थे; इस प्रकार, एक से चार राज्यों की एक सीमा नामित की गई थी। फिटिंग में सुधार पहले >25 पुनरावृत्तियों के साथ नकारात्मक वृद्धि के लिए निर्धारित किया गया था; इस प्रकार, प्रतिनिधि डेटा को फिट करने के लिए 25 पुनरावृत्तियों का उपयोग किया गया था।
    2. smFRET निशान का विश्लेषण करें और आदर्श निशान और विश्लेषण सत्र निर्यात करें। आदर्शीकृत निशान को डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए एक अलग फ़ोल्डर में सहेजें।
      नोट: आदर्श ीकृत निशान से राज्य संक्रमण और समय डेटा निकालने के लिए उपयोग किए जाने वाले कार्यक्रम पहले प्रकाशित कार्य29 में उपलब्ध कराए गए थे।
    3. MATLAB कार्यक्रमों का उपयोग करके, राज्य संक्रमण निकालें और उन्हें एक्स-समन्वय के साथ हीटमैप के रूप में प्लॉट करें जो शुरुआती रचना और वाई-समन्वय को अंतिम रचना का संकेत देता है।
      नोट: संक्रमण को यहां चर्चा किए गए प्रतिनिधि परिणामों में फ्रेट मान >0.1 में परिवर्तन के रूप में परिभाषित किया गया है। संक्रमण के लिए सीमा परिकल्पित विरूपण राज्यों पर निर्भर करती है, जिसमें रुचि का प्रोटीन कब्जा कर लेता है (निकटतम फ्रेट राज्यों के बीच अंतर से कम होने के लिए संक्रमण सीमा निर्धारित करता है), साथ ही प्रयोगात्मक सेटअप द्वारा अनुमत संकल्प भी। कई स्थितियों के लिए हीटमैप्स की परीक्षा सबसे आम संवहन राज्यों की पहचान करने में सक्षम बनाती है, जिसके माध्यम से एक सेंसर संक्रमण करता है और इस प्रकार, कब्जा कर लेता है। प्रतिनिधि परिणामों के लिए चार फ्रेट राज्यों की पहचान की गई थी (फ्रेट = 0.31, 0.51, 0.71, और 0.89)।
    4. MATLAB कार्यक्रमों का उपयोग करके, प्रत्येक पहचाने गए विरूपण अवस्था के लिए समय निकालें। डेटा अधिग्रहण के दौरान प्रत्येक राज्य और समय समाधान को रेखांकित करने वाले फ्रेट मूल्यों की एक श्रृंखला नामित करें। फ्रेट श्रेणियों को आसन्न फ्रेट राज्यों द्वारा समान रूप से विभाजित किया जाता है। दिए गए उपचार स्थितियों के लिए समय का निर्यात करें।
      नोट: ज्यादातर मामलों में, एक घातीय क्षय फ़ंक्शन द्वारा समय-समय डेटा का अच्छी तरह से अनुमान लगाया जा सकता है। यह विश्लेषण डेटा विश्लेषण और ग्राफ़िंग सॉफ़्टवेयर में किया जा सकता है।
  4. राज्य अधिभोग को मापने के लिए एसएमफ्रेट जनसंख्या हिस्टोग्राम की गॉसियन फिटिंग
    1. मल्टीपल पीक फिटिंग विश्लेषण के लिए डेटा विश्लेषण और ग्राफिंग सॉफ्टवेयर में रुचि की स्थितियों के लिए जनसंख्या फ्रेट हिस्टोग्राम आयात करें।
    2. मौजूद चोटियों की संख्या इंगित करें (एचएमएम विश्लेषण के आधार पर चार चोटियां या राज्य)। फिटिंग को कई गॉसियन वितरण ों का उपयोग करके किया गया था, Equation 1जहां ए शिखर क्षेत्र है, एक्ससी शिखर केंद्र है, और डब्ल्यू प्रत्येक चोटी के लिए शिखर चौड़ाई है।
    3. फिटिंग मापदंडों को ए > 0, एक्ससी = फ्रेट ± 0.02, और 0.1 ≤डब्ल्यू≤ 0.24 के रूप में सीमित करें। व्यक्तिगत आबादी के लिए चार फ्रेट चोटियां फ्रेट हिस्टोग्राम एक साथ फिट थीं। सभी शर्तों की फिटिंग के लिए परिभाषित बाधाओं को लागू करें।
    4. अधिभोग (प्रतिशत) की स्थिति की गणना कुल क्षेत्रफल से विभाजित ब्याज के शिखर के क्षेत्र के रूप में करें, जिसे सभी चोटियों के योग के रूप में परिभाषित किया गया है।

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Representative Results

यूएए-आधारित फ्रेट सेंसर की अभिव्यक्ति और फ्लोरोसेंट लेबलिंग
इसमें, mGluR2 (548UAA) के CRD के भीतर UAA (AZP) के सम्मिलन और फ्लोरोसेंट लेबलिंग के अनुकरणीय परिणामों पर चर्चा की गईहै। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, एमग्लूआर 2 में एजेडपी डालने के लिए, इंजीनियर ट्रांसलेशनल मशीनरी की सह-अभिव्यक्ति, जिसमें एक संशोधित टीआरएनए सिंथेटेस और पूरक टीआरएनए (पीआईआरई 4-एजेडआई) शामिल है, और एमग्लूआर 2 जिसमें स्थिति 548 पर एक एम्बर कोडन होता है, म्यूटेनेसिस का उपयोग करके बनाया गया है, आवश्यक है (चित्रा 2 ए, बी)। साइनिन रंगों द्वारा एजेडपी की लेबलिंग एक तांबा-उत्प्रेरित साइक्लोडिशन प्रतिक्रिया (चित्रा 2 सी) द्वारा प्राप्त की जाती है और इसके परिणामस्वरूप 548 यूएए (चित्रा 2 डी) की प्रभावी प्लाज्मा झिल्ली लेबलिंग होती है। पूर्ण लंबाई 548 यूएए के अनुवाद और डिमेरिक रिसेप्टर की अखंडता को सत्यापित करने के लिए, एसडीएस-पेज वैद्युतकणसंचलन एचईके 293 टी कोशिकाओं से सेल लाइसेट पर किया गया था, जो साइ 5 के साथ लेबल किए गए 548 यूएए को व्यक्त करता है। 250KDA पर एक एकल बैंड देखा गया था, जो पूर्ण लंबाई वाले डिमेरिक mGluR2 (चित्रा 2E) के साथ मेल खाता था।

डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण
सी-टर्मिनल फ्लैग-टैग के साथ 548 यूएए व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को Cy3 (दाता) और Cy5 (स्वीकर्ता) के साथ लेबल किया गया था और फिर इन विट्रो अध्ययन के लिए प्रोटीज अवरोधक की उपस्थिति में डिटर्जेंट31 के साथ लाइस किया गया था। सेल लाइसिस के पूरा होने और सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अघुलनशील अंश को हटाने पर, सुपरनैटेंट को पॉलीथीन ग्लाइकोल (पीईजी) -पासिवेटेड कवरस्लिप पर लगाया गया था, जो कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस (टीआईआरएफ) इमेजिंग के लिए एंटी-फ्लैग-टैग एंटीबॉडी के साथ कार्यात्मक था (चित्रा 3)। नमूना 532 एनएम लेजर का उपयोग करके रोशन किया गया था, और कणों को एसएमकैमेरा सॉफ्टवेयर का उपयोग करके डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए चुना गया था। कच्चे दाता, स्वीकर्ता और फ्रेट के निशान एसएमकैमेरा में सभी चयनित अणुओं के लिए उत्पन्न किए गए थे और MATLAB (अनुभाग 6) का उपयोग करके चुने गए थे। चित्र 4)। यहां उपयोग किए जाने वाले प्रयोगात्मक सेटअप के लिए स्वीकर्ता तीव्रता पर 8.8% दाता रक्तस्राव-माध्यम सुधार लागू किया गया था। यह सुधार कारक प्रयोगात्मक सेटअप, डाइक्रोइक फिल्टर और उपयोग किए जाने वाले उत्सर्जन फिल्टर के साथ भिन्न होगा और केवल दाता फ्लोरोफोरे के साथ लेबल की गई कोशिकाओं का उपयोग करके मानक प्रयोगात्मक स्थितियों के तहत दाता और स्वीकर्ता संकेतों को मापकर और ब्लीड-थ्रू ([स्वीकर्ता तीव्रता]/ [दाता तीव्रता]) की गणना करके निर्धारित किया जाना चाहिए। चित्रा 4 कई प्रतिनिधि फ्रेट निशान और संबंधित दाता और स्वीकर्ता संकेत दिखाता है। इन निशानों को प्रोटोकॉल (अनुभाग 6) में पहले वर्णित मानदंडों का उपयोग करके चुना गया था। प्रतिनिधि चयनित निशान जो कई राज्यों और दाता और स्वीकर्ता विरंजन घटनाओं के बीच संक्रमण दिखाते हैं, चित्र 4 बी-डी में दिखाए गए हैं।

संवहन अवस्थाओं की पहचान
कब्जे वाले संवहन राज्यों की पहचान करने और एक दूसरे के सापेक्ष इन राज्यों के संबंधों की पहचान करने के लिए, हिडन मार्कोव मॉडलिंग (एचएमएम) विश्लेषण आयोजित किया गया था। एचएमएम विश्लेषण MATLAB28 (चित्रा 5 ए) पर निष्पादित vbFRET कार्यक्रम का उपयोग करके किया गया था। चित्रा 5 राज्य की पहचान की प्रक्रिया को चित्रित करने के लिए एक मध्यवर्ती ग्लूटामेट एकाग्रता (5 μM) से डेटा का उपयोग करता है। कच्चे एसएमफ्रेट निशान के आधार पर, यह अनुमान लगाया गया था कि सीआरडी के लिए चार संभावित फ्रेट राज्य मौजूद थे। इस प्रकार, राज्यों की संख्या एक से चार तक सीमित थी। कुल मिलाकर, मौजूद राज्यों की संख्या निर्धारित करने के लिए प्रत्येक ट्रेस के लिए फिटिंग के 25 पुनरावृत्तियों का प्रदर्शन किया गया था। इन आदर्श फिट्स से, असतत फ्रेट राज्यों के बीच संक्रमण निकाला जा सकता है और संक्रमण घनत्व हीटमैप (चित्रा 5 बी) के रूप में प्लॉट किया जा सकता है। हीटमैप में 0.31, 0.51, 0.71 और 0.89 पर चार असतत फ्रेट राज्यों पर प्रकाश डाला गया है, जो डॉटेड लाइनों द्वारा इंगित किया गया है। संक्रमण को फ्रेट >0.1 में परिवर्तन के रूप में परिभाषित किया गया था। आदर्शीकृत फ्रेट निशान प्रत्येक पहचाने गए रचना (चित्रा 5 सी) के लिए रहने के समय पर भी जानकारी देते हैं।

जनसंख्या फ्रेट हिस्टोग्राम उत्पादन और पीक फिटिंग
अलग-अलग ग्लूटामेट सांद्रता की उपस्थिति में 548 यूएए के लिए प्रतिनिधि एकल-अणु निशान जिन्हें आगे के विश्लेषण के लिए मैन्युअल रूप से चुना गया था, चित्रा 6 ए, बी में दिखाए गए हैं। एसएमफ्रेट प्रयोगों के लिए एक सामान्य विश्लेषण प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति (चित्रा 6 सी) के लिए सैकड़ों एसएमफ्रेट निशान से जनसंख्या हिस्टोग्राम उत्पन्न करना है। ब्लीचिंग से पहले ट्रेस के खंड से जनसंख्या फ्रेट हिस्टोग्राम बनाए जाते हैं। लंबे निशान के व्यवहार के प्रति हिस्टोग्राम को पूर्वाग्रह से बचाने के लिए, औसत से पहले प्रत्येक ट्रेस से एक सामान्यीकृत फ्रेट हिस्टोग्राम उत्पन्न करना आवश्यक है। यह सुनिश्चित करता है कि प्रत्येक ट्रेस अंतिम हिस्टोग्राम में समान रूप से योगदान देता है। इस प्रणाली में, फ्रेट हिस्टोग्राम ग्लूटामेट एकाग्रता में वृद्धि के साथ उच्च फ्रेट की ओर एक सामान्य बदलाव दिखाते हैं, जो सीआरडी के बीच की दूरी में कमी और सक्रिय रचना की ओर बदलाव का संकेत देते हैं। हालांकि, ग्लूटामेट एकाग्रता की परवाह किए बिना, फ्रेट सिग्नल काफी छिटपुट रहता है, जो सीआरडी के लिए उच्च स्तर की आंतरिक गतिशीलता का संकेत देता है। उच्च फ्रेट की ओर सामान्य बदलाव के अलावा, हिस्टोग्राम (रंग वक्र) में विरूपण पहनावा का पुनर्वितरण स्पष्ट हो जाता है। अलग-अलग अणुओं को इन संवहन अवस्थाओं (डैश्ड लाइनों) (चित्रा 6 बी) का दौरा करते हुए भी देखा जा सकता है। राज्य अधिभोग की संभावना निर्धारित करने के लिए, किसी को शिखर के क्षेत्र को कुल क्षेत्रफल से विभाजित करना होगा, जिसे सभी चार अलग-अलग शिखर क्षेत्रों के योग के रूप में परिभाषित किया गया है। mGluR2 के CRD के smFRET प्रयोग से उत्पन्न smFRET हिस्टोग्राम ने क्रमशः 0.31, 0.51, 0.71 और 0.89 (राज्य 1-4 पर लेबल) पर चोटियों के साथ चार गतिशील अवस्थाओं को प्रदर्शित किया।

Figure 1
चित्र 1: कार्य प्रोटोकॉल और डेटा विश्लेषण का प्रवाह चार्ट. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: क्लिक रसायन विज्ञान द्वारा mGluR2 की साइट-विशिष्ट लेबलिंग। (A) कोशिकाओं में अप्राकृतिक अमीनो एसिड 4-एज़िडो-एल-फेनिलएलनिन निगमन प्रक्रिया का योजनाबद्ध। (बी) कॉपर-उत्प्रेरित एज़ाइड-एल्केन क्लिक प्रतिक्रिया द्वारा 548 वें स्थान पर अप्राकृतिक अमीनो एसिड के साथ एमग्लूआर 2 के साइट-विशिष्ट फ्लोरोसेंट लेबलिंग को दिखाने वाला योजनाबद्ध। (सी) फ्लोरोसेंटली लेबल एमग्लूआर 2 (हरे रंग में दाता अणु, लाल रंग में स्वीकर्ता अणु) की त्रि-आयामी संरचना जिसमें Cy3 और Cy5 अणु डॉक होते हैं। (डी) एचईके 293 टी कोशिकाओं की प्रतिनिधि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप छवि जो 548 यूएए को दाता (हरा: Cy3) और स्वीकर्ता (लाल: Cy5) फ्लोरोफोरेस के साथ लेबल की गई सेल सतह आबादी के साथ व्यक्त करती है। स्केल बार = 10 μm. (E) HEK293T कोशिकाओं से सेल लाइसेट के गैर-कम करने वाले 4% -20% पॉलीएक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन की छवि 548UAA को व्यक्त करती है और Cy5-alkyne द्वारा लेबल की जाती है। जेल को 633 एनएम उत्तेजना तरंग दैर्ध्य और 670-बीपी 30 उत्सर्जन फिल्टर-लेन ए: प्रोटीन सीढ़ी के साथ चित्रित किया गया है; लेन बी: सेल लाइसेट; लेन सी: Cy5-alkyne डाई। परिणाम एक व्यक्तिगत प्रयोग के प्रतिनिधि हैं। पैनल बी, डी और ई को लियाउ एट अल.11 से पुन: उपयोग किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: एसएमफ्रेट प्रयोगों और माइक्रोस्कोप सेटअप (टीआईआरएफ) का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। दाता की एकल-अणु प्रतिदीप्ति छवि हरे रंग (स्केल बार = 1000 एनएम) और स्वीकर्ता लाल रंग में दिखाई गई है। दाता लेजर का उपयोग करके 532 एनएम पर उत्साहित था। स्वीकर्ता दाता से फ्रेट से उत्साहित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: दाता (हरे) और स्वीकर्ता (लाल) के तीव्रता के निशान mGluR2. (A) कार्टून रिसेप्टर गतिशीलता और फ्रेट जांच के बीच की दूरी में परिवर्तन को दर्शाता है। (बी) लंबे समय तक रहने वाली उच्च फ्रेट अवस्था। (सी) स्वीकर्ता फोटोब्लीचिंग के साथ कई फ्रेट राज्य पहले और उसके बाद दाता फोटोब्लीचिंग। (डी) स्वीकर्ता फोटोब्लीचिंग के साथ अल्पकालिक फ्रेट स्थिति। (ई) स्वीकर्ता फोटोब्लीचिंग के साथ लंबे समय तक स्थिर फ्रेट स्थिति। इस आंकड़े को लियाउ एट अल .11 से न्यूनतम संशोधन के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: विरूपण अवस्था पहचान. (ए) संबंधित दाता और स्वीकर्ता संकेत के साथ आदर्श फिट ओवरलेड (लाल) के साथ प्रतिनिधि फ्रेट ट्रेस। (बी) संक्रमण घनत्व हीटमैप 548 यूएए द्वारा किए गए सबसे लगातार संवहन संक्रमणों को उजागर करता है। डैश्ड लाइनें फ्रेट राज्यों को इंगित करती हैं। (ग) प्रत्येक संवहन अवस्था का औसत अंतराल। इस आंकड़े को लियाउ एट अल .11 से न्यूनतम संशोधन के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्र 6: एकल-अणु फ्रेट mGluR2 CRD के चार संवहन अवस्थाओं को प्रकट करता है। (A) बाईं ओर दाता चैनल (Cy3) और दाईं ओर स्वीकर्ता चैनल (Cy5) के साथ एकल-अणु फिल्म से प्रतिनिधि फ्रेम। डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण के लिए विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा चुने गए अणुओं को हरे सर्कल द्वारा इंगित किया जाता है। स्केल बार = 3 μm. (B) उदाहरण एकल-अणु समय विभिन्न ग्लूटामेट सांद्रता पर 548UAA के निशान। दाता (हरा) और स्वीकर्ता (लाल) तीव्रता और संबंधित फ्रेट (नीला) दिखाया गया है। डैश्ड लाइनें चार अलग-अलग फ्रेट राज्यों का प्रतिनिधित्व करती हैं। (सी) ग्लूटामेट सांद्रता की एक श्रृंखला में एसएमफ्रेट जनसंख्या हिस्टोग्राम। डेटा N = 3 स्वतंत्र प्रयोगों के SEM ± माध्य का प्रतिनिधित्व करता है। इस आंकड़े को लियाउ एट अल .11 से न्यूनतम संशोधन के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: समग्र प्रोटोकॉल का सारांश। (ए) अप्राकृतिक अमीनो एसिड युक्त प्रोटीन को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को बढ़ाने और लेबल करने के लिए वर्कफ़्लो। (बी) एकल-अणु फ्रेट प्रयोगात्मक और विश्लेषण वर्कफ़्लो का उपयोग विरूपण अवस्थाओं की पहचान करने और mGluR2 में CRD डोमेन के गतिशील गुणों को चिह्नित करने के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

घटक वॉल्यूम/रिएक्शन (μL)
सीरम मीडियम कम हुआ 100
अभिकर्मक अभिकर्मक 4.4
घटक वॉल्यूम/रिएक्शन (μL)
सीरम मीडियम कम हुआ 100
P3000 4
निर्माण/घटक का नाम एकाग्रता (ng/μL) वॉल्यूम/वेल (12-वेल) (μL) वेल्स (#) डीएनए जोड़ा गया (μL)
टीआरएनए/सिंथेटेस 1000 1 1 1
प्रोटीन युक्त एम्बर कोडन 1000 1 1 1

तालिका 1: एचईके 293 टी सेल के अभिकर्मक के लिए अभिकर्मक।

अभिकर्मकों जोड़ने के लिए वॉल्यूम (μL) स्टॉक कॉन्स (mM) अंतिम शंख (mM)
1x RB 655.5
BTTES 10.5 50 0.75
CuSO4 5.25 20 0.15
NaAsc 17.5 100 2.5
AminoG 8.75 100 1.25
Cy3-Alkyne (10 mM) 1.25 10 0.018
Cy5-Alkyne (10 mM) 1.25 10 0.018

तालिका 2: लेबलिंग समाधान की संरचना (रसायन विज्ञान पर क्लिक करें)।

पूरक फ़ाइल 1: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले विभिन्न बफर की संरचना। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

जीपीसीआर प्रोटीन होते हैं जो सिग्नल ट्रांसडक्शन शुरू करने के लिए कोशिका झिल्ली पर काम करते हैं। कई जीपीसीआर में कई डोमेन होते हैं, सिग्नलिंग डोमेन के बीच सहकारी बातचीत पर निर्भर होती है। इन झिल्ली रिसेप्टर्स के गुणों को संशोधित करने के लिए, कई डोमेन के गतिशील व्यवहार को समझना आवश्यक है। एकल-अणु प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (एसएमफ्रेट) एक प्रतिदीप्ति तकनीक है जो वास्तविक समय11,32 में प्रोटीन रचना और गतिशीलता के माप को सक्षम बनाता है। यहां, एक पारित सतह पर स्थिर व्यक्तिगत प्रोटीन की पुनर्व्यवस्था को सीधे कल्पना करने के लिए एसएमफ्रेट, एकल-अणु पुल-डाउन (सिमपुल), और कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी के संयोजन का एक दृष्टिकोण 5,11,33 वर्णित है। फ्रेट दूरी के प्रति अत्यधिक संवेदनशील है और प्रभावी रूप से एक नैनोस्केल शासक के रूप में कार्य करता है जो इंट्रामोलेक्यूलर परिवर्तनों (3-8 एनएम) की जांच के लिए उपयुक्त है। पारंपरिक बायोफिज़िकल दृष्टिकोणों की तुलना में, एसएमफ्रेट ~ 10 एमएस टाइमस्केल पर बड़े विरूपण गतिशीलता के अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है और इसके लिए एक छोटे नमूने की मात्रा (लगभग 1 एफमोल प्रति प्रयोग) की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, संवहन गतिशीलता के पहनावा माप के विपरीत, जैसे कि परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) 34 या डबल इलेक्ट्रॉन-इलेक्ट्रॉन अनुनाद (डीआईआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी35 द्वारा प्रदान किया जाता है, एसएमफ्रेट दोनों संवहन अवस्थाओं और उनके समय क्रम के स्पष्ट असाइनमेंट के साथ-साथ दुर्लभ और क्षणिक मध्यवर्ती अवस्थाओं का प्रत्यक्ष पता लगाने की अनुमति देता है।

वर्तमान में, साइट-विशिष्ट फ्लोरोसेंट लेबलिंग की सीमाएं एक तकनीकी चुनौती पेश करती हैं जो प्रोटीन की रचना गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एसएमफ्रेट के व्यापक अनुप्रयोग को रोकती है। इसके अलावा, बड़ी मात्रा में झिल्ली प्रोटीन को शुद्ध करना और उनकी गतिविधि को संरक्षित करना मुश्किल है। सामान्य लेबलिंग रणनीतियाँ बड़े प्रोटीन टैग का उपयोग करती हैं या न्यूनतम सिस्टीन उत्परिवर्ती की पीढ़ी की आवश्यकता होती है, जो अक्सर फ्लोरोफोर संयुग्मन को प्रोटीन के टर्मिनी तक सीमित करती हैं, जिसमें कोई उजागर सिस्टीन अवशेष नहीं होते हैं। इन सीमाओं को दरकिनार करने के लिए, एक अप्राकृतिक अमीनो एसिड (यूएए) निगमन रणनीति को अनुकूलित और अनुकूलित किया गया था, जिससे तांबा-उत्प्रेरित क्लिक प्रतिक्रिया 11,12,14 का उपयोग करके गैर-परवर्ती, अवशेष-विशिष्ट लेबलिंग की अनुमति मिली। यह रणनीति झिल्ली रिसेप्टर के विलायक-उजागर क्षेत्रों में फ्लोरोफोर को संयुग्मित करना संभव बनाती है और विरूपण सेंसर की एक विस्तृत सरणी उत्पन्न करने में सक्षम बनाती है। इस प्रोटोकॉल में, एक एकल प्रकार के संयुग्मन रसायन विज्ञान का उपयोग किया जाता है। इसके परिणामस्वरूप दाता-दाता और स्वीकर्ता-स्वीकर्ता केवल आबादी होती है, जिसे डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के दौरान छोड़ दिया जाता है। वैकल्पिक रूप से, दो ऑर्थोगोनल लेबलिंग रणनीतियों का उपयोग इससे बचने या संभावित विषमता को दूर करने के लिए किया जा सकता है जब रुचि का प्रोटीन सममित नहीं होता है।

प्रोटीन का प्रत्यक्ष कब्जा पारंपरिक शुद्धिकरण चरणों को बायपास करने में मदद करता है जो समय लेने वाले और तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हैं। तांबे की साइटोटॉक्सिसिटी के कारण, ट्रांस-साइक्लोकटेन36 या मिथाइल-टेट्राज़िन37 पर आधारित तांबा मुक्त क्लिक रसायन विज्ञान भी नियोजित है। हालांकि, वे अभिकर्मक महंगे हैं, और प्रतिक्रिया की गैर-धार्मिकप्रकृति के परिणामस्वरूप फ्लोरोसेंटली टैग किए गए प्रोटीन की कम उपज होती है।

प्रवाह कक्ष की तैयारी से लेकर डेटा विश्लेषण तक इन विट्रो स्मफ्रेट प्रयोगों के लिए गहन दिशानिर्देश यहां प्रस्तुत किए गए थे। SMFRET डेटा एक TIRF सेटअप का उपयोग करके एकत्र किया गया था, और विश्लेषण एक कस्टम-लिखित MATLAB कोड का उपयोग करके किया गया था।

कुछ प्रमुख विचारों पर ध्यान दिया जाना चाहिए। सबसे पहले, किसी को पीईजी पासिवेटेड सतह को बायोटिन-पीईजी के साथ सजातीय और कम घने होने के लिए तैयार करना चाहिए। अतिरिक्त बायोटिन-पीईजी के परिणामस्वरूप अत्यधिक प्रोटीन पुल-डाउन हो सकता है, जिससे व्यक्तिगत अणुओं से फ्लोरोसेंट संकेतों को हल करना मुश्किल हो जाता है। दूसरा, सतह संतृप्ति से बचने के लिए नमूना कक्ष में जोड़े जाने से पहले प्रोटीन नमूना (सेल लाइसेट सुपरनैटेंट) को अच्छी तरह से पतला किया जाना चाहिए। प्रोटीन की उपज सेल घनत्व, पसंद के डिटर्जेंट और डिटर्जेंट एकाग्रता पर निर्भर करती है। एकल दाता और स्वीकर्ता जोड़े की संख्या को अनुकूलित करने के लिए, किसी को 256 x 512 पिक्सेल क्षेत्र में ~ 400 अणुओं के घनत्व को लक्षित करना चाहिए। तीसरा, ट्रोलॉक्स बफर को दीर्घकालिक उपयोग (महीनों) के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत होने पर ट्रोलॉक्स बफर 2 सप्ताह तक स्थिर रहता है। अंत में, एंटीबॉडी के साथ कार्यात्मकता के बाद प्रवाह कक्ष में हवा के बुलबुले पेश नहीं करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। प्रवाह कक्ष के सूखने से प्रोटीन स्थिरीकरण और नमूना प्रोटीन विकृतीकरण की दक्षता कम हो जाएगी।

यहां वर्णित mGluR2 सेंसर की संवहन गतिशीलता को smFRET का उपयोग करके व्यक्तिगत रिसेप्टर स्तर पर सफलतापूर्वक जांच की गई और रिसेप्टर सक्रियण के तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान की गई। सीआरडी को उच्च स्तर की आंतरिक गतिशीलता का प्रदर्शन करने के लिए पाया गया था, जो ग्लूटामेट की उपस्थिति या अनुपस्थिति की परवाह किए बिना चार विरूपण फ्रेट राज्यों के बीच संतुलन में मौजूद था। उच्च फ्रेट राज्यों या अधिक कॉम्पैक्ट रिसेप्टर की ओर एक बदलाव ग्लूटामेट एकाग्रता-निर्भर तरीके से दिखाया गया था (चित्रा 6)। दिलचस्प बात यह है कि ग्लूटामेट के संतृप्त स्तर पर भी, सीआरडी गतिशील बना रहा। विरूपण गतिशीलता को समझने के लिए यहां प्रस्तुत विधि (चित्रा 7 में संक्षेप में) अन्य वर्ग सी जीपीसीआर, साथ ही अन्य झिल्ली प्रोटीन जैसे आयन चैनल, आयोनोट्रोपिक रिसेप्टर्स और रिसेप्टर टायरोसिन किनेसेस (आरटीके) 32,39 पर लागू होती है।

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Disclosures

लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी हित घोषित नहीं किया है।

Acknowledgments

हम चर्चा के लिए रेजा वफाबख्श प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ ग्रांट आर01जीएम140272 (आरवी के लिए), नॉर्थवेस्टर्न यूनिवर्सिटी में लाइफ साइंसेज के लिए सियरल लीडरशिप फंड द्वारा और शिकागो बायोमेडिकल कंसोर्टियम द्वारा शिकागो कम्युनिटी ट्रस्ट (आरवी को) में सियरल फंड्स के समर्थन से समर्थित किया गया था। बीडब्ल्यूएल को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज (एनआईजीएमएस) प्रशिक्षण अनुदान टी 32 जीएम -008061 द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(+)-Sodium L-Ascorbate Sigma Aldrich Cat # 11140-250G
4-azido-L-phenylalanine Chem-Impex International Cat # 06162
548UAA Liauw et al. 2021 Transfected construct
Acetic Acid Fisher Chemical 64-19-7
Acetone Fisher Chemical 67-64-1
Adobe Illustrator (2022) https://www.adobe.com/ RRID:SCR_010279 Software, algorithm
Aminoguanidine (hydrochloride) Cayman Chemical 81530
Aminosilane Aldrich 919-30-2
Bath Sonicator 2.8 L Fisher Scientific Ultrasonic Bath 2.8 L
Biotin-PEG Laysan Bio Inc Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg
BTTES Click Chemistry Tools 1237-500
Copper (II) sulfate Sigma Aldrich Cat # 451657-10G
Cover slip VWR 16004-306 Sample chamber
Cy3 Alkyne Click Chemistry Tools TA117-5
Cy5 Alkyne Click Chemistry Tools TA116-5
DDM Anatrace Part# D310 1 GM Detergent
DDM-CHS (10:1) Anatrace Part# D310-CH210 1 ML Detergent with cholecterol
Defined Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific SH30070.03
Di01-R405/488/561/635 Semrock Notch filter
DMEM Corning 10-013-CV
EMCCD Andor DU-897U Camera
ET542lp Chroma Long pass emission filter
FF640-FDi01 Semrock Emission dichroic filter
FLAG-tag antibody Genscript A01429
Fluorescent bead Invitrogen T7279 TetraSpeck microspheres Spherical bead
Glass slides Fisherfinest 12-544-4 sample chamber
Glutamate Sigma Aldrich Cat # 6106-04-3
HEK 293T Sigma Aldrich Cat # 12022001 Cell line
HEPES FisherBioReagents 7365-45-9
Image splitter OptoSplit II
KOH Fluka 1310-58-3
Laser Oxxius 4-line laser combiner
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific L3000015 Transfection Reagent
Methanol Fisher Chemical 67-56-1
Microscope Olympus Olympus IX83
Milli-Q water Barnstead Water Deionizer
m-PEG Laysan Bio Inc Item# MPEG-SIL-5000-1g
NF03-405/488/532/635 Semrock Dichroic mirror
OptiMEM Thermo Fisher Scientific 51985091 Reduced Serum Medium
OptiMEM/Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific
OriginPro (2020b) https://www.originlab.com/ RRID:SCR_014212 Data analysis and graphing software
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
pIRE4-Azi Addgene Plasmid # 105829 Transfected construct
Poly-L-lysine hydrobromide Sigma Aldrich Cat # P2636
Protocatechuic acid (PCA) HWI group 99-50-3
smCamera (Version 1.0) http://ha.med.jhmi.edu/resources/ Camera software
Sodium bicarbonate FisherBioReagents 144-55-8
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma 1310-73-2
Syringe filter Whatman UNIFLO Cat#9914-2502 Liquid filtration
Trolox Sigma 53188-07

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References

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जैव रसायन अंक 186 जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआर) संवहन गतिशीलता झिल्ली रिसेप्टर्स अप्राकृतिक अमीनो एसिड एसएमफ्रेट
एकल-अणु फ्रेट का उपयोग करके झिल्ली रिसेप्टर्स के विरूपण गतिशीलता की कल्पना करना
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