यह अध्ययन अप्राकृतिक अमीनो एसिड (यूएए) निगमन के माध्यम से साइट-विशिष्ट लेबलिंग का उपयोग करके जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआर) पर एकल-अणु प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (एसएमफ्रेट) प्रयोगों को करने के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया प्रस्तुत करता है। प्रोटोकॉल एसएमफ्रेट नमूना तैयारी, प्रयोगों और डेटा विश्लेषण के लिए एक चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका प्रदान करता है।
बाहरी संकेतों का जवाब देने के लिए कोशिकाओं की क्षमता सेलुलर विकास, विकास और अस्तित्व के लिए आवश्यक है। पर्यावरण से संकेत का जवाब देने के लिए, एक सेल को इसे पहचानने और संसाधित करने में सक्षम होना चाहिए। यह कार्य मुख्य रूप से झिल्ली रिसेप्टर्स के कार्य पर निर्भर करता है, जिसकी भूमिका सिग्नल को कोशिका की जैव रासायनिक भाषा में परिवर्तित करना है। जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआर) मनुष्यों में झिल्ली रिसेप्टर प्रोटीन के सबसे बड़े परिवार का गठन करते हैं। जीपीसीआर के बीच, मेटाबोट्रोपिक ग्लूटामेट रिसेप्टर्स (एमग्लूआर) एक अद्वितीय उपवर्ग है जो डिमर के रूप में कार्य करता है और एक बड़ा बाह्य डोमेन रखता है जिसमें लिगैंड-बाइंडिंग साइट होती है। mGluRs के संरचनात्मक अध्ययन में हालिया प्रगति ने उनकी सक्रियण प्रक्रिया की समझ में सुधार किया है। हालांकि, सक्रियण और मॉड्यूलेशन के दौरान एमग्लूआर के माध्यम से बड़े पैमाने पर संवहन परिवर्तनों का प्रसार खराब समझा जाता है। एकल-अणु प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (एसएमफ्रेट) एकल-प्रोटीन स्तर पर बायोमोलेक्यूल्स की संरचनात्मक गतिशीलता की कल्पना और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है। mGluR2 सक्रियण की गतिशील प्रक्रिया की कल्पना करने के लिए, अप्राकृतिक अमीनो एसिड (यूएए) निगमन के आधार पर फ्लोरोसेंट विरूपण सेंसर विकसित किए गए थे जो रिसेप्टर्स की मूल संरचना के गड़बड़ी के बिना साइट-विशिष्ट प्रोटीन लेबलिंग की अनुमति देते थे। यहां वर्णित प्रोटोकॉल बताता है कि इन प्रयोगों को कैसे किया जाए, जिसमें उपन्यास यूएए लेबलिंग दृष्टिकोण, नमूना तैयारी और एसएमफ्रेट डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण शामिल हैं। ये रणनीतियाँ सामान्य हैं और विभिन्न प्रकार के झिल्ली प्रोटीन की संवहन गतिशीलता की जांच करने के लिए विस्तारित की जा सकती हैं।
प्लाज्मा झिल्ली में जानकारी का हस्तांतरण झिल्ली रिसेप्टर्स1 के कार्य पर बहुत अधिक निर्भर है। एक रिसेप्टर के लिए लिगैंड बाइंडिंग एक संवहन परिवर्तन और रिसेप्टर सक्रियण की ओर जाता है। यह प्रक्रिया अक्सर प्रकृति में एलोस्टेरिक होती है। 800 से अधिक सदस्यों के साथ, जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआर) मनुष्यों में झिल्ली रिसेप्टर्स का सबसे बड़ा परिवार है। लगभग सभी सेलुलर प्रक्रियाओं में उनकी भूमिका के कारण, जीपीसीआर चिकित्सीय विकास के लिए महत्वपूर्ण लक्ष्य बन गए हैं। जीपीसीआर सिग्नलिंग के कैननिकल मॉडल में, एगोनिस्ट सक्रियण के परिणामस्वरूप रिसेप्टर के विरूपण परिवर्तन होते हैं जो बाद में जीα के न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग पॉकेट पर जीटीपी के लिए जीडीपी के आदान-प्रदान के माध्यम से हेटरोट्रीमेरिक जी प्रोटीन कॉम्प्लेक्स को सक्रिय करते हैं। सक्रिय जीα-जीटीपी और जी ए सबयूनिट्स फिर डाउनस्ट्रीम प्रभावक प्रोटीन की गतिविधिको नियंत्रित करते हैं और सिग्नलिंग कैस्केड 4,5 का प्रचार करते हैं। यह सिग्नलिंग प्रक्रिया अनिवार्य रूप से रिसेप्टर के त्रि-आयामी आकार को बदलने के लिए लिगेंड की क्षमता पर निर्भर करती है। लिगेंड इसे कैसे प्राप्त करते हैं, इसकी एक यंत्रवत समझ नए चिकित्सीय विकसित करने और सिंथेटिक रिसेप्टर्स और सेंसर डिजाइन करने के लिए महत्वपूर्ण है।
मेटाबोट्रोपिक ग्लूटामेट रिसेप्टर्स (एमग्लूआर) वर्ग सी जीपीसीआर परिवार के सदस्य हैं और ग्लूटामेट के धीमे न्यूरोमॉड्यूलेटरी प्रभावों और न्यूरोनल उत्तेजना 6,7 को ट्यून करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। सभी जीपीसीआर में, क्लास सी जीपीसीआर संरचनात्मक रूप से अद्वितीय हैं कि वे बाध्यकारी डिमर के रूप में कार्य करते हैं। mGluRs में तीन संरचनात्मक डोमेन होते हैं: वीनस फ्लाईट्रैप (VFT) डोमेन, सिस्टीन-रिच डोमेन (CRD), और ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन (TMD)8। सक्रियण प्रक्रिया के दौरान विरूपण परिवर्तन जटिल होते हैं और इसमें स्थानीय और वैश्विक विरूपण युग्मन शामिल होता है जो 12 एनएम की दूरी पर फैलता है, साथ ही डिमर सहक्रियाशीलता भी होती है। मध्यवर्ती अनुरूपता, राज्यों का अस्थायी क्रम, और राज्यों के बीच संक्रमण की दर अज्ञात हैं। वास्तविक समय में व्यक्तिगत रिसेप्टर्स की रचना का पालन करके, सक्रियण के दौरान क्षणिक मध्यवर्ती अवस्थाओं और संवहन परिवर्तनों के अनुक्रम की पहचान करना संभव है। यह एकल-अणु प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण 9,10 (एसएमफ्रेट) को लागू करके प्राप्त किया जा सकता है, जैसा कि हाल ही में mGluR211 के सक्रियण के दौरान विरूपण परिवर्तनों के प्रसार की कल्पना करने के लिए लागू किया गया था। फ्रेट प्रयोगों में एक महत्वपूर्ण कदम दाता और स्वीकर्ता फ्लोरोफोरेस के साइट-विशिष्ट सम्मिलन द्वारा फ्रेट सेंसर की पीढ़ी है। एक अप्राकृतिक अमीनो एसिड (यूएए) निगमन रणनीति को विशिष्ट साइट-विशिष्ट फ्लोरोसेंट लेबलिंग प्रौद्योगिकियों की सीमाओं को दूर करने के लिए 12,13,14,15 अपनाया गया था, जिसके लिए सिस्टीन-कम उत्परिवर्ती के निर्माण या एक बड़े आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड टैग के सम्मिलन की आवश्यकता होती है। इसने आवश्यक कॉम्पैक्ट एलोस्टेरिक लिंकर के विरूपण पुनर्व्यवस्था की अनुमति दी, जो mGluR2 के लिगैंड-बाइंडिंग और सिग्नलिंग डोमेन में शामिल हो गया, को देखा जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, mGluR2 पर smFRET प्रयोगों को करने के लिए एक चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका प्रस्तुत की गई है, जिसमें कॉपर-उत्प्रेरित एज़ाइड साइक्लाइजेशन प्रतिक्रिया का उपयोग करके फ्लोरोफोर को संलग्न करने के लिए UAA के साथ mGluR2 के साइट-विशिष्ट लेबलिंग के लिए दृष्टिकोण शामिल है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल झिल्ली प्रोटीन और डेटा विश्लेषण के प्रत्यक्ष कैप्चर के लिए पद्धति का वर्णन करता है। यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल अन्य झिल्ली प्रोटीन की संवहन गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए भी लागू होता है।
जीपीसीआर प्रोटीन होते हैं जो सिग्नल ट्रांसडक्शन शुरू करने के लिए कोशिका झिल्ली पर काम करते हैं। कई जीपीसीआर में कई डोमेन होते हैं, सिग्नलिंग डोमेन के बीच सहकारी बातचीत पर निर्भर होती है। इन झिल्ली रिस…
The authors have nothing to disclose.
हम चर्चा के लिए रेजा वफाबख्श प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ ग्रांट आर01जीएम140272 (आरवी के लिए), नॉर्थवेस्टर्न यूनिवर्सिटी में लाइफ साइंसेज के लिए सियरल लीडरशिप फंड द्वारा और शिकागो बायोमेडिकल कंसोर्टियम द्वारा शिकागो कम्युनिटी ट्रस्ट (आरवी को) में सियरल फंड्स के समर्थन से समर्थित किया गया था। बीडब्ल्यूएल को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज (एनआईजीएमएस) प्रशिक्षण अनुदान टी 32 जीएम -008061 द्वारा समर्थित किया गया था।
(+)-Sodium L-Ascorbate | Sigma Aldrich | Cat # 11140-250G | |
4-azido-L-phenylalanine | Chem-Impex International | Cat # 06162 | |
548UAA | Liauw et al. 2021 | Transfected construct | |
Acetic Acid | Fisher Chemical | 64-19-7 | |
Acetone | Fisher Chemical | 67-64-1 | |
Adobe Illustrator (2022) | https://www.adobe.com/ | RRID:SCR_010279 | Software, algorithm |
Aminoguanidine (hydrochloride) | Cayman Chemical | 81530 | |
Aminosilane | Aldrich | 919-30-2 | |
Bath Sonicator 2.8 L | Fisher Scientific | Ultrasonic Bath 2.8 L | |
Biotin-PEG | Laysan Bio Inc | Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg | |
BTTES | Click Chemistry Tools | 1237-500 | |
Copper (II) sulfate | Sigma Aldrich | Cat # 451657-10G | |
Cover slip | VWR | 16004-306 | Sample chamber |
Cy3 Alkyne | Click Chemistry Tools | TA117-5 | |
Cy5 Alkyne | Click Chemistry Tools | TA116-5 | |
DDM | Anatrace | Part# D310 1 GM | Detergent |
DDM-CHS (10:1) | Anatrace | Part# D310-CH210 1 ML | Detergent with cholecterol |
Defined Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH30070.03 | |
Di01-R405/488/561/635 | Semrock | Notch filter | |
DMEM | Corning | 10-013-CV | |
EMCCD | Andor | DU-897U | Camera |
ET542lp | Chroma | Long pass emission filter | |
FF640-FDi01 | Semrock | Emission dichroic filter | |
FLAG-tag antibody | Genscript | A01429 | |
Fluorescent bead | Invitrogen T7279 | TetraSpeck microspheres | Spherical bead |
Glass slides | Fisherfinest | 12-544-4 | sample chamber |
Glutamate | Sigma Aldrich | Cat # 6106-04-3 | |
HEK 293T | Sigma Aldrich | Cat # 12022001 | Cell line |
HEPES | FisherBioReagents | 7365-45-9 | |
Image splitter | OptoSplit II | ||
KOH | Fluka | 1310-58-3 | |
Laser | Oxxius | 4-line laser combiner | |
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | Transfection Reagent |
Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
Milli-Q water | Barnstead | Water Deionizer | |
m-PEG | Laysan Bio Inc | Item# MPEG-SIL-5000-1g | |
NF03-405/488/532/635 | Semrock | Dichroic mirror | |
OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 51985091 | Reduced Serum Medium |
OptiMEM/Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | ||
OriginPro (2020b) | https://www.originlab.com/ | RRID:SCR_014212 | Data analysis and graphing software |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
pIRE4-Azi | Addgene | Plasmid # 105829 | Transfected construct |
Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | Cat # P2636 | |
Protocatechuic acid (PCA) | HWI group | 99-50-3 | |
smCamera (Version 1.0) | http://ha.med.jhmi.edu/resources/ | Camera software | |
Sodium bicarbonate | FisherBioReagents | 144-55-8 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | 1310-73-2 | |
Syringe filter | Whatman UNIFLO | Cat#9914-2502 | Liquid filtration |
Trolox | Sigma | 53188-07 |