Denna studie presenterar en detaljerad procedur för att utföra enmolekylära fluorescensresonansenergiöverföringsexperiment (smFRET) på G-proteinkopplade receptorer (GPCR) med hjälp av platsspecifik märkning via onaturlig aminosyra (UAA) införlivande. Protokollet innehåller en steg-för-steg-guide för smFRET-provberedning, experiment och dataanalys.
Cellernas förmåga att reagera på externa signaler är avgörande för cellulär utveckling, tillväxt och överlevnad. För att svara på en signal från miljön måste en cell kunna känna igen och bearbeta den. Denna uppgift är huvudsakligen beroende av membranreceptorernas funktion, vars roll är att omvandla signaler till cellens biokemiska språk. G-proteinkopplade receptorer (GPCR) utgör den största familjen av membranreceptorproteiner hos människor. Bland GPCR är metabotropa glutamatreceptorer (mGluRs) en unik underklass som fungerar som obligatoriska dimerer och har en stor extracellulär domän som innehåller ligandbindningsstället. De senaste framstegen inom strukturella studier av mGluRs har förbättrat förståelsen för deras aktiveringsprocess. Emellertid är förökningen av storskaliga konformationsförändringar genom mGluRs under aktivering och modulering dåligt förstådd. Enmolekylär fluorescensresonansenergiöverföring (smFRET) är en kraftfull teknik för att visualisera och kvantifiera den strukturella dynamiken hos biomolekyler på enproteinnivå. För att visualisera den dynamiska processen för mGluR2-aktivering utvecklades fluorescerande konformationssensorer baserade på onaturlig aminosyra (UAA) -införlivande som möjliggjorde platsspecifik proteinmärkning utan störning av receptorernas ursprungliga struktur. Protokollet som beskrivs här förklarar hur man utför dessa experiment, inklusive den nya UAA-märkningsmetoden, provberedning och smFRET-datainsamling och analys. Dessa strategier är generaliserbara och kan utvidgas för att undersöka konformationsdynamiken hos en mängd olika membranproteiner.
Överföringen av information över plasmamembranet är starkt beroende av membranreceptorernas funktion1. Livandbindning till en receptor leder till en konformationsförändring och receptoraktivering. Denna process är ofta allosterisk i naturen2. Med över 800 medlemmar är G-proteinkopplade receptorer (GPCR) den största familjen av membranreceptorer hos människor3. På grund av sin roll i nästan alla cellulära processer har GPCR blivit viktiga mål för terapeutisk utveckling. I den kanoniska modellen för GPCR-signalering resulterar agonistaktivering i konformationsförändringar av receptorn som därefter aktiverar det heterotrimera G-proteinkomplexet via utbyte av BNP mot GTP vid nukleotidbindningsfickan på Gα. De aktiverade underenheterna Gα-GTP ochG βγ styr sedan aktiviteten hos nedströms effektorproteiner och sprider signalkaskaden 4,5. Denna signalprocess beror väsentligen på ligandernas förmåga att ändra receptorns tredimensionella form. En mekanistisk förståelse för hur ligander uppnår detta är avgörande för att utveckla nya terapier och designa syntetiska receptorer och sensorer.
Metabotropa glutamatreceptorer (mGluRs) är medlemmar i klass C GPCR-familjen och är viktiga för de långsamma neuromodulerande effekterna av glutamat och tuning neuronal excitabilitet 6,7. Bland alla GPCR är klass C GPCR strukturellt unika genom att de fungerar som obligatoriska dimerer. mGluRs innehåller tre strukturella domäner: Venus flytrap (VFT) domän, cysteinrik domän (CRD) och transmembrandomän (TMD)8. Konformationsförändringarna under aktiveringsprocessen är komplexa och involverar lokal och global konformationskoppling som sprider sig över ett avstånd på 12 nm, liksom dimer kooperativitet. De mellanliggande konformationerna, den tidsmässiga ordningen av tillstånd och övergångshastigheten mellan tillstånd är okända. Genom att följa konformationen av enskilda receptorer i realtid är det möjligt att identifiera de övergående mellanliggande tillstånden och sekvensen av konformationsförändringar under aktivering. Detta kan uppnås genom att tillämpa enmolekylär fluorescensresonansenergiöverföring 9,10 (smFRET), som nyligen tillämpades för att visualisera förökningen av konformationsförändringar under aktiveringen av mGluR2 11. Ett viktigt steg i FRET-experiment är genereringen av FRET-sensorer genom platsspecifik införande av givar- och acceptorfluoroforerna i proteinet av intresse. En onaturlig aminosyra (UAA) inkorporeringsstrategi antogs12,13,14,15 för att övervinna begränsningarna hos typiska platsspecifika fluorescerande märkningstekniker som kräver skapande av cysteinlösa mutanter eller införande av en stor genetiskt kodad tagg. Detta gjorde det möjligt att observera konformationsomläggningen av den väsentliga kompakta allosteriska länkaren, som förenade ligandbindnings- och signaldomänerna för mGluR2. I detta protokoll presenteras en steg-för-steg-guide för att utföra smFRET-experiment på mGluR2, inklusive tillvägagångssättet för platsspecifik märkning av mGluR2 med UAA för att fästa fluoroforer med hjälp av den kopparkatalyserade azidcykliseringsreaktionen. Dessutom beskriver detta protokoll metoden för direkt infångning av membranproteiner och dataanalys. Protokollet som beskrivs här är också tillämpligt för att studera konformationsdynamiken hos andra membranproteiner.
GPCR är proteiner som opererar på cellmembranet för att initiera signaltransduktion. Många GPCR består av flera domäner, där signalering är beroende av den kooperativa interaktionen mellan domänerna. För att modulera egenskaperna hos dessa membranreceptorer är det viktigt att förstå det dynamiska beteendet hos de flera domänerna. Enmolekylär fluorescensresonansenergiöverföring (smFRET) är en fluorescensteknik som möjliggör mätning av proteinkonformation och dynamik i realtid11,32</s…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar medlemmarna i Reza Vafabakhsh-labbet för diskussioner. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health-bidraget R01GM140272 (till R.V.), av The Searle Leadership Fund for the Life Sciences vid Northwestern University och av Chicago Biomedical Consortium med stöd från Searle Funds vid The Chicago Community Trust (till R.V.). B.W.L. stöddes av National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Training Grant T32GM-008061.
(+)-Sodium L-Ascorbate | Sigma Aldrich | Cat # 11140-250G | |
4-azido-L-phenylalanine | Chem-Impex International | Cat # 06162 | |
548UAA | Liauw et al. 2021 | Transfected construct | |
Acetic Acid | Fisher Chemical | 64-19-7 | |
Acetone | Fisher Chemical | 67-64-1 | |
Adobe Illustrator (2022) | https://www.adobe.com/ | RRID:SCR_010279 | Software, algorithm |
Aminoguanidine (hydrochloride) | Cayman Chemical | 81530 | |
Aminosilane | Aldrich | 919-30-2 | |
Bath Sonicator 2.8 L | Fisher Scientific | Ultrasonic Bath 2.8 L | |
Biotin-PEG | Laysan Bio Inc | Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg | |
BTTES | Click Chemistry Tools | 1237-500 | |
Copper (II) sulfate | Sigma Aldrich | Cat # 451657-10G | |
Cover slip | VWR | 16004-306 | Sample chamber |
Cy3 Alkyne | Click Chemistry Tools | TA117-5 | |
Cy5 Alkyne | Click Chemistry Tools | TA116-5 | |
DDM | Anatrace | Part# D310 1 GM | Detergent |
DDM-CHS (10:1) | Anatrace | Part# D310-CH210 1 ML | Detergent with cholecterol |
Defined Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH30070.03 | |
Di01-R405/488/561/635 | Semrock | Notch filter | |
DMEM | Corning | 10-013-CV | |
EMCCD | Andor | DU-897U | Camera |
ET542lp | Chroma | Long pass emission filter | |
FF640-FDi01 | Semrock | Emission dichroic filter | |
FLAG-tag antibody | Genscript | A01429 | |
Fluorescent bead | Invitrogen T7279 | TetraSpeck microspheres | Spherical bead |
Glass slides | Fisherfinest | 12-544-4 | sample chamber |
Glutamate | Sigma Aldrich | Cat # 6106-04-3 | |
HEK 293T | Sigma Aldrich | Cat # 12022001 | Cell line |
HEPES | FisherBioReagents | 7365-45-9 | |
Image splitter | OptoSplit II | ||
KOH | Fluka | 1310-58-3 | |
Laser | Oxxius | 4-line laser combiner | |
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | Transfection Reagent |
Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
Milli-Q water | Barnstead | Water Deionizer | |
m-PEG | Laysan Bio Inc | Item# MPEG-SIL-5000-1g | |
NF03-405/488/532/635 | Semrock | Dichroic mirror | |
OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 51985091 | Reduced Serum Medium |
OptiMEM/Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | ||
OriginPro (2020b) | https://www.originlab.com/ | RRID:SCR_014212 | Data analysis and graphing software |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
pIRE4-Azi | Addgene | Plasmid # 105829 | Transfected construct |
Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | Cat # P2636 | |
Protocatechuic acid (PCA) | HWI group | 99-50-3 | |
smCamera (Version 1.0) | http://ha.med.jhmi.edu/resources/ | Camera software | |
Sodium bicarbonate | FisherBioReagents | 144-55-8 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | 1310-73-2 | |
Syringe filter | Whatman UNIFLO | Cat#9914-2502 | Liquid filtration |
Trolox | Sigma | 53188-07 |