Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Visualisering av membranreceptorernas konformationsdynamik med hjälp av enmolekylär FRET

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/64254
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Molecular Biosciences, Northwestern University

Summary

Denna studie presenterar en detaljerad procedur för att utföra enmolekylära fluorescensresonansenergiöverföringsexperiment (smFRET) på G-proteinkopplade receptorer (GPCR) med hjälp av platsspecifik märkning via onaturlig aminosyra (UAA) införlivande. Protokollet innehåller en steg-för-steg-guide för smFRET-provberedning, experiment och dataanalys.

Abstract

Cellernas förmåga att reagera på externa signaler är avgörande för cellulär utveckling, tillväxt och överlevnad. För att svara på en signal från miljön måste en cell kunna känna igen och bearbeta den. Denna uppgift är huvudsakligen beroende av membranreceptorernas funktion, vars roll är att omvandla signaler till cellens biokemiska språk. G-proteinkopplade receptorer (GPCR) utgör den största familjen av membranreceptorproteiner hos människor. Bland GPCR är metabotropa glutamatreceptorer (mGluRs) en unik underklass som fungerar som obligatoriska dimerer och har en stor extracellulär domän som innehåller ligandbindningsstället. De senaste framstegen inom strukturella studier av mGluRs har förbättrat förståelsen för deras aktiveringsprocess. Emellertid är förökningen av storskaliga konformationsförändringar genom mGluRs under aktivering och modulering dåligt förstådd. Enmolekylär fluorescensresonansenergiöverföring (smFRET) är en kraftfull teknik för att visualisera och kvantifiera den strukturella dynamiken hos biomolekyler på enproteinnivå. För att visualisera den dynamiska processen för mGluR2-aktivering utvecklades fluorescerande konformationssensorer baserade på onaturlig aminosyra (UAA) -införlivande som möjliggjorde platsspecifik proteinmärkning utan störning av receptorernas ursprungliga struktur. Protokollet som beskrivs här förklarar hur man utför dessa experiment, inklusive den nya UAA-märkningsmetoden, provberedning och smFRET-datainsamling och analys. Dessa strategier är generaliserbara och kan utvidgas för att undersöka konformationsdynamiken hos en mängd olika membranproteiner.

Introduction

Överföringen av information över plasmamembranet är starkt beroende av membranreceptorernas funktion1. Livandbindning till en receptor leder till en konformationsförändring och receptoraktivering. Denna process är ofta allosterisk i naturen2. Med över 800 medlemmar är G-proteinkopplade receptorer (GPCR) den största familjen av membranreceptorer hos människor3. På grund av sin roll i nästan alla cellulära processer har GPCR blivit viktiga mål för terapeutisk utveckling. I den kanoniska modellen för GPCR-signalering resulterar agonistaktivering i konformationsförändringar av receptorn som därefter aktiverar det heterotrimera G-proteinkomplexet via utbyte av BNP mot GTP vid nukleotidbindningsfickan på Gα. De aktiverade underenheterna Gα-GTP ochG βγ styr sedan aktiviteten hos nedströms effektorproteiner och sprider signalkaskaden 4,5. Denna signalprocess beror väsentligen på ligandernas förmåga att ändra receptorns tredimensionella form. En mekanistisk förståelse för hur ligander uppnår detta är avgörande för att utveckla nya terapier och designa syntetiska receptorer och sensorer.

Metabotropa glutamatreceptorer (mGluRs) är medlemmar i klass C GPCR-familjen och är viktiga för de långsamma neuromodulerande effekterna av glutamat och tuning neuronal excitabilitet 6,7. Bland alla GPCR är klass C GPCR strukturellt unika genom att de fungerar som obligatoriska dimerer. mGluRs innehåller tre strukturella domäner: Venus flytrap (VFT) domän, cysteinrik domän (CRD) och transmembrandomän (TMD)8. Konformationsförändringarna under aktiveringsprocessen är komplexa och involverar lokal och global konformationskoppling som sprider sig över ett avstånd på 12 nm, liksom dimer kooperativitet. De mellanliggande konformationerna, den tidsmässiga ordningen av tillstånd och övergångshastigheten mellan tillstånd är okända. Genom att följa konformationen av enskilda receptorer i realtid är det möjligt att identifiera de övergående mellanliggande tillstånden och sekvensen av konformationsförändringar under aktivering. Detta kan uppnås genom att tillämpa enmolekylär fluorescensresonansenergiöverföring 9,10 (smFRET), som nyligen tillämpades för att visualisera förökningen av konformationsförändringar under aktiveringen av mGluR2 11. Ett viktigt steg i FRET-experiment är genereringen av FRET-sensorer genom platsspecifik införande av givar- och acceptorfluoroforerna i proteinet av intresse. En onaturlig aminosyra (UAA) inkorporeringsstrategi antogs12,13,14,15 för att övervinna begränsningarna hos typiska platsspecifika fluorescerande märkningstekniker som kräver skapande av cysteinlösa mutanter eller införande av en stor genetiskt kodad tagg. Detta gjorde det möjligt att observera konformationsomläggningen av den väsentliga kompakta allosteriska länkaren, som förenade ligandbindnings- och signaldomänerna för mGluR2. I detta protokoll presenteras en steg-för-steg-guide för att utföra smFRET-experiment på mGluR2, inklusive tillvägagångssättet för platsspecifik märkning av mGluR2 med UAA för att fästa fluoroforer med hjälp av den kopparkatalyserade azidcykliseringsreaktionen. Dessutom beskriver detta protokoll metoden för direkt infångning av membranproteiner och dataanalys. Protokollet som beskrivs här är också tillämpligt för att studera konformationsdynamiken hos andra membranproteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollets övergripande arbetsflöde beskrivs i figur 1.

1. Beredning av provkammaren

  1. Rengöring av glid- och täckglas
    OBS: Dessa steg syftar till att rengöra ytorna på bilderna såväl som täckglasen och förbereda dem för aminosilanisering. Ett kritiskt krav för att genomföra enmolekylära fluorescensexperiment på ytbundna molekyler är en passiverad yta. Den mest tillförlitliga och reproducerbara passiveringstekniken innebär kovalent att fästa inerta polymerkedjor på glasytan som ett tätt skikt. Polyetylenglykol (PEG) är den mest effektiva polymeren som används för ytpassivering16. Detaljerna för passiveringsförfarandet med PEG (PEGylation) beskrivs nedan:
    1. Markera hål som ska borras på objektglasen med en markör (~ 6 mm från varandra och bort från kanten). Använd en Dremel för att borra små hål (1 mm diameter) på glasskivan. Sänk ner rutschkanorna i vatten under borrningsprocessen.
    2. Tvätta bilderna med aceton för att ta bort kvarvarande bläck från markören.
    3. Ta bort från aceton och skölj bilderna med vatten och mikrovågsugn dem sedan i 5 minuter i vatten vid hög effekt (700 W).
    4. Rengör bilderna med vatten innan du placerar dem i en glasfärgningsburk som ska sonikeras. Placera täckglasen i en annan färgburk.
    5. Sonicate glidbanor och täckglas i aceton för 30 min i ett bad sonicator vid 23 °C.
    6. Under tiden rengör du en glaskolv för beredning av aminosilaniseringslösningen som används under nästa steg. Fyll kolven med 1 M KOH, sonikera kolven i 30 min, skölj noggrant ur KOH med vatten och sedan sonika i ytterligare 30 min i metanol. Låt kolven stå i metanol tills tiden för aminosilaniseringssteget.
    7. Under tiden tar du bort aminosilan, mPEG och biotin-PEG från frysen (−20 °C) och låter dem komma till rumstemperatur (RT) i mörker.
    8. Kassera aceton från glas- och täckglasburkarna i lämplig behållare för kemiskt avfall, skölj noggrant med vatten och sedan sonikera bilderna i 5 M KOH i 30 minuter.
    9. Skölj bilderna och täckglasen med vatten och sedan sonikera i metanol i 2 min (upprepa två gånger). Låt burkarna fyllda med metanol tills aminosilaniseringssteget.
      OBS: I denna studie används avjoniserat vatten om inget annat anges. En badsonicator som arbetar vid 23 °C används.
  2. Aminosilanisering
    OBS: Detta steg syftar till att kovalent länka aminosilan till den rena glid- och täckglasytan. Funktionaliserad mPEG och biotin-PEG kommer kovalent att binda till denna yta i nästa steg.
    1. Bered en aminosilaniseringsblandning i en ren kolv (steg 1.6). Bered lösningen genom att blanda metanol (150 ml), ättiksyra (7,5 ml, använd glaspipett) och aminosilan (2,5 ml).
    2. Blanda lösningen försiktigt i den kemiska rökhuven, häll den sedan i glid- och täckglasburkarna. Använd 50 ml för täckglas och 100 ml för diabilder. Se till att glidbanor och täckglas är helt nedsänkta i lösningen.
    3. Inkubera i 10 min, sedan sonika burkarna i 1 min (ultraljudsbehandling tar bort föroreningarna från ytan) och inkubera i ytterligare 10 min.
    4. Kassera aminosilaniseringslösning i avfallsbehållaren. Tillsätt metanol i burkarna, stäng burkarna med lock och skaka försiktigt för hand. Kassera metanolen och fyll burkarna med vatten.
    5. Sätt tillbaka aminosilanflaskan i frysen (−20 °C).
  3. PEGylering
    OBS: Dessa steg beskriver PEGylation-proceduren.
    1. Under aminosilanisering, förbered pegyleringsbufferten. Väg upp 84 mg natriumbikarbonat (NaHCO3) och tillsätt det till 10 ml vatten (10 mM). Väg dessutom mPEG och biotin-PEG och lägg dem åt sidan. För sex objektglas och täckglas, använd 96 mg mPEG och 1,2-2,4 mg biotin-PEG.
      OBS: Det är viktigt att inte lägga till för mycket biotin-PEG eftersom det kan öka antalet bakgrundsfläckar. Lös inte upp PEG-blandningen förrän precis före applicering på objektglas.
    2. Skölj bilderna med vatten, torka dem med ett försiktigt luftslag och placera dem sedan i de fuktade monteringslådorna.
      OBS: Det är viktigt att använda ett rent flygbolag. Undvik att använda komprimerad konserverad luft, som kan lämna rester på glaset.
    3. Tillsätt pegyleringsbuffert till PEG-pulverblandningen och pipettera försiktigt upp och ner flera gånger för att lösa upp. Tillsätt 55 μl pegyleringsbuffert per objektglas (för sex objektglas, tillsätt 330 μl pegyleringsbuffert).
    4. Centrifugera vid 9 600 x g i 1 min vid 23 °C för att fälla ut oupplösta partiklar. Samla supernatanten som ska användas i nästa steg.
      OBS: Biotin-PEG hydrolyserar snabbt på grund av närvaron av NHS-gruppen. Det är viktigt att göra blandnings- och centrifugeringsstegen snabbt.
    5. Applicera 60 μl PEGylationslösning på varje objektglas och placera sedan täckglaset ovanpå så att PEGylationslösningen är inklämd mellan bilden och täckglaset.
      OBS: Undvik att införa bubblor mellan bilden och täckglaset, eftersom detta minskar passiveringseffektiviteten. Ta bort eventuella bubblor genom att justera täckglaset och bilden med en pipettspets.
    6. Placera bilderna i en låda som är platt och mörk. Bilder kan lagras över natten; Inkubation i 4-6 h resulterar emellertid i optimal passivering.
      OBS: Det är viktigt att komma ihåg vilken sida som är pegylerad.
    7. Markera den icke-pegylerade sidan före förvaring. Efter inkubation, demontera försiktigt och skölj glidbanorna och täckglasen noggrant med vatten
    8. Torka rutschkanorna och täckglasen genom att blåsa luft. Förvara objektglasen och täckglasen i ett sterilt rör (50 ml), med den PEGylerade ytan vänd bort från varandra. Förvaras vid −20 °C fram till experimentdagen.
      OBS: Det är bäst att använda glidbanor och täckglas inom 4 veckor efter beredningen. De PEGylerade ytorna ska vara vända bort från varandra. Förvaring av PEGylated diabilder och täckglas i vakuumförseglade påsar kan öka deras hållbarhet.

2. mGluR2-uttryck med införlivad onaturlig aminosyra, fluorescerande märkning och extraktion

OBS: Detta protokoll beskriver beredning, reagens och behandling av celler för att uttrycka mGluR2 innehållande UAA 4-azido-L-fenylalanin (AZP). Förfarandet är för HEK293T-celler som odlas på 18 mm glasöverdrag. Proceduren kan skalas upp vid behov.

  1. Seedning
    OBS: Behåll HEK293T-cellerna i DMEM kompletterat med 10% (v / v) fetalt bovint serum, 100 enhet · ml − 1 penicillin-streptomycin och 15 mM HEPES-buffert (tilläggsfil 1) (pH 7.4) vid 37 ° C under 5% CO2.
    1. Passera cellerna med 0,05% trypsin-EDTA. Frö HEK293T-celler på poly-L / D-lysin (PLL / PDL) glasöverdrag så att de når ≥80% sammanflöde under transfektionstiden.
  2. Transfektion
    1. Bered en 40 mM stamlösning av AZP i 0,1 M NaOH.
    2. Förbered AZP-kompletterade medier för odling av celler och mGluR2-uttryck. Komplettera standardmedia (+ FBS, penna/strep, 15 mM HEPES) med 40 mM AZP lagerlösning. Ta den slutliga AZP-koncentrationen till 0,6 mM. Tillsätt 1 M HEPES-lösning (halva volymen av 40 mM AZP stamlösning tillsatt). Till exempel, för att bereda 10 ml AZP-kompletterat media, kombinera 9,775 ml standardmedia, 150 μL 40 mM AZP-stamlösning och 75 μL 1 M HEPES-lösning.
    3. Filtrera (sterilisera) mediet med ett sprutfilter (0,2 μm, PES).
    4. Byt ut standardmediet mot media som innehåller AZP-kompletterade medier före transfektion.
      OBS: Var försiktig så att du inte torkar cellerna under byte av media.
    5. Transfektera cellerna med transfektionsreagens (materialtabell) enligt tillverkarens manual. Transfekta HEK293T-celler på en 18 mm täckskiva med totalt 2 μg DNA (1000 ng tRNA/syntetas + 1000 ng bärnstenskodoninnehållande proteinplasmid). Se tabell 1 för koncentration och volym av de komponenter som används.
    6. Byt media 24 h efter transfektion till färskt AZP-kompletterat medium och låt cellerna växa i ytterligare 24 timmar.
  3. Märkning med alkyncyaninfärger
    1. 20 minuter före märkning, tvätta täckglasen med varm (37 °C) inspelningsbuffert (RB) (tilläggsfil 1) två gånger och flytta dem till varma (37 °C) standardmedier utan AZP (+ FBS, Pen/Strep, 15 mM HEPES).
    2. Förbered märkningslösningen innehållande Cy3-alkyn, Cy5-alkyn, BTTES, koppar (II) sulfat (CuSO4), (+) natrium L-askorbat och aminoguanidin.
    3. Följ ordningen för att skapa och lägga till lösningar (tabell 2):
      1. Förbered 50 mM BTTES.
      2. Förbered 100 mM aminoguanidin.
      3. Förbered 100 mM Na-askorbat.
      4. Förbered 655,5 μL RB.
      5. Tillsätt Cy3/Cy5 alkynfärgämne (10 mM i DMSO-lager) till RB.
        OBS: Tillsätt aminoguanidin till RB.
      6. Förbered 20 mM CuSO4.
      7. Blanda CuSO4 och BTTES i ett nytt rör (lösningen blir blå).
      8. Tillsätt CuSO4- och BTTES-blandningen till RB (2.3.3.6).
      9. Lägg till Na-Askorbatet.
      10. Följ volymen som anges i tabell 2 nedan för en 18 mm täckglas.
    4. Blanda lösningen noggrant och inkubera på is och i mörkret i 10 minuter före märkning av celler.
    5. Innan du lägger till märkningslösningen i täckglasen, ta bort mediet och tvätta dem med RB. Tillsätt märkningslösningen och inkubera i 15 minuter vid 37 °C under mörka förhållanden.
    6. OBS: För att förbättra märkningen, tillsätt glutamat (slutlig koncentration ~ 0,5 mM) efter 10 min och inkubera i ytterligare 5 minuter. Koppar är mycket giftigt för cellerna, och märkningsreaktionen bör inte fortsätta i mer än 15 minuter in vivo. Förbered alla komponenter färska. Lägg till Na-Ascorbate sist. Håll reaktionen vid 4 °C medan du förbereder dig. Vid tillsats av märkningslösning ska cellerna dock förvaras vid 37 °C inuti inkubatorn.
  4. Skörda cellerna och extrahera proteinerna (celllys)
    1. Ta bort märkningslösningen och tvätta täckglaset (18 mm) som innehåller de mGluR2-transfekterade cellerna två gånger med RB.
    2. Tvätta cellerna från täckglaset med en pipett och återsuspendera i RB (1 ml).
      OBS: Minimera provexponeringen för ljus så mycket som möjligt efter denna punkt.
    3. Pelletera cellerna genom att snurra vid 1 000 x g vid 4 °C i 5 minuter och avlägsna supernatanten. Återsuspendera cellpelleten i 80-130 μl av lyslösningen.
      OBS: Cellpelleten ska vara synlig för ögat. Lysvolymen beror på mängden prov som förlorats under märknings- och tvättprocessen.
    4. Blanda försiktigt genom pipettering för att bryta upp pelleten. Vik in i folie och lägg på vippan vid 4 °C i 0,5-1 h för att lysera cellerna.
    5. Pelletera den olösliga fraktionen genom centrifugering vid 20 000 x g och 4 °C i 20 minuter. Överför supernatanten till ett nytt kallt rör (det lyserade proteinet som innehåller det fluorescerande märkta proteinet av intresse) och förvara det på is för experiment.

3. Enmolekylär flödeskammare montering och funktionalisering

  1. Ta bort rutschkanan och täckglaset från frysen och låt dem värmas vid RT i mörker (~ 30 min).
  2. Montera kammaren med dubbelsidig tejp genom att klämma remsor av dubbelsidig tejp mellan bilden och täckglaset. Se till att de PEGylerade ytorna bildar flödeskammarens inre.
  3. Använd en pipettspets och tryck på täckglaset för att säkerställa att tejpen får fullständig kontakt med både täckglas och glid; Var försiktig så att du inte bryter täckglaset. Applicera epoxi på kanterna på bilderna.
    OBS: Lägg inte till så mycket att epoxi fyller i de borrade hålen.
  4. Placera flödeskammaren med täcksidan nedåt i en fuktad mörk låda så att epoxin kan torka (~ 30 min).
    OBS: Tillsätt T50-buffert (tilläggsfil 1) genom de borrade hålen för att förhindra att epoxin täcker hålen (10-15 μL) under torkperioden.
  5. Inkubera varje kammarbana med 500 nM Neutravidin (utspätt i T50) genom att långsamt applicera ~40 μL på varje körfält.
  6. Inkubera vid RT i 2 minuter inuti en fuktad mörk låda. Tvätta med ~100 μL T50-buffert per körfält.
  7. Inkubera varje kammarbana med 20 nM biotinylerad antikropp11. Valet av antikropp beror på taggen på proteinet.
    OBS: Om den primära antikroppen inte biotinyleras, inkubera först med den biotinylerade sekundära antikroppen i 30 minuter och inkubera sedan med den primära antikroppen.
  8. Inkubera vid RT i 30 minuter inuti en fuktad mörk låda. Tvätta med ~ 200 μL T50 per körfält.
    OBS: Se till att banorna aldrig torkar ut under förberedelseprocessen.

4. Enmolekylära buffertar

  1. Trolox buffert
    OBS: Trolox-buffert är startbufferten för att göra bildbuffert. Komponenterna i bufferten är beroende av experimentet och kan variera beroende på proteinet av intresse. Bufferten som används i protokollet som beskrivs här inkluderar salter (NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2), buffringsmedel (HEPES) och Trolox (pH ~7,35).
    1. Lös upp 9-10 mg Trolox i 10 ml enmolekylsregistreringsbuffert (SRB, tilläggsfil 1)
      OBS: Trolox gör bufferten något sur. Justera pH-värdet i detta skede med natriumhydroxidlösning (NaOH), 10 M (pH 7,35). Den fina pH-justeringen kommer att göras efter att Trolox är helt upplöst; Att öka pH vid denna tidpunkt ökar emellertid troloxens löslighet.
    2. Blanda lösningen vid RT med en bänkvippa i 4-8 timmar (insvept i aluminiumfolie) för att lösa upp Trolox helt.
    3. Kontrollera pH-värdet och justera vid behov.
    4. Se till att Trolox är helt upplöst. Sterilisera lösningen med ett sprutfilter och förvara vid 4 °C.
      OBS: Bufferten ska användas efter 2-10 dagars åldrande. Trolox hjälper till att undertrycka blinkande och används ofta i enmolekylstudier17. De antiblinkande egenskaperna kommer från ett oxiderat derivat av Trolox18; därför rekommenderas det att hålla det på RT i minst några timmar för att mogna. Dessutom påskyndar UV-strålning från färsk Trolox-lösning oxidationsprocessen och kan användas för att påskynda "åldrandet" av Trolox buffert18.
  2. Bildbuffertrecept: Blanda Trolox-buffert + tvättmedel (~ 2 gånger tvättmedlets CMC-värde) + 4 mM protocatechuinsyra (PCA).
    OBS: Tvättmedelskoncentrationen hålls nära CMC eftersom höga tvättmedelskoncentrationer kan leda till ökad proteindenaturering. Till exempel kan följande blandning användas 955 μL Trolox + 5 μL 10% DDM + kolesterol (W%, 10:1) + 40 μL 100 mM PCA stamlösning. Här fungerar PCA som ett antioxidantmedel och användes tidigare i smFRET-studier19. DDM är icke-joniskt, används ofta för att solubilisera membranproteiner20,21 och har använts i enmolekylstudier. DDM är ett bra förstahandstvättmedel; Vi rekommenderar dock att du testar flera tvättmedel och ser till att resultaten är konsekventa.

5. Mikroskopinställning och smFRET-datainsamling

  1. Slå på datorn och mikroskopet. Slå på lasrarna för att värma upp (532 nm för Cy3 excitation och 640 nm för Cy5 excitation).
    OBS: Här användes ett inverterat mikroskop utrustat med ett 100x TIRF-mål (NA 1.49), bilddelare och EMCCD-kamera. Installationen är utrustad med en fyrlinjelaserkombinerare, en dikroisk spegel, ett långpassemissionsfilter, ett emissionsdikroiskt filter och ett hackfilter.
  2. Slå på EMCCD-kameran och öppna kameraprogramvaran. Vänta 20 minuter tills kameran når −69 °C och stabiliseras.
  3. Montera provkammaren på mikroskopsteget. Tillsätt proteinprovet gradvis för att uppnå ~ 400 molekyler per synfält (steg 2.4.5). Tvätta kammaren med 100 μL av bildbufferten.
  4. Justera förstärknings-, förvärvs- och laserkrafterna så att enmolekylära fluorescenssignaler detekteras i både givar- och acceptorkanalerna. Justera proteinkoncentrationen inuti provkammaren om det behövs.
    OBS: Med mer än 400 molekyler i synfältet blir det svårare att skilja enskilda molekyler och bakgrundsbruset blir högre.
  5. Excitera givaren och skaffa tidsspår tills minst 80% av donatormolekylerna i synfältet är fotoblekta.
  6. I slutet av filmen, slå på 640 nm-lasern för att direkt excitera acceptorn tills några av acceptormolekylerna fotobleker, vilket underlättar enmolekyl från multimerdiskriminering.
  7. Gå över till ett annat synfält och upprepa stegen ovan för att samla in minst tre filmer (tekniska repliker) per villkor.
    OBS: Använd lägsta möjliga lasereffekt när du väljer en ny region av intresse (ROI) och fokuserar för att minimera fotoblekning. Var uppmärksam på scendriften under förvärvet. Om märkbar drift observeras efter att ha flyttat till en ny avkastning, vänta i 3 minuter innan du börjar förvärva.

6. Analys av data

  1. Kanaljustering för givare och acceptor (filmmappning)
    1. Spela in de fluorescerande pärlbilderna i givar- och acceptorkanalerna.
    2. Generera mappningsfilen med hjälp av pärldata för att korrelera givarens och acceptorns fluorescens från varje molekyl22,23.
      OBS: Emissionssignalen från en enda molekyl delas upp i givar- och acceptorsignaler av emissionsdikrofiltret inuti bilddelaren. Donator- och acceptorbilderna projiceras på kameran sida vid sida. För att exakt associera givar- och acceptorintensiteterna för en enda molekyl mellan de två områdena genereras ofta en mappningsfil med hjälp av fluorescerande pärlprover. Med hjälp av denna kartläggningsfil mappas alla molekyler som detekteras i givar- och acceptorkanalerna på varandra. Analysen genererar sedan tidsspåren, som är givar- och acceptorintensiteterna över tid, för varje molekyl.
  2. Urval av enmolekylära FRET-spår (partikelplockning)
    OBS: Enskilda partikelspår undersöks och väljs ut för nedströmsanalys med hjälp av MATLAB. De exakta urvalskriterierna beror på systemet. Allmänna riktlinjer för vad som utgör en kvalitetspartikel beskrivs här. Alla anpassade koder är tillgängliga på GitHub (https://github.com/vafabakhsh-lab).
    1. Välj de spår där spårens totala intensitet (givare + acceptor) är stabil över tid. Välj spåren med antikorrelerade förändringar i givar- och acceptorintensiteter.
    2. Välj donator- och acceptormolekyler som visar fotoblekning i ett steg. Välj de spår som är >5 s långa.
      OBS: Bakgrunden i varje kanal efter blekning bör gå till noll. Spåren bör inte ha många blinkande händelser; Detta kommer att öka svårigheten att analysera.
    3. Beräkna FRET-verkningsgraden med ekvationen E = (I A− 0,088 × I D)/(I D + [I A− 0,088 × I D])24,25,26, där I D och I A är råa givar- respektive acceptorintensiteter.
      OBS: Läckaget av givaremission till acceptorkanalen bestäms med hjälp av endast donatormärkt prov exciterat med en 532 nm laser26. Läckagekorrigeringsfaktorn, 0,088, kan skilja sig åt för olika inställningar beroende på vilka filteruppsättningar som används. Det är viktigt att notera att kvantitativ och robust omvandling av FRET-effektivitet till absoluta avstånd kräver korrigering av givar- och acceptorintensiteter för flera faktorer och har diskuterats ingående före27.
  3. Identifiera konformationstillståndet med Hidden Markov Modeling (HMM)
    1. Kör vbFRET28-programmet i MATLAB och importera de valda spårningarna för ett givet tillstånd. Ange begränsningarna för antalet potentiella tillstånd och iterationer som ska köras.
      OBS: Baserat på rådata från de representativa resultaten antogs det att det fanns upp till fyra diskreta FRET-tillstånd upptagna av konformationssensorn; Således utsågs ett intervall på en till fyra stater. Förbättringar i montering bestämdes tidigare att försumbart öka med > 25 iterationer; Således användes 25 iterationer för att passa de representativa uppgifterna.
    2. Analysera smFRET-spårningarna och exportera de idealiserade spårningarna och analyssessionen. Spara de idealiserade spårningarna i en separat mapp för underordnad analys.
      OBS: De program som används för att extrahera tillståndsövergångs- och uppehållstidsdata från idealiserade spår gjordes tillgängliga i tidigare publicerat arbete29.
    3. Använd MATLAB-program, extrahera tillståndsövergångar och plotta dem som en värmekarta med X-koordinaten som indikerar startkonformation och Y-koordinaten som indikerar slutkonformation.
      OBS: Övergångar definieras som förändringar i FRET-värde >0.1 i de representativa resultaten som diskuteras här. Tröskeln för övergångar är beroende av de hypotetiska konformationstillstånd som ett protein av intresse upptar (inställd övergångströskel för att vara mindre än skillnaden mellan de närmaste FRET-tillstånden), liksom den upplösning som tillåts av den experimentella installationen. Undersökningen av värmekartor för flera förhållanden möjliggör identifiering av de vanligaste konformationstillstånden som en sensor övergår genom och därmed upptar. Fyra FRET-tillstånd identifierades för de representativa resultaten (FRET = 0,31, 0,51, 0,71 och 0,89).
    4. Använd MATLAB-program för att extrahera uppehållstiderna för varje identifierat konformationstillstånd. Ange ett intervall med FRET-värden som avgränsar varje tillstånd och tidsupplösning under datainsamlingen. FRET-intervall är jämnt uppdelade med intilliggande FRET-tillstånd. Exportera uppehållstiderna för givna behandlingsförhållanden.
      OBS: I de flesta fall kan uppehållstidsdata uppskattas väl med en enda exponentiell sönderfallsfunktion. Denna analys kan utföras i en dataanalys- och grafprogramvara.
  4. Gaussisk anpassning av smFRET-befolkningshistogram för att kvantifiera statlig beläggning
    1. Importera population FRET-histogram för förhållanden av intresse i dataanalys- och grafprogramvaran för flera topppassningsanalyser.
    2. Ange antalet toppar som finns (fyra toppar eller tillstånd baserat på HMM-analys). Montering utfördes med hjälp av flera Gaussiska fördelningar30 definierade som Equation 1, där A är toppområdet, xc är toppcentret och w är toppbredden för varje topp.
    3. Begränsa anpassningsparametrarna som A > 0, xc = FRET ± 0,02 och 0,1 ≤w≤ 0,24. Fyra FRET-toppar för enskilda populationers FRET-histogram passade samtidigt. Tillämpa de definierade begränsningarna för anpassningar av alla villkor.
    4. Beräkna beläggningstillståndet (procent) som området med topp av intresse dividerat med den totala ytan, definierad som summan av alla toppar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Uttryck och fluorescerande märkning av UAA-baserad FRET-sensor
Häri diskuteras exemplifierande resultat av införandet och fluorescerande märkning av en UAA (AZP) inom CRD för mGluR2 (548UAA)11. Som tidigare nämnts, för att infoga AZP i mGluR2, är det nödvändigt med samuttryck av det konstruerade translationella maskineriet, som inkluderar ett modifierat tRNA-syntetas och komplementärt tRNA (pIRE4-Azi) och mGluR2 som innehåller ett gult kodon vid position 548, skapat med mutagenes, (figur 2A,B). Märkningen av AZP med cyaninfärger uppnås genom en kopparkatalyserad cykloadditionsreaktion (figur 2C) och resulterar i effektiv plasmamembranmärkning av 548UAA (figur 2D). För att verifiera översättningen av 548UAA i full längd och integriteten hos den dimeriska receptorn utfördes SDS-PAGE-elektrofores på celllysatet från HEK293T-celler som uttrycker 548UAA märkt med Cy5. Ett enda band vid 250KDa observerades, vilket sammanföll med den dimeriska mGluR2 i full längd (figur 2E).

Datainsamling och analys
Celler som uttrycker 548UAA med C-terminal FLAG-tagg märktes med Cy3 (givare) och Cy5 (acceptor) och lyserades sedan med tvättmedel31 i närvaro av en proteashämmare för in vitro-studie. Efter avslutad celllys och avlägsnande av den olösliga fraktionen genom centrifugering applicerades supernatanten på en polyetylenglykol (PEG) -passiverad täckglidning funktionaliserad med en anti-FLAG-tag-antikropp för total inre reflektionsfluorescens (TIRF) avbildning (Figur 3). Provet belystes med en 532 nm laser, och partiklar valdes för nedströmsanalys med smCamera-programvara. Råa spår av donatorer, acceptor och FRET genererades för alla utvalda molekyler i smCamera och valdes med hjälp av MATLAB (avsnitt 6; Figur 4). En 8,8% givarblödningskorrigering tillämpades på acceptorintensiteter för den experimentella installationen som används här. Denna korrektionsfaktor kommer att variera med den experimentella inställningen, dikroiska filter och emissionsfilter som används och bör bestämmas genom att mäta givar- och acceptorsignalerna under standardexperimentella förhållanden med hjälp av celler märkta med endast givarfluorofor och beräkna genomblödningen ([acceptorintensitet]/[givarintensitet]). Figur 4 visar flera representativa FRET-spår och motsvarande givar- och acceptorsignaler. Dessa spår valdes med hjälp av kriterier som tidigare beskrivits i protokollet (avsnitt 6). Representativa valda spår som visar övergångar mellan flera tillstånd och givar- och acceptorblekningshändelser visas i figur 4B-D.

Identifiering av konformationstillstånd
För att identifiera de konformationstillstånd 548UAA som upptogs och förhållandet mellan dessa tillstånd i förhållande till varandra genomfördes Hidden Markov-modellering (HMM) analys. HMM-analys utfördes med hjälp av vbFRET-programmet som utfördes på MATLAB28 (figur 5A). Figur 5 använder data från en mellanliggande glutamatkoncentration (5μM) för att illustrera processen för tillståndsidentifiering. Baserat på råa smFRET-spår antogs det att upp till fyra potentiella FRET-tillstånd fanns för CRD. Således begränsades antalet stater till en till fyra. Sammantaget utfördes 25 iterationer av montering för varje spår för att bestämma antalet tillstånd som finns. Från dessa idealiserade passformer kan övergångar mellan diskreta FRET-tillstånd extraheras och plottas som en övergångsdensitetsvärmekarta (figur 5B). Värmekartan belyser fyra diskreta FRET-tillstånd vid 0,31, 0,51, 0,71 och 0,89, indikerade med prickade linjer. Övergångar definierades som förändringar i FRET >0.1. De idealiserade FRET-spåren ger också information om uppehållstid för varje identifierad konformation (figur 5C).

Population FRET histogramgenerering och topppassning
Representativa enmolekylspår för 548UAA i närvaro av varierande glutamatkoncentrationer som manuellt valdes ut för vidare analys visas i figur 6A,B. En allmän analys för smFRET-experiment är att generera populationshistogram från hundratals smFRET-spår för varje experimentellt tillstånd (figur 6C). Population FRET-histogram skapas från segmentet av spår före blekning. För att undvika att histogrammet förspänns mot beteendet hos längre spår är det nödvändigt att generera ett normaliserat FRET-histogram från varje spår före medelvärdet. Detta säkerställer att varje spår bidrar lika till det slutliga histogrammet. I detta system visar FRET-histogrammen en allmän förskjutning mot högre FRET med ökande glutamatkoncentration, vilket indikerar en minskning av avståndet mellan CRD: erna och en förskjutning mot den aktiva konformationen. Oavsett glutamatkoncentrationen förblir FRET-signalen dock ganska sporadisk, vilket indikerar en hög grad av inneboende dynamik för CRD. Förutom den allmänna förskjutningen mot högre FRET blir en omfördelning av konformationsensemblen uppenbar i histogrammet (färgkurvor). Enskilda molekyler kan också ses besöka dessa konformationstillstånd (streckade linjer) (figur 6B). För att bestämma sannolikheten för statlig beläggning måste man dela toppens yta med den totala ytan, definierad som summan av alla fyra enskilda toppområden. SMFRET-histogrammet som genererades från smFRET-experimentet av CRD för mGluR2 visade fyra dynamiska tillstånd med toppar vid 0,31, 0,51, 0,71 respektive 0,89 (märkta vid tillstånd 1-4).

Figure 1
Figur 1: Flödesschema över arbetsprotokollet och dataanalys. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Platsspecifik märkning av mGluR2 genom klickkemi . (A) Schematisk av den onaturliga aminosyran 4-azido-L-fenylalanininoxidationsprocessen i celler. (B) Schematisk visning av platsspecifik fluorescerande märkning av mGluR2, med den onaturliga aminosyran vid position 548, genom kopparkatalyserad azid-alkyne-klickreaktion. (C) Tredimensionell struktur av fluorescerande märkt mGluR2 (donatormolekyl i grönt, acceptormolekyl i rött) med Cy3- och Cy5-molekyler dockade. (D) Representativ konfokalmikroskopbild av HEK293T-celler som uttrycker 548UAA med cellytepopulationen märkt med donator (grön: Cy3) och acceptor (röd: Cy5) fluoroforer genom klickkemi. Skalstänger = 10 μm. (E) Bild av icke-reducerande 4% -20% polyakrylamidgelelektrofores av celllysat från HEK293T-celler som uttrycker 548UAA och märkt med Cy5-alkyn. Gelén är avbildad med en 633 nm excitationsvåglängd och 670-BP30 emissionsfilter-Lane a: proteinstege; körfält B: celllysat; körfält c: Cy5-alkynfärgämne. Resultaten är representativa för ett enskilt experiment. Panelerna B, D och E återanvänds från Liauw et al.11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Schematisk representation av smFRET-experimenten och mikroskopinställningen (TIRF). Den enmolekylära fluorescensbilden av givaren visas i grönt (skalstreck = 1000 nm) och acceptorn i rött. Donatorn var upphetsad vid 532 nm med hjälp av en laser. Acceptorn är upphetsad av FRET från givaren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Intensitetsspår av givare (grön) och acceptor (röd) märkt mGluR2. (A) Tecknad film som visar receptordynamiken och förändringen i avstånd mellan FRET-sonder. (B) Långlivad hög FRET-stat. (C) Flera FRET-tillstånd med acceptorfotoblekning först följt av givarfotoblekning. (D) Kortlivat FRET-tillstånd med acceptor fotoblekning. (E) Långlivat stabilt FRET-tillstånd med acceptorfotoblekning. Denna siffra återges med minimal modifiering från Liauw et al.11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Konformationstillståndsidentifiering . (A) Representativt FRET-spår med idealiserad passform överlagrad (röd) tillsammans med motsvarande givar- och acceptorsignal. (B) Värmekarta med övergångstäthet som markerar de vanligaste konformationsövergångarna som genomgått av 548UAA. Streckade linjer indikerar FRET-tillstånd. (C) Genomsnittliga uppehållstider för varje konformationstillstånd. Denna siffra återges med en minimal modifiering från Liauw et al.11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Enmolekylär FRET avslöjar fyra konformationstillstånd för mGluR2 CRD . (A) Representativ ram från en enmolekylfilm med givarkanalen (Cy3) till vänster och acceptorkanalen (Cy5) till höger. Molekyler valda av analysprogramvara för nedströms bearbetning indikeras med gröna cirklar. Skalstreck = 3 μm. (B) Exempel på enmolekylära tidsspår av 548UAA vid olika glutamatkoncentrationer. Donator (grön) och acceptor (röd) intensiteter och motsvarande FRET (blå) visas. Streckade linjer representerar fyra distinkta FRET-tillstånd. (C) SMFRET-populationshistogram i en rad glutamatkoncentrationer. Data representerar medelvärdet ± SEM. av N = 3 oberoende experiment. Denna siffra återges med en minimal modifiering från Liauw et al.11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: Sammanfattning av det övergripande protokollet . (A) Arbetsflöde för odling och märkning av celler som uttrycker ett protein som innehåller en onaturlig aminosyra. (B) Enmolekylärt FRET-experimentellt och analysarbetsflöde som används för att identifiera konformationstillstånd och karakterisera de dynamiska egenskaperna hos CRD-domänen i mGluR2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Komponent Volym/reaktion (μL)
Reducerat serummedium 100
Transfektion reagens 4.4
Komponent Volym/reaktion (μL)
Reducerat serummedium 100
P3000 4
Konstruktions-/komponentnamn Koncentration (ng/μl) Volym/brunn (12-brunn) (μL) Brunnar (#) Tillsatt DNA (μL)
tRNA/syntetas 1000 1 1 1
Bärnstensfärgad kodon som innehåller protein 1000 1 1 1

Tabell 1: Reagenser för transfektion av HEK 293 T-cellen.

Reagenser Volym att lägga till (μL) Lager conc (mM) Slutlig koncit (mM)
1x RB 655.5
BTTES 10.5 50 0.75
CuSO4 5.25 20 0.15
NaAsc 17.5 100 2.5
AminoG 8.75 100 1.25
Cy3-Alkyne (10 mM) 1.25 10 0.018
Cy5-Alkyne (10 mM) 1.25 10 0.018

Tabell 2: Sammansättning av märkningslösningen (klicka på kemi).

Tilläggsfil 1: Sammansättning av olika buffertar som används i denna studie. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

GPCR är proteiner som opererar på cellmembranet för att initiera signaltransduktion. Många GPCR består av flera domäner, där signalering är beroende av den kooperativa interaktionen mellan domänerna. För att modulera egenskaperna hos dessa membranreceptorer är det viktigt att förstå det dynamiska beteendet hos de flera domänerna. Enmolekylär fluorescensresonansenergiöverföring (smFRET) är en fluorescensteknik som möjliggör mätning av proteinkonformation och dynamik i realtid11,32. Härbeskrivs ett tillvägagångssätt som kombinerar smFRET, enmolekylär pull-down (SiMPull) och total intern reflektionsfluorescens (TIRF) mikroskopi för att direkt visualisera omläggningen av enskilda proteiner immobiliserade på en passiverad yta 5,11,33. FRET är mycket känsligt för avstånd och fungerar effektivt som en linjal i nanoskala som är lämplig för att undersöka intramolekylära förändringar (3-8 nm). Jämfört med traditionella biofysiska tillvägagångssätt är smFRET särskilt väl lämpad för studier av stor konformationsdynamik vid en tidsskala på ~ 10 ms och kräver en liten provvolym (cirka 1 fmole per experiment). Dessutom, i motsats till ensemblemätningar av konformationsdynamik, såsom de som tillhandahålls av kärnmagnetisk resonans (NMR)34 eller dubbelelektron-elektronresonans (DEER) spektroskopi35, tillåter smFRET den uttryckliga tilldelningen av både konformationstillstånd och deras tidsordning, liksom direkt detektion av sällsynta och övergående mellanliggande tillstånd.

För närvarande utgör begränsningarna för platsspecifik fluorescerande märkning en teknisk utmaning som förhindrar en bredare tillämpning av smFRET för att studera proteinernas konformationsdynamik. Dessutom är det svårt att rena membranproteiner i stora mängder och bevara deras aktivitet. Vanliga märkningsstrategier använder stora proteintaggar eller kräver generering av minimala cysteinmutanter, vilket ofta begränsar fluoroforkonjugering till termini av proteiner utan exponerade cysteinrester. För att kringgå dessa begränsningar anpassades och optimerades en onaturlig aminosyrainkorporeringsstrategi (UAA), vilket möjliggjorde icke-störande, restspecifik märkning med hjälp av en kopparkatalyserad klickreaktion11,12,14. Denna strategi gör det möjligt att konjugera fluoroforer genom de lösningsmedelsexponerade regionerna i membranreceptorn och gör det möjligt att generera ett bredare spektrum av konformationssensorer. I detta protokoll används en enda typ av konjugationskemi. Detta resulterar i populationer som endast är donator-donatorer och acceptor-acceptor, som utelämnas under nedströmsanalysen. Alternativt kan två ortogonala märkningsstrategier användas för att undvika detta eller övervinna eventuell heterogenitet när proteinet av intresse inte är symmetriskt.

Den direkta infångningen av protein hjälper till att kringgå traditionella reningssteg som är tidskrävande och tekniskt utmanande. På grund av kopparens cytotoxicitet används också kopparfri klickkemi baserad på transcyklooktan36 eller metyltetrazin37 . Dessa reagenser är dock dyra, och reaktionens icke-regiospecifika38-natur resulterar i ett lågt utbyte av fluorescerande märkt protein av intresse.

Grundliga riktlinjer för in vitro smFRET-experiment, från flödeskammarberedning till dataanalys, presenterades här. SMFRET-data samlades in med hjälp av en TIRF-inställning och analysen utfördes med hjälp av en specialskriven MATLAB-kod.

Några viktiga överväganden bör noteras. Först bör man förbereda PEG-passiverad yta för att vara homogen och mindre tät med biotin-PEG. Överskott av biotin-PEG kan resultera i överdriven proteinneddragning, vilket gör det svårt att lösa fluorescerande signaler från enskilda molekyler. För det andra bör proteinprovet (celllysatsupernatant) spädas ordentligt innan det tillsätts till provkammaren för att undvika ytmättnad. Utbytet av protein beror på celltäthet, valfritt tvättmedel och tvättmedelskoncentration. För att optimera antalet enskilda donator- och acceptorpar bör man rikta in sig på en densitet på ~ 400 molekyler i ett synfält på 256 x 512 pixlar. För det tredje ska Trolox-bufferten förvaras vid −20 °C för långvarig användning (månader). Trolox buffert förblir stabil i 2 veckor vid förvaring vid 4 °C. Slutligen bör man se till att inte införa luftbubblor i flödeskammaren efter funktionalisering med antikroppen. Torkning av flödeskammaren kommer att resultera i minskad effektivitet av proteinimmobilisering och provproteindenaturering.

Konformationsdynamiken hos mGluR2-sensorn som beskrivs här undersöktes framgångsrikt på individuell receptornivå med hjälp av smFRET och gav insikt i mekanismen för receptoraktivering. CRD befanns visa en hög nivå av inneboende dynamik, existerande i en jämvikt mellan fyra konformationella FRET-tillstånd oavsett närvaro eller frånvaro av glutamat. En förskjutning mot högre FRET-tillstånd eller en mer kompakt receptor visade sig ske på ett glutamatkoncentrationsberoende sätt (figur 6). Intressant nog, även vid mättande nivåer av glutamat, förblev CRD dynamisk. Metoden som presenteras här (sammanfattad i figur 7) för att förstå konformationsdynamiken är tillämplig på andra klass C GPCR, liksom andra membranproteiner såsom jonkanaler, jonotropa receptorer och receptortyrosinkinaser (RTK)32,39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.

Acknowledgments

Vi tackar medlemmarna i Reza Vafabakhsh-labbet för diskussioner. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health-bidraget R01GM140272 (till R.V.), av The Searle Leadership Fund for the Life Sciences vid Northwestern University och av Chicago Biomedical Consortium med stöd från Searle Funds vid The Chicago Community Trust (till R.V.). B.W.L. stöddes av National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Training Grant T32GM-008061.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(+)-Sodium L-Ascorbate Sigma Aldrich Cat # 11140-250G
4-azido-L-phenylalanine Chem-Impex International Cat # 06162
548UAA Liauw et al. 2021 Transfected construct
Acetic Acid Fisher Chemical 64-19-7
Acetone Fisher Chemical 67-64-1
Adobe Illustrator (2022) https://www.adobe.com/ RRID:SCR_010279 Software, algorithm
Aminoguanidine (hydrochloride) Cayman Chemical 81530
Aminosilane Aldrich 919-30-2
Bath Sonicator 2.8 L Fisher Scientific Ultrasonic Bath 2.8 L
Biotin-PEG Laysan Bio Inc Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg
BTTES Click Chemistry Tools 1237-500
Copper (II) sulfate Sigma Aldrich Cat # 451657-10G
Cover slip VWR 16004-306 Sample chamber
Cy3 Alkyne Click Chemistry Tools TA117-5
Cy5 Alkyne Click Chemistry Tools TA116-5
DDM Anatrace Part# D310 1 GM Detergent
DDM-CHS (10:1) Anatrace Part# D310-CH210 1 ML Detergent with cholecterol
Defined Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific SH30070.03
Di01-R405/488/561/635 Semrock Notch filter
DMEM Corning 10-013-CV
EMCCD Andor DU-897U Camera
ET542lp Chroma Long pass emission filter
FF640-FDi01 Semrock Emission dichroic filter
FLAG-tag antibody Genscript A01429
Fluorescent bead Invitrogen T7279 TetraSpeck microspheres Spherical bead
Glass slides Fisherfinest 12-544-4 sample chamber
Glutamate Sigma Aldrich Cat # 6106-04-3
HEK 293T Sigma Aldrich Cat # 12022001 Cell line
HEPES FisherBioReagents 7365-45-9
Image splitter OptoSplit II
KOH Fluka 1310-58-3
Laser Oxxius 4-line laser combiner
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific L3000015 Transfection Reagent
Methanol Fisher Chemical 67-56-1
Microscope Olympus Olympus IX83
Milli-Q water Barnstead Water Deionizer
m-PEG Laysan Bio Inc Item# MPEG-SIL-5000-1g
NF03-405/488/532/635 Semrock Dichroic mirror
OptiMEM Thermo Fisher Scientific 51985091 Reduced Serum Medium
OptiMEM/Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific
OriginPro (2020b) https://www.originlab.com/ RRID:SCR_014212 Data analysis and graphing software
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
pIRE4-Azi Addgene Plasmid # 105829 Transfected construct
Poly-L-lysine hydrobromide Sigma Aldrich Cat # P2636
Protocatechuic acid (PCA) HWI group 99-50-3
smCamera (Version 1.0) http://ha.med.jhmi.edu/resources/ Camera software
Sodium bicarbonate FisherBioReagents 144-55-8
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma 1310-73-2
Syringe filter Whatman UNIFLO Cat#9914-2502 Liquid filtration
Trolox Sigma 53188-07

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smock, R. G., Gierasch, L. M. Sending signals dynamically. Science. 324 (5924), 198-203 (2009).
  2. Changeux, J. P., Christopoulos, A. Allosteric modulation as a unifying mechanism for receptor function and regulation. Cell. 166 (5), 1084-1102 (2016).
  3. Tang, X. -l, Wang, Y., Li, D. -l, Luo, J., Liu, M. -Y. Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets. Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 363-371 (2012).
  4. Chung, K. Y., et al. Conformational changes in the G protein Gs induced by the β2 adrenergic receptor. Nature. 477 (7366), 611-615 (2011).
  5. Vafabakhsh, R., Levitz, J., Isacoff, E. Y. Conformational dynamics of a class C G-protein-coupled receptor. Nature. 524 (7566), 497-501 (2015).
  6. Niswender, C. M., Conn, P. J. Metabotropic glutamate receptors: Physiology, pharmacology, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 50, 295-322 (2010).
  7. Pin, J. P., Bettler, B. Organization and functions of mGlu and GABA(B) receptor complexes. Nature. 540 (7631), 60-68 (2016).
  8. Kniazeff, J., et al. Closed state of both binding domains of homodimeric mGlu receptors is required for full activity. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (8), 706-713 (2004).
  9. Ha, T. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 25 (1), 78-86 (2001).
  10. Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
  11. Liauw, B. W. -H., Afsari, H. S., Vafabakhsh, R. Conformational rearrangement during activation of a metabotropic glutamate receptor. Nature Chemical Biology. 17 (3), 291-297 (2021).
  12. Noren, C. J., Anthonycahill, S. J., Griffith, M. C., Schultz, P. G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins. Science. 244 (4901), 182-188 (1989).
  13. Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
  14. Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S. X., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. G Protein Coupled Receptors: Structure. 520, 281-305 (2013).
  15. Serfling, R., Coin, I. Chapter Four - Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods in Enzymology. Pecoraro, V. 580, Academic Press. Cambridge, MA. 89-107 (2016).
  16. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
  17. Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
  18. Cordes, T., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent. Journal of the American Chemical Society. 131 (14), 5018-5019 (2009).
  19. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  20. Lee, S., et al. How do short chain nonionic detergents destabilize G-protein-coupled receptors. Journal of the American Chemical Society. 138 (47), 15425-15433 (2016).
  21. Cao, A. -M., et al. Allosteric modulators enhance agonist efficacy by increasing the residence time of a GPCR in the active state. Nature Communications. 12 (1), 1-13 (2021).
  22. Mancebo, A., Mehra, D., Banerjee, C., Kim, D. -H., Puchner, E. M. Efficient cross-correlation filtering of one-and two-color single molecule localization microscopy data. Frontiers in Bioinformatics. 1, 739769 (2021).
  23. Mehra, D., Adhikari, S., Banerjee, C., Puchner, E. M. Characterizing locus specific chromatin structure and dynamics with correlative conventional and super-resolution imaging in living cells. Nucleic Acids Research. , (2022).
  24. Chen, H., Puhl, H. L., Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical Journal. 91 (5), 39-41 (2006).
  25. Gopich, I. V., Szabo, A. FRET efficiency distributions of multistate single molecules. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (46), 15221-15226 (2010).
  26. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  27. Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-A multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
  28. Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. Learning rates and states from biophysical time series: A Bayesian approach to model selection and single-molecule FRET data. Biophysical Journal. 97 (12), 3196-3205 (2009).
  29. Zhang, J., et al. Specific structural elements of the T-box riboswitch drive the two-step binding of the tRNA ligand. Elife. 7, 39518 (2018).
  30. Goodman, N. R. Statistical analysis based on a certain multivariate complex Gaussian distribution (an introduction). The Annals of Mathematical Statistics. 34 (1), 152-177 (1963).
  31. Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. Journal of the Royal Society Interface. 5, Suppl 2 131-138 (2008).
  32. Schamber, M. R., Vafabakhsh, R. Mechanism of sensitivity modulation in the calcium-sensing receptor via electrostatic tuning. Nature Communications. 13 (1), 2194 (2022).
  33. Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
  34. Huang, S. K., et al. Delineating the conformational landscape of the adenosine A(2A) receptor during G protein coupling. Cell. 184 (7), 1884-1894 (2021).
  35. Wingler, L. M., et al. Angiotensin analogs with divergent bias stabilize distinct receptor conformations. Cell. 176 (3), 468-478 (2019).
  36. Gordon, C. G., et al. Reactivity of biarylazacyclooctynones in copper-free click chemistry. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9199-9208 (2012).
  37. Kim, E., Koo, H. Biomedical applications of copper-free click chemistry: In vitro, in vivo, and ex vivo. Chemical Science. 10 (34), 7835-7851 (2019).
  38. Pickens, C. J., Johnson, S. N., Pressnall, M. M., Leon, M. A., Berkland, C. J. Practical considerations, challenges, and limitations of bioconjugation via azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 29 (3), 686-701 (2018).
  39. Geng, Y., et al. Structural mechanism of ligand activation in human calcium-sensing receptor. Elife. 5, 13662 (2016).

Tags

Biokemi utgåva 186 G-proteinkopplade receptorer (GPCR) konformationsdynamik membranreceptorer onaturliga aminosyror smFRET
Visualisering av membranreceptorernas konformationsdynamik med hjälp av enmolekylär FRET
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Banerjee, C., Liauw, B. W. H.,… More

Banerjee, C., Liauw, B. W. H., Vafabakhsh, R. Visualizing the Conformational Dynamics of Membrane Receptors Using Single-Molecule FRET. J. Vis. Exp. (186), e64254, doi:10.3791/64254 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter